CN1582340A - 受体捕获分析方法 - Google Patents

受体捕获分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1582340A
CN1582340A CN02822059.5A CN02822059A CN1582340A CN 1582340 A CN1582340 A CN 1582340A CN 02822059 A CN02822059 A CN 02822059A CN 1582340 A CN1582340 A CN 1582340A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
tracer agent
transcription factor
analytical procedure
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN02822059.5A
Other languages
English (en)
Inventor
兰迪·莱曼·艾伦
约翰·杰弗里斯·威利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HYBRIZYME CORP
Original Assignee
HYBRIZYME CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HYBRIZYME CORP filed Critical HYBRIZYME CORP
Publication of CN1582340A publication Critical patent/CN1582340A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了快速、灵敏、一致和经济的分析方法，用于基于核酸示踪剂的扩增以及随后的扩增产物的测量来测定分析物和转录因子的活性。

Description

受体捕获分析方法
发明领域
本发明涉及快速和灵敏地检测分析物和病原生物标记物的方法。
发明背景
同样种类的毒性试剂在病理上一般来说是通过相关的生物化学途径来发挥效应的，这是一个被广泛接受的毒理学原则。因而，已经进行了大量的努力来开发利用机械论手段的生物分析方法，用于检测毒性试剂以及鉴定对各种疾病状态和紊乱以及暴露到偶然或故意引入环境的毒性试剂进行指示的生物标记物。
在世界范围内化学工业经过了一个多世纪的快速增长，已经有各种各样的工业有毒物质被生产出来并释放到环境中。例如，多氯化碳氢化合物和类似的卤化有机化合物是对人类有害的有毒污染物。它们在环境中具有持久性，可以在食物链中积累。这其中包括二噁英(dioxin)、呋喃、多氯化联苯(PCBs)、DTT以及这些化合物的类似物和衍生物。已知这些类型的有毒物质可以在人类和动物中引起多种医学问题，包括癌症、发育重要事件的延迟、免疫抑制以及多种外胚层发育异常。例如，已经报道普通人群通过摄取食物中低水平的二噁英类化合物已经慢性接触到二噁英类化合物。
二噁英类化合物和PCBs呈现一种重要的工业和环境危险，因为这些化合物对于分解具有抗性，并且可以在植物和动物、包括人的脂肪和油中积累。最近的研究报道了在食物(Alcock等，Chemosphere，1998 37：1457-1472)和动物饲料(Bernard等，Nature，1999 401：231-232)中存在二噁英和PCBs。与二噁英和PCBs接触已经与动物和人类中广范围的毒理学和生物学效应联系上了。其中包括免疫抑制、诱导不需要的酶活性、肿瘤促进、肝细胞毒性以及生殖和发育毒性。已经发生了几次意外的PCBs和二噁英食物中毒，最近的一次是1999年发生在比利时，那次有1克二噁英和50公斤PCBs被引入了食物链。
在应对环境污染时一个重要的需求是对这样的毒性化合物的存在进行检测和定量的有效方法。目前可用的技术一般来说昂贵而耗时。例如，传统的分析方法是高分辨率的气相色谱和质谱(GC/MS)，其费用依赖于多快需要结果和分析的复杂性，对于血清而言为1200到2000美元，而对于土壤样品而言为800到1500美元。每一种单独的二噁英同类物的浓度必须通过GC/MS检测，然后通过一个数学公式根据指定的TEF值将其转换为TEQ(参见Clement，Analytical Chemistry，1991 63：1130A-1139A)。这样的高费用阻止了对人类、食物和环境样品的日常监测。
许多提供快速和经济的分析二噁英、PCBs、DTT和无数其它的这种类型的环境有毒物质的方法的尝试依赖于特异性抗体的选择性结合。一种类型的抗体分析方法基于通过一种或多种抗体选择性结合目的毒物。例如，Albro等的美国专利No.4,238,472显示了一种检测二噁英(包括TCDD)的放射性免疫分析方法，而美国专利Nos.5,429,925和5,674,697显示了一种检测二噁英的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。所有的免疫分析方法都依赖于对靶分子的高抗原特异性，以减小定性和定量误差。这种技术的限制是难以构建抗体，所述抗体能够在数百个物质中识别出几个同类物并且鉴别所识别的同类物的相对毒性。
各种不同的化学和结构相关的二噁英类化合物的毒性，相对于化合物与细胞内的芳基碳氢化合物(Ah)受体或AhR的结合能力已经被描述。一个化合物作为Ah受体的配体的能力是二噁英类毒性的一个必要条件，这些化合物的毒性也依赖于化合物促进受体在结合配体后转化为DNA结合形式的能力。Ah受体的转化包含了一系列事件，包括无活性的受体从一种包含了一个或多个分子伴侣HSP90分子的蛋白复合物上解离、形成一种包含了HSP90-解离的Ah受体加上结合的二噁英和核蛋白芳基碳氢化合物受体核转运蛋白(ARNT，也称为缺氧诱导因子1β)的新的复合物、以及Ah受体/ARNT复合物与特异性DNA序列的结合。对于二噁英类型的化合物，这些特异性DNA序列或分子是二噁英效应元件(DREs)，位于某些基因的启动子区上游，研究最多的是P4501AI基因。转化的Ah受体和相关的蛋白与DREs的结合增强了相关基因的转录。
快速和灵敏的分析检测方法的另一个应用与针对美国及其盟国使用化学或传染性试剂的恐怖活动的威胁紧密相关。恐怖主义的活动是无法预测的，其对策必定包含了发展新的方法，用于快速检测、精确诊断和暴露人群的快速治疗(Claudio，Environmental Health Perspectives 2001 109：A529-A536)。
除了提供灵敏和快速的检测方法的难度之外，化学战试剂和生物战生物体以及产生的毒物还有可能被修饰以避开检测的危险。这样的修饰可能使得有毒试剂或感染性试剂避开常规的基于结构的技术、例如抗体或基于DNA的测试的检测。此外，生物战生物体的感染活性可能具有被大大提高的潜力，使得它们在利用现有的检测系统所不能检测到的浓度时就具有毒性。在任何情况下，现有的鉴定毒素或有毒物质的方法都需要烦琐的样品制备和复杂精密的仪器设备，导致对威胁的反应存在潜在的灾难性的延迟、或基于不充分的信息的不适当的处理。此外，上面指出的问题突出了对开发新的整合了检测方式的分析方法的需要，所述检测方式集中了对于这样的有毒试剂进行活化的常见病理途径。尽管化学和生物学结构可以被操作，但一般情况下，这些试剂产生它们的病原性的途径不能被改变。对界定了这些有毒试剂的破坏性功能的生物标记物进行监测正是利用了在细胞水平赋予了它们有害性的生物化学基础。
有许多有毒试剂在生物和化学恐怖主义情况下对人类是一个威胁。例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种高毒性的试剂，可以形成极端坚硬的孢子，能够存活非常长的时间。在吸入了炭疽杆菌孢子后疾病可以快速发展，如果不及时治疗会在几天内导致死亡。因此，早期检测和鉴别诊断是关键的。但是，到目前为止，还没有可靠的筛选测试能够在疾病的早期阶段诊断吸入炭疽病(Lane等，Nature Medicine 2001 7：1271-1273)。
特别是，将表现出流感类的症状和病征的其它疾病与吸入炭疽病相区别是困难的。每年有数以百万计的流感或流感类的病例报道。在单个病人中诊断流感的快速流感测试的临床用处是有限的，因为流感快速测试的灵敏度相当低，因此很大比例的患有流感的人不能被检测出来(Lane和Fauci，JAMA 2001 286：2595-2597)。
快速和灵敏的分析检测方法还有另一个应用，与一组被称为内分泌破坏剂(disrupter)的化合物相关。这些化合物，由于它们对人类和野生动物的有害作用，已经受到一段时间的关注了。内分泌破坏剂是环境中的化学物质，被认为模拟了自然的激素，从而抑制了激素的作用或改变了免疫、神经和内分泌系统的正常的调节功能。研究者已经对环境化学物质的雌激素效应关注了25年以上。
许多最近的科学关注来自于日见频繁的报道，这些报道显示发生在激素敏感性受体位点的疾病和功能障碍在多种紊乱、例如在乳腺、子宫和睾丸中是共同的。现在已经知道极低剂量的雌激素(比美国癌症学会认为安全的水平低达50倍)可以引起显著的激素变化。现在被认为与环境内分泌破坏剂相关的效应包括妇女中的乳腺癌和子宫内膜异位、男子中的睾丸和前列腺癌、儿童的性发育异常、男性生育能力的降低、垂体和甲状腺功能的改变、免疫抑制和神经行为效应(Colborn等，1993 Environ Health Perspect 101：378-384)。最近的报道已经显示，许多被释放到环境中的化学物质例如DTT、二噁英和杀虫剂能够在多种水生生物和野生生物中破坏正常的内分泌功能。这些效应包括鱼和鸟中异常的甲状腺功能和发育，贝、鱼、鸟、爬行动物和哺乳动物生育能力的降低，以及鸟和哺乳动物中免疫和行为功能的变化。
环境内分泌或激素破坏剂可以被定义为，能够在体内干扰负责维持稳态、生殖、发育和/或行为的天然激素的合成、分泌、运输、结合、作用或消除的外源试剂。重要的一点是注意到，内分泌破坏剂不只包括了环境雌激素。内分泌模拟化合物能够靶向各种不同的受体，并包括模拟性类固醇、肾上腺类固醇、甲状腺激素、维生素D和视黄酸的化学物质。
环境内分泌破坏剂也可以具有通过改变激素的合成、储存和/或释放、运输和清除、受体识别和结合、以及后来的受体活化而影响激素的能力。此外，剂量、体重、时间选择以及在生命的关键时期接触的持续时间，在评估潜在的内分泌破坏剂的副作用时也是重要的考虑因素。
激素通过直接与细胞内的受体或膜结合的受体相互作用而引发各自靶组织的反应。细胞内受体例如性类固醇、肾上腺类固醇、甲状腺激素、维生素D和视黄酸的受体，以一种配体依赖性的方式通过与特异性DNA序列相互作用来调节基因的转录。天然的配体与受体的相互作用是关键的。
许多环境试剂已经被显示通过模拟天然配体和作为兴奋剂或拮抗剂起作用而改变了这种相互作用。化合物如甲氧氯、十氯酮、DTT、PCBs和烷基酚显示干扰了雌激素受体的结合(White等，1994 Endocrinology 135：175-182)。二甲酰亚胺杀真菌剂vinclozolin的抗雄激素作用是化合物对雄激素受体亲和性的结果(Kelce等，1994 Nature 375：581-585)。环境化学物质的组成有六氯环己烷的异构体、二氯联苯-三氯乙烷的同类物(DTT、p，p-DTT、p，p-DDE、o，p-DTT)、氧桥氯甲桥萘、莠去津和五氯苯酚可以引起DHT与雄激素受体的特异性结合在统计学上显著的抑制，范围从100％到25％。许多已经被分类为环境雌激素的化学物质与多种受体的结合具有几乎相同的亲和性。例如，o，p-DTT和十氯酮以几乎相同的亲和性抑制雌激素和黄体酮受体(Laws等，1994 Toxicology 92：127-142)。其他的化合物例如壬基酚和HPTE具有以同样的亲和性抑制与雌激素、黄体酮和雄激素受体结合的能力(Laws等，1995 Toxicologist 15：294)。
前面提到的问题，即检测环境和食物链中的工业污染物、检测内分泌化合物和内分泌破坏剂、以及检测化学或生物战试剂，都具有共同的特点和技术需要，包括需要高度的灵敏性和准确性、相对低的费用和在野外条件下的快速可操作性。同等重要的是，许多这些有毒试剂的病理途径彼此间的相似性，转而为开发基于生物标记物的分析方法提供了新的机会。
有趣的是，这些化学和生物试剂的许多效应具有一个共同的作用机制，它们由相同或相似的转录因子介导，其中的一个例子是PAS蛋白家族。“PAS”是一组被称为Per、ARNT和Sim的蛋白的名字(Gu，Y.Z.等，2000 AnnuRev Pharmacol Toxicol，40：519-61)。PAS结构域在多种蛋白中发现，所述蛋白在发育和对环境的适应性方面发挥作用(Jain等，Mechanisms ofDevelopment 1998 73：117-123)。PAS结构域通常也可以在包含碱性的螺旋-环-螺旋(bHLH-PAS)结构域、以及成对作为异源二聚体转录因子起作用的蛋白中发现。PAS蛋白或可以被分类为经常用作环境信号的感应器的α类蛋白(即AhR、HIF-1α、CLOCK和SIM)，也可以被分类为一般用作广谱伴侣伴随这些异源二聚体到达它们的基因组靶的β类蛋白(即MOP3和ARNT)(Gu等，Annu Rev Pharmaco.Toxicol.2000 40：519-61)。缺氧诱导因子1α□HIF-1α”是一种属于PAS蛋白家族成员的转录因子，在美国专利6,222,018中有进一步的描述，在此以其全文引为参考。
类固醇和甲状腺超家族受体包括糖皮质激素、雌激素、盐皮质激素、黄体酮、雄激素、维生素D、甲状腺素、视黄酸、蜕皮甾类受体和病毒erbA癌基因，它们在缺少配体时是无活性的。在结合了一个激动剂配体后，受体被一个包含了二聚作用和类似于PAS转录因子家族的构象变化的过程所激活。同样地，被转化的受体能够与DNA结合，以反式激活相关的基因，如同在Englebienne的“免疫和受体分析方法：理论和实践(Immune andReceptor Assays in Theory and Practice)”，CRC出版社，纽约，2000中描述的那样。
已经有许多尝试利用前面提到的观察来产生新的分析方法。例如，E1-Fouly等(1994，Environmental Toxicology and Chemistry，13(10)：1581-1588)描述了一种通过将AhR识别位点与人类PAP载体拼接、然后将载体转染入小鼠的肝细胞瘤细胞而进行的对二噁英的生物分析方法。但是根据报道，许多细胞，特别是人类的上皮细胞，含有能够干扰生物分析方法的内源水平的热稳定PAP活力，因此基于PAP酶的报告基因被认为是不可靠的。
Denison等的美国专利No.5,854,010，描述了一种生物分析系统，通过在荧光素酶报告基因前插入二噁英效应元件、然后将产生的重组表达质粒转染到小鼠的肝细胞瘤细胞中而制备。Bradfield等的美国专利No.5,378,822描述了在一种检测样品内二噁英的生物分析方法中使用来自小鼠或人的AhR的cDNA的表达蛋白。Bradfield等的美国专利No.5,650,283描述了转基因宿主细胞，包括被转染的哺乳动物或酵母细胞，能够表达AhR蛋白，具有一个DRE驱动的lac Z报告基因，用于检测卤化的烃化合物。所有的生物分析方法都需要维持一个与目的有毒物质相接触的细胞培养。
Poland等的美国专利No.5,128,244描述了一种竞争性结合分析方法，其中二噁英被呈递给从小鼠细胞液中制备的AhR，让125I-二噁英衍生物与样品中的二噁英竞争有限数量的AhR结合位点。未结合的放射性标记的二噁英类似物在计数前与结合的放射活性分离。125I的短的半衰期和与放射性物质的暴露和处理相关的危险限制了这种分析方法用于日常测试。
