CN1585898A - 分离装置,分离方法和生产分离装置的方法 - Google Patents

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马场雅和
川浦久雄
佐野亨
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染谷浩子
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Abstract

本发明提供了在短时间内利用少量样品以优异分辨率分离样品的分离技术，所述技术很少引起诸如阻塞的问题。多个疏水区705以大约等间距排列在样品通过的槽路中，而且亲水基材701的表面暴露在除疏水区705以外的区域。

Description

分离装置，分离方法和生产分离装置的方法
技术领域
本发明涉及用于分离在大小，极性，水亲合性等方面不同的样品的装置和方法。
技术背景
为了分析核酸或者蛋白，通常预先对样品进行分离和纯化，或者根据它们的大小和所带电荷进行分离。例如，广泛用作碱基测序方法的Maxam-Gilbert法中，DNA末端用32P标记并进行化学分解以获得不同长度的片段。随后，片段通过电泳的方法进行分离，并通过放射性自显影对碱基序列解码。这种分离操作是决定分析时间长短的重要因素，并且一直是本领域减少分离操作完成所需时间的关键技术问题。为了解决该问题，需要开发在短时间内能够精确分离目的物质的分离装置。
通常，毛细管电泳装置被广泛用作这样的分离装置。但是，使用毛细管电泳装置需要花费很长时间进行测定，而且也需要大量样品。此外，常常不能获得令人满意的分离效果。
本发明要解决的问题
因此本发明的目的就是提供用少量样品在短时间内精确分离所需要物质的装置和方法。
本发明的公开
本发明提供了一种分离装置，包括：基材；在基材表面形成的用于样品流动的槽路，其具有进样部分，样品排出部分，以及在进样部分和样品排出部分之间的一种或者多种样品分离部分；其中样品分离部分的表面包括多个以大约等间距两维排列的第一个区域和占据了除第一个区域以外样品分离部分表面的第二个区域，一个为疏水性而另一个为亲水性。
顺便提及，“以大约等间距两维排列”是指第一个区域以有序的方式以大约相等的间距垂直和水平排列的状态。
分离装置可以进一步包括通过外力将样品从进样部分移动到样品排出部分的外力施加装置。电场，表面张力，压力等可被用作外力，外力施加装置的例子包括电压施加部分，泵等等。在利用表面张力作为外力的情况中，不需要任何特定的外力施加装置。
本发明的分离装置可以包括两种构型：
(i)第一个区域为疏水区，而第二个区域为亲水区；或者
(ii)第一个区域为亲水区，而第二个区域为疏水区。顺便提及，根据本发明，和疏水区相比亲水区有更高的亲水性。亲水性的水平通过测定水接触角进行计算。
下面，本发明分离装置的原理通过例如上述情形(i)进行描述。在这种情况下，分离靶样品溶于或者分散在相对较高亲水的溶剂中，并在装置中进行。这些溶剂避开了疏水区(第一个区域)的表面，只分配在亲水区(第二个区域)。结果，各自疏水区域之间的间隙或间距形成了靶样品的通道，因此样品通过样品分离部分所需的时间根据样品间距和样品大小之间的关系进行确定。因此，样品的分离根据大小进行。
此外，根据本发明，也根据样品的极性进行分离。也就是说，可以分离多种在亲水/疏水水平不同的样品。在上述情形(i)中，高度疏水样品在疏水区容易被捕捉到，而排出样品的时间相对延长。另一方面，高度亲水样品在疏水区不容易被捕捉到，排出样品的时间相对缩短。
如上所述，根据本发明，不仅可以根据样品的大小还可以根据其极性进行分离，因此能够分离从前很难分离的多组分样品。
本发明分离装置提供了样品分离部分，其在槽路表面形成作为分离装置，和通过障碍物结构进行分离的系统不同。虽然，表面上微孔的大小必须准确控制用于表面的分离，但是很难稳定生产具有需要大小和需要形式微孔的表面。但是，根据本发明，样品分离部分可以通过对槽路进行表面处理产生，需要的分离效果可以通过调整各自第一个区域之间的间距获得。因此，没有多少困难就可以实现用于任何目的的合适装置结构。例如，本发明分离装置中的样品分离部分可以通过将含有疏水基团的化合物沉积在掩膜开口形成各自疏水区域间的间隔通过调整掩膜开口的宽度而得以容易地控制。也就是说，疏水区之间间距的正确调节依赖于分离目的从而产生适合目的样品分离部分。尤其是，为了分离蛋白或者DNA，需要分离从巨大物质到纳米级物质的所有大小物质。通过传统技术在短时间内很难高分辨率分离这样纳米级的物质。另一方面，通过本发明的分离装置，通过将各自第一个区域之间的间距变小就可以分离较小物质。第一个区域之间的间距通过利用微制造技术获得，并且可以真正实现级米级大小物质的分离。
另外，利用本发明的分离装置，可以利用少量样品在短时间内进行分离。也就是说，根据本发明，分离基于样品分离部分的表面特征进行，并可以进行精确分离。另外，样品损失很小，因此利用少量样品就可以获得良好的分离效果。
