CN1578673A - 鉴定与涉及异常细胞增殖的疾病相关的多肽抗原的方法和用于治疗此种疾病的组合物 - Google Patents

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Abstract

提供使用具有对正常、非癌细胞和组织具有限制性一般毒性的有丝分裂抑制物发展有效的癌症治疗的方法和组合物。该方法和组合物利用的细胞毒性化合物包含与抗有丝分裂化合物(例如美登木素生物碱)偶联的细胞结合剂(例如抗体)。本发明进一步提供基本上不能诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)的抗体，从而保证治疗效果主要由细胞毒性化合物的抗有丝分裂成分而不是通过ADCC和/或CDC的间接杀细胞作用介导。本发明的抗体进一步能区分在增殖的癌细胞比在增殖的非癌细胞上表达更高的多肽抗原。

Description

鉴定与涉及异常细胞增殖的疾病相关的多肽抗原 的方法和用于治疗此种疾病的组合物
1. 发明领域
本发明涉及用于鉴定与涉及异常细胞增殖(例如癌症)的疾病相关的多肽抗原的方法。更具体地，本发明涉及鉴定作为癌症治疗的有效靶点的细胞多肽抗原的新方法。此外，本发明还涉及包含细胞毒性化合物(例如美登木素生物碱)的新组合物，通过将该细胞毒性化合物和细胞结合剂(例如抗体)偶联，可将该组合物运送到具体细胞类群，其中的组合物显示抗有丝分裂的特性。
2. 背景技术
2.1. 细胞有丝分裂
细胞有丝分裂是包括细胞分裂和复制(Albefts，B.，等，In The Cell，pp.652-661(1989)；Stryer，E.Biochemistry(1988))的多步过程。细胞通过分裂成两个子细胞进行繁殖。已知细胞繁殖周期的DNA复制阶段为“S”期。在S期中，细胞内的染色体被复制，产生称为挛生染色分体组的相同的子DNA分子对，随后在有丝分裂中分离产生两个新的细胞核。尽管术语“有丝分裂”通常被用做术语“细胞分裂”的同义词，有丝分裂的正确含义仅指细胞分裂过程中的一个阶段：挛生染色分体组平均分配到两个子细胞中的过程。在真核细胞中，有丝分裂后为质裂，通过该过程细胞浆被分到两个截然不同的但遗传上相同的子细胞中。
有丝分裂开始时，称为胞质微管的小胞内丝状结构(其主要成分是称为微管蛋白的蛋白质)分解成微管蛋白分子。随后微管蛋白再装配成微管形成认为是“有丝分裂纺锤体”的细胞内结构。该有丝分裂纺锤体在两个子细胞之间精确分配分裂细胞内的染色体中起关键作用。因此，很明确胞内微管的形成是哺乳动物细胞增殖过程中的必要步骤。
然而不幸地，多种疾病以异常细胞增殖为特征。例如，不受控制的细胞分裂是癌症的标志。癌症是男性和女性死亡的最主要原因，仅次于心脏病。在对抗癌症的斗争中，各种技术被发展并且是目前针对理解疾病的性质和原因以及提供控制或治疗疾病的方法的研究的主题。
癌细胞通常以较大多数健康细胞中观察到的更快的细胞分裂和增殖为特征，并且许多抗癌制剂通过抑制细胞分裂起作用。由于癌细胞比健康细胞的分裂更快，癌细胞优选被抑制有丝分裂的抗癌制剂杀死。此种化合物通常称作”抗由丝分裂”化合物。
2.2. 抗肿瘤剂
目前，已知抗肿瘤药剂的三个主要家族。药剂的每个家族与一种已知的作用机制相关。首先，抗肿瘤药剂可以是烃化剂，通常与DNA以共价方式结合形成双功能损伤。双功能损伤涉及同一条链上相邻的或附近的碱基，可选地，涉及形成链间交联的对等链上的碱基。烃化剂的实例包括氮芥，环磷酰胺和苯丁酸氮芥。与使用烃化剂相关的细胞毒性包括恶心，呕吐，脱发，出血性膀胱炎，肺纤维化等。其次，抗肿瘤制剂可以是抗代谢物，通常抑制涉及DNA合成和组装的酶。可选地，抗代谢物可作为DNA加工的假性或类似底物。抗代谢物的实例包括嘌呤，嘧啶和叶酸拮抗物以及植物生物碱例如长春花碱和长春新碱。与使用抗代谢物相关的细胞毒性包括脱发，骨髓抑制，呕吐，恶心，周围神经病等。第三，抗肿瘤制剂可以是抗生素，它通过插入DNA螺旋或将链突变(break)引入DNA起作用。抗生素的实例包括阿霉素，柔红霉素和放线菌素。与使用抗生素相关的细胞毒性包括骨髓抑制，过敏反应，厌食，心脏毒性，肺纤维化等。
已知若干类别的抗有丝分裂化合物，当用于分裂细胞时，其通过结合微管蛋白或微管阻止有丝分裂纺锤体的形成。缺乏有丝分裂纺锤体造成有丝分裂的停滞和具有可见挛生染色分体组的细胞的累积，但不具有正常的有丝分裂形态。细胞不能分裂最终导致细胞死亡。此种化合物在例如E.Hamel，Medicinal Research Reviews，Vol.16，pp.207-231(1996)中被讨论。已知阻止有丝分裂纺锤体形成的化合物的实例包括长春花属生物碱(Catharalthusalkaloid)长春花碱和长春新碱；苯并咪唑氨基甲酸酯(benzimidazole carbamate)例如诺考达唑(nocodazole)；秋水仙碱和相关化合物例如鬼臼毒素(podophyllotoxin)，steganacin和combretastatin；taxane例如紫杉醇(paclitaxel)和吉西它滨和紫素(docetaxel)；以及美登木素生物碱。生物碱长春花碱和长春新碱，基于taxane的化合物以及美登木素生物碱已被用做抗癌药(见，例如，E.K.Rowinsky和R.C.Donehower，Pharmacology and Therapeutics，vol.52，pp.35-84(1991))。
电离辐射也是已建立的恶性疾病疗法并已肯定其对治疗和缓解的益处。然而，放疗有若干不良并发症，例如粘膜炎，白细胞减少症，皮肤脱屑，脊髓坏死和闭塞性动脉内膜炎。这些并发症经常限制使用治疗剂量射线的能力或在治疗后造成显著的发病率。许多化疗剂对正常组织的细胞有毒，并因此化疗副作用对病人的破坏性有时和肿瘤负荷本身一样。减小化疗副作用的一个方法是试图通过将药剂附在对肿瘤细胞上的抗原特异的抗体上，为化疗剂包括放射性同位素与各种植物和细菌毒素定向。见例如美国专利4,348,376和4,460,559，其描述了使用抗癌胚抗原抗体对固体肿瘤(肉瘤)的放射免疫治疗，和美国专利5,595,721其针对淋巴瘤，一种更为播散的肿瘤的放射免疫治疗。然而，使用抗体偶联物的治疗结果通常令人失望。缓解率较低并通常不能重复。
2.3. 美登木素生物碱
美登木素生物碱是有丝分裂抑制物，通过抑制微管蛋白的聚合起作用。美登素最早自东非灌木齿叶美登木(美国专利3,896,111)分离。随后，发现特定的微生物也可产生美登木素生物碱，例如美登木醇(maytansinol)和C-3美登木醇酯(美国专利4,151,042)。本领域人员熟悉合成美登木醇和美登木醇类似物，并在例如美国专利4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中公开，其公开内容在此包含作为参考。
美登素和美登木素生物碱是高度细胞毒性的，但其在癌症治疗中的临床应用主要由于其对肿瘤极低的选择性造成的严重系统副作用被极大地限制。美登素的临床试验由于对中枢神经系统和胃肠道系统严重的副作用(Issel等，1978，Can.Trtmnt.Rev.，5：199-207)而被终止。而且，发现美登素与周围神经病有关。因此，美登木素生物碱在癌症治疗中的应用只提供有限的成功。
2.4. 与抗体偶联的美登木素生物碱
