CN1597963A - 菜豆几丁质酶基因及其编码产物的氨基酸序列 - Google Patents

Abstract

菜豆几丁质酶基因及其编码产物的氨基酸序列，它涉及一种新的基因序列。现在需要分离具有强抗真菌病能力的几丁质酶基因。本发明基因序列在GenBank注册号为AY357300，该基因全长1088bp，其中T、C、G、A分别为232 (21.3％)、330(30.3％)、276(25.4％)、250(23.0％)。在7bp处有起始密码子ATG，在988bp处有终止密码子TGA，在1008bp和1082bp处各有一个poly(A)附加信号。该序列无内含子，具有981bp完整的开放读码框，编码327个氨基酸。编码产物分子量为35.3kD，等电点pI为7.93。本发明在从菜豆基因组中分离出一个几丁质酶基因，扩大了植物抗真菌病基因资源，从而为植物抗病虫害及品质改良基因工程提供了更加丰富的优良候选基因。

Description

菜豆几丁质酶基因及其编码产物的氨基酸序列

技术领域：

本发明涉及一种新的基因。

背景技术：

近年来真菌病对农作物造成了巨大的危害，因此通过基因工程手段进行真菌病防治具有重要意义。由于许多危害植物的病原真菌的细胞壁的组成成分之一是几丁质，而植物中尚未发现几丁质酶的底物，所以几丁质酶在防御病原真菌侵害中具有重要作用，是植物防御系统的重要组成部分。因此，几丁质酶基因的分离和转化已经成为作物抗真菌病基因工程的研究热点。

植物几丁质酶基因的研究开始于1986年。1986年，Broglie等从菜豆中分离了几丁质酶基因，阅读框为984个核苷酸，编码328个氨基酸。1991年，Zhu等以蚕豆几丁质酶基因片段为探针，从水稻基因组文库分离到第一个几丁质酶RCH10基因的全部核苷酸序列，它含有一个无内含子的开放读码框，编码由336个氨基酸组成的多肽。1994年，Wu等利用PCR技术得到玉米几丁质酶的两个cDNA克隆PCH2和PCH11，并发现它们是编码ClassI的几丁质酶。

目前几丁质酶基因大多是从玉米、水稻、烟草中分离得到的，对菜豆几丁质酶基因的研究较少。并且近年来所分离到的几丁质酶基因在转化植株中虽然显示出一定的抗真菌病能力，但是仍然需要分离具有更强抗真菌病能力的几丁质酶基因。

发明内容：

本发明旨在从菜豆基因组中分离一个几丁质酶基因，扩大植物抗真菌病基因资源，从而为植物抗病虫害及品质改良基因工程提供更加丰富的优良候选基因。本发明的菜豆几丁质酶基因Bchi是以菜豆品种油豆总DNA为模板，通过PCR扩增获得的，它具有如下所示核苷酸序列：