除此以外，根据本发明，因为分离是基于样品通过槽路的表面特征进行的，所以分离装置很少有阻塞问题。另外，分离装置通过用清洗液冲洗样品分离部分的表面而很容易进行清洗。
本发明的另一方面，提供了将样品从其进样部分加入到上述分离装置并从样品中分离上述成分的样品分离方法。
根据本发明的样品分离方法，在解决诸如阻塞的问题的同时可以实现高度精确的样品分离。
本发明的另一方面，提供了制造样品分离装置的方法，所述样品分离装置含有具有亲水表面的基材，在基材表面形成用于样品流动的槽路，以及为槽路提供的样品分离部分，所述方法包括如下步骤：
在基材表面刻凹槽形成槽路；和
在至少部分槽路表面形成具有开口的掩膜后，从开口处将含有疏水基团的化合物沉积在槽路的表面，并将掩膜移走从而形成每个都包括以大约等间距两维排列的多个疏水区的各自样品分离部分。
本发明的另一方面，提供了制造样品分离装置的方法，所述样品分离装置含有具有疏水表面的基材，在基材表面形成的用于样品流动的槽路，以及为槽路提供的样品分离部分，所述方法包括如下步骤：
在基材表面刻凹槽形成槽路；和
在至少部分槽路表面形成具有开口的掩膜后，从开口处将含有亲水基团的化合物沉积在槽路的表面，并将掩膜移走从而形成每个都包括以大约等间距两维排列的多个疏水区的各自样品分离部分。
例如，硅烷偶合试剂可以用作含有疏水/亲水基团的化合物。
利用本发明的生产方法，可能以优良收率产生具有高准确性的疏水区和亲水区混合的分离模式。
附图说明
图1是显示本发明分离装置例子的图；
图2是显示图1描述的分离槽路详细构造的图；
图3是显示图1描述的分离槽路详细构造的两个图；
图4是解释分离样品方法的图；
图5是解释分离样品方法的图；
图6是说明施加校正电压调整电渗流方法的图；
图7是示意性图示本发明分离装置构造的平面图；
图8是解释本发明分离装置制造方法的一系列截面图；
图9是解释本发明分离装置制造方法的一系列截面图；
图10是解释本发明分离装置制造方法的一系列截面图；
图11是解释本发明分离装置制造方法的两个截面图；
图12是解释本发明分离装置制造方法的两个截面图；
图13是示意性图示本发明分离装置构造的平面图；
图14是解释本发明分离装置制造方法的两个图；
图15是示意性图示本发明分离装置制造构造的截面图；
图16是显示在疏水板上所形成泡的显微示图；
图17是显示和泡碰撞的珠子的显微示图。
顺便提及，标号101a和101b代表储液池。标号102a和102b代表储液池。标号103a和103b代表储液池。标号110代表基材。标号111代表进样槽路。标号112代表分离槽路。标号113代表检测器。标号114代表收集槽路。标号701代表基材。标号702代表防电子束辐射保护层。标号702a代表未显露部分。标号702b代表显露部分。标号703代表亲水区。标号705代表疏水区。标号706代表样品分离部分。标号710代表硬掩膜。标号711代表抗蚀剂掩膜。标号720代表疏水表面处理层。标号721代表保护层。标号730代表凹槽部分。标号731代表样品分离区。标号902代表玻璃基材。标号903代表疏水层。标号904代表间距。
实施本发明的最佳方案
根据本发明，样品分离部分可以以如此的方式产生，从而对基材亲水表面部分提供疏水处理，或者对基材疏水表面部分提供亲水处理。或者，样品分离部分可以通过对基材表面进行疏水和亲水处理产生。
具有亲水表面的基材例子包括石英基材和玻璃基材。另一方面，具有疏水表面基材的例子包括诸如有机硅树脂基材和聚乙烯树脂基材的树脂基材。
为了进行疏水/亲水处理，例如，将由被基材材料吸收或者和基材材料化学连接的单元和带有疏水/亲水辅助基团单元的化合物固定到基材表面或者和基材表面偶合。硅烷偶联剂等可被用作这样的化合物。
硅烷偶联剂的例子包括：
乙烯基三氯甲硅烷；
乙烯基三甲氧基硅烷；
乙烯基三乙氧基硅烷；
β-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷；
γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷；
γ-环氧丙氧丙基甲基二乙氧基硅烷；
γ-环氧丙氧丙基三乙氧基硅烷；
γ-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷；
γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；
γ-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷；
γ-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷；
N-β(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷；
N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷；
N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷；