为提高美登素和美登木素生物碱的治疗指数，将其与特异结合肿瘤细胞抗原的抗体结合。更具体地，治疗模式涉及结合美登木素生物碱和抗体，该抗体识别并结合存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上的抗原，从而将美登木素生物碱的毒性效应仅限于对肿瘤细胞。此种包含结合肿瘤细胞抗原的美登木素生物碱的免疫结合物的实例在例如美国专利5,208,020；5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1中公开，其内容在此包含作为参考。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8618-8623(1996)描述的免疫偶联物包含命名为DM1的美登素，它与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接。发现该偶联物对培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性，并在体内肿瘤生长试验中显示抗肿瘤活性。实际上，C242-DM1偶联物不仅对100％的COLO 205细胞具有细胞毒性，其中C242抗原(CanAg)在约100％的细胞上表达，而且还对约99％的LoVo细胞具有细胞毒性，其中仅约20-30％表达C242抗原。Chari等，Cancer Research，52：127-131(1992)描述的免疫偶联物中的美登木素生物碱通过二硫键与结合人结肠癌细胞系上的抗原的鼠抗体A7或另一种结合HER-2/neu原癌基因的鼠单克隆抗体TA.1偶联。在人乳腺癌细胞系SK-BR-3上于体内检测TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×105个HER-2表面抗原。该药物偶联物达到与游离美登木素生物碱药物相似的细胞毒性程度，通过增加每个抗体分子的美登木素生物碱分子数目增加该药物的细胞毒性。A7-美登木素生物碱偶联物在大鼠中显示低的系统细胞毒性。许多上述美登木素生物碱抗体偶联物的每个抗原分子利用3-4个美登木素生物碱分子，从而增加该偶联物的细胞毒性。
尽管上述美登木素生物碱抗体偶联物取得一些成功，由于据证实极难鉴定和生产只与肿瘤抗原特异结合而不与正常细胞上的抗原结合的抗体，总体治疗功效受到限制。因此，已采用的方法和使用美登木素生物碱的组合物导致相对较高的对体内正常细胞总毒性。因此，需要一种能用来鉴定无上述总毒性的细胞有丝分裂抑制物的细胞多肽靶点的新方法。
2.5. 进一步治疗的必要
尽管已评估了多种可能的抗癌制剂，人类癌症的治疗仍有许多并发症，常导致一系列次最优治疗的选择。因此，可廉价获得或生产，可被病人较好耐受并易于使用的具有较小或没有毒性的化疗剂是目前肿瘤学家可利用的治疗模式的可取补充。选择性致敏恶性组织以使较低剂量的放射或治疗在对健康组织产生较小的破坏下获得同样的治疗效果的药剂也是所需的。类似地，阻止癌症发生或复发的药剂也是所需的。本发明通过提供此种化疗和致敏药剂填补这些需要。此外，本发明克服了目前抗体-毒素偶联物模型的缺陷：它不是利用与肿瘤细胞表面的抗原而不是所有正常细胞上的抗原特异性结合的抗体所必要的。
3. 发明内容
本发明提供使用对病人的正常，非癌性细胞或组织具有有限总毒性的有丝分裂抑制剂发展有效的癌症疗法的方法和组合物。所述方法和组合物利用包含与抗有丝分裂化合物偶联的抗体的细胞毒性化合物。在优选的实施方案中，所述抗体基本上不能诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)，因此保证疗效(例如，只对增殖的细胞的杀细胞作用)主要通过细胞毒性化合物的抗有丝分裂成分介导，而非通过ADCC和/或CDC发挥间接杀细胞作用。
本发明提供治疗与异常细胞增殖相关的疾病(例如癌症)的方法和组合物。更具体地，本发明基于以下发现：那些当与细胞结合剂(例如抗体)偶联时显示抗有丝分裂特性的化合物(例如美登木素生物碱)对治疗以增加的细胞增殖为特征的疾病有效。本发明基于一惊人发现：细胞结合剂不必特异于肿瘤抗原(即存在于肿瘤细胞上而不存在于正常细胞上的抗原)。细胞结合剂只需区分在增殖的癌细胞上的表达较增殖的非癌细胞上的表达更高的那些多肽抗原。
在一个实施方案中，本发明提供了鉴定可用作癌症治疗靶点的细胞表面多肽抗原的方法。在优选的实施方案中，该多肽抗原在增殖的癌细胞表面的表达较增殖的非癌细胞表面的表达更高。在另一实施方案中，该多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面比增殖的非癌细胞表面的表达更高。在另一实施方案中，多肽抗原增殖的癌细胞表面的表达水平与在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达水平相同或低于后者。在另一实施方案中，鉴定多肽抗原的步骤包括使用微阵列分析。
在其它实施方案中，本发明提供产生用于治疗癌症的细胞毒性化合物的方法，包括鉴定在增殖的癌细胞表面比增殖的非癌细胞表面表达更高的多肽抗原，产生结合该多肽抗原的抗体并将至少一种抗有丝分裂化合物与抗体连接。在进一步的实施方案中，该多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面的表达更高。在另一实施方案中，多肽抗原在增殖的癌细胞表面的表达水平与在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达水平相同或较后者低。在附加实施方案中，鉴定多肽抗原的步骤包括使用微阵列分析。在优选的实施方案中，至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。在进一步的实施方案中，抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。在另一实施方案中，抗体特异地结合多肽抗原。在另一实施方案中，抗体基本上不能诱导ADCC或CDC。
在其它实施方案中，本发明提供抑制癌细胞增殖的方法，包括鉴定在癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面表达更高的多肽抗原，产生结合该多肽抗原的抗体，使至少一种抗有丝分裂化合物与该抗体连接以提供细胞毒性化合物并将癌细胞与该细胞毒性化合物接触。在进一步的实施方案中，该多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面上比增殖的非癌细胞表面上的表达更高。在另一实施方案中，多肽抗原在增殖的癌细胞表面的表达水平与非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达水平相同或较后者低。在附加实施方案中，鉴定多肽抗原的步骤包括使用微阵列分析。在优选的实施方案中，至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。在进一步的实施方案中，抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。在另一实施方案中，抗体特异地结合多肽抗原。在另一实施方案中，抗体基本上不能诱导ADCC或CDC。
本发明的另一实施方案提供治疗哺乳动物中的癌症的方法，包括对哺乳动物施用治疗有效量的细胞毒性化合物，该化合物包含结合多肽抗原的抗体和至少一种与抗体连接的抗有丝分裂化合物，所述多肽抗原在癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面上表达更高。在另一实施方案中，该方法包括施用附加化疗剂。在另一实施方案中，该方法进一步包括外科方法。在进一步的实施方案中，该多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面上比增殖的非癌细胞表面上表达更高。在另一实施方案中，所述多肽抗原在增殖的癌细胞表面的表达约等于，或少于在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达。在附加实施方案中，鉴定多肽抗原的步骤包括使用微阵列分析。在优选的实施方案中，至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。在进一步的实施方案中，抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。在另一实施方案中，抗体特异地结合多肽抗原。在另一实施方案中，抗体基本上不能诱导ADCC或CDC。