Wheelock和Babish的美国专利No.5,529,899和Wheelock的美国专利No.6,127,136分别描述了用一个特异性针对结合或复合形式的AhR或ARNT蛋白的抗体检测AhR/ARNT复合物形成的分析方法。针对AhR产生特异性和高亲和性的抗体的难度限制了这种分析方法用于测试低水平的二噁英。同样地，使用特异性针对ARNT的抗体来检测AhR/ARNT复合物需要使用相对大体积的AhR细胞液。
在此引为参考的美国专利6,316,197描述的方法，通过监测基因表达的类型、例如监测众多基因包括HIF-α基因的上调和表达来确定对感染性试剂的早期暴露。’197专利表明在暴露于炭疽杆菌孢子后几个小时内循环血淋巴细胞中的HIF-1α的mRNA是上调的。这个观察非常重要，因为HIF-1α的调控的主要机制主要是在蛋白水平上而不是在mRNA水平上(Zelzer等，EMBO J.1998 17：5085-5094)。但是，’197专利中的方法需要从哺乳动物获得一个样品，然后“检测在该样品中存在的基因表达或蛋白表达的类型；将该样品中的基因或蛋白表达类型与已知的针对毒性试剂的基因或蛋白表达类型文库进行比较”。但是，监测广泛的基因表达的类型不能解决提供快速、灵敏和经济的用于早期检测特异性感染试剂的分析方法中的问题。
凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)被广泛用于检测蛋白-核酸相互作用(Revzin，Bio Techniques，1987 7：346-355)。在进行EMSA时，P32标记的DNA和蛋白被混合在一起，溶液通过聚丙烯酰胺进行电泳，然后对凝胶中的DNA进行分析，通常是通过放射自显影。蛋白与DNA的结合能够产生复合物，其与游离的DNA具有不同的电泳迁移率。EMSA已经被用于检测HIF-1α的诱导，需要几天的时间来完成，通量有限(Zelzer等，(1998)同上)。EMSA对于日常使用来说太昂贵和耗时。
Nargessi的美国专利No.5,770,176描述了一种免疫分析方法，通过将DNA效应元件与受体的特异性结合和与特异性抗体的结合相关联，可以检测和定量细胞或组织样品中的功能性核受体。这些分析方法被设计用来筛选样品中的核受体，以便例如这样的受体能够在肿瘤活体组织样品中被鉴定。
因此，在本技术领域仍然长期存在着对能够快速、可靠和经济地检测和定量环境毒性物质例如持久性卤化碳氢化合物、感染试剂和毒素的分析方法的需要，以及对能够测量某些生物标记物的活性和表明生物体与任何数量的这种毒性试剂相接触的分析方法的需要。
发明概述
本发明通过提供快速、灵敏、一致和经济地测定分析物和转录因子活性的分析方法，致力于解决本技术领域内的这些和其它的缺点，这种分析方法是基于核酸示踪剂的扩增以及随后对最终与分析物或转录因子活性的存在相关的扩增产物进行的测量。
本发明的一个实施方案的实行是通过在有利于允许活化的转录因子变得能够结合DNA效应元件的情况下，将转录因子与一种目的分析物相接触，该DNA效应元件包含在核酸示踪剂引物识别序列中，该序列是预先选定的以用于标准的核酸扩增方案。更具体来说，该方法要求将一个其中含有分析物的样品与一个能够特异性与分析物结合的转录因子分析试剂相接触。转录因子通过与分析物相接触被转化而产生了一个在功能上与相容的DNA效应元件结合的活化转录因子。含有至少一个核酸引物识别序列和至少一个与活化的转录因子相结合的DNA效应元件的核酸示踪剂，也在可以促进核酸示踪剂中的DNA与活化的转录因子之间形成蛋白-核酸复合物的条件下，同时或连续地与转录因子分析试剂和样品相接触。然后，将蛋白-核酸复合物与未复合的核酸示踪剂相分离，通过核酸扩增进行复合的示踪剂的检测，其中被扩增的核酸示踪剂的出现表明在样品中存在被分析物。
在另一个实施方案中，本发明还提供了快速、灵敏和经济的分析方法，用于检测在暴露到紊乱、有毒物质、毒素或感染性试剂的生物体中转录因子活化的变化。该分析方法在检测动物或人类中转录活化的改变，以确定从生物体中分离的转录因子是否已经由于例如暴露到某些紊乱、有毒物质、毒素和感染性试剂而得以活化中，具有独特的应用。
在本发明方法的这种实施方案中，分析方法被用来检测或测量转录因子活化，特别是在被相信已经暴露到能够活化转录因子的有毒试剂的组织中。该方法广义上包括将样品与含有至少一个核酸引物识别序列和至少一个与转录因子的活化形式相结合的DNA效应元件的核酸示踪剂相接触。这种接触是在促进示踪剂与转录因子之间形成蛋白-核酸复合物的条件下进行的。将该复合物与未复合的核酸示踪剂相分离，并通过核酸扩增进行检测，随后在存在被扩增的核酸示踪剂与该转录因子活性之间进行关联。
本发明还提供了一种新的核酸示踪剂，以用于本发明的各种分析方法。
发明详述
本发明提供了快速、灵敏、一致和经济地测定分析物和转录因子活性的分析方法，这种分析方法是基于核酸示踪剂的扩增以及随后对最终与分析物或转录因子活性相关的扩增产物进行的测量。本发明的一个实施方案的实行是通过在有利于允许活化的受体转变为一个能够结合DNA效应元件的蛋白的情况下，将转录因子与一种目的分析物相接触，该DNA效应元件包含在预先选定的用于标准技术扩增方案的核酸序列中。
在另一个实施方案中，本发明还提供了快速、灵敏和经济的分析方法，用于检测在暴露到紊乱、有毒物质、毒素或感染性试剂的生物体中转录因子活化的变化。该分析方法可用于任何所需的目的，以检测在动物或人类中转录活化的改变。这些活化事件的检测提供了诊断能力，并且由于同样的原因，这些分析方法可以被用于确定从生物体中分离的转录因子是否已经由于例如暴露到二噁英或炭疽杆菌而得以活化。
因此，本发明提供了改进的分析方法，用于检测样品中的分析物以及诊断与某些紊乱、有毒物质、毒素或传染病的暴露。
当通过本发明的方法进行分析物的检测或测定时，一个适当的转录因子，在所需的试剂或细胞因子存在下，与已知浓度的一个或多个目的分析物接触，或者与可能含有受怀疑的目的分析物的未知样品相接触。然后通过本发明的任何一种方法检测所得的一组分析物，以便将已知和未知的分析物样品的浓度相关联，以确定分析物在样品(例如土壤、食物、血液、组织等)中的存在。
当本发明的方法被用来检测或测定转录因子活化时，将据认为含有转录因子的组织进行处理以获得足够纯的形式的转录因子，从而通过本发明的方法来确定活化状态。这种确定可以容易地被用来检测紊乱或生物体(例如植物、野生动物、宠物、家畜和/或人类)与目的有毒物质、毒素或感染性试剂的暴露。
当转录因子被活化、然后能够选择性结合到特异性的独特的含有DNA效应元件和引物识别序列的核酸示踪剂上时，需要高度的特异性。一旦以这种选择性的方式与转录因子结合后，DNA效应元件又会很容易地通过DNA扩增方法如PCR，以极高的灵敏度和精确性被检测。
如上所述，本发明的另一个实施方案可以被用来检测在目的生物体中发生的转录因子活化。在本发明的这个实施方案中，通过检测转录因子活化状态的特异性效应，对有毒物质、毒性试剂或感染性试剂的直接分离和检测的需要被避免了。
一种转录因子在与目的分析物结合并被转化成活化的DNA结合蛋白后，将与相容的核酸示踪剂在促进蛋白-核酸(DNA)复合物形成的条件下相结合。通过任何一种本技术领域内熟知的标准方法，可以将蛋白-核酸复合物与未结合的DNA和未结合的蛋白分离开来，这些方法包括例如凝胶过滤层析、离心过滤、疏水分离、带电的基于膜的分离、羟基磷灰石分离、抗体沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、聚乙二醇沉淀和二氧化硅沉淀。
在优选情况下，将蛋白-核酸复合物与未复合DNA的分离可以使用本领域内任何能够将复合物捕获在固相基片(其例子包括试管、微量滴定板孔、微量滴定板条、微量滴定板、珠子、微粒、磁性微粒及其组合)上、然后通过一个或多个清洗步骤除去未结合物质的标准方法来完成。然后，复合物中的DNA的检测和/或定量通过PCR和/或任何相容的核酸扩增方法来进行。此外，随后的与对照或标准曲线的相关性提供了对分析物浓度的高度精确的测定。
照此，本发明的方法可以被用于为以前未知的对某些受体或转录因子系统的所需的或不需要的影响来筛选化合物(例如工业或天然存在的化合物、药物等)。例如，可以筛选化合物以确定它们是否具有二噁英和PCBs不适当地活化Ah受体的活性。可以筛选杀虫剂以确定它们是否具有例如DTT不适当地活化鸟类雌激素受体的活性。同样，本发明的方法可以容易地用于筛选或检测活化的转录因子，用于疾病的诊断、预后和治疗，以及作为一个发现新的治疗药物和策略的平台。
为了专业技术人员能够更容易地理解本发明的范围，提供了下述的定义。
在此处术语“转录因子”是指这样的蛋白，它们能够与相关于调节基因的效应元件、即DNA效应元件相互作用，并且在特定的情况下是或者变为DNA结合蛋白。在此所用的“受体”被定义为配体活化的转录因子，可以存在于细胞质中(例如Ah受体)或细胞核中(例如糖皮质激素受体)。核受体广义上包括类固醇激素、甲状腺激素、类视色素、维生素A和D的激素形式、过氧化物酶体活化剂和蜕皮激素的受体。许多转录因子通过非配体介导的生化途径被活化以与DNA结合(例如HIF-1α)。
在此所用的术语“活化”，当与术语受体或转录因子结合使用时，是指蛋白被转化为一种能够与其各自DNA效应元件结合的形式。尽管活化反应可能不同，在各种不同的转录因子的信号传导途径之间具有显著的相似性。例如，类固醇和甲状腺激素受体超家族和PASα-类蛋白AhR、HIF-1α和CLOCK都结合β-类PAS蛋白，产生的同型二聚体或异源二聚体识别它们各自的DNA效应元件。
“DNA效应元件”在此被定义为，指一个与转录因子结合的独特的DNA序列。在生理条件下，DNA效应元件是与转录因子结合并调节基因转录的基因或基因区域相关或相容的DNA序列。DNA效应元件典型地位于被调节基因的启动子的5’端，但是也可以位于下游。活化试剂直接或间接地活化转录因子，以使其与通常存在于各自细胞类型的核中的特异性DNA效应元件相结合，并通过这种方法将对相应基因的转录及其随后的任何蛋白合成进行上调或下调。
“核酸示踪剂”被定义为一种含有一个或多个可以结合引物识别序列的DNA效应元件的核酸。
为了描述的方便，几个其它的术语被定义如下。“分析物”被广义地定义为在分析方法中被鉴定和测量的物质。在本发明的某些实施方案中，分析物被设想为在很多种物质中存在或提取的持久性环境有毒物质，这些物质包括土壤、岩石和人造物和建筑材料，它们通过从其制成的原材料的方式或在生产过程中可能已经被污染了(例如建筑物或其它结构、运输工具、衣服等的陈设品、内部或外部特征)，以及那些被认为存在于任何类型的生物材料上或之中的有毒物质。
用于此处的术语“生物材料”广义上是指从一个活的或以前活的生物体中获得的或是其一部分的物质或材料，包括食品，以及人类和动物的医药和装饰产品，不论本质上是人造的、动物来源的还是植物来源的。
专业技术人员将会明白和理解，当生物材料在进行医学或诊断目的的测试时，样品的来源可以包括从需要这样测试的活的动物甚至人类病人中获得的组织或血液。
术语“二噁英类”在广义上是指二苯并二噁英、二苯并呋喃、偶氮苯、二苯并醚、某些多氯化联苯、某些多芳族碳氢化合物，以及它们许多有毒的和持久性的衍生物，如同将在后面更详细地描述的那样。
术语“二噁英”广义上是指2，3，7，8-四氯二苯并-p-二氧芑或TCDD和/或TCDD的75个同类物中的任何一个。
术语“呋喃”是指2，3，7，8-四氯二苯并-p-呋喃(TCDF)和/或TCDF的135个同类物中的任何一个。
短语“PCB化合物”广义上是指特定的PCB同类物及其可能存在于PCB污染材料中的潜在的降解产物中的任何一种。这包括了在商业化的AroclorTM成分中发现的209种不同的PCB异构体形式以及其它可能来自非商业化的生产、或活的生物体的代谢活动例如土壤微生物的生物转化的异构体形式中的任何一种。
此外，在本说明书中为了方便使用单数形式的术语，并不意味着进行如此的限制。因此，例如，当提到含有“一种抗体”的组合物时，除非特别的说明，还包括一个或多个这样的抗体(例如一种含有针对特定目的的足够抗体的制剂)。
在下面提供的实施例中使用了重组的构建体。这些构建体包括一种载体，例如质粒或病毒载体，其中插入了用于表达受体、受体结合伴侣或融合了任一二聚体成员的蛋白的序列。大量的适合的载体和启动子对于本领域的专业人员来说是熟知的，并且是可以购买到的。
含有重组构建体的宿主细胞可以是高等的真核细胞，例如哺乳动物细胞，或是较低等的真核细胞例如酵母细胞。此外，宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。将构建体引入宿主细胞可以通过磷酸钙转染、脂类或DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔来进行。
转录因子和结合伴侣可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中在适当的启动子控制下表达。此外，杆状病毒/昆虫细胞表达系统也可以使用。使用从cDNA衍生的RNAs，可以通过无细胞翻译系统来产生这样的蛋白。通过上面描述的方法生产的受体可以是商业化的。用于原核和真核宿主的适当的克隆和表达载体在Sambrook等1989年出版的《分子克隆实验指南》(第二版)第1到3卷中有描述，在此以其全文引为参考。
I、转录因子
功能上作为第一信使的转录因子可以被一个配体直接活化。几个直接活化的受体家族通过一种共同的作用机制发挥功能。受体蛋白是无活性的，并且通常与分子伴侣蛋白形成复合物。当配体被引入时，受体与配体结合，经历了一种转变并被活化。此外，受体然后可以与另一种同样类型的受体结合以形成一个同型二聚体，或者与一种通常具有同源性并且是同类蛋白的成员的不同的蛋白/受体结合形成一个异源二聚体。被活化的受体然后可以结合到特异性DNA靶上以影响转录。
举个简单的例子，类固醇、类视色素和甲状腺激素在真核生物中调控发育和稳态。但是，当这些受体的一级结构通过克隆和测序被阐明时，很快就认识到它们具有高水平的同源性。此外，它们都被鉴定为在结合配体后作用于基因转录的调控蛋白。这些共同的特点支持了将它们分类在一个大的受体蛋白超家族下。这个超家族包括糖皮质激素受体、雌激素受体、盐皮质激素受体、黄体酮受体、雄激素受体、维生素D受体、甲状腺激素受体、哺乳动物的视黄酸受体，也包括昆虫的蜕皮激素受体。这种共同性还被进一步扩展到病毒的erbA癌基因，它的原癌基因产物已经被鉴定为一种甲状腺激素受体的拮抗物。几种孤儿受体(即其特异性配体还没有被鉴定的受体)在测序后也已经被分类在这个超家族下。
这个超家族的细胞内受体在缺少配体的情况下是无活性的。一般来说，在与激动剂配体结合后，受体通过一个包含了二聚作用和构象变化的过程被活化。在类固醇激素受体中，二聚作用过程伴随着与受体的单体形式相关的热休克蛋白的丧失。这被称为转化，对于结合DNA和反式激活是必需的。一般来说，当配体是一种拮抗物时，二聚作用发生，但是受体不能经历反式激活。甲状腺激素、视黄酸和维生素D受体在缺少配体时仍然能够二聚体化并结合DNA。在这种情况下，配体的结合是在受体与细胞核中的DNA结合时发生的。象类固醇受体一样，它们在结合配体后也经历了转化(Englebienne，免疫和受体分析方法：理论与实践(Immune and ReceptorAssays in Theory and Practice)，CRC出版社，纽约，2000)。
