CN1592789A - 对映异构体富集的α－氨基酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在乙内酰脲酶和D－氨基甲酰基化酶的存在下，在一锅反应中实施的制备对映异构体富集的D－α－氨基酸的方法，其中N－氨基甲酰基－L－α－氨基酸转化为相应的D－α－氨基酸，且其中N－氨基甲酰基－α－氨基酸可由相应的L－α－氨基酸制备。优选使用的酶源自放射形土壤杆菌或黑蓝节杆菌。非常适用的α－氨基酸的实例为亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸。

Description

对映异构体富集的α-氨基酸的制备方法
本发明涉及一种在乙内酰脲酶(hydantoinase)和D-氨基甲酰基化酶(D-carbamoylase)的存在下，在一锅反应中制备对映异构体富集的D-α-氨基酸的方法。
D-α-氨基酸可以通过相应的D-和L-5-取代的乙内酰脲混合物的酶促反应来制备。EP0775748中公开了这一制备方法。在该方法中，在D-乙内酰脲酶和D-氨基甲酰基化酶存在下的一锅反应中，将D-和L-5-取代的乙内酰脲混合物对映异构选择性地转变为相应的D-α-氨基酸。对映异构体富集的α-氨基酸是构成一些生物活性制品如β-内酰胺抗生素、多肽激素和杀虫剂的重要构建成分。
该方法的缺点是制备对映异构体富集的α-氨基酸的起始物质，即相应的5-取代的乙内酰脲通常由于大多5-取代的乙内酰脲的水溶性很低而难于操作。
本发明的目的是提供一种制备D-α-氨基酸的简单方法，该方法中可应用比5-取代的乙内酰脲更易操作的起始物质。根据本发明，通过将N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸而实现上述目的。
研究发现，N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸相对快速且产率高，并且，乙内酰脲酶的对映异构选择性对本发明所述方法不起关键作用。这是令人惊讶的，因为Syldatk等(Appl.Microbiol.Biotechnol，vol.51，p 293-309(1999))已经披露了非选择性乙内酰脲酶步骤能够限制空间/时间产率，该空间/时间产率是单位反应体积和单位时间内的制备产物的量的量度。由于N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸易于通过相应的L-α-氨基酸制备，本发明还提供了由相应的L-α-氨基酸快速、高产率制备D-α-氨基酸的方法。L-α-氨基酸价廉且易于获得。另外，根据本发明的方法特别适用于当通过化学转变为相应的乙内酰脲时，仅产生较少稳定乙内酰脲(结果在这些L-α-氨基酸化学转化成相应的乙内酰脲时形成了大量的副产物)的L-α-氨基酸来制备D-α-氨基酸。所述的α-氨基酸的实例为丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。
术语氨基甲酰基化酶是现有技术中已知的。本领域技术人员知道氨基甲酰基化酶是具有氨基甲酰基化酶活性的酶，即它能够催化由N-氨基甲酰基-α-氨基酸转化为相应的α-氨基酸的反应。本领域技术人员知道D-氨基甲酰基化酶是一种优选催化N-氨基甲酰基-D-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸的酶。根据本发明的D-α-氨基酸的制备方法中的D-氨基甲酰基化酶优选具有至少90％，更特别优选为至少95％，甚至更特别优选为至少98％以及最特别优选为至少99％的选择性。在本发明的描述中，D-氨基甲酰基化酶9 0％选择性是指，在D-氨基甲酰基化酶的催化下，将N-氨基甲酰基-(D，L)-α-氨基酸转变为90％的D-α-氨基酸和10％的L-α-氨基酸，总转化率为50％，其相应于在转化率为50％时80％的D-α-氨基酸对映异构体超出量(e.e.)。