在进一步的实施方案中，本发明提供包含与抗有丝分裂化合物偶联的抗体。在优选实施方案中，抗体结合那些在增殖的癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面上表达更高的多肽抗原。在进一步的实施方案中，抗体结合那些在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面上比在增殖的非癌细胞表面上表达更高的多肽抗原。在另一实施方案中，多肽抗原在增殖的癌细胞表面的表达水平与非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达水平相同或较后者低。在优选实施方案中，至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。在进一步的实施方案中，抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。在另一实施方案中，抗体特异地结合多肽抗原。在另一实施方案中，抗体基本上不能诱导ADCC或CDC。
在另一实施方案中，本发明提供包含与药用载体混和的抗体-美登木素生物碱偶联物的组合物。优选，该组合物无菌。该组合物可以液体药物配制剂的形式被施用，该配制剂可被保藏以获得长期储存稳定性。保藏的液体药物配制剂可包括若干剂量的组合物，并因此适合多次(repeated)使用。
在另一实施方案中，本发明提供制备用于治疗癌症的此种组合物的方法，包括将治疗有效量的抗体-美登木素生物碱偶联物与可药用的载体混合。
在另一方面，本发明提供一种制品，包括：
(a)物质组合物，它包含抗体-美登木素生物碱偶联物；
(b)容纳所述组合物的容器；和
(c)黏附于所述容器的标签或包括在所述容器内的包装插页，其指示所述抗体—美登木素生物碱偶联物在治疗或缓解高度增殖疾病(优选癌症)中的使用。该组合物可包含治疗有效量的抗体-美登木素生物碱偶联物。
4. 附图说明
图1显示名为“DM1.”的美登木素生物碱的结构。在DM1的结构中，“R”可被各种能够与选定的接头形成化学键的基团占据。优选，“R”是SH基团或其被保护的衍生物，它与例如N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)等接头形成S-S键。
图2说明HERCEPTIN-DM1偶联物的结构。
图3是HERCEPTIN-DM1偶联物在Sephacryl S300凝胶过滤柱上的洗脱曲线。
图4显示体内SK-BR3细胞上HERCEPTIN和HERCEPTIN-DM1偶联物的抗增殖效应。对照使用无关单克隆抗体RITUXAN或RITUXAN-DM1偶联物。
图5(A-D)显示正常人细胞(人乳腺上皮细胞(5A)；人肝细胞(5B)；正常人表皮角质细胞(5C)；和小气道上皮细胞(5D))不被HERCEPTIN-DM1偶联物杀死。
图6显示生长停滞细胞对HERCEPTIN-DM1不敏感。
5. 发明详述
5.1. 定义
术语“癌症”，“癌症的”和“恶性的”指或描述哺乳动物以失控的细胞生长为典型特征的病理性情况。癌症的实例包括但不限于，癌包括腺癌、淋巴瘤，母细胞癌，黑素瘤，肉瘤和白血病。此种癌症更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道癌、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)如肝癌(hepaticcarcinoma)和肝细胞癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌，唾液腺癌，肾癌例如肾细胞癌和Wilms氏瘤，基底细胞癌，黑素瘤，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，睾丸癌，食道癌和各种头颈部癌。本文治疗的优选癌症包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌和上述其它涉及血管肿瘤的癌症。
本文所用术语“细胞毒制剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化疗剂例如氨甲蝶呤，adriamicin，长春花碱类(长春花碱，长春新碱，依托泊甙)，阿霉素，美法伦(melphalan)，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔红菌素或其它插入剂(intercalateingagent)，酶和其片段例如核苷酸溶酶，抗生素，和毒素例如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体，以及以下公开的各种抗肿瘤huo抗癌药剂。其它细胞毒性药剂在以下描述。杀肿瘤药剂造成肿瘤细胞的破坏。
“化疗剂”是在肿瘤治疗中使用的化学化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)h环磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶(ethyleneimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚胺嗪(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(calicheamicin)，carabicin，洋红霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类如二甲睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2’，2-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；taxanes，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhone-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxiene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制剂如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的药用盐、酸或衍生物。
本文所用术语“前体药物”指药物学活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物对癌细胞的细胞毒性较小并能被酶活化或转化成更具活性的亲本形式。见例如Wilman“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransanctions，14，pp.357-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelivery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于，含磷酸盐前体药物，含硫代磷酸脂前体药物，含硫酸盐前体药物，含肽前体药物，D氨基酸修饰的前体药物，糖基化前体药物，含β内酰胺的前体药物，任选取代的含苯氧基乙酰胺的前体药物或任选取代的含苯基乙酰胺的前体药物，可被转化成更具活性且不具有细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可被衍生为本发明所用前提药物形式的细胞毒药物的实例包括，但不限于，上述那些化疗剂。