此外，作为第一信使起作用的转录因子包括属于PAS蛋白家族成员的蛋白，命名为Per、ARNT和Sim蛋白(Gum Y.Z.等，2000 Annu Rev PharmacolToxicol，40：519-61，在此引为参考)。PAS结构域在许多蛋白中被发现，所述蛋白在发育和对环境的适应性方面发挥作用。PAS结构域通常也可以在包含碱性的螺旋-环-螺旋(bHLH-PAS)结构域以及成对作为异源二聚体转录因子起作用的蛋白中发现。转录因子与多种伴侣进行二聚作用的能力在许多蛋白家族中存在。一些碱性的螺旋-环-螺旋-PAS家族成员蛋白可以与多种伴侣相互作用，在体外形成同型二聚体或者在体内形成异源二聚体。在结合了适当的配体后，活化的AhR结合到ARNT、芳基碳氢化合物受体核转运蛋白上。AhR/ARNT复合物形成了一个异源二聚体，然后能够结合到一个叫做二噁英效应元件的特异性DNA效应元件上。
最近，从表达的序列标签数据库和低严紧性杂交筛选中发现了多种“孤儿”bHLH-PAS蛋白(MOP3、MOP4和MOP5)。对它们的异源二聚体伴侣的鉴定和DNA效应元件的确定目前正在进行中(Hogenesch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998 95：5474-5479)。
PAS转录因子家族的某些成员被间接活化。HIF-1α操作如下。在正常情况下，细胞中的HIF-1α通过泛素-蛋白酶体途径快速降解。当细胞暴露到一种激活剂中时，HIF-1α蛋白被稳定了。然后HIF-1α从细胞质中被转移到核中，在那里它与ARNT复合产生HIF-1复合物。HIF-1复合物然后结合到已知为缺氧效应元件(HRE)的其特异性DNA效应元件上。CLOCK蛋白是另一种操作类似于HIF-1α的受体或转录因子。CLOCK蛋白对光作出反应被诱导并与MOP3形成复合物。这个异源二聚体转移到核中并结合到其被称为MOP3和MOP4效应元件(M34RE)的特异性DNA效应元件上。
其它的转录因子也间接地通过某些残基的磷酸化或者通过对与因子结合的抑制蛋白进行修饰而活化。在许多情况下，外部试剂与膜结合的受体以一种刺激了一个或级联的修饰酶，通常为激酶的方式相互作用。举个简单的例子，转录因子如Stat的成员、AP-1和CREB通过被激酶磷酸化而活化，而该激酶又是由生长因子、细胞因子或其它刺激物所活化。NFkB家族成员与细胞质中的IkB成员结合并在转录上失活。当细胞用各种试剂或细胞因子处理时，IkB的降解发生。NFkB二聚体可以转移到核内，与被调节基因的特异性DNA元件结合。
这样，本发明的方法可以选择性地与任何第一或第二信使，例如转录因子一起使用，以便当它们被活化时将与适合用在本发明分析方法中作为核酸报道分子的特异性DNA元件相结合。
在本发明的一个实施方案中，PAS配体活化的转录因子是一种芳基碳氢化合物受体。AhR的PAS结构域的功能与90KDa的热休克蛋白(hsp90)相结合，与ARNT形成二聚体，以及结合配体。
在另一个实施方案中，本发明的激素依赖性受体是与它们各自雌激素特异性DNA效应元件结合的雌激素受体(ERs)和直接与糖皮质激素效应元件(GREs)结合以调控基因转录的糖皮质激素受体(GR)。
在本发明的另一个特定的实施方案中，所述方法利用了HIF1-α，一种通过第二信使活化的PAS蛋白转录因子。
A、芳基碳氢化合物受体
芳基碳氢化合物受体是一种配体激活的转录因子，其是碱性的螺旋-环-螺旋-PAS蛋白家族的成员。AhR和它的结合伴侣ARNT都是PAS蛋白家族的成员，如同前文讨论的，在该结构域中具有同源性。AhR的PAS结构域的功能是与90KDa的热休克蛋白(hsp90)相结合，与ARNT形成二聚体，以及结合配体。AhR和ARNT也具有一个氨基末端碱性区域和螺旋-环-螺旋结构域，它们在一起发挥作用介导DNA的结合和蛋白二聚作用。
无活性的没有结合配体的AhR在细胞质中与热休克蛋白90和亲免蛋白(immunophilin)类似的蛋白形成复合物，这种亲免蛋白类似的蛋白在本技术领域内是指被命名为XAP2、AIM或Ara9的三种蛋白中的任何一种。在结合配体后，活化的AhR从复合物上解离并与ARNT结合。转化后的AhR/ARNT复合物是一个异源聚合体，其然后能够与特异性针对二噁英的DNA效应元件——二噁英效应元件结合。据推测，二噁英类化合物的毒性效应可能是由于对被调控的基因的不适当的诱导或抑制，并且与AhR结合的化学物质可能是在模拟一种目前尚未鉴定的内源性激素。
结构不同的化合物以不同的亲和性与AhR结合，这种亲和性与观察到的毒性有很强的相关性。大多数人群暴露在存在于食物或环境中的这种化合物的混合物中，样品中存在的部分的种类和浓度影响了总的AhR介导的反应。国际惯例以毒性当量因子(TEF)值定义结合AhR的化学物质，其中对于该组中最具毒性的化学物质TCDD来说该值为1，其它所有化学物质的值小于1(参见Van den Berg，M.等，1998 Environ Health Perspect 106：775-789，在此以其全文引为参考)。总毒性当量(TEQ)是混合物中每个同类物的毒性的总和(TEF乘以同类物的浓度)，而这是一个被接受的工业标准。
含有AhR的异源聚合物可以从任何数量的来源获得。例如，异源聚合体存在于啮齿动物的肝、胸腺、肺、肾、脑、睾丸和骨骼肌细胞中。一个尤其优选的异源聚合体来源是哺乳动物肝细胞的细胞液组分。在优选情况下，异源聚合体的获得可以通过从雄性Hartley豚鼠中分离肝细胞液(参见E.C.Henry等，“Ah受体的多种形式的表征：物种和组织的比较(Characterizationof Multiple Forms of the Ah receptor：Comparison of Species and Tissues)”，Biochem，28：6430-40，1989，在此以其全文引为参考)，在玻璃或塑料试管中5mL的等份试样，然后冷冻或冷冻干燥。当AhR是从肝细胞液获得时，一般来说，所有对AhR转化所需要的蛋白和酶都存在。肝细胞的细胞系也是AhR异源聚合体的一个方便的来源，因为这为细胞液制剂提供了一种统一的可重复的来源，而且不需要收集和破坏肝组织。因为异源聚合体的转化/活化是细胞过程的一个天然部分，所需的蛋白和酶以适当的比率存在，用于使Ah受体在存在AhR作出反应的试剂的情况下能够完全转化和活化。
在此以其全文引为参考的Bradfield等的美国专利No.5,650,283提供了产生大量重组AhR的方法。该专利描述了全长的AhR和在其氨基或羧基末端含有缺失的AhR，以及具有功能的嵌合受体，它们在被配体激活时都能够与其相关的DNA效应元件结合。这些嵌合的Ah受体通过将AhR的DNA结合和二聚作用一级结构域与LexA和Gal4蛋白的类似结构域相交换而制备。获得的嵌合蛋白的药效与AhR/ARNT/DRE系统的药效基本相当(Carver等，JBC 1994 269(48)：30109-30112)。
AhR的结合配体包括各种卤化化合物，例如PCBs、二噁英和本领域已知的二噁英类化合物。二噁英类化合物包括例如多氯化二苯并二噁英、多氯化二苯并呋喃、多氯化联苯以及能够表现出多氯化二苯并二噁英、多氯化二苯并呋喃和/或多氯化联苯的特征的生物活性的结构类似物。
术语二噁英在通常使用时，是2，3，7，8-四氯二苯并-p-二氧芑的缩写。TCDD仅仅是多氯化二苯并-p-二氧芑家族(PCDD)的一个成员或同类物，根据氯原子的数量和位置的变化可以有75个结构不同的可能的同类物。在生物学上，TCDD是最具潜力的PCDD，而其它大多数PCDDs的活力要低十到几千倍。在所有的PCDD同类物中TCDD被研究得最广泛。
几种芳族碳氢化合物具有与TCDD相似的生物学性质，特别是当侧链位置用氯取代时。其中最重要的是多氯化二苯并呋喃(PCDF)和多氯化联苯家族的某些成员。大量可能的PCDD、PCDF和PCB同类物使环境分析极大地复杂了，因此在这样的分析进行之前需要复合物清除步骤。当用于此处时，“二噁英类化合物”包括上述化合物家族的所有成员以及其它诱导同样的细胞效应的化合物，例如偶氮苯和苯并芘。
B、雌激素受体
雌激素受体(ER)直接与雌激素效应元件结合以调节基因的转录。ER是一个大的核受体家族成员，在功能上是激素依赖性的。ER识别身体内存在的许多结构上不同的内源性化合物或外源性化合物例如药物、污染物或食物成分。雌激素强烈地影响生殖系统的生长、分化和功能，特别是哺乳动物的腺体和子宫。ER的拮抗剂，例如三苯氧胺(tamoxifen)，已经被成功地用于治疗ER阳性乳腺癌。
ER含有配体结合结构域、DNA结合结构域、二聚作用界面结构域和N-端和C-端反式激活结构域。大多数实验室观察到在缺少配体的情况下在ERE上形成了ER同型二聚体，而配体改变了转录功能。
最近，从野生型雌激素受体得到了一个cDNA HE0，其中含有一个单一氨基酸取代，使受体只有在配体活化后才能与它的DNA效应元件结合(Aumais等，JBC 272(18)：12229-12235)。
C、糖皮质激素受体
糖皮质激素是参与能量代谢和免疫/炎症反应的调控的类固醇。糖皮质激素受体(GR)直接与糖皮质激素效应元件(GREs)结合而调控基因的转录。GR是一个大的核受体家族成员，在功能上是激素依赖性的。GR识别身体内存在的许多结构上不同的内源性化合物或外源性化合物例如药物、污染物或食物成分。GR含有配体结合结构域、DNA结合结构域、二聚作用界面结构域和N-端和C-端反式激活结构域，在配体诱导解离和同型二聚体形成之前，它一直与hsp90蛋白形成复合物。
D、HIF-1α转录因子
HIF-1α在激活对缺氧(一种氧的需求超过供应的状态)的稳态反应中发挥重要作用，HIF-1α的活化可以作为一种生物标记物，用于传染病的早期检测。已经了解到哺乳动物需要分子氧进行基本的代谢过程，包括ATP形成过程中的氧化性磷酸化，其中O2作为电子受体。由缺氧引发的全身、局部和细胞内稳态反应包括由贫血或处于高海拔个体导致的红细胞生成作用(Jelkmann，Physiol.Rev.1992 72：449-489)、缺血性心肌层中的血管新生作用(White等，Circ.Res.1992 71：1490-1500)以及在氧压减少情况下培养的细胞中的糖酵解作用(Wolfle等，Eur.J.Biochem.1983 135：405-412)。这些适应性反应或是增加了氧的运送或是活化了不需要氧的替代代谢途径。参与这些反应的缺氧诱导的基因产物包括红细胞生成素(EPO)(有关综述参见Semenza，Hematol.Oncol.Clinics N.Amer.1994 8：863-884)、血管上皮生长因子(Shweiki等，Nature 1992 359：843-845；Banai等，Cardiovasc.Res.1994 28：1176-1179；Goldberg & Schneider，J.Biol.Chem.1994 269：4355-4359)以及糖酵解酶(Firth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994 91：6496-6500；Semenza等，J.Biol.Chem.1994 269：23757-23763)。
对于EPO基因，已经深入地研究了介导对缺氧的遗传反应的分子机理，该基因编码了一个调节红细胞生成作用的生长因子(Jelkman，1992同上；Semenza，1994同上)。对缺氧作出反应进行转录激活所需的顺式作用的DNA序列被鉴定位于EPO的3’-侧接区域，而与增强子结合的反式作用因子缺氧诱导因子1α(HIF-1α)，已经被显示符合EPO转录的生理调节因子的标准：EPO表达的诱导物(1％的氧、氯化钴[CoCl2]和去铁草酰胺DFX)也以同样的动力学诱导HIF-1 DNA结合活性；EPO表达的抑制剂(放线菌素D、环己酰亚胺和2-氨基嘌呤)阻断了HIF-1α活性的诱导；在EPO的3’-侧接区域的突变消除了HIF-1的结合，也消除了增强子的功能(Semenza，1994，同上)。这些结果也支持了这样一种假设，即氧压由一个血红素蛋白所感应(Goldberg等，Science 1988 242：1412-1415)，以及一个需要正在进行的转录、翻译和蛋白磷酸化的信号转导途径参与了对HIF-1α的DNA结合活性和缺氧细胞中EPO转录的诱导(Semenza(1994)同上)。EPO的表达是细胞类型特异性的，但是在许多哺乳动物细胞系中已经检测到了由1％的O2、CoCl2或DFX诱导的HIF-1α的活性(Wang & Semenza，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993 90：4304-4308)。
此外，已经报道在产生EPO的Hep3B或不产生EPO的HeLa细胞中，编码几种糖酵解酶的RNA分子被1％的O2、CoCl2或DFX所诱导，但是用环己酰亚胺处理阻断了这些同样的RNA分子的诱导。而且，含有HIF-1α结合位点的糖酵解基因序列在转染分析中被显示能够介导缺氧诱导的转录(Firht等，1994，同上；Semenza等，1994，同上)。这些报告支持了HIF-1α在激活对缺氧的稳态反应中的作用。
II、分析方法
A、检测分析物的分析方法
在本发明的一个实施方案中，分析方法包括了下列一系列步骤：利用分析物对特异性转录因子的活化，接着将含有引物识别序列和相应的DNA效应元件的核酸示踪剂选择性地与被激活的转录因子结合形成复合物，然后用任何一种本领域已知的扩增方法确定选择性结合的核酸示踪剂的存在。这些步骤描述如下。
a)在存在正常细胞成分的情况下，在适合转录因子活化的条件下，将转录因子分析试剂与分析物相接触；
b)使活化的转录因子与一种含有核酸扩增引物识别序列和DNA效应元件的核酸示踪剂相结合，形成蛋白-核酸复合物；
c)将蛋白-核酸复合物与未复合的核酸示踪剂分离；并且
d)通过扩增对复合的核酸示踪剂进行检测和/或定量。
转录因子分析试剂从适合于目的转录因子的细胞或组织中获得，或通过重组方法生产。转录因子分析试剂包括例如类固醇激素超家族受体、PAS超家族蛋白、Stat家族转录因子、Rel或NFkB家族蛋白、CREB家族蛋白以及AP-1家族蛋白。例如，AhR受体一般来说是通过将啮齿动物来源(例如小鼠、大鼠或豚鼠肝、或肝细胞肿瘤细胞系)获得的哺乳动物肝细胞破碎并分离细胞质组分而获得的，如同下文所举例的那样。
分析物被配制成校正标准品的形式，其浓度在希望被检测或定量的代表性化合物的范围内。对于二噁英来说，容易使用的校正物是浓度范围为10到大约1000fmol的2，3，7，8-四氯二苯并-p-二氧芑(TCDD)的相容性溶剂，例如甲醇或DMSO中。
专业技术人员将会理解TCDD和其它的二噁英一般来说容易粘附在塑料上。因此，在AhR/TCDD分析中，TCDD或其它的二噁英之间的接触最好在玻璃器皿中进行。一旦分析物已经与AhR进行了足够的接触使得活化的复合物稳定，它可以被转移到塑料材料中(例如任何适当的基于聚合物的器材)，例如商业化的微量滴定板。
标准的微量滴定板使用方便，因为它们采用单条8或12个孔或标准的96孔的形式。类似的高密度微量滴定板的形式可用于高通量筛选方法。
在分析后，含有活化的转录因子的介质被转移到微量滴定条中，玻璃管可以丢弃。使用微量滴定板使得可以采用所有的为ELISA工作已加以开发的器材(例如洗板机、进样器等)。在优选情况下，微量滴定条或板的大小适合于进行PCR，如同在本文举例的那样。大多数热循环仪的构造现在适合使用96孔板的形式。
为了只测定那些参与了与活化的转录因子结合(即DNA-蛋白复合物形成)的核酸示踪剂的存在，将复合物与分析介质中的未复合的蛋白和核酸示踪剂分离开来。正如上面注意到的，任何本技术领域内的标准分离方法都可以使用，但是在优选情况下，通过将复合物捕获或锚定到一个固相支持物上，以便其它的蛋白和核酸可以通过清洗除去，这样更为利于分离。捕获可以通过任何与本分析相容的方法进行，但是优选通过选定的特异性针对复合物上存在的一个或多个抗原决定簇的抗体的方式来进行。
捕获抗体可以通过任何本技术领域内已知的方法(例如蛋白A和/或一个或多个聚合物连接物)直接锚定在固相支持物上，此外，捕获抗体也可以与复合物接触，然后其本身结合到另一个配体上(例如任何对捕获抗体具有选择性的结合抗体)，其中该结合抗体是结合到固相支持物上或者可以在以后结合到固相支持物上。