术语乙内酰脲酶是现有技术中已知的。本领域技术人员知道乙内酰脲酶是具有乙内酰脲酶活性即能催化5-取代的乙内酰脲产生相应的N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶。根据本发明的方法所需要的乙内酰脲酶活性由一种或多种乙内酰脲酶提供。乙内酰脲酶的对映异构选择性在N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸中不起特别关键的作用。例如，可以使用D-乙内酰脲酶、L-乙内酰脲酶或非对映异构选择性乙内酰脲酶或应用其组合。本领域技术人员知道，D-乙内酰脲酶是优选催化5-取代的D-乙内酰脲可逆水解为相应的N-氨基甲酰基-D-α-氨基酸的乙内酰脲酶。令人惊奇的是，D-乙内酰脲酶可用于本发明的方法中，因为通常认为D-乙内酰脲酶具有严格的D-选择性(Drauz，K，Waldmann，H，Enzyme catalysis in organicsynthesis-a comprehensive handbook，second，completelyrevised and enlarged edition，volume III，WILEY-VCH VERLAGGmbH，Weinheim 2002)，因此，本领域技术人员不会想到用D-乙内酰脲酶来转化N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸。
优选地，在乙内酰脲消旋酶的存在下实施根据本发明的将N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸。在现有技术文献中(例如WO 01/23582 A1)，乙内酰脲消旋酶是已知的。本领域技术人员知道，乙内酰脲消旋酶是具有乙内酰脲消旋活性即能催化L-5-取代的-乙内酰脲(或D-5-取代的乙内酰脲)进行消旋反应的酶。
在根据本发明的方法中，当然也可以应用N-氨基甲酰基-α-氨基酸对映异构体的任意混合物来制备相应的D-α-氨基酸。
依据本发明，温度和pH值在N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸的方法中不是关键因素。但是，优选地，实施转化的pH为5～10。特别地，实施转化的pH为6.0～7.5。N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸的转化中优选的温度为0～80℃之间，特别为10～50℃，更特别为35～45℃。在根据本发明的方法中优选的反应条件为能使对映异构体富集的D-α-氨基酸结晶出来，以便于回收对映异构体富集的D-α-氨基酸。
优选地，将N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸的方法用于由相应的L-α-氨基酸制备D-α-氨基酸。按照与上述相同的方法进行使用，另外还需加上一个额外步骤，即由相应的L-α-氨基酸制备N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸。由相应的α-氨基酸制备N-氨基甲酰基-α-氨基酸可通过例如将α-氨基酸与例如，MOCN，其中M代表碱金属，优选钾或钠，在水中相接触而产生化学影响。所使用的温度并不是关键因素：反应优选在温度为大约-5～100℃下进行，更优选在0～80℃下进行；该化学反应的优选pH为8～11，更优选为9～10。
优选地，在一个单独的容器中进行由相应的L-α-氨基酸经由相应的N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸制备D-α-氨基酸。该方法的优点是不需要N-氨基甲酰基-α-氨基酸的中间回收步骤。
本发明不受任何用于本发明的酶的形式的限制。不同的酶可彼此独立地以特定形式存在。所述酶可例如以未纯化的酶溶液或提纯的酶而存在。所述酶还可例如以(透化和/或固定化)存在于自然或通过遗传修饰获得所需酶/酶活性的细胞中，或存在于具有所述活性的细胞裂解液中。所述酶还可例如以固定化形式或化学修饰形式使用。对本领域普通技术人员而言很清楚的是，在本发明方法中还可以应用具有乙内酰脲酶和/或对映选择性氨基甲酰基化酶和/或乙内酰脲消旋酶活性的自然产生(野生型)的酶的突变型。野生型酶的突变可例如通过本领域技术人员已知的诱发突变技术(随机诱变、定向诱变、定向进化、基因转位等)来修饰编码野生型酶的DNA，从而使所述DNA编码的酶至少在一个氨基酸上不同于野生型酶，以及通过影响所述修饰的DNA在适用(宿主)细胞内的表达来实施。