本文中“生长抑制剂”是指在体内或体外抑制细胞(例如过度表达Wnt的癌症细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期恶性细胞百分比的药物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期(在除S期以外的阶段)进展的药物，例如诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春花类(长春新碱和长春花碱)，taxol，美登木素生物碱和topoII抑制剂如阿霉素、柔红菌素、依托泊甙和博来霉素等。那些使G1期停滞的药物还连带(spill over)使S期停滞，例如DNA烷化剂象他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。详见The Molecular Basis of Cancer Mendelsohn和Israel编，第一章，Murakami等的题为″Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs″的文章(WB Saunders：Philadephia，1995)，尤其见13页。其它实例包括肿瘤坏死因子(TNF)，能够抑制或中和酸性或碱性FGF或肝细胞生长因子(HGF)的血管生成活性的抗体，能够抑制或中和组织因子凝血活性的抗体，蛋白C，或蛋白S(见例如WO 91/01753，公开于1991年2月21日)，或能够结合HER2受体(WO 89/06692)的抗体，例如4D5抗体(及其功能对等物)(例如WO92/22653)。
“治疗”是一种介入，其旨在阻止高度增殖性疾病的发展或改变其病理。治疗的概念应用广泛，具体包括预防，慢化，缩小和治愈任何阶段的高度增殖性疾病。相应地，“治疗”指治疗性疗法和防病或预防措施，其目的是阻止或减慢(减少)或改善此种疾病。需要治疗的包括那些已患该病和那些有得病倾向或那些需预防该病的人。
“慢性”给药指以与急性方式相反的连续方式给药所述制剂，从而在更长的时间内维持最初的效果。
需要治疗的“哺乳动物”是指归为哺乳动物类的任何动物，包括人、家养和农用动物，和动物园、运动项目用的动物或宠物，如犬、马、猫、牛、绵羊、猪等。优选哺乳动物是人。
与一种或多种其它治疗药物“联合”给药包括同时(并行)给药和任何顺序的连续给药。
术语“治疗有效量”指有效“治疗”个体或哺乳动物的疾病的抗体或药物的量。对于癌症，此药物治疗有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤体积；抑制(例如减慢到一定程度并优选停止)癌细胞对周围器官的浸润；抑制(例如减慢到一定程度并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。见前述“治疗”定义。药物根据阻止癌细胞的生长和/或杀死已有癌细胞的程度，可以是抑制细胞生长或发挥细胞毒性。
本文中“载体”包括可药用载体，赋形剂或稳定剂，它们在所使用的剂量和浓度条件下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒性作用。通常可药用载体是pH缓冲水溶液。可药用载体的实例包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量多肽(小于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如吐温TM，聚乙二醇(PEG)或PLURONICSTM。
“抗体”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是具有同样结构特征的糖蛋白。抗体显示对特定抗原的结合特异性，免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一种多肽由例如淋巴系统在较低的水平产生和由骨髓瘤在增加的水平产生。术语“抗体”是指最广义上的抗体，具体包括且不限于完整的单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两种完整抗体形成的多重特异抗体(例如双特异抗体)，及抗体的片段，只要其显示所需的生物活性。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，不同免疫球蛋白同种型的重链的二硫键数目不同。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链的一个末端具有可变区(VH)和后随的几个恒定区。每条轻链的可变区(VL)在其一个末端，恒定区在另一末端；轻链的恒定区与重链的第一恒定区并列，轻链的可变区与重链的可变区并列。特定氨基酸残基据信形成轻链和重链可变区之间的界面。
术语“可变的”指可变区的特定部分在不同抗体中的序列不同，并被用于每种具体抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变区中分布不均。它聚集在轻链和重链可变区中称为互补性决定区(CDRs)或超变区的三段中。可变区更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各包含4个FR区，主要采用β折叠构型，由三个CDRs连接，其形成连接β折叠结构的袢(loop)或有时形成β折叠结构的一部分。每条链的CDRs通过FR区紧密维持，并与其它链的CDRs形成抗体的抗原结合位点。见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，第一卷，647-669页(1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示各种效应功能，例如使抗体参与抗体依赖的细胞毒作用。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二价抗体；线性抗体(Zapata等，Protein Eng.，8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的各带有单个抗原结合位点的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段，Fc片段的名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍然能交联抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密非共价连接的一个重链可变区与一个轻链可变区的二聚体组成。在此构象中每个可变区的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个CDR总体上使抗体具有抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或仅含三个抗原特异CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管比完整结合位点的亲和力低。
Fab片段还包括轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段与Fab片段的差别在于重链CH1区羧基末端多几个残基，包括抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中指恒定区半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab’。F(ab’)2抗体片段在最初产生为Fab’片段对形式，它们之间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联是众所周知的。
脊椎动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可依据恒定区氨基酸序列而被归为两种不同型(称为κ和λ)中的一种。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象是众所周知的。