agagaaatga agaagaatag gatgatgatt atgatatgca gtgtaggagt ggtgtggatg    60

ctgttagttg gaggaagcta cggagagcag tgtggaaggc aagcaggagg tgcactctgc    120

ccagggggca actgttgcag ccagttcggg tggtgcggct ccaccactga ctactgcggc    180

aaggattgcc agagccagtg cgggggaccg tctcctgctc ctactgatct cagcgccctc    240

atatccaggt ccaccttcga ccaggtgctc aaacatcgca acgacggagt atgcccagcc   300

aaaggcttct acacctacga tgccttcatc gccgccgcca aggcttaccc cagcttcgga   360

aacaccggag acacggccac tcgcaagagg gagattgcgg ccttcttggg gcaaacgtct   420

cacgaaacaa ccgggggatg ggccactgcg cccgacggac catacgcatg gggatactgc   480

ttcgtgaggg agcggaaccc cagtgcgtac tgctccgcca ctccccaatt cccctgcgcc   540

cctgggcagc agtactacgg caggggtccc atccagatat cctggaacta caactatggt   600

cagtgcggaa gggccattgg ggttgacttg ctcaacaaac ctgatctagt cgccactgac   660

tctgtcatct ccttcaagtc cgccctctgg ttctggatga ccgcacagtc ccccaaacct   720

tcctcccacg acgtcatcac ctctcgatgg accccctcct ctgccgacgt cgccgcccgc   780

cggcttcccg gctacggcac tgtgacgaac atcatcaacg gaggcctgga gtgcgggcga   840

ggacaggaca gctagggcac agaccgcatc ggattcttca agagatactg tgatctgctt   900

ggagttggtt atggcaacaa ccttgactgc tactctcaga ctccatttgg aaattcactc   960

ttcctctctg accttgtcac ctctcagtga cactgccatc ccatcagaat aaataaactc   1020

ataaatctgt gtttcccttt ctgatcacaa ctttccaata acacttttcc caccatctat   1080

caataaat                                                            1088

构建重组载体：采用的载体为pUC18载体，这是一种公知的载体，在市场上即有销售，如大连宝生物工程公司生产的、商品名称即为“PUC18”的载体，这是一种常用的克隆载体，大小为2686bp，具有Amp抗性基因。带有一段大肠杆菌lacZ的调控序列和N-端146个氨基酸的编码信息，此编码区插入了多克隆位点，若无外源基因插入，载体会与大肠杆菌lacZ的C-端序列功能互补，即α互补，产生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，则破坏了其读码框，产生无α互补能力的肽段，因此，在附加X-gal和IPTG的筛选培养基上白色菌落为带有重组质粒的细菌，蓝色菌落为带有重新环化载体的细菌。

外源基因导入宿主细胞：所用宿主细胞为E.coliJM109，基因导入宿主的过程即CaCl₂法制备E.coliJM109感受态细胞的过程：

(1)E.coliJM109在LB平板上划线培养12-16h，挑取单菌落接入不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)取过夜活化的E.coliJM109菌液1ml置于100ml新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.3；

(3将菌液分装于两个预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min。

(4)4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；

(5)加入10ml冰冷的0.1MCaCl₂，重悬菌体，冰浴30min；

(6)4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；

(7)加入2ml冰冷的0.1MCaCl₂，重悬菌体。

阳性重组子的筛选和鉴定：

(1)蓝白斑反应筛选阳性重组子

根据α-互补反应的原理，在附加X-gal和IPTG的筛选培养基上产生的白色菌落为带有重组质粒的菌落，蓝色菌落为带有重新环化载体的菌落，因此白色菌落可初步鉴定为阳性重组子。

(2)阳性重组子的酶切鉴定

提取白斑菌落质粒，利用SacI和BamHI对重组质粒双酶切分析，若电泳显示出约2.7kb(pUC18载体大小)和约1.1kb(目的基因大小)两条带，则证明质粒重组正确，是阳性重组子。

基因产物的表达及其制备：本发明基因产物表达所采用的宿主细胞为E.coliM15，将几丁质酶基因Bchi与原核表达载体pQE-30重组，pQE-30载体由中科院微生物研究所提供，构建成重组表达质粒pQE-Bchi，热激法转化到原核表达宿主菌E.coliM15感受态细胞中，1.0mMIPTG诱导3.5h后，经12％的SDS-PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色检测基因的表达情况：将分离的Bchi基因与原核表达载体pQE-30连接，构建成pQE-Bchi重组表达载体，诱导后表达出目的蛋白(35～36kD)，证实该基因是一个具有表达功能的基因。

本发明Bch编码的多肽产物的氨基酸序列为：

mkknrmmimi csvgvvwmll vggsygeqcg rqaggalcpg gnccsqfgwc gsttdycgkd 60

cqsqcggpsp aptdlsalis rstfdqvlkh rndgvcpakg gnccsqfgwc akaypsfgnt 120

gdtatrkrei aaflgqtshe ttggwatapd gpyawgycfv rernpsaycs atpqfpcapg 180

qqyygrgpiq iswnynygqc graigvdlln kpdlvatdsv isfksalwfw mtaqspkpss 240

hdvitsrwtp ssadvaarrl pgygtvtnii ngglecgrgq dsrvqdrigf fkrycdllgv 300

gygnnldcys qtpfgnslfl sdlvtsq                                     327

菜豆几丁质酶基因植物表达载体的构建及烟草的遗传转化：

将几丁质酶基因Bchi与植物表达载体pMHL7133-Gus重组，构建成重组表达质粒pMHL7133-Bchi，通过发根农杆菌pRiA4b介导将pMHL7133-Bchi转化到烟草中，所用pMHL7133-Gus载体由日本农林水产省生物资源所大乔先生惠赠。