对于受体是AhR、分析物是TCDD和相关化合物的分析来说，优选的捕获抗体可以选择性地结合ARNT。抗ARNT的抗体可以通过本领域众所周知的标准的免疫方法产生，和/或作为抗HIF-1β抗体从Colorado Littleton的Novus Biologicals公司购买获得。
任选地，蛋白A的板(湿的或干的)也可以购买到，或者专业技术人员也可以通过标准程序容易地制备它们。此外，抗ARNT抗体可以通过其它现有的方法容易地包被或结合到微量滴定条或板上，包括例如共价键合、将抗ARNT抗体吸附到塑料表面上、或通过生物素-亲和素系统。这些和其它的标准技术步骤在David Wild编辑的《免疫分析手册(IMMUNOASSAYHANDBOOK)》(第二版)中有描述，Nature Publishing Group，2001，ISBN1-56159-270-6，在此以其全文引为参考。
因此，使用抗体捕获在微量滴定条或板上的TCDD/AhR分析方法包括下列步骤：
a)将含有TCDD的样品与AhR和核酸示踪剂在一个玻璃容器中接触；
b)  将蛋白-核酸复合物转移到微量滴定条或板的孔中，使用标准的ELISA技术和一种能够结合到微量滴定孔上的针对ARNT的抗体，例如蛋白A，将活化的TCDD-Ah受体/ARNT复合物捕获；
c)清洗条以除去未捕获的物质；
d)通过核酸示踪剂检测捕获的DNA效应元件，其中PCR试剂被加入到微量滴定条或板的每个孔中，在扩增的起始加热步骤中使复合物变性并使示踪剂解离。如果使用替代的扩增技术进行检测，专业技术人员将意识到，只要适用，无热的变性可以通过热、化学(例如用盐、去污剂等处理)或酶法完成。
在本发明的分析方法的另一个实施方案中，活化的转录因子的捕获可以通过用重组蛋白取代活化转录因子的天然存在的成分而得以促进。例如被修饰的融合蛋白，使其能够提供便于捕获或识别蛋白的附加的多肽序列。例如，这样的附加的多肽序列可以包括用于结合抗体的抗原决定簇、用于将蛋白A结合在固体表面上的抗体的Fc部分、谷胱苷肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、His(n)、FLAG和/或Strep标签等等。这些可筛选的标签在本技术领域内是众所周知的，本领域技术人员完全可以获得(参见AA版的《重组蛋白手册(THE RECOMBINANT PROTEIN HANDBOOK)》，AmershamPharmacia Biotech，目录号18-1142-75，在此以其全文引为参考)。
一个这样的标签是谷胱苷肽-S-转移酶(GST)，编码它的载体可以从Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，New Jersey)购买到。这些载体被用于制备带有目的DNA结合蛋白的标记融合部分。表达和纯化GST融合蛋白的步骤是广泛可用的，来源包括制造商例如Amersham Pharmacia Biotech和Sigma Chemical Co.。例如，Amersham Pharmacia以目录号27-4570-01销售GST纯化形式。这个步骤可以从毫升级放大到升级原培养液的规模而不影响收率。使用标准的固相材料，例如与谷胱苷肽共价连接的或用抗GST抗体包被的琼脂糖或聚苯乙烯，可以容易地分离这样的标记融合蛋白。如同下面将会举例的那样，表达ARNT-GST融合蛋白的载体在小量的大肠杆菌培养物中进行筛选和表达。ARNT-GST融合蛋白被抽提并收集在GST-琼脂糖(Sigma Chemical Co.)上。
固相支持物可以是任何适合的基片或表面。为了易于操作，可以是可购买到的反应表面，例如设计用于PCR分析的有孔条。也可以使用珠子或者磁性珠子以便于操作。
复合的DNA(即复合的核酸示踪剂)的检测通过核酸扩增来完成，最简单的是PCR。其它本领域内熟知的核酸扩增方法也可以使用，例如连接酶链反应(LCR)、连接活化转录(LAT)、滚环扩增技术(RCAT)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和飞镖DNA扩增(Boomerang DNA Amplification)(BDA)。
PCR扩增的DNA可以通过任何一种本领域所熟知的方法容易地检测，其中必需的成分可以以试剂盒的形式购买到。用于PCR的引物，如同此处所举例的，可以由专业技术人员制备，用于使用PCR方法与包含在核酸示踪剂中的引物识别序列杂交，所述方法是众所周知的，并在Mullis的美国专利Nos.4,683,195和4,683,202和Wang等的美国专利No.5,219,727中有描述，这些专利在此引为参考。此外，可接受的引物可以从本领域的专业技术人员所熟知的各种来源购买到。例如，生物素化和荧光标记的引物可以购买到，使得扩增的DNA被捕获在亲和素包被的孔上，使用过氧化物酶偶联的抗荧光素抗体允许快速地收集定量数据。
本领域的专业技术人员将会理解并意识到，当受体是例如AhR时，核酸示踪剂内的DNA效应元件是二噁英效应元件。核酸示踪剂应该含有至少一个DRE序列，它侧接本领域的专业技术人员所熟知的适用引物识别序列。许多工作，包括例如Swanson，H.I.等，1995 J Biol Chem 270(44)：26292-302，显示了DRE共有序列是TNGCGTG。b-珠蛋白序列和基本的PCR方法在Vahey，M.T.等的《PCR引物：实验指南(PCR PRIMER：A LABORATORYMANUAL)》，17-21，1995中有描述，其公开内容在此以全文引为参考。
B、用于检测分析物的分析试剂盒
希望用任何常规的测试试剂盒的形式执行本发明分析方法的各种实施方案。例如，分析试剂盒可以包括支持物如磁性珠子、捕获板或捕获条，如用捕获材料如蛋白A包被的捕获板或捕获条。支持物也可以用固定在其上的捕获抗体(例如抗ARNT抗体)来制备。试剂盒还可以被制备成含有一定量的转录因子，优选为冷冻或冻干的形式，以及其他转录因子活化或转化所需的细胞成分，和核酸示踪剂。活化的复合物所需的转录因子和/或成分也可以在试剂盒中提供。受体(例如AhR异源二聚体)在存在核酸示踪剂的情况下与分析物任选结合，并将得到的混合物与固相支持物结合，以便产生的蛋白/核酸复合物结合到支持物上，优选通过上述的抗-ARNT抗体方案。在除去未结合的物质后，核酸示踪剂通过使用此处描述的核酸扩增方法直接检测捕获的核酸示踪剂来进行检测和/或定量。
C、检测活化的转录因子的分析方法
在另一个实施方案中，本发明的方法包括下列一系列步骤：利用活化的受体与含有引物识别序列和相应的DNA效应元件的核酸示踪剂选择性地结合形成蛋白-核酸复合物，然后通过任何标准技术的核酸扩增方法定性或定量检测选择性结合的核酸示踪剂的存在。在本实施方案中，分析鉴定了在体内活化的转录因子，以便诊断与已知能够引起转录因子活化的特定的紊乱、有毒物质、毒素或感染性试剂的接触。
这些步骤概述如下：
a)从被测试的动物或人的细胞或组织中提取或获得活化的转录因子；
b)使活化的转录因子结合到含有核酸扩增引物识别序列和DNA效应元件的核酸示踪剂上，形成蛋白-核酸复合物；
c)将蛋白-核酸复合物与未复合的核酸示踪剂分离开来；并且
d)通过扩增检测和/或定量复合的核酸示踪剂，并且与目的条件相关联。
活化的转录因子从适合于目的转录因子的细胞或组织中获得。因此，为了检测病原生物标记物，通过标准方法(例如离心)从血液中分离或纯化免疫细胞，然后从免疫细胞中提取含有活化的转录因子的组分。在优选情况下，提取的活化的转录因子不与内源的DNA效应元件复合。
确定结合的核酸示踪剂的存在，包括通过各种捕获方法将它从未结合的示踪剂和蛋白中分离出来的步骤已经在前面描述过了。当转录因子是AhR、HIF-1a和类似的PAS家族蛋白时，优选的捕获抗体选择性地结合ARNT，其方法也在前面描述过了。
因此，使用捕获抗体在微量滴定条或板上的分析方法包括下列步骤：
a)获得细胞或组织样品(例如来自细胞培养物或来自需要被测试的动物或人类患者)。除非特别指明，在此所用的术语“细胞”或“组织”包含了血液及其组分；
b)从细胞或组织中提取含有活化的转录因子的组分；
c)将据信含有活化的转录因子的提取物转移到条或板的孔中，使用被蛋白A结合到微量滴定孔上的针对ARNT的抗体(ELISA技术)捕获活化的复合物；
d)清洗条以除去未被捕获的物质；以及
e)通过核酸示踪剂检测捕获的DNA效应元件，其中PCR试剂如上所述加到条或板的每个孔中。
在另一个优选实施方案中，活化的转录因子的捕获可以通过用重组蛋白取代活化的转录因子复合物的天然存在的成分而得以促进。如同前面已经详尽地描述的那样，这样的融合蛋白可以被修饰，使其能够提供便于捕获或识别蛋白的附加的多肽序列。
如上所述，固相支持物可以是任何适合的基片或表面，以及确定蛋白-核酸复合物的测定方法也如上所述。
D、用于检测活化的转录因子的分析方法的分析试剂盒
希望用任何常规的测试试剂盒的形式执行本发明的检测方法。例如，分析试剂盒可以包括支持物如磁性珠子、捕获板或捕获条，如用捕获材料如蛋白A包被的捕获板或捕获条。支持物也可以用固定在其上的捕获抗体(例如抗ARNT、ER或GR抗体)来制备。试剂盒还可以被制备成含有一定量的特异性针对目的转录因子的核酸示踪剂，相关缓冲液和清洗液。
E、核酸示踪试剂
本发明的核酸示踪试剂经过独特的设计，用于包含了核酸扩增的检测分析方法。这种新的分析试剂包含了至少一种核酸引物识别序列和至少一种能够结合活化的转录因子的DNA效应元件，并且可以通过本领域的专业技术人员熟知的普通方法进行构建。具体来说，为了扩增，引物识别序列应该被最适化，记住的是，最适扩增的关键参数是正确的序列设计和位置，从而减少非特异性产物的生成，降低背景，并且在反应的指数期产生在数量上接近产物积累理论值的产物。在指数扩增中，在每个退火步骤中即使是小的无效率也将会累积并导致扩增产物的显著减少(Dieffenbach和Dvdksler编辑的《PCR引物实验指南(PCR PRIMER，A LAVORATORYMANUAL)》，冷泉港实验室出版社，1995)。
使用最小长度的能够保证对于选定的扩增方法具有最适的熔化温度的识别序列，为维持特异性和效率提供了最好的机会。对于PCR来说，如果该PCR的退火温度被设定在引物Tm值(被定义为引物/模板双螺旋的解离温度)几度的范围内，18到24个碱基之间的引物往往具有很高的序列特异性。引物识别序列和引物之间完全碱基配对最适合于获得好的结果。此外，在引物对中GC含量和Tm应该匹配好。匹配不好的引物对可能是低效和低特异性的，因为Tm值较低时特异性降低；具有较高Tm值的引物在这些条件下具有较高的错误引发的机会。引物识别序列的关键设计也将消除引物二聚体现象。
在本技术领域可以获得众多被设计用来构建引物的软件程序，它们可以被用来设计引物识别位点。
如前所述，DNA效应元件是与转录因子结合的基因或基因区域相关或“相容”的DNA序列，并调控基因的转录。到目前为止已经鉴定的DNA效应元件被首先在此文献中提出，并随后被提交到序列数据库中，例如DDBJ、EMBL、Genebank和TRANSFAC中，其内容在此以其全部引为参考。
一般情况下，按照目的DNA或RNA分子内一段特异性序列作为已经存在的核酸模板来设计引物。在这些情况下，引物被设计成在扩增的特异性和扩增的效率之间获得平衡。在本发明中，对引物识别序列进行了设计，以便可以在分析中使用最好的引物组，使得扩增过程中的关键参数得以最适化。
实施例
在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行修改和变化，这对于本领域的专业技术人员来说是显而易见的。下面描述的特定的实施方案仅仅是提供例子，本发明只受所附权利要求中的术语以及这些权利要求所给予的等同物的全部范围的限制。
实施例1
试剂的准备
A、Ah受体的制备
含有AhR的异源聚体通过标准方法从哺乳动物肝细胞获得。这些细胞包括Hepa 1c1c7肝细胞瘤细胞和啮齿动物肝。Hepa 1c1c7得自美国典型培养物保藏中心ATCC，编号No.CRL 2026。啮齿动物包括C57BS/6J小鼠、Long-Evans大鼠和Hartley豚鼠，从Jackson实验室或Charles Rivers实验室获得。
Hepa 1c1c7细胞被如下处理：
MENDG缓冲液的组成为25mM MOPS、1mM EDTA、0.02％NaN3(重量/体积比)、1mM DTT、10％甘油(体积/体积比)、1X蛋白酶抑制剂(SigmaP2714)，pH7.5。
简单来说，Hepa 1c1c7细胞的平板被生长到汇合，用冷PBS洗涤。将细胞刮到磷酸盐缓冲液(PBS)中，1000xg离心5分钟。细胞沉淀被重新悬浮在MENDG中，大约50×150mm的平板制备8ml。然后在冰上通过超声裂解细胞，使用两次20秒的脉冲。此外，细胞也可以使用M-PER哺乳动物蛋白提取试剂(Pierce，Rockford，IL 61105)按照制造商的说明书进行裂解。裂解液在4℃、105,000g超速离心1小时。含有AhR异源聚体的上清液，即细胞液被分成等份，在-70℃冷冻直到使用。
啮齿动物肝的获得和处理如下。动物通过暴露在CO2中或扭颈处死。取出肝脏，立刻浸泡在PBS中或用HEDG缓冲液(含有25mM HEPES(N-2[2-羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]钠盐，1.0mM EDTA(乙二胺四乙酸四钠盐)，1mM DTT(DL-二硫苏糖醇)，10％甘油(体积/体积比)，pH7.6)灌注，切碎并浸泡在PBS中。肝脏被磨细并在冰冷的HEDG中使用Teflon-玻璃Potter-Elvehjem组织匀浆器匀浆。匀浆液在4℃、10,000g离心20分钟。上清液在4℃、100,000g离心60分钟。每次离心后，表面的脂被吸出。含有AhR异源聚体的细胞液被储存在-70℃。
B、制备特异性针对Ah受体的核酸示踪剂
核酸示踪剂的互补链命名为DRE1和DRE2，被商业化合成。二噁英效应元件核苷酸序列在本领域内是已知的，在前面提供的参考文献中已经公开。引物识别序列从前面的参考文献所公开的引物序列中选择，或使用商业化的核酸软件设计。
DRE1(SEQ ID NO：1)
CAACTTCATCCACGTTCACCTCGAGCTGGGGGCATTGCGTGACAAGCCGTACCTGTCCTTGGCTCTTC
DRE2(SEQ ID NO：2)
GAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCTTGTCACGCAATGCCCCCAGCTCGAGGTGAACGTGGATGAAGTTG
下划线的序列是二噁英效应元件，寡聚核苷酸每端的20个核苷酸含有引物识别序列。引物(PRIA和PRIB)被商业化合成，没有修饰，用于凝胶和地高辛检测步骤。
PRIA，GAAGAGCCAAGGACAGGTAC(SEQ ID NO：3)
PRIB，CAACTTCATCCACGTTCACC(SEQ ID NO：4)
核酸示踪剂分子通过将互补的寡核苷酸链(例如DRE1和DRE2)退火而制备。1μM的互补寡核苷酸溶液被加热到95℃1分钟、80℃1分钟、65℃1分钟，然后冷却到室温。稀释10倍得到100nM的退火模板溶液，分成等份储存在-20℃。
C、制备缓冲液、蛋白A条和捕获条
洗涤缓冲液A被制备成含有10mM Tris、150mM NaCl和0.1％NaN3(重量/体积比)，pH7.6。
蛋白A包被的微量滴定条的制备方法是用50μl蛋白A的碳酸盐缓冲液包被TopYieldTM微量滴定条(“strips”)(Nunc，Denmark)，然后将滴定条在37℃保温1到1.5小时。每个微量滴定条含有8个薄壁的孔，其格式允许使用自动洗板机和与96孔板相容的热循环仪。