γ-氨丙基三甲氧基硅烷；
γ-氨丙基三乙氧基硅烷；
N-苯基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷；
γ-氯丙基三甲氧基硅烷；
γ-巯基丙基三甲氧基硅烷；
3-异氰酸酯丙基三乙氧基硅烷；
3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；
3-三乙氧甲硅烷基-N-(1，3-二甲基-亚丁基)；和
3-硫羟丙基三乙氧基硅烷。
其中，那些含有氨基的化合物，诸如N-β(氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷，N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷，γ-氨丙基三甲氧基硅烷，γ-氨丙基三乙氧基硅烷，N-苯基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷等是含有亲水基团的优选硅烷偶联剂。
另一方面，那些含有硫羟基的化合物诸如3-硫羟丙基三乙氧基硅烷等是含有疏水基团的优选硅烷偶联剂。
为了施用偶联剂，使用旋转涂布，喷雾，浸渍和汽相的方法等等。在旋转涂布的方法下，结合层的组分溶解或者分散其中的偶联剂或者液体通过旋转涂布器施用。根据本发明的方法，层厚度可以获得良好控制。在喷雾的方法下，偶联剂喷射到基材上，在浸渍的方法下，基材浸渍在偶联剂中。通过这些方法，无需使用特殊设备就可以用简单的方法形成膜层。此外，在蒸汽相的方法下，如果需要加热基材，偶联剂等的蒸汽漂浮在其上。根据该方法，也可形成厚度控制良好的薄层。尤其是，优选使用硅烷偶联剂溶液的旋转涂布，因为可以稳定获得良好附着。在这种情况下，硅烷偶联剂溶液的优选浓度从0.01到5v/v％，更优选从0.05到1v/v％。作为硅烷偶联剂溶液的溶剂，纯化水，诸如甲醇，乙醇，异丙醇的醇，和诸如乙酸乙酯的酯可以单独使用或者混合使用。其中，用纯化水稀释的甲醇，乙醇或者乙酸乙酯被优选使用，因为附着有显著提高。将偶联剂施用到基材上以后，进行干燥。虽然对于干燥温度没有特殊限制，但通常在从室温(25℃)到170℃的温度范围内进行干燥。干燥时间虽然依赖于干燥温度，但通常从0.5到24小时。干燥可以在空气或者在诸如氮气的惰性气体中进行。例如，偶联剂可以通过将氮气吹向基材进行干燥。
根据本发明，第一个区域的形状没有特殊限制，可以是圆形，椭圆形，正方形，三角形等形状。第一个区域可以通过疏水表面处理达到指定高度的凸度。此外，第一个区域的大小没有特殊的限制，大小根据所需目的和分离装置的使用进行确定。
本发明的分离装置可被用于分离/纯化在大小，极性等方面不同的液体样品。尤其是，分离装置适合分离生物材料。例如，利用人或者其它动物的唾液作为样品，分离装置适合用于分离/浓缩如下组分：
(i)分离/浓缩细胞和其它组分；
(ii)分离/浓缩匀浆细胞获得的组分中的固体材料(细胞膜片段，线粒体，内质网)和液体部分(细胞质)；
(iii)分离/浓缩液体部分的组分中高分子量组分(DNA，RNA，蛋白，糖链)和低分子量组分(甾类，葡萄糖等)；
(iv)分离聚合物裂解物。
本发明的分离装置能够分离微观物质，并适合分离/纯化各种大小的核酸片段，氨基酸，肽，蛋白等有机分子，金属离子等。
根据本发明，各自第一个区域之间的间距根据分离目的进行确定。例如，在如下方法中：
(i)分离/浓缩细胞和其它组分；
(ii)分离/浓缩匀浆细胞获得的组分中的固体材料(细胞膜片段，线粒体，内质网)和液体部分(细胞质)；以及
(iii)分离/浓缩液体部分组分中的高分子量组分(DNA，RNA，蛋白，糖链)和低分子量组分(甾类，葡萄糖等)；
间距分别设定到：
(i)1μm到10μm；
(ii)100nm到1μm；以及
(iii)1nm到100nm。
本发明的分离装置当在其样品分离部分下游提供了检测部分时就作为分析装置。此外，分离装置可以构造成指定组分从样品排出部分取出。
如上所述，各自第一个区域之间的间距根据分离目的进行确定。间距可被设定到，例如小于100nm。因为疏水区可以通过基于诸如电子束辐射的蚀刻技术的沉积方法产生，可以获得低于100nm，进一步低于50nm的间距。因此，可以分离从前很难分离的组分。
本发明的分离装置可以包括多个样品分离部分和穿过样品分离部分用于样品通过的通道。根据这种构造，样品的分离根据除了一般分子筛以外的原理进行。虽然本发明的分离装置能够根据样品大小，亲水/疏水，和对水的亲合性以及极性进行分离，但根据大小的分离特别解释如下。
通过一般分子筛，大分子物质更容易被阻止通过分子筛。因此，分离方式就是较大物质在较小物质已被洗脱后才被洗脱。另一方面，根据本发明，较小样品在样品分离部分移动较长的距离，因此分离方式就是较小物质在较大物质已被洗脱后才被洗脱。换言之，较大物质通过分离区域相对容易。结果，分离操作的通量显著提高。尤其是，在分离核酸，蛋白等情况下，分子的回转半径表现出较大范围的变化，大分子物质有可能降低分离效率。本发明解决了该问题，并适合用于进行分离核酸，蛋白等。