本文术语“单克隆抗体”是指自一群基本同质的抗体获得的抗体，即除了少量可能天然存在的突变以外，包含该群的单个抗体完全相同。单克隆抗体针对单个抗原位点高度特异。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原的单个决定簇。除特异性外，单克隆抗体的优点在于可通过杂交瘤培养来合成，不受其它抗体污染。修饰词“单克隆”表明抗体的特点是来自基本同质的抗体群，而不解释为需通过任何特殊方法产生抗体。例如，根据本发明应用的单克隆抗体可通过Kohler等（Nature，256：495(1975))首先描述的杂交瘤法，或者重组DNA法制备(例如见美国专利4816567)。还可用例如Clackson等(Nature，352：624-628(1991))和Marks等(J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))所述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文中单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，但该链剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体(以及此抗体的片段，只要它们显示所需生物活性)的相应序列相同或同源。美国专利4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab)’或其它抗原结合序列)。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和性能的来自非人物种例如小鼠、大鼠或家兔(供体抗体)的CDR的残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的FvFR残基被相应非人残基取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或外来的CDR或框架序列中均未被发现的残基。这些修饰旨在进一步改善和最大化抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中全部或基本上全部CDR区对应非人免疫球蛋白的CDR区，而全部或基本上全部FR区具有人免疫球蛋白序列。人源化抗体还优选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curt.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。人源化抗体包括PRIMATIZEDTM抗体，其中抗体的抗原结合区来自通过兴趣抗原免疫接种猕猴制备的抗体。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(VH-VL)上含有相连的一个重链可变区(VH)和一个轻链可变区(VL)。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger等，Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)更详细地描述二价抗体。
“分离的”抗体指从蛋白的天然环境的成分中鉴定，分离和/或回收的抗体。其天然环境中的杂质成分是可干扰抗体用于诊断或治疗的物质，可包括酶，激素，及其它蛋白或非蛋白溶质。在优选的实施方案中，抗体可被纯化(1)至通过Lowry方法测定的抗体重量的95％以上，并最优选大于99％重量，(2)至足以通过采用转杯式测序仪得到N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(3)至在还原或非还原条件下经SDS-PAGE及考马斯兰或优选银染色证实为均质。分离的抗体包括重组细胞中的原位抗体，因为所述抗体的天然环境中至少一种成分不存在。但通常，通过至少一步纯化步骤制备分离的抗体。
“特异性结合”具体多肽或具体多肽上的表位或“对其特异的”的抗体为结合具体肽或具体多肽的表位，而基本不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。
术语“表位”用来指(单克隆或多克隆)抗体在蛋白抗原上的结合位置。通过“表位定位”鉴定结合于特定表位的抗体。本领域已知多种定位和表征蛋白表位位置的方法，包括溶解抗体-抗原复合物的晶体结构，竞争试验，基因片段表达试验，和基于合成肽的试验，在例如Harlow and Lane，UsingAntibodies，a Laboratory Manual的第11章，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，纽约，1999中描述。竞争试验在下文描述。根据基因片段试验，编码蛋白的开放阅读框架随机地或通过特定遗传构建被切成片段，并测定该蛋白表达片段对待测抗体的反应性。基因片段可例如通过PCR来制备，并在存在放射活性氨基酸的条件下进行体外转录并翻译成蛋白。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳测定抗体与放射活性标记的蛋白片段的结合。还可通过使用噬菌体颗粒表面展示的随机肽序列的大文库(噬菌体文库)鉴定特定的表位。可选地，可在简单的结合试验中检测重叠肽片段的一种文库与待测抗体的结合。后一方法适合限定约5至15个氨基酸的线性表位。
当两种抗体识别相同或空间重叠的表位时，抗体和对照抗体结合“基本相同的表位”。使用最广并且最快的测定两个表位是否结合相同或空间重叠表位的方法是竞争试验，使用标记抗原或标记抗体可在所有不同模式中设定它。通常抗原固定在96孔板上，并使用放射活性或酶标记测定未标记抗体阻断标记抗体的结合的能力。
“天然序列“多肽是与来自天然的多肽(例如抗体)具有同样氨基酸序列的多肽。此种天然序列多肽可从自然界分离或通过重组或合成方法产生。因此，天然序列多肽可具有天然存在的人多肽、鼠多肽、或来自任何其它哺乳动物种类的多肽氨基酸序列。
术语“氨基酸序列变体”指具有在一定程度上与天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体具有与天然序列至少约70％的同源性，优选至少约80％，更优选至少约85％，更优选至少约90％同源性，最优选至少约95％。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的特定位置上可具有取代，缺失，和/或插入。
术语抗体的“功能性片段或类似物”是具有性质与全长抗体相同的生物活性的化合物。例如，抗IgE抗体的功能性片段或类似物是可以与IgE免疫球蛋白结合以阻止或基本上降低此种分子具有结合高亲和力受体FcRI的能力的化合物。
“同源性”定义为经序列比对和在必要时引入缺口以达到最大同一性比例之后，在氨基酸序列变体中相同残基的比例。本领域人员熟知用于比对的方法和计算机程序。一种计算机程序是″Align2″，作者是Genentech，Inc.，该程序与用户说明于1991年12月10日被提交到美国版权局，华盛顿特区20559。
抗体“效应功能”指那些由抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的生物活性，并随抗体同种型的不同而不同。抗体的Fc区也可确定抗体的同种型。各种抗体同种型的实例包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgD，IgM和IgE。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体下调(例如B细胞受体)；和B细胞活化。