蛋白A包被的微量滴定条用洗涤缓冲液A清洗3次，在每个孔中加入100μl封闭缓冲液(5％脱脂奶粉的洗涤缓冲液A(重量/体积比))。蛋白A包被的微量滴定条于4℃储存在封闭缓冲液中直到使用。
然后使用上述的蛋白A包被条制备捕获条，方法如下：针对芳基碳氢化合物受体核转运蛋白(ARNT)的抗体作为抗-HIF-1β从Novus Biologicals公司(Littleton，CO)获得，并在Hybrizyme分析缓冲液(从Hybrizyme公司，Raleigh，NC购买)中稀释1000倍。蛋白A条用洗涤缓冲液B(洗涤缓冲液A加入0.05％吐温20(重量/体积比))清洗3次。在蛋白A条的每个孔中加入50μl稀释的抗体，振动保温1到1.5小时。抗体包被的条在洗涤缓冲液B中清洗3次以除去没有与蛋白A结合的抗体，然后立刻使用。
另一种抗体也被成功地应用于捕获。这是兔抗AhR多克隆抗体，其被引发结合鼠AhR的第1-402位氨基酸残基。这种多克隆抗体在Pollenz，RS，Sattler，CA，Poland，A Mol.Pharm.，45，428-438(1994)中有详细的描述，在此引为参考。兔抗AhR捕获条的制备方法如同上述用于抗ARNT抗体的方法。
D、ARNT-GST融合蛋白的制备
一个编码鼠ARNT的第1-474位氨基酸的截短的cDNA(Reyes，H.等，1992 Science 256：1193-1195)被克隆到pGEX-4T载体1、2和3中(AmershamPharmacia Biotech公司，目录号27-4580-01、27-4581-01、27-4582-01)，其中使用的cDNA是按照Reisz-Porszasz等，1994，Molecular and CellularBiology 14(9)：6075-6086和Pongratz等，1998，Molecular and Cellular Biology18(7)：4079-4088中描述的过程使用PCR扩增出来的，这些文献在此以其全文引为参考。
下面步骤中的GST融合蛋白是从1升带有重组构建体的细菌(大肠杆菌BL21)的分批培养液中通过常规方法制备的。在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中生长过夜的饱和培养液10ml，用含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基稀释到1升，在水浴摇床中于37℃培养2.5小时。基因表达是在tac启动子控制之下，通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)直到终浓度为O.1mM，然后继续培养2.5小时来进行诱导。细菌培养液在4℃、7700g离心10分钟收获，上清液丢弃。细菌用PBS洗涤，在2ml离心管中重新离心收集。吸取上清液并丢弃。得到的细菌沉淀在液氮中冷藏直到进行下一步处理。
向细菌沉淀中加入裂解缓冲液(20mM Tris，pH8.0，0.1M NaCl，10％甘油(体积/体积比))，将沉淀重新悬浮。然后在悬浮的细菌中加入溶菌酶到150μg/ml，接着将悬浮液在冰上保温30分钟。加入DL-二硫苏糖醇(DTT)到5mM的浓度。加入N-十二烷基肌氨酸到O.8％的浓度(重量/体积比)，然后将细胞在冰上保温15分钟。细菌在冰上超声破碎两次，每次30秒。加入蛋白酶抑制剂(Sigma P2714)到终浓度为1X，裂解液在4℃、40,000g超速离心45分钟。向上清液中加入Triton X-100到1％(体积/体积比)。在提取液中加入2ml用PBS洗过的谷胱苷肽琼脂糖(Sigma G4510)，轻轻摇动1小时。通过在500g离心将琼脂糖在PBS中洗3次。用10mM还原型谷胱苷肽的50mM Tris pH8.0分批混合30分钟洗脱GST蛋白。纯化的蛋白分成等份在-20℃冷冻。10μl的等份样品在SDS-PAGE中分析，用考马斯蛋白染色显色。
E、生物素标记的ARNT的制备
如上所述对GST融合的ARNT进行纯化。大约1ml 200μg/ml的ARNT溶液在Slide-A-Lyzer透析盒(Pierce，产品号66415、66425)中于4℃对pH8.0的PBS透析过夜。使用18号针头，将2mg/200μl的Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce，产品号21430)水溶液3、5或20μl注射到透析盒中。透析盒在一个台式摇床上于室温摇动30分钟。然后将透析盒于4℃对pH8.0的20mM Tris透析过夜。
暴露到3、5或20μl/ml Sulfo-NHS-LC-生物素的生物素酰化的ARNT样品通过凝胶电泳和Western印迹进行分析。加入生物素后ARNT制备物的迁移受到轻微地滞留。在每种Sulfo-NHS-LC-生物素浓度被生物素酰化的ARNT都可以被针对GST的抗体识别，并与链亲和素HRP反应。
F、中性亲和素(Neutravidin)条的制备
微量滴定条(Nunc TopYield)用50μl 5μg/ml中性亲和素(Pierce，产品号31000)的碳酸盐缓冲液包被，并在37℃保温1小时。条用洗涤缓冲液A洗3次，然后与150μl封闭缓冲液(5％脱脂奶粉(重量/体积比)的洗涤缓冲液A)在室温保温30分钟，然后储存在4℃，最多可以两个星期。使用前，微量滴定条用洗涤缓冲液B洗3次。
G、抗体包被的磁性微粒的制备
抗缺氧诱导因子-1β(a/k/a ARNT)多克隆抗血清从Novus Biologicals公司购买(Littleton，CO，产品号NB100-110)。抗血清的IgG部分使用ImmunoPure IgG(蛋白A)纯化试剂盒(Pierce，产品号44667)按照生产商的说明进行制备。从200μl抗血清制备了大约1mg IgG。Ser-Mag磁性羧化修饰的微粒从Seradyn，Indianapolis，IN(产品号294290050250)购买。抗体与珠子的连接在按照生产商的建议进行预活化共价连接后进行。
在预活化步骤中将下列试剂混合在1.5ml微量离心管中：100μl 500mMpH6.1的MES缓冲液，100μl 10％的微粒固体悬浮液(重量/体积比)，230μlNHS(50mg/ml水)，110μl EDAC(10mg/ml水)和360μl水。离心管在混合轮上于室温混合30分钟。微粒被离心，上清液丢弃。微粒被重新悬浮在1ml50mM pH6.1的MES缓冲液中，离心，上清液丢弃。沉淀用100μl 500mMpH6.1的MES缓冲液、650μl水和250μl抗体(1mg/ml)重新悬浮，使用吸管快速混合。离心管在混合轮上于室温混合1小时。微粒用50mM pH6.1的MES缓冲液洗涤3次。最终的沉淀被重新悬浮于酪蛋白封闭缓冲液(25mMTris，pH8.3，1％酪蛋白(重量/体积比)，100mM NaCl，0.1％NaN3(重量/体积比))或脱脂奶粉(NFDM)封闭缓冲液(25mM Tris，pH8.3，5％NFDM(重量/体积比)，100mM NaCl，O.1％NaN3(重量/体积比))。
H、HIF1-β转录因子的制备
1、人HeLa S3细胞
人HeLa S3细胞用125mM CoCl2维持或处理(Wang & Semenza，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993 90：4304-4308)。从处理或未处理的细胞制备细胞提取液。如前所述从未处理的细胞制备核提取物(Semenza & Wang，Mol.Cell.Biol.1992 12：5447-5454；Dignam等，Nucleic Acids Res.1983 11：1474-1489)。HeLa S3细胞从美国典型培养物保藏中心获得，将其生长在补充有5％(体积/体积比)胎牛血清(Life Technologies，Gaithersburg，Md.)的F 12K培养基的150mm组织培养皿中。
2、细胞提取物的制备
HIF-1 DNA结合活性如下进行诱导。活性分裂的HeLa S3细胞在37℃用125μM的CoCl2处理4小时。细胞在收获前在组织培养皿中用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次。细胞在420g离心5分钟，用PBS洗涤两次，重新悬浮于5倍细胞体积的补充有Sigma蛋白酶抑制剂混合物(P8340，SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo.)的缓冲液A(10mM Tris-HCl(pH7.6)，1.5mMMgCl2，10mM KCl，1mM DTT)中。在冰上保温15分钟后，细胞在450g离心5分钟，重新悬浮于2倍细胞体积的补充有Sigma蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液C(0.42M KCl，20mM Tris-HCl(pH7.6)，20％甘油，1.5mM MgCl2，1mM DTT和0.2mM EDTA)中。细胞使用装有微型头的Branson超声仪450(Branson Ultrasonics Corp.，Danbury，CT)破碎，两次20秒脉冲，占空因素为45％。20,000g离心5分钟后，上清液命名为细胞提取物。来自处理和未处理细胞的细胞提取物被分成等份，储存于-80℃。
3、核提取物的制备
核提取物的制备如下。上述未处理的细胞在420g离心5分钟，用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，并重新悬浮于5倍细胞体积的补充有Sigma蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液A(10mM Tris-HCl(pH7.6)，1.5mMMgCl2，10mM KCl，1mM DTT)中。在冰上保温15分钟后，细胞在450g离心5分钟，重新悬浮于2倍细胞体积的缓冲液A中，在带有B型研杵的玻璃Dounce匀浆器中冲击20次裂解。10,000g离心1O分钟沉淀核，并重新悬浮于2/3沉淀细胞的补充有Sigma蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液C(0.42MKCl，20mM Tris-HCl(pH7.6)，20％甘油，1.5mM MgCl2，1mM DTT和0.2mMEDTA)中。在4℃摇动30分钟抽提核蛋白。20,000g离心5分钟后，上清液命名为核提取物。核提取物被分成等份，储存于-80℃。
I、特异性针对HIF-1a的核酸示踪剂的制备
核酸示踪剂的互补链命名为HRE1和HRE2，被商业化合成。缺氧效应元件(HRE)的核苷酸序列在本领域内是已知的(Semenza等，JBC 1996 271：32529-32537)。引物识别序列从前述的参考文献所公开的引物序列中选择或使用商业化的核酸软件设计。
HRE1(SEQ ID NO：5)
CAACTTCATCCAGTCTCACCGATCGCCCTACGTGCTGTCTCGACTCTGTCCTTGGCTCTAC
HRE2(SEQ ID NO：6)
GTAGAGCCAAGGACAGAGTCGAGACAGCACGTAGGGCGATCGGTGAGACTGGATGAAGTTG
寡核苷酸每端的20个核苷酸含有引物识别序列。引物被商业化合成，并命名为PRIHa和PRIHb。
PRIHa(SEQ ID NO：7)
CAACTTCATCCAGTCTCACC
PRIHb(SEQ ID NO：8)
GTAGAGCCAAGGACAGAGTC
用于检测HRE的寡聚物命名为HRECo1和HRECo2，通过商业化合成，不含有引物识别序列，用于竞争分析。
HRECo1(SEQ ID NO：9)
GATCGCCCTACGTGCTGTCTC
HRECo2(SEQ ID NO：10)
GAGACAGCACGTAGGGCGATC
核酸示踪剂或DNA竞争分子通过将互补的寡核苷酸链(例如分别为HRE1和HRE2，或HRECo1和HRECo2)退火而制备。1μM的互补寡核苷酸溶液被加热到95℃1分钟、80℃1分钟、65℃1分钟，然后冷却到室温。稀释10倍得到100nM的退火模板溶液，分成等份储存在-20℃。
J、雌激素受体试剂的制备
杆状病毒表达的重组人ER-α从Panvera，Madison，WI购买(目录号P2187)。特异性针对人ER的小鼠单克隆抗体从StressGen Inc.，Victoria，British Columbia，Canada购买(目录号SRA-100)，并被包被在抗小鼠IgG条/板上(Wallac，Finland)。
核酸示踪剂含有来自卵黄生成素启动子的单一的ERE，它侧接于实施例1B中描述的引物识别序列。因此PRIA和PRIB被用做引物。
所有的序列是5’到3’方向。
VER1(SEQ ID NO：11)
CAACTICAICCACGTTCACCGTCCAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAAGTTGTACCTGTCCTTGGCTCTTC
VER2(SEQ ID NO：12)
GAAGAGCCAAGGACAGGTACAACTTTGATCAGGTCACTGTGACCTGACTTTGGACGGTGAACGTGGATGAAGTTG
竞争ERE链
DX1 CTAGAAAGTCAGGTCACAGTGACCTG(SEQ ID NO：13)；
DX3 CAGGTCACTGTGACCTGACTTTCTAG(SEQ ID NO：14)
K、糖皮质激素受体试剂的制备
活化的糖皮质激素受体(GR)的检测通过类似上述ER的方法进行。杆状病毒表达的重组GR从Panvera，Madison，WI购买(目录号P2187)。特异性针对GR的兔多克隆抗-GR抗体从Affinity Bioreagents，Goldin，CO购买(目录号PA1-510A)，并被包被在抗小鼠IgG条/板(Wallac，Finland)上。
核酸示踪剂含有来自人酪氨酸氨基转移酶启动子的单一的GRE，它侧接于实施例1B中描述的引物识别序列。因此上述的PRIA和PRIB被用做引物。
所有的序列是5’到3’方向。
BGGR1(SEQ ID NO：15)
CAACTTCATCCACGTTCACCGCTGTACAGGATGTTCTGCCGTACCTGTCCTTGGCTCTTC
BGGR2(SEQ ID NO：16)
GAAGAGCCAAGGACAGGTACGGCAGAACATCCTGTACAGCGGTGAACGTGGATGAAGTTG
竞争GRE链
TGR1 GCTGTACAGGATGTTCTGCC(SEQ ID NO：17)
TGR2 GGCAGAACATCCTGTACAGC(SEQ ID NO：18)
实施例2
二噁英的检测
A、通过实时PCR测量二噁英
在甲醇中制备一组含有万亿分之(ppt或pg/ml)5000、2500、1250、626、313、156和78的2，3，7，8-四氯二苯并-p-二氧芑(TCDD)的标准品。除了TCDD之外，在分析中一组AhR激动剂β-萘黄酮(BNF)的标准品也被制备并分析。另外，在每1ml啮齿动物细胞液中加入25μl稀释50,000倍的10μM核酸示踪剂储液作为AhR的来源，然后分成等份放在玻璃管中。标准品用50-100μl啮齿动物细胞液稀释20倍，在室温到37℃保温1到2小时。保温后，40到100μl反应液被转移到抗体包被的捕获条的每个孔中，并在水平摇床上于室温保温30分钟到1小时。捕获条用清洗缓冲液B洗涤5次并吸干；在每个循环中也可以用清洗缓冲液浸泡孔30秒到5分钟。Taqman通用PCR主混合液(Master Mix)、引物和Taqman探针(Applied Biosystems，CA)被加入，施加上胶粘盖。使用ABI PRISM7700进行PCR和分析，使用缺省的参数设置：50℃2分钟，95℃10分钟，然后95℃15秒和60℃60秒共40个循环。对于每个反应确定一个低限循环(Ct)。Ct代表了一个PCR循环，其中高于基线信号的报告荧光的增长第一次能够被检测到。