适用于根据本发明的方法的乙内酰脲酶和/或D-氨基甲酰基化酶和/或乙内酰脲消旋酶可以以原形存在，如通常也用于在乙内酰脲酶-氨基甲酰基化酶反应中提供酶的微生物，所述微生物例如为以下种类：假单胞菌属，优选为假单胞菌，更特别为假单胞菌FERM BP 1900、汉森酵母属、土壤杆菌属，优选为土壤杆菌或放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，更特别为土壤杆菌IP I-671或放射形土壤杆菌NRRLB 11291、产气杆菌属，优选为阴沟产气杆菌，更特别为阴沟产气杆菌IAM 1221、气单孢菌属，优选为Bacillusmacroides杆菌，更特别为Bacillus macroides杆菌ATCC 12905、短杆菌属、黄质菌属、沙雷氏菌属、微球菌属、节杆菌属，优选为黑蓝节杆菌(Arthrobacter aurescens)，更特别为黑蓝节杆菌DSM3747、诺卡菌属、棒状杆菌属、分支杆菌属、游动放线菌属、链霉菌或副球菌属。乙内酰脲酶和/或D-氨基甲酰基化酶和/或乙内酰脲消旋酶的最佳选择随具体的底物/所需D-α-氨基酸可有所变化并且本领域技术人员可以很容易地确定。最优选地，用于根据本发明的将N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转变为相应的D-α-氨基酸中的一种或多种酶来自放射形土壤杆菌或黑蓝节杆菌。
本发明可用于结构式为R-CH(NH2)-COOH的α-氨基酸的蛋白源性和非蛋白源性D-对映异构体的制备，所述结构式中R代表一个氨基酸残基，例如具有例如1～20个碳原子的被取代的或未被取代的烷基或具有1～20个碳原子的被取代的或未被取代的(杂)芳基。具有结构式R-CH(NH2)-COOH的氨基酸的实例包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天门冬酰胺、谷酰胺、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、瓜氨酸、苯基丙氨酸、3-氟苯丙氨酸。优选地，本发明用于制备蛋氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和苯基丙氨酸的D-对映异构体。
图1中描述了假定在乙内酰脲酶和D-氨基甲酰基化酶存在下，由N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸/L-α-氨基酸在一锅反应中制备D-α-氨基酸的反应路线。图1显示了L-α-氨基酸转变为D-α-氨基酸；化合物1、2、3代表L-构型的化合物，化合物4、5、6代表具有D-构型的化合物。R代表上文中所定义的氨基酸残基。
反应1至2显示了由相应的L-α-氨基酸到N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸的转化。反应2到6显示了由N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸的可能途径。根据图1，N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸(2)在乙内酰脲酶和D-氨基甲酰基化酶的作用下转化为相应的L-5-取代的乙内酰脲(3)。L-5-取代的乙内酰脲随即进行原位外消旋化。L-5-取代的乙内酰脲的外消旋化可以自发进行，但也可例如通过加热或通过乙内酰脲消旋酶作用而实现。在形成的5-取代的乙内酰脲(4)的对映异构体的混合物中存在的D-5-取代的乙内酰脲，随后被转变为相应的N-氨基甲酰基-D-α-氨基酸(5)，随后N-氨基甲酰基-D-α-氨基酸在乙内酰脲酶和D-氨基甲酰基化酶的存在下转变为相应的D-α-氨基酸(6)。
参照下述实施例进一步描述本发明，但本发明并不受下述实施例的限制。
实施例
实施例I
在100ml水中加入17.4g(0.10mol)N-氨基甲酰基-L-亮氨酸，随后用10N NaOH将pH值调至7.2。加水调整总体积至150ml。随后将该混合物加热至40℃。然后，在氮气环境下，加入18g放射形土壤杆菌细胞悬液启动酶反应。通过3mol/L的H3PO4滴定维持反应混合物的pH值恒定为7.2。用HPLC分析法来监测反应混合物的组成。反应43小时后，检测D-亮氨酸浓度为67g/L，基于N-氨基甲酰基-L-亮氨酸计，该浓度相应于转化率＞95％。生成的D-亮氨酸的对映异构体的过量为＞98％。