“抗体依赖细胞介导的细胞毒”或“ADCC”指一种细胞毒形式，其中分泌的Ig结合特定的细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)，使这些细胞毒性效应器细胞特异性结合携带抗原的目的细胞，并随后用细胞毒素杀死目的细胞。抗体“武装(arm)”细胞毒细胞，并且是此种杀作用必需的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞的FcγR表达在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)464页的表3中总结。为评价兴趣分子的ADCC活性，采用美国专利5,500,362或5,821,337中描述的体外ADCC分析法。对此分析法有用的效应器分子包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替换地或此外，兴趣分子的ADCC活性可在Clynes等，PNAS(USA)，95：652-656(1998)公开的动物模型中进行体内估测。此外，本领域人员熟悉调节(即增加或降低)抗体的ADCC水平和/或CDC活性的技术。见例如美国专利6,194,551。本发明的抗体优选不具有，或被修饰而具有降低的诱导ADCC和/或CDC的能力。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)和包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的旁路剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这两种受体具有相似氨基酸序列，它们的差别主要在胞浆区域。活化受体FcγRIIA的胞浆区包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞浆区包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)(参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15：203-23491997)。FcRs参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)；Capel等，Immunomenthods，4：25-34(1994)；和de Haas等，Lab.Clin.Med.，126：330-41(1995)。其它FcRs，包括有待将来鉴定的那些，均包含于本文术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将IgGs由母体转运至胎儿(Guyer等，J.Immunol.，117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.，24：249(1994))。
“人效应器细胞”是表达一种或多种FcRs并行使效应功能的白细胞。优选，该细胞表达至少FcRIII并行使ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，自然杀伤细胞(NK)，单核细胞，细胞毒性T细胞和中性粒细胞；优选PBMCs和NK细胞。效应器细胞可自天然来源，例如自血液中分离。
“补体依赖性细胞毒”和”CDC“指补体存在的情况下对目标细胞的溶解。经典补体活化途径通过补体系统的第一成分(Clq)与结合其同类(cognate)抗原的抗体的结合来启动。可进行CDC分析来评估补体活化，例如参见Gazzano Santoro等，J.Immunol.Methods，202：163(1996)。
本文术语“标记”指可检测的化合物或直接或间接与抗体偶联以产生“标记的”抗体的其它组合物。标记可通过其自身被检测(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。可作为可检测标记的放射性核素包括例如I-131，I-123，I-125，Y-90，Re-188，At-211，Cu-67，Bi-212，和Pd-109。标记也可是不可探测的物质例如毒素。
“固相”是指本发明的抗体可粘附的非水基质。本发明固相的实例包括那些部分或完全由玻璃形成的基质(例如具有受控制的孔的玻璃)，多糖(例如琼脂糖)，聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇和硅氧烷。在某些实施方案中，根据具体情况，固相可以包括分析板的孔；在另一些实施方案中，固相可以是纯化柱(例如亲和层析柱)。该术语还包括分散的颗粒的不连续固相，例如美国专利4,275,149描述的那些。
“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文的抗体)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
本文中所用术语“免疫粘附素”为抗体样分子，其结合了异源蛋白(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应功能。结构上，免疫粘附素包括不同于该抗体的抗原识别和结合位点(即为“异源性”)且具有所需结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区序列的融合。免疫粘附分子的粘附素部分通常是至少包括受体或配体的结合位点的邻接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
本文术语“表位标记的”指包含与“标记多肽”融合的抗体多肽的嵌合多肽。该标记多肽具有足够的残基以提供表位，可针对该表位制造抗体，但又足够短以使该多肽不干扰与其融合的Ig多肽的活性。该标记多肽也优选较为独特，以使抗体基本上不与其它表位交叉反应。适宜的标记多肽通常具有至少6个氨基酸残基和通常约8至50个氨基酸残基(优选，约10到20个氨基酸残基)。
本文限定“小分子”具有约500道尔顿以下的分子量。
术语“包装插页”通常指包含在治疗产品的商品包装中给用户的说明，其包含有关适应症，用途，剂量，施用方法，禁忌症，和/或与使用此种治疗产品有关的警示。
“分离的核酸”是一种核酸，例如RNA，DNA或混合聚合物，其基本上与其它基因组DNA序列以及在天然状态下与天然序列相伴的蛋白或复合物例如核糖体和聚合酶分离。该术语包括已脱离其天然环境的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统经过生物合成的类似物。基本纯的分子包括该分子的分离形式。
“载体”包括穿梭载体和表达载体。通常，质粒构建体包括复制起点(例如ColEl复制起点)和可选的标记物(例如氨苄西林或四环素抗性)，分别用于细菌中质粒的复制和选择。“表达载体”指包含在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体(包括抗体片段)所必需的控制序列或调节元件的载体。适宜的载体在以下公开。
“癌症治疗靶点”在本文定义为能够被异源分子结合的分子，通常是多肽，它具有一个或多个结合异源分子的位点，并可能是设计，发现或制备改善癌症或其它高度增殖性疾病或失调的相关症状的治疗药物的焦点。除了多肽靶点，本发明还包含非多肽癌症治疗靶点，例如美国专利5,091,178中描述的肿瘤相关的糖脂靶点。
本发明的“抗有丝分裂化合物”指在细胞循环的任何阶段抑制、阻止或延缓细胞有丝分裂和/或细胞进展的化合物。抗有丝分裂化合物可能通过影响微管形成和/或行为(action)起作用。此种制剂可为例如微管稳定剂或破坏微管形成的制剂。本领域熟练技术人员熟悉的本发明所用的影响微管的制剂包括但不限于美登素，美登素衍生物，allocolchicine，Halichondrin B，秋水仙碱(colchicine)，秋水仙碱衍生物，海兔毒素(dolastatin)10，rhizoxin，紫杉醇，taxol.RTM衍生物，硫代秋水仙碱(thiocolchicine)，三苯甲半胱氨酸，硫酸长春新碱(vinblastine sulfate)，硫酸长春花碱(vincristine sulfate)，埃坡霉素(epothilone)A，埃坡霉素，和discodermolide estramustine，诺考达唑，MAP4等。此种制剂的实例也在科学和专利文献中描述。见例如Bulinski(1997)J.Cell Sci.110：3055-3064；Panda(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：10560-10564；Muhlradt(1997)Cancer Res.57：3344-3346；Nicolaou(1997)Nature 387：268-272；Vasquez(1997)Mol.Biol.Cell8：973-985；Panda(1996)J.Biol.Chem.271：29807-29812.