当使用来自豚鼠的AhR时，剂量反应曲线的特征包括在分析中EC50为2.6pg TCDD，斜率为-1.042，R方值为0.9975。从使用来自大鼠的AhR所获得的剂量反应曲线中得到同样的结果，包括在分析中EC50为2.8pgTCDD，斜率为-1.208，R方值为0.9989。
代表性的剂量反应曲线的数据概述在下表中。
    剂量反应曲线
    TCDD(ppt)     Ct值
    0     26.29
    78     24.52
    156     23.81
    313     23.16
    625     22.23
    1250     21.3
    2500     20.5
    5000     20.28
通过测定上述分析中BNF的反应性证实了AhR的药理学。BNF是一种激动剂，对Ah受体的亲和性比TCDD低大约1个数量级(Carver等，1994JBC 269：30109-30112)。同时对TCDD和BNF进行反应得到的剂量反应曲线数据分别包括EC50为4pM，斜率为-1.195，R方值为0.9990和EC50为40pM，斜率为-0.7637，R方值为0.9993，表明AhR受体的药理学性质在分析中得以保持。
由于实时PCR固有的优势，可以在不到5个小时内分析96个样品。此外，实时PCR可以确保数据收集发生在扩增过程的线性部分，这时分析的灵敏度和精确度是最适的。
B、通过终点PCR测定二噁英
终点PCR也可以用于检测二噁英。制备含有10、100、1000fmol 2，3，7，8-四氯二苯并-p-二氧芑(TCDD)的标准品，每种标准品1μl被分配到一个玻璃试管中。
按照实施例1描述的方法制备Hepa 1c1c7细胞的提取物，为分析提供AhR。100μl NEAT和0.5μl用分析缓冲液稀释的Hepa 1c1c7细胞提取物被加到每个管中，充分混合，给试管加盖或用封口膜封住。然后将样品在室温到37℃保温30分钟到2小时。接着在AhR反应介质中加入盐和鲑鱼精子DNA，浓度分别为50mM到200mM和5到100μg/ml。然后将样品在室温保温0到20分钟。加入核酸示踪剂(1nM)，轻轻混合，以使在TCDD的存在下在活化的AhR和核酸示踪剂之间形成复合物。反应管在室温保温10分钟到1小时。
按照实施例1描述的方法制备用抗ARNT抗体包被的捕获条。然后从每个玻璃管中取出等份的AhR反应介质(25到100μl)转移到相应的捕获条的孔中。捕获条边振荡边于室温继续保温30分钟到1小时。用清洗缓冲液B洗涤孔5次以完全除去未结合的核酸示踪剂；在每个循环中也可以用清洗缓冲液浸泡孔30秒到5分钟。在浸泡步骤中如果需要也可以摇动条。条用水洗两次，最后吸干所有的液体。
使用下面的方法对残留在捕获条上的核酸示踪剂进行PCR扩增：配制PCR主混合液，终浓度如下：含有1.5mM MgCl2、0.2mM dATP、dCTP、dGTP、0.15mM dTTP、0.05mM DIG-dUTP(Roche，Indianapolis，IN)的1X PCR缓冲液，0.5μM每种引物(PRI 1A和PRI 1B)，每个反应0.22-0.25μl Taq聚合酶。在每个孔中加入等份的30-50μl主混合液，然后用胶带封住孔。热循环仪的设置为：94℃20秒，94℃30秒、52℃30秒和72℃30秒共15个循环，然后72℃30秒，并冷却到4℃。
10μl PCR样品通过用抗-DIG检测的ELISA-PCR进行分析，方法如下。
在0.2ml管中用水将PCR样品稀释到30μl。样品在95℃加热3-5分钟。固定化(捕获)探针是：
BDpro＝TGTCACGCAATGCCCCCAGC-生物素(SEQ ID NO：19)。
探针在杂交缓冲液(0.5X分析缓冲液，0.5M NaCl)中稀释到10nM。然后将100μl探针(1pmol)加入到热的样品中，混合，并在37℃保温45分钟。
样品被转移到预先洗过的链亲和素包被的微量滴定条或板上的孔中，该或条板从DELFIA获得，目录号4009-0010(Wallac，Finland)，然后在室温摇动45分钟。用Wallac清洗缓冲液(DELFIA清洗浓缩液，目录号13800865，Wallac，Finland)将条或板洗3次。用于自动洗板机的1XWallac清洗缓冲液从含有Tris、NaCl和TWEEN-20的25X清洗浓缩液(Wallac)制备。
抗DIG抗体(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)在分析缓冲液中稀释1000倍，取100μl加到每个孔中，将条摇动30分钟。然后用Wallac清洗缓冲液将条洗3次。Eu标记的抗小鼠IgG(抗小鼠IgG-Eu，目录号1244-130，Wallac，Finland)在分析缓冲液中稀释50倍，取100μl加到每个孔中。将条摇动30分钟，然后用Wallac清洗缓冲液将条洗3次。加入150μl增强溶液(DELFIA增强溶液，目录号C500-100，Wallac，Finland)，将条摇动1分钟。使用时间分辨荧光在一个Victor 2多标记计数器/读板器(目录号1420-012，Wallac，Finland)上对样品进行计数。被检测到的荧光的量直接与样品中TCDD的量成比例。代表性数据概述在以下表所呈现的剂量反应曲线中。
     剂量反应曲线
    TCDD(fmol)     计数
    0     5430
    1     5770
    10     17287
    100     100645
    1000     504879
上面产生并显示的数据证实了，增加TCDD浓度导致PCR扩增的DNA产量的增加，所述DNA中掺入了地高辛修饰的dUTP。产生了标准的S形剂量反应曲线。这种形式的分析方法的检测限制在1-10fmol TCDD之间。
当复合物象实施例1描述的那样被兔抗-AhR多克隆抗体固定化时，获得了同样的结果。
在另一个试验中，向Hepa 1c1c7细胞提取物中加入AhR激动剂，即BNF的DMSO，与只含有DMSO对照的结果相比，显著并可重复地增加了DNA的信号。
C、通过使用ARNT-GST融合蛋白测定二噁英
制备了含有谷胱苷肽-S-转移酶的重组ARNT融合蛋白(ARNT/GST)，以便GST抗原决定簇能够被抗GST抗体特异性地靶向以结合活化的Ah受体复合物。这是有优势的，因为GST抗原决定簇具有免疫原性，并且商业化制备的抗GST微量滴定板可以从多个生产商获得，包括Pierce、SigmaChemical Co.和Perkin Elmer Life Sciences。
受体在存在ARNT/GST结合伴侣和测试样品的情况下被活化。加入足够的ARNT/GST以取代在Ah受体制备液中存在的内源性ARNT。在一个试管中，将98μl Hepa 1c1c7(0.8mg)提取物与1μl GST-ARNT(50ng)和1μl样品(例如BNF或只有媒介物)在30℃保温1小时。通过将反应混合液与60mMNaCl和2μg鲑鱼精子DNA在室温预先保温15分钟，可以减少核酸示踪剂的非特异性结合。加入核酸示踪剂至50fmol，反应在室温保温20分钟。复合物被捕获在一个可以购买到的96孔抗GST板上(Perkin Elmer Life Sciences，Boston，MA)。抗GST包被的微量滴定板用Wallac清洗缓冲液洗1次，然后加入50μl受体-DNA反应液。板在室温摇动50分钟。
未结合的成分用一系列清洗步骤除去。板用Wallac清洗缓冲液洗3次，然后在每个孔中加入0.1ml Hybrizyme分析缓冲液。摇动5分钟后，该过程再重复2次。在最后一次用分析缓冲液保温后，将缓冲液吸干，加入0.1ml水，不摇动放置10秒。将水吸干。商业化制备的抗GST板的格式不适用于PCR扩增。因此，过量的水被预先加热到99℃，并在每个孔中加入25μl热水以释放出结合的核酸示踪剂，以转移到一个适当的PCR容器中(管、条或板)。样品在PCR扩增前可以短期储存在4℃。
PCR按照实施例2B描述的方法进行。购买时为冻干粉的引物被重新悬浮在pH7.5的TE中至终浓度为100μM。最后的反应体积为50μl，其中25μl来自上述水中的样品。因此，以下生成的主混合液是2X浓度的试剂，但是在终体积50μl中被描述成1X。最终的PCR组成为1XPCR缓冲液(10mM Tris，pH8.3，50mM KCl，0.001％明胶)、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs、1μM每种引物、0.25-0.3μl Taq聚合酶，最后加水直到每个反应为25μl。
阴性对照样品为25μl水加上25μl PCR主混合液。阳性对照样品含有24.5μl水、0.5μl 100nM的退火的模板和25μl PCR主混合液。
热循环仪的设置使用95℃30秒，然后95℃30秒、52℃30秒、72℃30秒共25-30个循环，最后72℃30秒。在分析前将样品冷却到室温，储存在4℃。
样品通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，用溴化乙锭将DNA条带染色，在紫外辐射下观察。一般来说，每个样品20μl在4％的凝胶中分析，从阳性对照能够产生明亮的荧光条带。使用Polaroid 665胶卷为凝胶照相，曝光45秒，对照片和底片进行处理。底片用HPscanjet 2200c扫描，使用ScionImage(Scion Corporation)软件对DNA条带进行定量。
对于β-萘黄酮(10μM)或媒介物(DMSO)取双份样品使用上述的步骤经过30个循环的PCR后进行分析。DMSO对照样品的平均值是363，而含有BNF的样品的平均值是3013。
D、通过使用生物素标记的ARNT测定二噁英
在亲和素/链亲和素-生物素之间发生的结合事件是已知最强的非共价生物相互作用。生物素和亲和素之间的键形成非常快并且稳定，使它成为一种非常耐用和灵敏的分析系统。在本实施例中，Ah受体在存在过量的生物素酰化的ARNT、测试样品和核酸示踪剂的情况下被保温。活化的受体/核酸示踪剂复合物被捕获在一个链亲和素包被的板上。
Ah受体随着剂量的活化是在一个微量离心管中进行的，其中含有50μlAh受体制备液、1μl 200μg/ml生物素酰化的ARNT和1μl 1nM的β-萘黄酮，在30℃保温1小时。为了使非特异性相互作用最小化，1-2μg鲑鱼精子DNA被加入到活化的复合物中，并一同加入NaCl到终浓度为60mM。室温放置10分钟后，加入不同量的核酸示踪剂(50-500fmol)，反应液在室温继续保温10分钟。反应混合物(40μl)被转移到中性亲和素包被的板上，并在Wallac摇板器上于室温保温30分钟。孔用清洗缓冲液B洗5次，在每个循环中用清洗缓冲液将孔浸泡3分钟，然后用超纯水洗两次。
对于PCR分析，加入50μl PCR试剂，孔中的内容物使用GeneAmp PCR系统2700(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行28个循环的PCR扩增。使用50μl以无核酸酶的水稀释到适当浓度的PCR主混合液(Promega，Madison，WI)进行PCR，每个PCR反应使用每种引物1μM。在加入PCR混合液后，用胶带将微量滴定条封住，并放置在热循环仪中。样品首先被加热到95℃5分钟，以使Ah受体/ARNT复合物变性并释放出核酸用于PCR分析，然后94℃30秒、52℃30秒、72℃45秒共进行28个循环，最后72℃5分钟，然后冷却到4℃。
20μl PCR产物用4％的琼脂糖凝胶电泳分析，PCR产物用溴化乙锭染色，在紫外光下观察。使用Polaroid MP4 Land照相机和Polaroid 55型胶卷为紫外光照射的凝胶照相。对胶卷底片进行透射光密度测量，使用任意单位计算峰下的面积。
如下表所示，生物素酰化的ARNT被用做一种有效的捕获系统，从而不需要使用抗体。在本分析方法中，当加入的核酸示踪剂的浓度高于受体浓度时，核酸示踪剂对背景没有明显地增加。
      生物素酰化的ARNT分析
  核酸示踪剂(fmol)     DMSO     BNF
    500     122     392
    250     116     392
    125     126     349
    63     129     459
E、使用磁性微粒测量二噁英
大量的小的球形微粒为捕获抗体结合提供了高的表面积。因为这些微粒在反应过程中也保持悬浮，分子扩散距离短，从而使保温时间最小化。磁性微粒使得在进行清洗步骤时可以使用小的廉价磁铁来分离未结合的物质。在本实施例中，使用磁性微粒代替微量滴定条。
Ah受体随着剂量的活化是在一个微量滴定条中进行的，其中含有50μlAh受体制备液、1μl 200μg/ml生物素酰化的ARNT和1μl 1nM的β-萘黄酮，并在30℃保温1小时。为了使非特异性相互作用最小化，1-2μg鲑鱼精子DNA被加入到活化的复合物中，并一同加入NaCl到终浓度为60mM。室温放置10分钟后，加入核酸示踪剂(50fmol)，反应液在室温继续保温10分钟。在每个孔中加入5μl 10％用抗ARNT抗体包被的微粒的溶液，并在Wallac摇板器上于室温保温30分钟。使用一个被设计用来在微量滴定板中分离磁性微粒的LifeSep 96P磁铁(Dexter，Elk Grove Village，IL)来清洗孔。条被放置在磁性分离器上3分钟。此时珠子已经移动到孔的侧面，通过吸取除去上清液。珠子用150μl清洗缓冲液B再洗4次。捕获珠子，丢弃上清液，重新悬浮在PCR反应混合液中，并按照实施例2B的方法扩增。扩增产物通过凝胶电泳进行分析。与DMSO媒介物对照相比，在BNF样品中观察到了DNA的显著提高。
实施例3
活化的Ah受体的检测
为了证实在先前已经接触到二噁英类化合物的细胞(或组织)中能够检测到活化的Ah受体，进行了下面的实验。Hepa 1c1c7细胞在Dulbecco氏修饰的Eagle氏培养基和8％胎牛血清中生长直到接近汇合。用10μM β-萘黄酮(BNF)的DMSO将细胞处理1小时。用冰冷的PBS清洗两次，然后1000g离心收获细胞。然后将细胞悬浮在5倍细胞沉淀体积的10mM HEPES(pH7.5)中，放置10分钟。
悬浮的细胞通过离心再次收集，然后重新悬浮在2倍细胞沉淀体积的25mM HEPES(pH7.5)、3mM MgCl2、1mM DTT中，接着在带有B型研杵的Kontes全玻璃Dounce匀浆器中冲击10次裂解。得到的匀浆液用显微镜检查以证实细胞的裂解，然后在1000g离心10分钟沉淀核。
核提取物的制备如下。核被重新悬浮于含有0.4M KCl的25mMHEPES(pH7.5)、3mM MgCl2、1mM DTT中，并保温30分钟。在30分钟保温过程中悬浮液被不时地震荡，然后在微量离心管中高速离心。在上清液中加入甘油到终浓度为10％。在测试前将核提取物稀释以降低其中的盐浓度。稀释液是事先煮沸以使蛋白因子失活然后又冷却到室温的Hepa 1c1c7细胞提取液。加入核酸示踪剂(50fmol)，轻轻混合以便在BNF存在的情况下在活化的AhR和核酸示踪剂之间能够形成复合物。反应管在室温保温10分钟到1小时。