实施例II
将17.9g(0.093mol)N-氨基甲酰基-D，L-蛋氨酸加入115ml水中制成匀浆，转至一个双层玻璃反应器中。将该混合物加热至40℃，用10N NaOH将pH值调至7.2，此后。将混合物的总体积补加至170ml。然后加入12g放射形土壤杆菌细胞悬液，随后通过3mol/L的H3PO4滴定维持反应混合物的pH值恒定为7.2。该反应在氮气环境下进行，用HPLC分析法来监测反应混合物的组成。反应约29小时后，基于N-氨基甲酰基-D，L-蛋氨酸计，转化率＞88％。生成的D-蛋氨酸的对映异构体的过量为＞96％。
实施例III
在100ml水中加入24.0g(0.12mol)N-氨基甲酰基-L-亮氨酸，随后用10N NaOH将pH值调至7.2。加水调整总体积至170ml，随后将该混合物加热至40℃。然后在氮气环境下，加入14.2g放射形土壤杆菌细胞悬液启动酶反应。通过3mol/L的H3PO4滴定维持反应混合物的pH值恒定为7.2。用HPLC分析法来监测反应混合物的组成。反应44小时后终止反应。本实验的结果如图2所示，转化率(c，单位为％)是时间(小时，t(h))的函数。图2显示了反应超过40小时时，基于N-氨基甲酰基-L-蛋氨酸(S)计转化率达到约65％，生成的D-蛋氨酸(P)的对映异构体的过量为＞97.8％。
实施例IV
在300ml水中加入66.0g(0.50mol)L-亮氨酸和44.0g(0.525mol)KOCN。将混合物在室温、氮气环境下搅拌过夜。通过HPLC确定转化率＞99％。该溶液的体积为350ml。冷却反应混合物后，用浓的磷酸将70ml混合物的pH值调至7.2，随后在氮气环境下，加热至40℃。将反应混合物的体积补加至150ml。然后加入19g放射形土壤杆菌细胞悬液，通过3mol/L的H3PO4滴定维持反应混合物的pH值恒定为7.2。
用HPLC分析法来监测反应混合物的组成。反应42小时后，检测D-亮氨酸浓度为67g/L，基于N-氨基甲酰基-L-亮氨酸计，该浓度相应于转化率＞95％。生成的D-亮氨酸的对映异构体的过量为＞98％。
实施例V：N-氨基甲酰基-L-半胱氨酸和N-氨基甲酰基-L-苏氨酸的转化
在100ml水中加入N-氨基甲酰基-L-氨基酸(18.4g(80mmol)N-氨基甲酰基-L-半胱氨酸或17.8g(110mmol)N-氨基甲酰基-L-苏氨酸)。用5mol/L的NaOH将混合物的pH值调至7.2。加水调整总体积至150ml。将混合物转移至一恒温反应器中，调整温度为40℃。加入22g放射形土壤杆菌细胞悬液启动酶反应。通过3mol/L的H3PO4滴定维持反应混合物的pH值恒定为7.2。定时取样并进行HPLC分析。所有情况下均显示了生成D-氨基酸的对映异构体的过量为＞98％。
实施例VI：N-氨基甲酰基-L-苯基丙氨酸的转化
黑蓝节杆菌DSM 3747来源的L-乙内酰脲酶在大肠杆菌中的克隆
一般步骤
标准分子克隆技术如质粒DNA的提取、凝胶电泳、核酸的限制性酶修饰、大肠杆菌转染等均遵照《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning：a laboratory manual)(Sambrook等，1989，Cold springHarbor Laboratory，Cold spring Harbor，NY)或厂家提供的操作手册中所述的流程。人工合成的寡链脱氧核苷酸来自InvitrogenLifeTechnologies公司(Paisley，Scotland，UK)。
实施例VI A.质粒pET101/D-TOPOhyuH的构建
黑蓝节杆菌DSM 3747基因组DNA的提取
应用Invitrogen公司的pET101 TOPO定向表达试剂盒，用黑蓝节杆菌DSM 3747菌株提取乙内酰脲酶基因hyuH。
黑蓝节杆菌基因组DNA的提取流程如下。