转基因烟草内切几丁质酶活力测定：

采用氨基葡萄糖法测定转基因植株叶片几丁质酶活力。

(1)几丁质酶液提取及处理：

①称取转基因植株和非转基因植株对照植株)叶片各2g，放入预冷的研钵中，并加入6ml 0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)及少许石英砂，冰浴中研磨成匀浆；

②4℃，12000rpm离心15min，上清液即为粗酶液；

③取1ml酶液，加1ml 0.5％壳聚糖(pH6.0)2ml 0.2M醋酸钠(pH5.2)，混匀。同时用样品缓冲液代替底物做空白对照；

④37℃水浴2h，4℃，12000rpm离心5min，取上清液备用。

(2)外切酶活力测定：

①取1ml上清液于试管中，加1ml H₂O及1ml乙酰丙酮试剂，摇匀；

②用玻璃球封住试管口，沸水中加热20min，然后冷却至室温；

③加5ml无水乙醇和1mlDMAB试剂，再以无水乙醇补足至总体积10ml，充分混匀；

④65℃-70℃水浴10min，加速CO₂释放，然后冷却至室温，测530nm处的吸收值。用水代替酶液做空白对照。

(3)总酶活力测定：

①取1ml上清液于试管中，加100μl 1M磷酸缓冲液(pH7.1)和70μl3％蜗牛酶，摇匀；

②37℃水浴2h，加水至总体积为2ml；

③65℃-70℃水浴10min，加速CO₂释放，冷却至室温，测530nm处的吸收值。

(4)计算方法：

根据标准曲线方程，将OD值换算成氨基葡萄糖产量，以每小时分解胶体壳聚糖产生1μg氨基葡萄糖为一个酶活力单位。

标准曲线方程为：Y＝329.82X-3.3249

X：OD值  Y：氨基葡萄糖量(μg)

直线相关系数r＝0.9923

(5)内切酶活力计算：

内切酶活力＝总酶活力-外切酶活力。

本发明基因是从五常油豆基因组中分离得到的，基因序列在GenBank注册号为AY357300。该基因全长1088bp，其中T、C、G、A分别为232(21.3％)、330(30.3％)、276(25.4％)、250(23.0％)。在7bp处有起始密码子ATG，在988bp处有终止密码子TGA，在1008bp和1082bp处各有一个poly(A)附加信号。该序列无内含子，具有981bp完整的开放读码框，编码327个氨基酸。编码产物分子量为35.3kD，等电点pI为7.93。在结构上具有Class Ia几丁质酶前体的结构特征，结构分为四个区域：N-端具有一个26个氨基酸的信号肽；41个氨基酸的几丁质结合区，其中有8个半胱氨酸；由249个氨基酸组成的高度保守的催化区；C-端为由11个氨基酸组成的液泡定位多肽。在几丁质结合区和催化区之间无富含脯氨酸的可变交连区。通过GenBank基因序列比对分析，表明与已注册的菜豆Class I几丁质酶同源性为90～98％，证明是一个新的菜豆Class Ia几丁质酶基因，为碱性内切几丁质酶基因。将分离的Bchi基因与原核表达载体pQE-30连接，构建成pQE-Bchi重组表达载体，诱导后表达出目的蛋白(35～36kD)，证实该基因是一个具有表达功能的基因。本发明在从菜豆基因组中分离出一个几丁质酶基因，扩大了植物抗真菌病基因资源，从而为植物抗病虫害及品质改良基因工程提供了更加丰富的优良候选基因。本发明将分离的Bchi基因与植物表达载体pMHL7133-Gus连接，构建成重组表达载体pMHL7133-Bchi，通过发根农杆菌pRiA4b介导将pMHL7133-Bchi转化到烟草中。氨基葡萄糖法对转基因烟草叶片几丁质酶活力测定结果显示，转基因烟草内切几丁质酶活力是非转基因烟草(对照植株)的1.4～2.3倍，证实Bchi基因在烟草中得到表达，提高了烟草植株的几丁质酶活力。赤星病菌链格孢菌对转基因烟草抗真菌病能力测验结果显示，转基因烟草植株叶片表面基本没有病斑，而对照植株叶表面接菌部位发黄，产生褐色的病斑，表明阳性植株较对照植株对真菌病害有较强的抗性，进一步证实Bchi基因在烟草中得到表达，其表达产物几丁质酶具有较强的抗真菌病害能力。对转基因烟草的田间调查结果显示，转基因植株较对照植株对蚜虫具有一定抗性，证明Bchi基因的表达产物几丁质酶具有一定的抗蚜虫能力。