顺便提及，通过样品分离部分的通道的宽度较样品分离部分各自疏水区域之间的平均间距宽。根据这种构造，大分子物质更顺利地通过样品分离部分的通道，根据其大小，小分子物质在移动了一定长度的距离后通过样品分离区。因此，较大物质在较小分子物质洗脱后洗脱的分离也顺利地进行。
此外，每个样品分离部分中各自第一个区域之间的间距可以根据每个样品分离部分被设定到任一间距。因此，根据本发明，可以任意设定两种类型的参数，即，每个样品分离部分中各自第一个区域之间的间距和通过样品分离部分的通道宽度，从而使得各种大小的样品以高分辨率分离，而不发生阻塞和通量损失的现象。例如，为了高分离率分离小分子，可以通过将第一个区域之间的间距减少到几个纳米到几十个纳米的范围，同时将通过样品分离部分的通道增宽使得较大分子顺利通过从而阻止阻塞和分离效率的损失。
包括在样品分离部分中的第一个区域可以大体上大小相同并间距相等。通过这种方式，分离的敏感性可被提高。当样品分离部分包括多个第一个区域时，其分辨率提高。
样品分离部分可以含有不同大小的第一个区域。即，第一个区域可以以不同大小和不同间距排列形成。通过这种方式，可以高分辨率分离多种大小的样品，而不出现阻塞和通量的损失。
本发明的分离装置进一步含有通过外力用于在槽路中移动样品的外力施加装置。根据这种构造，通过控制施加外力的水平，可以准确设定用于任何目的的分离精度和分离所用时间。作为外力，优选使用压力或者电场，因为这些力不需要任何特殊的外力施加装置。此外，样品可以通过毛细现象进行移动。在这种情况下，不需要外力施加装置，从而使得装置微型化。
例如，本发明的分离装置用于如下样品分离：
(i)分离/浓缩细胞和其它组分；
(ii)分离/浓缩匀浆细胞获得的组分中的固体材料(细胞膜片段，线粒体，内质网)和液体部分(细胞质)；
(iii)分离/浓缩液体部分组分中的高分子量组分(DNA，RNA，蛋白，糖链)和低分子量组分(甾类，葡萄糖等)；以及
(iv)分离聚合物裂解物。
微观样品的例子包括核酸或者核酸片段，氨基酸，肽，蛋白等有机分子，金属离子等等。尤其是，当利用核酸或蛋白作为样品时分离装置有效。为了分离这些样品，必需以高分辨率分离小分子，因此分离装置必须提供从几纳米到几十纳米量级的微小间距。同时，需要有效阻止由大物质引起的阻塞。本发明的分离装置能够满足这两个需要，并适合分离核酸或者蛋白。
在上述分离装置中，在槽路表面上形成的样品分离部分可以通过缝隙分成多个部分。根据这个构造，检测部分的条带呈线性，检测区域可以增宽从而提高检测灵敏度。
顺便提及，本发明的分离装置恰好需要包括样品分离部分，但是不必须包括进样部分和外力施加装置。例如，本发明的分离装置可以是一次性筒芯类型，并包含在应用时的指定单位中。
现在参考附图，详细描述本发明优选的实施方案。
图1是显示本发明分离装置例子的图。在图1中，分离槽路112在基材110上形成。样品注射槽路111和收集槽路114的形成是为了穿过分离槽路112。储液池101(a，b)，102(a，b)和103(a，b)分别在样品注射槽路111，分离槽路112和收集槽路114的两端形成。分离槽路112被提供了检测器113。虽然根据分离装置外尺寸的应用选择合适的值，但是该值通常设定到从5mm到5cm×3mm到3cm。样品分离部分在分离槽路112的部分形成。样品分离部分的位置根据分离效率等的考虑进行适当设定。例如，当在样品注射槽路111下游的样品注射槽路111和分离槽路112交叉点附近点形成样品分离部分时，样品的分离有效进行。
下面，将描述用分离装置进行样品分离的方法。在本发明实施方案中，用于分离的样品溶解或者分散在纯水，纯水和亲水溶剂的混合物，或者诸如待用缓冲液的载体溶剂中。优选载体溶剂的例子包括水和异丙醇，三甲基铵，包含硼酸和乙二胺四乙酸(EDTA)的水溶液和含水磷酸钠溶液的混合物。
在准备分离时，分离装置中的每个槽路填满载体溶剂。随后，样品填充到储液池102a或者102b中。当将样品进料到储液池102a时，施加电压使得样品流向储液池102b。一方面，当将样品进料到储液池102b时，施加电压使得样品流向储液池102a。因此，样品流进样品注射槽路111以填满整个样品注射槽路111。这一点，分离槽路112中的样品只在和样品注射槽路111的交叉点出现，并形成大约样品注射槽路111宽度的条带。
随后，停止施加穿过储液池102a和102b的电压，在储液池101a和101b之间施加电压，使得样品流向储液池101b。因此，样品根据分子大小，电荷强度，以及各自第一个区域之间的间距大小以一定的速度穿过分离槽路112。结果，样品中不同的分子组分离形成以不同速度移动的条带。当分离带到达检测器113时，检测器113通过光学或者物理化学的方法检测到条带。例如通过用检测器113上的激光照射结合了荧光材料的分子，并观察从分子发出的荧光而进行光学检测。分离条带可以根据各个条带收集。在停止施加电压通过储液池101a和101b后施加电压通过储液池103a和103b并与目的条带通过检测器113定时，在分离槽路112和收集槽路114交叉点出现的条带流入收集槽路114。当施加通过储液池103a和103b的电压在设定的时间停止后，可以获得分离条带中的目的分子。