用抗ARNT抗体包被的捕获条按照实施例1中的方法制备。然后将等份的AhR反应介质(25到100μl)转移到捕获条的相应孔中。捕获条在室温边摇动边继续保温30分钟到1小时。孔用清洗缓冲液B洗5次，在每个循环中将孔用清洗缓冲液浸泡2-5分钟，以便彻底除去未结合的核酸示踪剂。条用水洗两次，最后吸干所有的液体。残留在捕获条中的核酸示踪剂用前述的方法进行PCR扩增。
当在分析中使用来自与BNF接触的细胞的核提取物时，与从用媒介物DMSO处理的细胞中获得的核提取物相比，观察到PCR扩增的DNA量有显著和可重复的增长。本实施例为二噁英暴露提供了一个定性的标记，不需要对样品中的二噁英进行提取和测试。
实施例4
活化的雌激素受体的检测
在本实施例中，抗体包被的孔在存在或不存在雌二醇或竞争核酸ERE试剂的情况下，捕获了活化的ER。在竞争ERE的核酸序列中，为防止扩增，引物识别序列被消除了。
ER(3.5pmol)在0.1ml中与或不与100nM 17β-雌二醇的结合缓冲液(25mM Tris，pH8.0，50mM KCl，5％甘油(体积/体积比)，0.5mM DTT，40μg/ml鲑鱼精子DNA)，于4℃保温15分钟。在一些样品中加入摩尔数过量100倍的退火的竞争双链体。加入核酸示踪剂(3.5pmol)，反应液在4℃保温15分钟。
在事先包被了抗ER条的每个孔中加入50μl反应介质保温。这些条的制备方法是，将用分析缓冲液稀释200倍的抗ER抗体在抗IgG条中保温30到45分钟，摇动，然后用清洗缓冲液B洗涤3次。
在捕获了受体-DNA复合物后，按照实施例2B中描述的方法完全洗去未结合的物质。被洗脱的DNA的PCR扩增按照实施例2B中描述的方法进行，差别只在于进行26个循环的PCR。扩增产物如上述通过凝胶电泳进行分析。本实施例中使用的杆状病毒表达的重组人ER-α进行DNA结合不依赖于配体活化。用DMSO和雌二醇处理的ER都表现出高于背景的受体活性，如下表所示。
          受体活性
    测试试剂     ER活性1
    DMSO     137
    雌二醇     104
    雌二醇+竞争剂     81
1从阴性对照PCR获得的背景从数据中减去了。
竞争核酸试剂的存在显著地降低了表明分析特异性的信号和分析方法检测ER活化状态的能力。
实施例5
活化的糖皮质激素受体的检测
在本实施例中，抗体包被的孔在存在或不存在地塞米松或竞争GRE的情况下，捕获了活化的GR。竞争GRE不含有与所加入的引物互补的序列，因此不会被PCR扩增。GR(1pmol)在0.1ml中与或不与100nM地塞米松的结合缓冲液(25mM Tris，pH7.9，60mM KCl，10％甘油(体积/体积比)，2mMDTT，40μg/ml鲑鱼精子DNA)，于4℃保温15分钟。
在一些样品中加入摩尔数过量100倍的退火的竞争双链体。加入核酸示踪剂(0.5pmol)，反应液在4℃保温15分钟。在事先包被了抗GR条的每个孔中加入50μl反应液保温。这些条的制备方法是，将用分析缓冲液稀释200倍的抗GR抗体在抗IgG条中保温30到45分钟，摇动，然后用清洗缓冲液B洗涤3次。在捕获了受体-DNA复合物后，按照实施例2B中描述的方法完全洗去未结合的物质。被洗脱DNA的PCR扩增按照实施例2B中描述的方法进行，差别只在于进行25个循环的PCR。
扩增产物如上述通过凝胶电泳进行分析。面积通过减去阴性对照值(33)而校正，校正后的阳性对照值是142。用DMSO和地塞米松处理的GR都表现出高于背景的受体活性，如下表所示。
          受体活性
    测试试剂     GR活性1
    DMSO     82
    地塞米松     68
    地塞米松+竞争剂     44
1从阴性对照PCR获得的背景从数据中减去了。
本实施例中使用的杆状病毒表达的重组子进行DNA结合不依赖于配体活化。过量的核酸竞争剂显著地减少了通过扩增获得的信号。该竞争表明了特异性受体-DNA相互作用。杆状病毒表达的ER和GR是已经受到活化，但是从体内来源和其它体外表达系统得到的ER和GR需要配体活化才能发生DNA结合。尽管在上述的具体实施例中，ER和GR可以分别被用来检测与每个受体进行特异性相互作用的分析物，它们的使用是为了证实对活化受体的检测。
实施例6
缺氧诱导因子-1α活化的检测
HIF-1α诱导的检测是通过将未处理细胞和接触到125mM氯化钴的细胞中的FIH-1α水平进行比较而实现的。象上面讨论的那样，在各种刺激物中，钴已知能够诱导HIF-1α。分析的主要步骤如下进行。
如上所述，从对照和诱导的Hela细胞制备细胞提取液。提取液用HEDG(25mM HEPES pH7.6，1mM EDTA，1mM DTT和10％甘油)稀释，并在每个微量离心管中加入50μl反应介质。加入核酸示踪剂(50fmol)并轻轻混合，使得在HIF-1α/ARNT和示踪剂之间形成复合物。在某些实验中，加入100XDNA竞争剂。反应管在室温保温10分钟。用抗ARNT抗体包被的捕获条如上制备。然后从每个微量离心管中取出40μl等份反应介质转移到捕获条的相应孔中。捕获条在室温边摇动边继续保温30分钟。孔用清洗缓冲液B洗5次，在每个循环中将孔用清洗缓冲液浸泡2-5分钟，以便彻底除去未结合的核酸示踪剂。
残留在捕获条中的核酸示踪剂用前述方法进行PCR扩增。
引物PRIHa和PRIHb(终浓度0.9μM)被加到2XPCR SYBRGreen主混合液(Applied Biosystems，目录号4309155)中，主混合物用水配制成1X。通过在每个孔中加入60μl主混合液，用胶布封住孔，在Applied BiosystemsGeneAmp 2700热循环仪中将条加热到95℃9分钟，使DNA从孔的表面洗脱下来。然后从每个孔取出50μl主混合液转移到一个PCR板上，加盖，并使用Opticon热循环仪(MJ Research，Inc.，Watham，Ma.)通过实时PCR进行分析。热循环仪设置为：95℃1分钟，然后95℃15秒、60℃1分钟共40个循环。获得熔点曲线以证实SYBR Green的结果。
简单地说，将从未处理或CoCl2处理的细胞制备的细胞提取液稀释，然后暴露到核酸示踪剂中。复合物被转移到一个用抗ARNT多克隆抗体包被的微量滴定板中，并进行结合。洗去未结合的核酸示踪剂，加入PCR反应混合液。使用实时PCR监测DNA的扩增。该过程仅需几个小时就能完成，可以提供定性或定量的结果。
PCR数据一般作为初级生长曲线作图。出于定量和比较的目的，对于每个样品确定一个低限循环(Ct)。低限可以是一个高于背景的任意信号，也可以是一定量高于背景的标准偏差。通常，Ct值在接近PCR产物以最高的速度被扩增(没有试剂限制)以及扩增产物在高于背景下被检测到的第一个循环进行计算。检测通过使用SYBR绿色探针来进行。结果概述于下面的表1中。
                             表1
    1     2     3     4
细胞液   处理的   未处理的     处理的     未处理的
DNA竞争剂     加上     加上
Ct值   20.47   23.08     22.52     22.58
处理和未处理的细胞制备液的Ct值的差别超过2.60单位。作为单凭经验的方法，一个Ct单位的差别大约相当于3倍的DNA浓度的差别。加入竞争DNA完全阻止了未结合的核酸示踪剂与HIF-1α/ARNT复合物的结合，因此表明了DNA结合的特异性。
为了确定HIF-1是否能够在未处理细胞中得以检测，制备了含有更浓的HIF-1的核提取液，含有或不含有添加的竞争DNA的该提取液的Ct值被测定。下面的表2显示了在核提取物中加入竞争DNA明显抑制了DNA的结合，证实了未处理的HIF-1能够使用RC PCR分析方法进行检测。
               表2
    核提取液     1     2
    竞争DNA     加上
    Ct     23.5     26.51
在本申请中提到了许多出版物、专利、专利申请和其它文献，它们所有在此引为参考。
尽管在此已描述了目前被相信是本发明优选的实施方案，但本领域的专业技术人员将会认识到，可以对本发明进行改变和修饰而不偏离本发明的精神。所有这样的改变和修饰都要求保护，如同落入本发明的真正范围内。
                              序列表
<110>海布瑞泽姆公司(HYBRIZYME CORPORATION)
<120>受体捕获分析方法(RECEPTOR CAPTURE ASSAY)
<130>SCT041573-47
<140>
<141>
<150>PCT/US02/35262
<151>2002-11-01
<150>60/336,065
<151>2001-11-02
<150>60/369,789
<151>2002-04-03
<160>19
<170>PatentIn Ver.3.2
<210>1
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>1
caacttcatc cacgttcacc tcgagctggg ggcattgcgt gacaagccgt acctgtcctt 60
ggctcttc                                                          68
<210>2
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>2
gaagagccaa ggacaggtac ggcttgtcac gcaatgcccc cagctcgagg tgaacgtgga 60
tgaagttg                                                          68
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸引物
<400>3
gaagagccaa ggacaggtac                                             20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸引物
<400>4
caacttcatc cacgttcacc                                             20
<210>5
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>5
caacttcatc cagtctcacc gatcgcccta cgtgctgtct cgactctgtc cttggctcta 60
c                                                                 61
<210>6
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>6
gtagagccaa ggacagagtc gagacagcac gtagggcgat cggtgagact ggatgaagtt 60
g                                                                 61
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸引物
<400>7
caacttcatc cagtctcacc                                             20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸引物
<400>8
gtagagccaa ggacagagtc                                             20
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>9
gatcgcccta cgtgctgtct c                                           21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>10
gagacagcac gtagggcgat c                                           21
<210>11
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>11
caacttcatc cacgttcacc gtccaaagtc aggtcacagt gacctgatca aagttgtacc 60
tgtccttggc tcttc                                                  75
<210>12
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>12
gaagagccaa ggacaggtac aactttgatc aggtcactgt gacctgactt tggacggtga  60
acgtggatga agttg                                                   75
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>13
ctagaaagtc aggtcacagt gacctg                                        26
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>14
caggtcactg tgacctgact ttctag                                        26
<210>15
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>15
caacttcatc cacgttcacc gctgtacagg atgttctgcc gtacctgtcc ttggctcttc   60
<210>16
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>16
gaagagccaa ggacaggtac ggcagaacat cctgtacagc ggtgaacgtg gatgaagttg         60
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>17
gctgtacagg atgttctgcc                                                    20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸
<400>18
ggcagaacat cctgtacagc                                                    20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸探针
<400>19
tgtcacgcaa tgcccccagc                                                    20

Claims (27)

1.一种用于快速检测样品中的分析物的分析方法，该分析方法包括下列步骤：
(a)将该样品与下列物质接触：