附图说明：

图1是pUC18载体图谱。

具体实施方式：

本发明所述的菜豆几丁质酶基因Bchi是以菜豆品种五常油豆总DNA为模板，通过PCR扩增获得的。对该基因进行了原核表达检测，同时构建了该基因的植物表达载体并转化烟草，对转基因植株进行了内切几丁质酶活力测定和抗真菌病能力测验。其具体方法如下：

1、菜豆几丁质酶基因的克隆

(1)PCR引物的设计

根据GenBank中收录的菜豆mRNA序列，采用软件Primer Primier5.0设计了一对PCR扩增引物，序列如下：

P1(5′端引物)：5′GG GGATCCAGAGAATGAAGAAGAATAGG 3′

BamHI

P2(3′端引物)：5′GG GAGCTCATTTATTGATAGATGGTGGG3′

SacI

(2)菜豆基因组总DNA的提取：

取菜豆植株幼叶约100mg，放入液氮中研磨成粉末状，采用SDS法提取。

(3)几丁质酶基因的PC扩增：

以菜豆总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系：1x Buffer，0.2mM dNTP，引物P1、P2各0.4μM，ExTaqDNA聚合酶1.25U，模板DNA0.1～1μg，加ddH₂O至25μL。反应程序：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

(4)PCR产物的克隆：

PCR产物用柱式DNA胶回收试剂盒回收，方法参照试剂盒说明书。回收产物经限制性内切酶SacI、BamHI酶切后，与经同样酶切的pUC18克隆载体连接，连接体系：pUC18载体50ng，PCR产物50～100ng，1x Ligase Buffer，T₄DNA连接酶1U，加ddH₂O至20μL。23℃～26℃连接2h。连接产物转化E.ColiJM109感受态细胞。在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选，并提取白斑菌落质粒进行酶切以鉴定阳性重组子。

(5)DNA序列测定与分析：

利用ABI377荧光自动序列分析仪进行序列测定，测序结果用软件DNAMAN进行序列比较分析，序列的同源性比较在http：//www.ncbi.nlm.gov网站上用BLAST程序进行。

2.构建重组载体：采用的载体为pUC18载体，这是一种公知的载体，在市场上即有销售，如大连宝生物工程公司生产的、商品名称即为“PUC18”的载体，这是一种常用的克隆载体，大小为2686bp，具有Amp抗性基因。带有一段大肠杆菌lacZ的调控序列和N-端146个氨基酸的编码信息，此编码区插入了多克隆位点，若无外源基因插入，载体会与大肠杆菌lacZ的C-端序列功能互补，即α互补，产生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因插入，则破坏了其读码框，产生无α互补能力的肽段，因此，在附加X-gal和IPTG的筛选培养基上白色菌落为带有重组质粒的细菌，蓝色菌落为带有重新环化载体的细菌。

3、外源基因导入宿主细胞：所用宿主细胞为E.coliJM109，基因导入宿主的过程即CaCl₂法制备E.coliJM109感受态细胞的过程：

(1)E.coliJM109在LB平板上划线培养12-16h，挑取单菌落接入不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)取过夜活化的E.coliJM109菌液1ml置于100ml新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.3；