本文的“美登木素生物碱”是袢大环内酯(ansa macrolide)，它是高度毒性地有丝分裂抑制物，通过抑制微管蛋白聚合起作用。美登素是美登物类的一种，最早自东非灌木Maytenus serrata中分离(美国专利3,896,111)。本发明的美登木素生物碱包括但不限于合成美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物(例如美登木醇)，其在本领域已知并在例如美国专利4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中被公开，公开内容包括在本文中作为参考。
文中“更高表达”指细胞表面多肽的表达时，意味着与另一细胞相比细胞表面多肽的拷贝数高至少10％，优选15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％并最优选与另一细胞相比高100％。
当“大约相同”指细胞表面多肽的表达时，意味着与另一细胞相比细胞表面多肽的拷贝数的差异小于10％，优选小于5％，2％，1％并最优选与另一细胞相比细胞表面多肽的拷贝数的差异为0％。
“DNA微阵列”指例如纸，尼龙或其它类型的膜，滤纸(film)，凝胶，聚合物，芯片，玻片或任何其它适宜的支持物包括固相支持物的基质上不同多核苷酸或寡核苷酸的排列。DNA微阵列用来同时监测大量基因的不同表达水平(以产生转录像)和鉴定遗传变异体，突变和多态性。特别地，DNA微阵列设计成检测来自第一细胞类型的基因与第二细胞类型(通常第一细胞类型对应非疾病组织而第二细胞类型对应疾病组织)中同样基因的表达的差异或改变。蛋白阵列也包含在本发明的范围内。此蛋白阵列的实例见于例如美国专利6,197,599。通常，DNA微阵列是基于数据库的使用，该数据库具有由机器人(robot)排列在单个显微镜载玻片上的代表基因片段的上千个不同核酸序列。随后，将具体细胞类型的mRNA(反映多种基因的细胞特定表达)通过RT/PCR法转化成以荧光标记物标记的cDNA，并和载玻片上选定的核酸序列杂交。随后扫描仪检测并测量载玻片上每个样品的荧光，这种荧光代表来自待测细胞的标记信使，这种细胞可以因其与载玻片上已知位点的已知核酸序列杂交而鉴定。相对荧光表示基因的相对活性，强荧光表示活跃基因表达相对大量的信使。较小或没有荧光表示没有标记信使与已知核酸序列杂交。
文中“增殖”细胞指细胞增殖周期的M期(M＝有丝分裂)至少大约每8小时出现一次的细胞。本文的“缓慢增殖”的细胞指细胞增殖周期的M期(M＝有丝分裂)的出现少于大约每8小时一次但大于或等于大约72个小时一次。本文的“非增殖细胞”指细胞增殖周期的M期(M＝有丝分裂)的出现小于大约每72小时一次。
5.2. 本发明的组合物和方法
5.2.1. 本发明的抗体
下文描述了制造用于本发明的抗体的示范技术。在某些情况下，使用标准重组DNA法可在细菌或真核细胞中重组制造并分离抗体。
5.2.1.1. 多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中制备多克隆抗体。它可用来将相关抗原(尤其使用合成肽时)与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白偶联。例如，可以用双功能制剂或衍生制剂使抗原与钥孔血蓝蛋白(KLH)，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物结合，所述双功能或衍生制剂例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2，或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团。
通过将例如100μg或5μg蛋白或偶联物(分别对兔子或鼠而言)与3倍体积的弗氏(Freund′s)完全佐剂混合，并经皮内多位点注射该溶液，可以使动物对抗原、免疫原性偶联物、或衍生物产生免疫。一个月后，将含有1/5到1/10最初量的多肽或偶联物的弗氏完全佐剂经皮下注射到多个位点，来给动物加强免疫。7到14天后，自动物取血并分析血清中抗体的滴度。获得滴度平台后给动物加强免疫。偶联物也可在重组细胞培养中产生，为蛋白融合体形式。聚集剂例如明矾适宜用来增强免疫应答。
5.2.1.2. 单克隆抗体
单克隆抗体可用Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤法制备或通过重组DNA法(美国专利4,816,567)制备。
在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，例如仓鼠，来激发产生或能产生特异结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可被体外免疫。免疫后，淋巴细胞可被分离并随后使用适宜的融合剂例如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))。
由此制备的杂交瘤细胞被种于适宜的培养基并在其中生长，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞(也称融合伙伴)的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)这些抑制HGPRT-缺陷细胞生长的物质。
优选融合伙伴骨髓瘤细胞为那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体、并敏感于抗(against)未融合亲代细胞的选择性培养基的细胞系。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute CellDistreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和M.C.-11小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653细胞。也描述了人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur等，Moneclonal Antibody Production Techniques and Applications，(Marcel Dekker，Inc.，New York纽约，(1987))51-63页]。
可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。
单克隆抗体的结合亲和力可通过，例如Muson等，Anal.Biochem.，107；220(1980)所述Scatchard分析来测定。
一旦产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞被鉴定，这些克隆可通过有限稀释进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))使其生长。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，通过例如将细胞注射入小鼠中，可以使杂交瘤细胞以动物腹水肿瘤的形式在体内生长。
上述亚克隆所分泌的单克隆抗体可用经典抗体纯化方法如，例如，亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白Sepharose)，或离子交换层析，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析等从培养基，腹水或血清中分离。
使用传统方法(例如通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)可轻易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，可以将它置入表达载体中，该载体随后被转染至宿主细胞中例如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成抗体蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。有关编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol，5：256-262(1993)和Plukthun，Immunol.Revs.，130：151-188(1992)。
在进一步的实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的文章描述了通过链改组产生高亲和性(纳米级)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及将组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行(viable)选择。
可以对编码所述抗体的DNA进行修饰以产生嵌合或融合抗体多肽，方法是例如，以人重链和轻链恒定区(CH和CL)序列代替同源鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的完整或部分编码序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定区，或它们可替代抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，它包含两个特异于不同抗原的抗原结合位点。
5.2.1.3. 人源化抗体