下面，将描述分离装置中分离槽路的构造。图2是显示图1描述的分离槽路112的详细构造的图。在图2中，深度为D的凹槽部分在基材701上形成，每个直径为φ的疏水区705在凹槽部分以相等间距有规则的形成。在这个实施方案中，含有疏水基团的偶联剂固定在基材701的表面或和基材701的表面偶合形成疏水区705。虽然没有在图2中显示，槽路通常提供一个覆盖物，从而防止溶剂蒸发并能够使得槽路中的样品通过压力移动。顺便提及，分离装置可能不包括这种覆盖物。
在图2中，每个部分的尺寸设定如下：
W：10到20μm；
W：50nm到10μm；
φ：10到1000nm；
d：10nm到10μm；和
p：50nm到10μm。
根据分离目的确定尺寸。例如，以如下方式考虑p：
(i)分离/浓缩细胞和其它组分；
(ii)分离/浓缩匀浆细胞获得的组分中的固体材料(细胞膜片段，线粒体，内质网)和液体部分(细胞质)；以及
(iii)分离/浓缩液体部分组分中的高分子量组分(DNA，RNA，蛋白，糖链)和低分子量组分(甾类，葡萄糖等)；
p值分别设定到：
(i)1μm到10μm；
(ii)100nm到1μm；以及
(iii)1nm到100nm。
另外，深度D值是影响分离效果的重要因素，优选设定到分离靶样品回转半径的1到10倍，更优选设定到样品回转半径的1到5倍。
图3是显示图2所述的分离槽路俯视图(图3(a))和侧视图(图3(b))的两个图。每个疏水区域705通常的层厚度为0.1到100nm。在除了疏水区705的部分，基材701表面是暴露的。使用诸如玻璃的亲水材料作为图2显示的基材701，疏水区以设定的图型在其亲水表面形成，从而实施样品分离功能。换言之，当使用上述亲水缓冲液等作为载体溶剂时，样品只通过亲水表面，但是不在疏水区。结果，疏水区705作为样品流通的障碍，从而引发样品分离功能。
下面，将描述依赖疏水区705的图型，根据分子大小的分离方法或者方式。有两种可能的分离方式。其中一种显示在图4中。这种方式中，较大分子是疏水区705导致的较大障碍，并且需要很长时间通过图4显示的分离区域。一方面，小分子通过各自疏水区705之间的间距相对顺利，并且相对于大分子以更短的时间通过分离区。
在图5显示的另一种方式中，和图4的情况相反，大分子快速流过，小分子较慢流过。在图4的方式中，当大物质包含在样品中时，物质有时阻塞疏水区705之间的间距，引起分离效率的损失。图5显示的分离方式解决了该问题。在图5中，多个样品分离部分706在分离槽路112以等间距形成。在各自分离部分706中，相似大小的疏水区705以等间距排列。
因为在样品分离部分706形成的通道足够宽可以使得大分子通过，和图4的情况相反，大分子快速流过，小分子较慢流过。换言之，小分子更可能被捕捉，并在分离区域移动较长距离。另一方面，大分子顺利地通过样品分离部分706中的通道。因此，分离方式就是较小分子在较大分子被洗脱后洗脱。因为较大分子相对顺利地通过分离区域，前面提及由捕捉较大分子引起的阻塞问题就会减少，因此获得分离效率的显著提高。为了产生更好的效果，优选通过样品分离部分706的通道比两个相邻疏水区域705之间的间距宽。通道的宽度优选设定到疏水区域705之间间距的2到200倍，更优选设定到间距的5到100倍。
顺便提及，虽然在图5的情况下，相同大小的疏水区域705在各自样品分离部分以等间距排列，样品分离部分可以含有不同大小以不同间距排列的疏水区705。
当分离分子大小的物质时，通过样品分离部分的通道的宽度以及每个样品分离部分中相邻第一个区域之间的间距根据分离靶组分(核酸，氨基酸，肽，蛋白等有机分子，和螯合金属的分子/离子)的大小进行准确确定。例如，两个相邻第一个区域之间的间距优选设定到和最小分子的回转半径相同或者仅仅稍小/稍大。尤其是，第一个区域之间的间距被设定到最小分子的回转半径和间距的大小间的差别在100nm，优选在50nm，更优选在10nm以内。正确设定各自第一个区域之间的间距可以进一步提高分离效果。
相邻样品分离部分的间距(通道的宽度)优选设定到和最大分子的回转半径相同或者仅仅稍小/稍大。尤其是，相邻样品分离部分的间距被设定到最大分子的回转半径和间距之间的差别在最大分子回转半径的10％，优选在5％，更优选在1％以内。当相邻样品分离部分之间的间距太宽时，小分子的分离有时表现出不令人满意的结果。另一方面，当相邻样品分离部分之间的间距太狭窄时，更可能发生阻塞。
另外，虽然在上述实施方案中疏水区以等间距排列，但是疏水区可以在各自样品分离部分以不同的间距排列。通过这种方式，不同大小的大，中和小分子/离子可以有效分离。此外，在样品流动的方向交替排列疏水区也是有效用的。利用这种构造，可以有效分离靶组分。