(3)将菌液分装于两个预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min。

(4)4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；

(5)加入10ml冰冷的0.1MCaCl₂，重悬菌体，冰浴30min；

(6)4℃，4000rpm，离心10min，弃上清；

(7)加入2ml冰冷的0.1MCaCl₂，重悬菌体。

热激法转化E.coliJM109感受态细胞：

(1)取200μl感受态细胞，置于冰上，加入4μl连接产物，轻轻旋转混匀内容物。

(2)冰浴30min。

(3)42℃水浴中热激90s，勿摇动。

(4)冰浴2-3min。

(5)加入800μl无附加抗生素的LB培养基，混匀，37℃200-250rpm摇床振荡预表达培养45-60min。

(6)室温，4000rpm，离心5min，弃去900μl上清液，余液将菌体悬浮。

(7)将细菌涂布在附加50mg/L Amp、4μlIPTG和40μlX-gal的LB固体培养基上。

(8)平板于37℃正向放置至液体被吸收，然后倒置培养过夜。

4、阳性重组子的筛选和鉴定：

(1)蓝白斑反应筛选阳性重组子：

根据α-互补反应的原理，在附加X-gal和IPTG的筛选培养基上产生的白色菌落为带有重组质粒的菌落，蓝色菌落为带有重新环化载体的菌落，因此白色菌落可初步鉴定为阳性重组子。

(2)阳性重组子的酶切鉴定：

提取白斑菌落质粒，利用SacI和BamHI对重组质粒双酶切分析，电泳显示出约2.7kb(pUC18载体大小)和约1.1kb(目的基因大小)两条带，证明质粒重组正确，是阳性重组子。

基因产物的表达及其制备：本发明基因表达所采用的宿主细胞为E.coliM15，将几丁质酶基因Bchi与原核表达载体pQE-30重组，pQE-30载体由中科院微生物研究所提供，构建成重组表达质粒pQE-Bchi，热激法转化到原核表达宿主菌E.coliM15感受态细胞中，1.0mM IPTG诱导3.5h后，经12％的SDS-PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色检测基因的表达情况：诱导后表达出目的蛋白(35～36kD)，证实该基因是一个具有表达功能的基因。

Bchi编码的多肽产物符合Class Ia几丁质酶前体的结构特点：其N-端具有一个26个氨基酸的信号肽，其中疏水性氨基酸为18个，约占69％，信号肽剪切位点在G₂₆-E₂₇之间，与几丁质酶的细胞定位有关，在成熟肽中将被切除；其后是富含8个半胱氨酸(Cys)、长41个氨基酸的几丁质结合区；还有由249个氨基酸组成的高度保守的催化区，在几丁质结合区和催化区之间无富含脯氨酸(Pro)的可变交连区；C-端有由11个氨基酸组成的液泡定位多肽序列，见图1。因此Bchi编码的蛋白产物属于Class Ia几丁质酶，且为碱性内切几丁质酶。该基因序列已被GenBank收录，登录号为AY357300。

5、菜豆几丁质酶基因植物表达载体的构建及烟草的遗传转化：

将几丁质酶基因Bchi与植物表达载体pMHL7133-Gus重组，构建成重组表达质粒pMHL7133-Bchi，通过发根农杆菌pRiA4b介导将pMHL7133-Bchi转化到烟草中，所用pMHL7133-Gus载体由日本农林水产省生物资源所大乔先生惠赠。

6、转基因烟草内切几丁质酶活力测定：

采用氨基葡萄糖法测定转基因植株叶片几丁质酶活力。

(1)几丁质酶液提取及处理：

①称取转基因植株和非转基因植株(对照植株)叶片各2g，放入预冷的研

 钵中，并加入6ml 0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)及少许石英砂，冰浴中

 研磨成匀浆；

②4℃，12000rpm离心15min，上清液即为粗酶液；

③取1ml酶液，加1ml 0.5％壳聚糖(pH6.0)和2ml 0.2M醋酸钠(pH5.2)，混匀。同时用样品缓冲液代替底物做空白对照；

④37℃水浴2h，4℃，12000rpm离心5min，取上清液备用。

(2)外切酶活力测定：

①取1ml上清液于试管中，加1ml H₂O及1ml乙酰丙酮试剂，摇匀；

②用玻璃球封住试管口，沸水中加热20min，然后冷却至室温；

③加5ml无水乙醇和1ml DMAB试剂，再以无水乙醇补足至总体积10ml，充分混匀；

④65℃-70℃水浴10min，加速CO₂释放，然后冷却至室温，测530nm处的吸收值。用水代替酶液做空白对照。

(3)总酶活力测定：

①取1ml上清液于试管中，加100μl 1M磷酸缓冲液(pH7.1)和70μl 3％蜗牛酶，摇匀；

②37℃水浴2h，加水至总体积为2ml；

③65℃-70℃水浴10min，加速CO₂释放，冷却至室温，测530nm处的吸收值。

(4)计算方法：

根据标准曲线方程，将OD值换算成氨基葡萄糖产量，以每小时分解胶体壳聚糖产生1μg氨基葡萄糖为一个酶活力单位。

标准曲线方程为：Y＝329.82X-3.3249

X：OD值Y：氨基葡萄糖量(μg)