将黑蓝节杆菌DSM 3747在28℃下于K2培养基中培养(K2培养基配制方法为将4g bacto蛋白胨，4g酵母提取液，7.5g甘氨酸，2g磷酸二氢钾，3.62g磷酸氢二钾，加水至1升，并调整pH值为7.0)。将10ml预培养物加入75ml K2培养基中，在28℃下孵育。孵育3小时后，加入75μl溶菌酶(100mg/ml)和1.5ml羧苄青霉素(50mg/ml)并在28℃下继续孵育1小时。离心收获细胞，然后重新悬浮于2.5ml由125μl 1M的Tris HCl，pH 8，250μl 0.5M的EDTA，pH8和2.125ml Milli-Q组成的溶液中。然后加入50μl溶菌酶(100mg/ml)和20μl蛋白酶K(20mg/ml)。在37℃孵育该混悬液30分钟，然后加入3ml核裂解液(来自Promega公司，莱顿，荷兰)，在80℃继续孵育15分钟。然后向溶液中加入5μl RNA酶A(100mg/ml，Promega)，在37℃继续孵育30分钟。加入1ml蛋白沉淀液(Promega)，振荡该溶液20秒，置冰上15分钟。在4℃ 4500rpm离心10分钟，将上清液转移至0.1体积的醋酸钠(3M，pH 5)和2体积的无水乙醇中。将DNA沉淀取出，重新溶解于1×TE中。通过分光光度分析和琼脂糖凝胶电泳确定纯度和浓度。基因组DNA用于PCR实验。
质粒pET101/D-TOPOhvuH的构建
应用来自黑蓝节杆菌DSM 3747的染色体DNA通过PCR扩增乙内酰脲酶基因HyuH的含有开放阅读框架(ORF)的1377bp的片段(4651-6027的核苷酸序列，目录名为AF146701)。所用的引物如下：
hyuH上游引物：
5’- CACCATGTTTGACGTAATAGTTAAGAACTGCCGTATGG-3’[SEQ.ID：No.1]，
(用于定向克隆入pET101/D-TOPO载体的突出端用下划线标出)
hyuH下游引物：
5′-TCACTTCGACGCCTCGTAGTGGTGACG-3′[SEQ.ID：No.2]
为了更好的在大肠杆菌中表达，将启始密码子由GTG变为ATG。应用白金Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)扩增ORF。
通过琼脂糖凝胶电泳确定扩增片段(1381bp)的正确大小。共进行4次独立的PCR反应，集中这些反应的产物，根据Invitrogen操作说明进行定向TOPO克隆。
随机选择几个转化子抽提质粒，并用限制性酶HindIII消化，5个质粒显示出正确的限制性图形，将它们称为pET101/D-TOPOHyuH，并用于进一步的实验。
VI B.黑蓝节杆菌源性乙内酰脲酶基因hyuH的表达
根据Invitrogen操作说明，将5个pET101/D-TOPOHyuH质粒转染入转化的大肠杆菌BL21 STAR(DE3)One Shot细胞(Invitrogen)。将转化株置于含有100mg/ml羧苄青霉素的LB培养基中于28℃培养，并按照Invitrogen操作说明用0.5mM IPTG(终浓度)诱发。孵育过夜后，离心收获细胞，并用0.2M Tris-HCl(pH 7)清洗。
通过在含有1mM MnCl2的0.2M TRIS-HCl(pH 7)缓冲液(1g湿重的细胞10ml缓冲液)中超声制备粗提物。将该样品在4℃20,000rpm下离心15分钟，将上清液(不含细胞的提取物)置于-20℃保存，用于活性测定。
VI C.黑蓝节杆菌源性乙内酰脲酶HyuH分析
对于苯丙氨酸乙内酰脲和色氨酸乙内酰脲的活性检测
准备10ml测试混合物：含有0.1M  Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)和a)4mM苯丙氨酸乙内酰脲，或b)1.8mM色氨酸乙内酰脲。
测试在37℃进行，加入0.75ml无细胞的提取物启动反应。定时取出0.5ml样品，加入5μl 85％的磷酸终止这部分样品的反应。应用HPLC和220nm波长UV检测进行分析。使用NUCLEOSIL-120-5 C18柱(50×4mm，5μ，来自Macherey-Nagel，Düren，德国)。用洗脱液A(50mM H3PO4 pH 2.7)和洗脱液B(由50v/v％洗脱液A和50v/v％乙腈组成)进行洗脱。梯度：0～1.5min，0％B；1.5～6.5min，0％～50％B；6.5～7.0min，50％B；7.0～7.1min，50％～0％B；7.1～12min，0％B。流速为1.0ml/分钟，柱温度设定为40℃，加样量为2μl。