在本发明的分离装置中，将电压施加到分离槽路112的两端使得如图6中显示移动样品。在这点上，除了通过外力移动样品的电压以外，还可以施加用于抑制电渗流的电压。在图6的情况下，为此目的施加ζ校正电压于基材上。通过这种方式，电渗流可被抑制，并可以有效阻止测定峰的增宽。
下面，在图13所示的分离装置的制造方法将参考附图进行描述。在图13中显示的分离装置和图1中显示的大体上相似，除了收集槽路的去除。这种分离装置的目的不是分类分离样品，而是用于通过检测器113分析取出的组分。样品分离槽路112提供了一个样品分离区。样品分离区表面的组成为多个以大约等间距两维排列的疏水区和多个占据除疏水区以外的样品分离部分表面的亲水区。
在图13显示分离装置的制造方法中，如图7(a)所示凹槽部分730首先在基材701表面形成，随后如图7(b)所示样品分离区73 1在凹槽730的指定位置形成。然后，在图7(a)的基材701上产生凹槽730的方法将参考图8进行描述。顺便提及，在该实施方案中，玻璃基材用作基材701。
首先，在基材701上顺序形成硬掩膜710和抗蚀剂掩膜711(图8(a))。随后，给抗蚀剂掩膜711提供了指定开口(图8(b))。随后，对具有开口的抗蚀剂掩膜711进行干燥蚀刻，所述开口作为蚀刻掩膜(图8(c))。SF6等可以作为蚀刻气体。然后，通过使用诸如缓冲氢氟酸的蚀刻剂对基材701进行湿蚀刻。通常，蚀刻的深度设定到大约1μm。图8(d)显示了蚀刻完成后的情形。最终，去除硬掩膜710和抗蚀剂掩膜711(图8(e))。以这种方式，产生如图7(a)所示的凹槽730。
在图7(a)凹槽730的生产方法中，可以制造凹槽730的亲水表面，以及基材701疏水表面的其它部分。下面，参考图9描述生产这种构成的方法。首先，如图(9(a))所示，疏水表面处理的层720在图8(e)的基材701整个表面上形成。疏水表面处理的层720组成材料的例子包括3-硫羟丙基三乙氧基硅烷。
然后，基材表面通过旋转涂布方法用保护层721进行涂布并经干燥(图9(b))。随后，相应于凹槽对保护层721提供开口(图9(c))。然后，用具有开口的保护层721进行干燥蚀刻，所述开口作为蚀刻掩膜(图9(d))。随后，通过抛光或者脱模剂处理的方式去除保护层721。以这种方式，获得图9(e)所示的情形。换言之，槽路内壁暴露于由玻璃材料制成的基材701的亲水表面，虽然其它部分由疏水表面处理的层720覆盖。根据这种构造，通过使用亲水溶剂作为载体溶剂阻止样品流出槽路。
下面，将参考图10描述图7(b)所示样品分离区的生产方法。首先，如图10(a)所示在基材701上形成电子束辐射保护层702。随后，电子束辐射保护层702暴露于电子束以形成设定的图型(图10(b))。暴露部分溶解或者去除使得开口以图10(c)所示的设定图型显示。然后，如图10(d)所示进行O2等离子抛光，O2等离子抛光对于亚微米级的造型是必须的，因为其活化了偶联剂连接的表面，从而可以获得适合精细造型的表面。另一方面，当生产较亚微米级大的图型时，很少需要O2等离子抛光。
当完成抛光时，达到图11(a)所示情形。在图11(a)中，亲水区703通过残全抗蚀剂和污染物的沉积形成。从此情形看，产生疏水区705(图11(b))。为了形成组成疏水区705的层，例如可以使用汽相的方法。在这种情况下，基材和包括含有疏水基团偶联剂的溶液放置在气密性容器中设定的时间段形成层。根据该方法，可以准确获得所需图型的处理层，因为溶剂等不附着到基材的表面。此外，旋转涂布的方法也适于形成层。在旋转涂布的方法下，基材表面用含有疏水基团的偶联剂溶液处理形成疏水区705。3-硫羟丙基三乙氧基硅烷可以用作含有疏水基团的偶联剂。另外，浸渍的方法等也可用于形成层。疏水区705不在亲水区703上沉积，而是只沉积在基材701暴露的部分，并且因此，多个疏水区705以一定间距如图3所示形成在基材表面上。
除了上述描述的方法，下述方法可以用来获得如前所述的相同的表面构造。根据该方法，以图10(c)所示图型形成未暴露部分702a后，不进行O2等离子抛光，但是3-硫羟丙基三乙氧基硅烷在每个抗蚀剂开口沉积形成疏水区705。随后，用能够选择性将未暴露部分702去除的溶剂进行湿蚀刻获得图12(b)所示的情形。在这种情况下，选择不损坏形成疏水区705的层的溶剂就非常重要。这种溶剂的例子包括丙酮。
虽然在上述实施方案中疏水区在槽路中形成，下列方法依然适用。在该方法中，使用图14(a)和14(b)显示的两种类型基材。在图14(a)中，玻璃基材901具有包括其上含有诸如3-硫羟丙基三乙氧基硅烷的疏水基团的化合物的疏水层903。疏水层903以设定的图型形成。提供了疏水层903的位置形成样品分离部分。另一方面，在图14(b)中，玻璃基材902在其表面上具有纹状凹槽。凹槽作为样品槽路。通过前面描述的方法形成疏水层903。在玻璃基材902表面的纹状凹槽以上述描述的相同方式利用蚀刻掩膜通过湿蚀刻很容易的生产。如图15所示本发明的样品分离装置可以通过将两种基材结合在一起获得。两种基材之间的间距904作为样品的槽路。根据该方法，疏水层903在平表面上形成，这有助于分离装置的制造从而保证优异的可制造性。