直线相关系数r=0.9923

(5)内切酶活力计算：内切酶活力＝总酶活力-外切酶活力。

7、转基因烟草抗真菌病实验：

所用真菌为赤星病菌链格孢菌。将菌丝接种在PDA培养基上，25℃培养7天。用1ml无菌水冲洗培养基表面制成菌液，倒入培养皿，再将45℃的培养基倒入培养皿，摇匀，培养7天后使用。接菌过程如下：

①制备孢子悬浮液：用适量无菌水冲洗培养基表面，保证菌液浓度不低于100000个/ml，在孢子悬浮液中加入1％的葡萄糖。

②接菌：选取生长状况一致的转基因植株叶片和非转基因植株叶片，取20ml孢子液滴在滤纸片上，将滤纸贴在烟草叶片上。

③瓷盘底铺上滤纸，滤纸浸湿。接菌叶片放置在瓷盘中的滤纸上，盖上玻璃板，保湿20℃光照培养2周，观察感病情况。

 测定结果显示，转基因烟草内切几丁质酶活力是非转基因烟草(对照植株)的1.4～2.3倍，证实Bchi基因在烟草中得到表达，提高了烟草植株的几丁质酶活力。赤星病菌链格孢菌对转基因烟草抗真菌病能力测验结果显示，转基因烟草植株叶片表面基本没有病斑，而对照植株叶表面接菌部位发黄，产生褐色的病斑，表明阳性植株较对照植株对真菌病害有较强的抗性，进一步证实Bchi基因在烟草中得到表达，其表达产物几丁质酶具有较强的抗真菌病害能力。对转基因烟草的田间调查结果显示，转基因植株较对照植株对蚜虫具有一定抗性，证明Bchi基因的表达产物几丁质酶具有一定的抗蚜虫能力。

附：

                      序列表

菜豆几丁质酶基因Bchi的核苷酸序列：

agagaa atga agaagaatag gatgatgatt atgatatgca gtgtaggagt ggtgtggatg    60

ctgttagttg   gaggaagcta cggagagcag tgtggaaggc aagcaggagg tgcactctgc    120

ccagggggca   actgttgcag ccagttcggg tggtgcggct ccaccactga ctactgcggc    180

aaggattgcc   agagccagtg cgggggaccg tctcctgctc ctactgatct cagcgccctc    240

atatccaggt   ccaccttcga ccaggtgctc aaacatcgca acgacggagt atgcccagcc    300

aaaggcttct   acacctacga tgccttcatc gccgccgcca aggcttaccc cagcttcgga    360

aacaccggag   acacggccac tcgcaagagg gagattgcgg ccttcttggg gcaaacgtct    420

cacgaaacaa   ccgggggatg ggccactgcg cccgacggac catacgcatg gggatactgc    480

ttcgtgaggg   agcggaaccc cagtgcgtac tgctccgcca ctccccaatt cccctgcgcc    540

cctgggcagc   agtactacgg caggggtccc atccagatat cctggaacta caactatggt    600

cagtgcggaa   gggccattgg ggttgacttg ctcaacaaac ctgatctagt cgccactgac    660

tctgtcatct   ccttcaagtc cgccctctgg ttctggatga ccgcacagtc ccccaaacct    720

tcctcccacg   acgtcatcac ctctcgatgg accccctcct ctgccgacgt cgccgcccgc    780

cggcttcccg   gctacggcac tgtgacgaac atcatcaacg gaggcctgga gtgcgggcga    840

ggacaggaca   gcagggttca agaccgcatc ggattcttca agagatactg tgatctgctt    900

ggagttggtt   atggcaacaa ccttgactgc tactctcaga ctccatttgg aaattcactc    960

ttcctctctg   accttgtcac ctctcag tga cactgccatc ccatcag

taaactc   1020

                                           (5)

ataaatctgt gtttcccttt ctgatcacaa ctttccaata acacttttcc caccatctat      1080

c

t                                                           1088

(6)