所检测的所有5个大肠杆菌/pET101/D-TOPOhyuH克隆的无细胞提取物均在1小时内生成N-氨基甲酰基苯丙氨酸或N-氨基甲酰基色氨酸。
使用放射形土壤杆菌和来自大肠杆菌/pET101/D-TOPOhyuH L-乙 内酰脲酶克隆的无细胞的提取物制备D-苯丙氨酸
用5mol/L NaOH将45ml含有1.8g(8.6mmol)N-氨基甲酰基-L-苯丙氨酸的溶液pH值调整至7.2。反应恒温于40℃。加入2ml放射形土壤杆菌细胞悬液和2ml来自大肠杆菌/pET101/D-TOPOhyuH L-乙内酰脲酶克隆的无细胞提取物(含有来自黑蓝节杆菌DSM 3747的L-乙内酰脲酶)启动酶反应。维持反应体系的pH值为7.2。应用HPLC定期取样分析以监测D-氨基酸的转化率和光学纯度。结果显示，40℃孵育4小时后，46％的N-氨基甲酰基-L-苯丙氨酸转化为D-苯丙氨酸。生成的D-苯丙氨酸的对映异构体的过量为＞98％。
                               序列表
<110>DSM N.V.
<120>对映异构体富集的α-氨基酸的制备方法
<130>WO 20383
<160>2
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>38
<212>DNA
<213>人造的
<400>1
caccatgttt gacgtaatag ttaagaactg ccgtatgg    38
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人造的
<400>2
tcacttcgac gcctcgtagt ggtgacg                27

Claims (13)

1.一种在乙内酰脲酶和D-氨基甲酰基化酶的存在下，在一锅反应中制备对映异构体富集的D-α-氨基酸的方法，其特征在于将N-氨基甲酰基-L-α-氨基酸转化为相应的D-α-氨基酸。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于在D-乙内酰脲酶存在下实施所述方法。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于在D-乙内酰脲酶和L-乙内酰脲酶存在下实施所述方法。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其特征在于将N-氨基甲酰基氨基酸的对映异构体混合物转化为相应的D-α-氨基酸。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其特征在于由相应的α-氨基酸制备N-氨基甲酰基-α-氨基酸。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于在单个容器中实施由相应的L-α-氨基酸到D-α-氨基酸的制备。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其特征在于D-氨基甲酰基化酶的选择性为至少99％。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其特征在于在乙内酰脲消旋酶存在下实施所述转化。
9.根据权利要求1-8任一项方法，其特征在于在pH值为6.0～7.5下实施所述转化。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其特征在于在温度为35～45℃下实施所述转化。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其特征在于选择能使生成的对映异构体富集的D-α-氨基酸结晶出来的反应条件。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其特征在于所述转化使用一种或多种源自放射形土壤杆菌或黑蓝节杆菌的酶。
13.根据权利要求1-12任一项的方法，其特征在于所述D-α-氨基酸为D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-半胱氨酸、D-苏氨酸和D-苯丙氨酸。
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