利用如“Nature，vol.403，13 January 2000”中所述LB膜提升法通过在基材所有表面形成硅烷偶联剂的层可以产生亲水/疏水区的微图型。
另外，通过疏水/亲水处理可以形成槽路本身。
在通过疏水处理产生槽路的情况下，使用诸如玻璃基材的亲水基材，而且作为槽路壁的部分制成疏水区。水围绕疏水区流动，从而形成槽路。
槽路可以有覆盖物也可以不含覆盖物。当对槽路提供覆盖物的时候，需要在覆盖物和基材之间留出几个μm的间距。通过使用诸如PDMS(聚二甲基硅氧烷)或者PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)的粘性树脂作为粘合剂将覆盖物的边缘和基材结合形成间距。即使只在接近边缘处覆盖物和基材结合，水避开了疏水区并进料到形成槽路的部分。这样就形成了槽路。
另一方面，当通过亲水处理产生槽路时，使用疏水基材或者通过硅氮烷处理成疏水的基材等。具有亲水区的槽路通过对待被槽路占据的部分进行亲水处理产生。水只进料到亲水区，并且形成槽路。
通过使用诸如冲压和喷墨打印的模压技术进行疏水/亲水处理。
例如，PDMS树脂用于冲压。因为PDMS树脂通过硅油的聚合获得，即使产物在树脂化成为PDMS树脂后，其分子之间的间距用硅油填充。因此，当将PDMS树脂和诸如玻璃表面的亲水表面接触时，接触了PDMS树脂的部分玻璃表面变得极其疏水并排水。基于这种考虑，通过在和有待被槽路占据的部分并排的PDMS区上形成凹度并将该区冲压到亲水基材上，通过疏水处理可以很容易生产出槽路。
这种处理可以通过喷墨打印机等进行。
在使用喷墨式打印机的情况下，使用低粘度硅油作为喷墨式打印机的打印用墨，诸如一张聚乙烯，PET(聚对苯二甲酸乙二酯)或者醋酸纤维素(玻璃纸)的亲水树脂薄层作为打印纸。通过将硅油施用于部分成为槽路壁的方式打印图型，槽路壁制成亲水性。
此外，可以提供一种过滤器，使得比特定大小小的物质通过并利用疏水表面处理板(疏水板)或者亲水表面板(亲水板)将比该大小大的物质捕捉在槽路中。
例如，在用疏水板形成过滤器的情况下，板以规则间距线性排列从而在过滤器上形成虚线图型。相邻板之间的间距设定到比物质大小大的物质通过，较物质大小小的物质被捕捉。为了将大于100μm的物质去除，相邻疏水板之间的间距必须小于100μm，例如设定到50μm。
通过整体形成构成槽路的疏水区图型以及由疏水板制成的虚线图型获得过滤器。制造过滤器方法的例子包括光刻法和SAM成层，冲压和喷墨打印。
顺便提及，在槽路中形成过滤器的情形中，过滤器表面可以和流向呈直角或者平行的方式排列。优选过滤器表面和流向呈平行排列，用于与流向呈直角排列的情形相比减少阻塞并允许过滤器的更大空间。在这种情况下，扩大槽路的宽度(例如，1000μm)，50μm×50μm的正方形疏水板形成或者以50μm的间距在流向上排列在槽路的中央部分，这种方式使得槽路的纵向分为两部分。当从分开槽路的一侧进料含有待分离物质的液体时，比50μm大的物质通过过滤从液体中去除，而从槽路的另一侧获得滤液。
下面将描述本发明的使用实施例，但是并不限制本发明。
实施例
通过试验的方式产生用于根据大小分离细胞大小物质的槽路。
细胞的大小范围从10μm到1μm。尤其是，红细胞的大小为大约φ7.5μm，白细胞的大小为大约φ10μm，血小板的大小为大约φ2μm，此外，细菌的大小大约为φ1μm。因此，两个不同大小φ1μm和φ10μm的荧光珠(Polysciences，Inc.Fluoresbright Carboxylate(2.5％ Solid-Latex))作为分离靶点。这些珠子的观察显示：
(1)在疏水表面处理板(疏水板)上形成气泡；
(2)珠子不能进入疏水板上的气泡，板上气泡的功能是作为槽路中的障碍；
(3)在和疏水板上的气泡接触时两种大小的珠子的移动速度降低；以及
(4)φ10μm大小的珠子受到接触的影响更强烈。
分离槽路通过如下步骤产生。
10mm×50mm长的分离区在用于显微镜观察的24mm×50mm的盖玻片中央附近纵向形成。随后，100μm×100μm的正方形疏水板以彼此200μm的间距排列从而在整个分离区中形成四方晶格图型。
为了产生疏水板，通过照相平板印刷术覆盖在盖玻片上的阴性光致抗蚀剂(S1818)暴露在光照下产生正方形板图型，并将保护层的正方形部分除去。进行完氧气等离子抛光后(350W，0.5Torr，10分钟)，通过用硅氮烷气体处理表面在各自玻璃表面暴露的部分形成疏水硅氮烷膜(SAM)。然后，用丙酮除去保护层。
通过这种方式，在两个盖玻片上形成疏水板。用瞬时粘合剂将10cm×10cm的载玻片粘合到其中之一上，18μm厚的聚乙烯片放在除分离区以外的部分。随后，将其它盖玻片覆盖在上面使得两个盖玻片的处理表面彼此相对产生分离槽路。
通过移液管将1×TBE缓冲液加入到利用上述过程制成的宽10mm，长50mm，深18μm的分离槽路的一端。1×TBE缓冲液由于毛细现象自动填满分离槽路。