1)一种转录因子分析试剂，该试剂能够特异性结合该分析物，其通过与该分析物接触被转化产生功能上与相容的DNA效应元件结合的活化转录因子；和
2)含有至少一个核酸引物识别序列和至少一个能够结合活化转录因子的DNA效应元件的核酸示踪剂；
所述样品在促进蛋白-核酸复合物形成的条件下，同时或顺序地与该转录因子分析试剂和该核酸示踪剂接触；
(b)将该复合物与未复合的核酸示踪剂分离；以及
(c)通过核酸扩增检测复合的核酸示踪剂的存在；
其中扩增的核酸示踪剂的存在表明在样品中存在分析物。
2.权利要求1中的分析方法，其中所述核酸扩增主要选自PCR、LCR、RCAT、LAT、TMA、NASBA、BDA和SDA。
3.权利要求2中的分析方法，其中核酸扩增是实时PCR。
4.权利要求1中的分析方法，其中所述转录因子分析试剂主要选自类固醇激素超家族受体、PAS超家族蛋白、Stat家族转录因子、Rel或NFkB家族蛋白、CREB家族蛋白和AP-1家族蛋白。
5.权利要求4中的分析方法，其中所述转录因子分析试剂主要选自类固醇激素超家族受体和PAS超家族蛋白。
6.权利要求5中的分析方法，其中所述转录因子分析试剂主要选自芳基碳氢化合物受体、雌激素受体和糖皮质激素受体。
7.权利要求1中的分析方法，其中将所述复合物与未复合的核酸示踪剂分离所用的技术主要选自凝胶过滤层析、离心过滤、疏水分离、基于带电膜的分离、羟基磷灰石分离、抗体沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、聚乙二醇沉淀和二氧化硅沉淀。
8.权利要求1中的分析方法，其中将所述复合物与未复合的核酸示踪剂分离的方法是，将所述复合物或未复合的核酸示踪剂与一种能够与所述复合物或未复合的核酸示踪剂选择性结合的试剂相接触。
9.权利要求8中的分析方法，其中将所述复合物与未复合的核酸示踪剂分离的方法是，将所述复合物与一种能够与所述复合物的抗原决定簇选择性结合的抗体相接触。
10.权利要求8中的分析方法，其中所述试剂被固定在固相支持物上。
11.权利要求10中的分析方法，其中所述支持物主要选自试管、微量滴定孔、微量滴定条、微量滴定板、珠子、微粒、磁性微粒或其组合。
12.权利要求8中的分析方法，其中所述复合物被生物素酰化，并且与未复合的核酸示踪剂的分离是通过将所述复合物与结合到固相上的亲和素相接触。
13.一种快速检测样品中特定转录因子的活性的分析方法，该分析方法包括下列步骤：
a)将该样品与一种核酸示踪剂相接触，所述核酸示踪剂含有至少一个核酸引物识别序列和至少一个能够结合该特定转录因子的活化形式的DNA效应元件，该接触在促进该示踪剂和该转录因子之间形成蛋白-核酸复合物的条件下进行；
b)将该复合物与未复合的核酸示踪剂分离；
c)通过核酸扩增检测复合的核酸示踪剂的存在；以及
d)将扩增的核酸示踪剂的存在与该转录因子的活性相关联。
14.权利要求13中的分析方法，其中该转录因子主要选自类固醇激素超家族受体、PAS超家族蛋白、Stat家族转录因子、Rel或NFkB家族蛋白、CREB家族蛋白和AP-1家族蛋白。
15.权利要求14中的分析方法，其中该转录因子主要选自类固醇激素超家族受体和PAS超家族蛋白。
16.权利要求15中的分析方法，其中该转录因子主要选自芳基碳氢化合物受体、雌激素受体、糖皮质激素受体和HIF-1α转录因子。
17.权利要求13中的分析方法，其中样品选自动物组织、培养的细胞和动物，该方法还包括从该样品中提取活化的转录因子。
18.权利要求17中的分析方法，其中该样品所来自的动物怀疑或是患有被认为由有毒的或感染性的因子引起的紊乱、或是暴露在这些因子之中、或是患有被认为由这些因子引起的症状。
19.权利要求18中的分析方法，其中该样品来自人类。
20.权利要求18中的分析方法，其中该疾病是炭疽。
21.一种用于引入了核酸扩增的检测分析方法的核酸示踪剂，该试剂含有至少一个核酸扩增引物识别序列和至少一个能够结合活化转录因子的DNA效应元件。
22.权利要求21中的核酸示踪剂，其中该试剂被使用在分析方法中以检测分析物的存在。
23.权利要求21中的核酸示踪剂，其中该试剂被使用在分析方法中以检测转录因子活性。
24.权利要求21中的核酸示踪剂，其中该核酸扩增引物识别序列最适合于使用一种从下面技术组中选择的方法进行扩增：PCR、LCR、RCAT、LAT、TMA、NASBA、BDA和SDA。
25.权利要求24中的核酸示踪剂，其中该核酸扩增引物识别序列最适合于通过PCR进行扩增。
26.权利要求21中的核酸示踪剂，其中该DNA效应元件主要选自那些包含在DDBJ、EMBL、Genebank和TRANSFAC核苷酸序列数据库中的DNA效应元件。
27.权利要求26中的核酸示踪剂，其中该DNA效应元件主要选自二噁英效应元件、雌激素效应元件、糖皮质激素效应元件和HIF-1α效应元件。
CN02822059.5A 2001-11-02 2002-11-01 受体捕获分析方法 Pending CN1582340A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33606501P 2001-11-02 2001-11-02
US60/336,065 2001-11-02
US36978902P 2002-04-03 2002-04-03
US60/369,789 2002-04-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1582340A true CN1582340A (zh) 2005-02-16

Family

ID=30002853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN02822059.5A Pending CN1582340A (zh) 2001-11-02 2002-11-01 受体捕获分析方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20040259096A1 (zh)
EP (1) EP1472365B1 (zh)
JP (1) JP2005519640A (zh)
CN (1) CN1582340A (zh)
AT (1) ATE413469T1 (zh)
AU (1) AU2002367937B2 (zh)
CA (1) CA2465519A1 (zh)
DE (1) DE60229785D1 (zh)
WO (1) WO2004001371A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517282A (zh) * 2011-12-30 2012-06-27 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007096702A2 (en) * 2005-07-25 2007-08-30 Asm Scientific, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
WO2007028162A2 (en) * 2005-09-02 2007-03-08 The University Of Toledo Methods and compositions for identifying biomarkers useful in diagnosis and/or treatment of biological states
CN1987464B (zh) * 2006-09-29 2012-03-14 浙江大学 磁捕获技术在NF-κB蛋白分离与检测中的应用方法
WO2009120802A2 (en) * 2008-03-25 2009-10-01 The University Of Toledo Methods and compositions for identifying biomarkers useful in characterizing biological states
US8980553B2 (en) * 2011-04-02 2015-03-17 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for enriching either target polynucleotides or non-target polynucleotides from a mixture of target and non-target polynucleotides
US11360104B2 (en) 2017-12-04 2022-06-14 Trustees Of Boston University Microbial-based biosensors

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0614530B1 (en) * 1991-11-15 1998-03-04 Cornell Research Foundation, Inc. Indirect immunoassay for dioxinlike compounds
US6127136A (en) * 1995-10-23 2000-10-03 Paracelsian, Inc. Detection of dioxin-like compounds by detection of transformed Ah receptor/ARNT complex
US5770176A (en) * 1995-12-08 1998-06-23 Chiron Diagnostics Corporation Assays for functional nuclear receptors
US5833994A (en) * 1997-01-08 1998-11-10 Paracelsian, Inc. Use of the AH receptor and AH receptor ligands to treat or prevent cytopathicity of viral infection
IL134862A0 (en) * 1997-09-12 2001-05-20 Genelabs Tech Inc dsRNA/dsRNA-BINDING PROTEIN METHODS AND COMPOSITIONS
US6927024B2 (en) * 1998-11-30 2005-08-09 Genentech, Inc. PCR assay
US6432692B1 (en) * 1999-06-21 2002-08-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Sensitive bioassay for detecting agonists of the aryl hydrocarbon receptor
EP1138781A3 (en) * 2000-03-31 2004-07-14 Health Research, Inc. Method for Quantifying DNA binding activity of DNA binding proteins

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517282A (zh) * 2011-12-30 2012-06-27 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列
CN102517282B (zh) * 2011-12-30 2013-10-30 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种富集分离内源转录因子及其复合物的方法及其专用转录因子串联结合序列
US8846884B2 (en) 2011-12-30 2014-09-30 Baylor College Of Medicine Method for enrichment and isolation of endogenous transcription factor and complexes thereof and corresponding tandem arrays of concatenated transcription factor response elements

Also Published As

Publication number Publication date
CA2465519A1 (en) 2003-12-31
EP1472365A2 (en) 2004-11-03
EP1472365B1 (en) 2008-11-05
EP1472365A4 (en) 2005-06-22
AU2002367937B2 (en) 2008-11-13
ATE413469T1 (de) 2008-11-15
AU2002367937A1 (en) 2004-01-06
WO2004001371A2 (en) 2003-12-31
WO2004001371A3 (en) 2004-08-19
US20040259096A1 (en) 2004-12-23
JP2005519640A (ja) 2005-07-07
DE60229785D1 (de) 2008-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1258604C (zh) 一种用于检测非致病性或致病性a型流感病毒h5亚型病毒的试剂盒
CN100351375C (zh) 体外肽表达文库
CN1798976A (zh) 口蹄疫的诊断方法及诊断试剂盒
CN100344970C (zh) 结合前列腺特异性膜抗原胞外域的抗体或其抗原结合部分、包含它们的试剂盒及其用途
CN101065501A (zh) 确定基因毒性的方法
CN1324147C (zh) 细小病毒b19的诊断测试
CN1687454A (zh) 基于环介导的等温扩增技术的血液病毒核酸筛查方法
CN1898395A (zh) 基于引物的核酸的多重扩增的方法和试剂盒
CN1646917A (zh) 鉴定与跨膜蛋白相互作用的化合物的方法
CN1071955A (zh) 分支杆菌引物及探针
CN1636058A (zh) 新型丙氨酸转氨酶及其应用方法
CN1566366A (zh) 一种基于dna芯片的基因分型方法及其应用
CN1467500A (zh) 免疫学测定方法、免疫测定用试剂及其制造方法
CN1203180C (zh) 来自脑膜炎奈瑟氏球菌的basb006多核苷酸和多肽
CN1961080A (zh) 基因毒性检测
CN1289522C (zh) 锌指结构域文库
CN1918305A (zh) 核酸检测方法及其应用
CN1582340A (zh) 受体捕获分析方法
CN101046475A (zh) 激酶活性的测定方法及测定用试剂盒
CN1798842A (zh) 核酸检测
CN1784496A (zh) 多基因转录活性测定系统
CN101039955A (zh) 与sars冠状病毒刺突蛋白相关的核酸、多肽、表达方法和免疫原性组合物
CN1749403A (zh) 一种依据荧光素酶基因的表现来检测二恶英类化合物的重组细胞株
CN1878865A (zh) 无细胞Notch切割分析方法以及药物筛选方法
CN1214692A (zh) 由hla－b44分子呈递的肿瘤排斥抗原及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Open date: 20050216