Bchi编码的多肽产物的氨基酸序列：

mkknrmmimi csvgvvwmll vggsyg  eqcg rqaggalcpg gnccsqfgwc gsttdycgkd   60

         (1)                            (2)

cqsqspcggpsp aptdlsalis rstfdqvlkh mdgcpakg fytyafiaa akaypsfgnt      120

gdtatrkrei aaflgqtshe ttggwatapd gpyawgycfv rernpsaycs atpqfpcapg      180

                                                      (3)

qqyygrgpiq iswnynygqc graigvdlln kpdlvatdsv isfksalwfw mtaqspkpss      240

hdvitsrwtp ssadvaarrl pgygtvtnii ngglecgrgq dsrvqdrigf fkrycdllgv      300

gygnnldcys qtpfgn slfl sdlvtsq                                        327

                     (4)

几丁质酶基因Bchi核苷酸序列及其编码产物的氨基酸序列：(1)N-端信号肽；(2)几丁质结合区；(3)催化区；(4)液泡定位多肽；(5)、(6)poly(A)附加信号。

Claims (2)

1.一种菜豆几丁质酶基因，该基因命名为Bchi，它具有如下所示DNA序列：

agagaaatga agaagaatag gatgatgatt atgatatgca gtgtaggagt ggtgtggatg     60

ctgttagttg gaggaagcta cggagagcag tgtggaaggc aagcaggagg tgcactctgc    120

ccagggggca actgttgcag ccagttcggg tggtgcggct ccaccactga ctactgcggc    180

aaggattgcc agagccagtg cgggggaccg tctcctgctc ctactgatct cagcgccctc    240

atatccaggt ccaccttcga ccaggtgctc aaacatcgca acgacggagt atgcccagcc    300

aaaggcttct acacctacga tgccttcatc gccgccgcca aggcttaccc cagcttcgga    360

aacaccggag acacggccac tcgcaagagg gagattgcgg ccttcttggg gcaaacgtct    420

cacgaaacaa ccgggggatg ggccactgcg cccgacggac catacgcatg gggatactgc    480

ttcgtgaggg agcggaaccc cagtgcgtac tgctccgcca ctccccaatt cccctgcgcc    540

cctgggcagc agtactacgg caggggtccc atccagatat cctggaacta caactatggt    600

cagtgcggaa gggccattgg ggttgacttg ctcaacaaac ctgatctagt cgccactgac    660

tctgtcatct ccttcaagtc cgccctctgg ttctggatga ccgcacagtc ccccaaacct    720

tcctcccacg acgtcatcac ctctcgatgg accccctcct ctgccgacgt cgccgcccgc    780

cggcttcccg gctacggcac tgtgacgaac atcatcaacg gaggcctgga gtgcgggcga    840

ggacaggaca gcagggttca agaccgcatc ggattcttca agagatactg tgatctgctt    900

ggagttggtt atggcaacaa ccttgactgc tactctcaga ctccatttgg aaattcactc    960

ttcctctctg accttgtcac ctctcagtga cactgccatc ccatcagaat aaataaactc   1020

ataaatctgt gtttcccttt ctgatcacaa ctttccaata acacttttcc caccatctat   1080

caataaat                                                            1088。

2.一种权利要求1所述菜豆几丁质酶基因的编码产物，它具有如下所示的氨基酸序列：

mkknrmmimi csvgvvwmll vggsygeqcg rqaggalcpg gnccsqfgwc gsttdycgkd    60

cqsqcggpsp aptdlsalis rstfdqvlkh rndgvcpakg fytydafiaa akaypsfgnt    120

gdtatrkrei aaflgqtshe ttggwatapd gpyawgycfv rernpsaycs atpqfpcapg    180

qqyygrgpiq iswnynygqc graigvdlln kpdlvatdsv isfksalwfw mtaqspkpss    240

hdvitsrwtp ssadvaarrl pgygtvtnii ngglecgrgq dsrvqdrigf fkrycdllgv    300

gygnnldcys qtpfgnslfl sdlvtsq                                        327。