图16显示了加入TBE缓冲液后形成气泡的图型。在图16中，可以观察到圆形气泡在由疏水板标记的位置形成，而且气泡在分离槽路表面形成气柱。相邻气泡之间的距离为300μm。
两种类型的珠子稀释或者悬浮在浓度适合观察的1×TBE缓冲液中。然后，将0.5μl的珠子悬浮物加入到添满1×TBE缓冲液的分离槽路的一端。珠子溶液由于毛细现象进入槽路并停止。两种类型的珠子在显微镜下根据大小不同可以很清楚地分辨开。
然后，将200μl的1×TBE缓冲液同时加入到分离槽路的相同端。加入的缓冲液自动进入槽路并从槽路的另一端溢出。在这个过程中，停留在槽路末端的珠子悬浮液通过分离槽路带走。利用CCD照相机可以观察到流动的现象。
因为如果加入TBE缓冲液后经过了太长时间，φ10μm大小的珠子沉到槽路底部，所以加入后进行观察3秒钟，这时珠子依然在漂浮。
图17显示了珠子和气泡撞击。如图所示珠子从左向右以300μm/s的速度流动。两种类型的珠子除了在气泡处以大约相同的速度随着液流一块移动，并在疏水板上和气泡撞击而短暂停止。然后，虽然珠子环绕着气泡并重新流动，但是其流动速度减少到大约三分之一。这意味着疏水板和其上的气泡构成了珠子移动的限制因素。很明显，φ10μm大小(图17标号1所显示)的珠子与小珠子(图17标号2所示，因为快门速度呈条纹状)相比环绕气泡的速度更低，大约是小珠子速度的三分之二。这就表明珠子的大小使得珠子通过和疏水板接触环绕气泡的速度不同。因此，达到了分离效果。通过形成疏水板的浓密图型，可以提高珠子撞击的频率，预料分离效果可能更加显著。
工业实用性
如前所述，根据本发明，疏水/亲水区的图型形成在样品分离部分的表面，并且由于表面特征进行分离。也就是说，以间距排列在样品分离部分表面的疏水/亲水区作为筛子，从而保证靶组分的有效分离。因为根据大小和极性分离样品，因此可以实现较从前更好的分离效果。此外，通过表面处理形成样品分离部分，从而提供了优异的制造稳定性。除此以外，由于表面特征进行分离，所以需要更短的时间和更少量的样品。另外，本发明的分离装置很少存在阻塞问题，可以通过用清洗液冲刷样品分离部分的表面很容易进行清洗。因此，可以实现高精度分离和优异的可操作性。

Claims (19)

1.一种分离装置，其包括：基材；在基材表面形成用于样品流动的槽路，其具有进样部分，样品排出部分以及位于进样部分和样品排出部分之间的样品分离部分；其中样品分离部分表面包括多个以大约等间距两维排列的第一个区域和占据了除第一个区域以外的样品分离部分表面的第二个区域，一个为疏水性而另一个为亲水性。
2.权利要求1的分离装置，进一步包括通过外力将样品从进样部分移动到样品排出部分的外力施加装置。
3.权利要求1或者2的分离装置，进一步含有在样品分离部分下游的检测部分。
4.权利要求1到3中任一分离装置，其中疏水区由表面组成，所述表面包括含有疏水基团的化合物。
5.权利要求4的分离装置，其中含有疏水基团的化合物为含有疏水基团的硅烷偶联剂。
6.权利要求4或者5的分离装置，其中疏水基团为硫羟基。
7.权利要求1到6中任一个分离装置，其中亲水区由表面组成，所述表面包括含有亲水基团的化合物。
8.权利要求7的分离装置，其中含有亲水基团的化合物为含有亲水基团的硅烷偶联剂。
9.权利要求8的分离装置，其中硅烷偶联剂为含有氨基的化合物。
10.权利要求1到9中任一分离装置，含有多个样品分离部分。
11.权利要求10的分离装置，其中相邻样品分离部分间的间距较形成每个样品分离部分的各自第一个区域之间的间距宽。
12.权利要求10或者11的分离装置，其中每个样品分离部分中各自第一个区域之间的间距彼此不同。
13.一种用于从样品中分离规定组分的样品分离方法，所述方法使用权利要求1到12中任一分离装置通过从进样部分将样品进样到分离装置中。
14.一种生产分离装置的方法，所述分离装置包括具有亲水表面的基材，在基材表面形成用于样品流动的槽路，以及槽路中提供的样品分离部分，所述方法包括如下步骤：
在基材表面刻凹槽形成槽路；以及
在至少部分槽路表面形成具有开口的掩膜后，从开口处将含有亲水基团的化合物沉积在槽路的表面，并将掩膜移走从而形成每个都包括以大约等间距两维排列的多个疏水区的各自样品分离部分。
15.权利要求14中生产分离装置的方法，其中化合物为含有疏水基团的硅烷偶联剂。
16.权利要求14或者15生产分离装置的方法，其中疏水基团为硫羟基。
17.一种生产分离装置的方法，所述分离装置包括具有疏水表面的基材，在基材表面形成用于样品流动的槽路，以及槽路中提供的样品分离部分，所述方法包括如下步骤：
在基材表面刻凹槽形成槽路；以及
在至少部分槽路表面形成具有开口的掩膜后，从开口处将含有亲水基团的化合物沉积在槽路的表面，并将掩膜移走从而形成每个都包括以大约等间距两维排列的多个疏水区的各自样品分离部分。
18.权利要求17中制造分离装置的方法，其中化合物为含有亲水基团的硅烷偶联剂。
19.权利要求18中制造分离装置的方法，其中硅烷偶联剂为含有氨基的化合物。
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