使非人抗体人源化的方法已在本领域中描述。人源化抗体具有一或多个从非人来源引入它的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))所述，通过高度可变区序列替换人抗体的对应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中超变区残基且可能有部分FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
当抗体用于人类治疗用途时，选择人源化抗体制备所用的人可变区轻链和重链，对于降低抗原性和HAMA反应(人抗鼠抗体)非常重要。根据所谓的“最适”方法，针对已知人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。鉴定与啮齿类V区序列最接近的人V区序列并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims et al.，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法使用从具有轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同样的框架区可被用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体序列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，超变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。
本发明还涉及人源化抗体的各种形式。例如人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab，其可选地与一种或多种细胞毒性制剂偶联以产生免疫偶联物。可选地，人源化抗体可以是完整的抗体，例如完整IgG1抗体。
5.2.1.4. 人抗体
作为人源化的备选，可制备人抗体。例如，现在可以制备转基因动物(如小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列转移到此胚系突变小鼠中，将导致在抗原攻击的情况下产生人抗体。见例如，Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；美国专利5,545,806,5,569,825，5,591,669(所有均授予GenPharm)；5,545,807；和WO 97/17852.
或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348：552-553(1990))从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技术，将抗体V区基因与丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因克隆在相同的阅读框内，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特点进行的选择也导致对显示这些性质的抗体的编码基因进行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；这些综述见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in StructuralBiology 3,564-571(1993)。可使用V基因节段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson等，Nature 352，624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因随机组合小文库中分离出一批多样的抗-噁唑酮抗体。可基本如Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所述，构建未免疫的人类供体的V基因库，并分离针对多种多样抗原(包括自身抗原)的抗体。也见美国专利5,565,332和5,573,905。
如上讨论，人抗体也可通过体内活化的B细胞产生(见美国专利5,567,610和5,229,275)。
5.2.1.5. 抗体片段
在特定的情况下，使用抗体片段比整个抗体更有优势。片段的较小体积允许快速清除，并导致更好地接近实体肿瘤。
已开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生(见例如，Morimoto等，J.Biochem.Biojphys.Methods 24：107-117(1992)和Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接生产。Fab，Fv和ScFv抗体片段均可在大肠杆菌中表达并从中分泌，从而使这些片段的大量生产变容易。也可自上述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可选地，Fab’-SH片段可自大肠杆菌直接回收并利用化学方法偶联形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一方法，F(ab’)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。包括补救受体结合表位残基并具有延长的体内半寿期的Fab和F(ab′)2片段在美国专利5,869,046中描述。熟练技术人员掌握其它产生抗体片段的技术。其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。Fv和sFv是具有缺乏恒定区的完整结合位点的唯一种类；因此，其适于在体内应用期间降低非特异结合。可以构建sFv融合蛋白，从而在sFv的氨基或羧基末端融合效应蛋白。见上文的Antibody Engineering，Borrebaeck编辑。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如在美国专利5,641,870中描述。此种线型抗体片段可以是单特异或双特异的。
5.2.1.6. 双特异抗体
双特异抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。典型的双特异抗体可结合抗原的两种不同表位。其它此种抗体可将抗原结合位点与针对另一蛋白的结合位点组合。双特异抗体也可用来将细胞毒制剂定位在表达特定抗原的细胞上。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性制剂的臂(例如皂草素(saporin)，抗α-干扰素，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)。可以将双特异抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组制备是基于两个免疫球蛋白重链—轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein and Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829(1993年5月13日公开)和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)。
依据另一种并且是更优选的方法，可将具有所需结合特异性(抗体—抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区、CH2及CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能够较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3日公开的WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。
根据美国专利5,731,168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这提供了一种机制，其使异二聚体的产量比不想要的终产物如同二聚体高。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，可在美国专利4676980号中获得。
从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab′)2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇，再与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。
近期的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了完全人源化双特异抗体F(ab′)2分子的产生。每一Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)所述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有VH，其通过接头与VL相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。
本发明还涉及二价以上的抗体。例如可制备三特异抗体。Tutt等J.Immunol.147：60(1991)。
5.2.1.7. 多价抗体
多价抗体比二价抗体更容易被表达与该抗体结合的抗原的细胞内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)(它们不是IgM类)，通过使编码所述抗体多肽链的核酸重组表达可轻易制备该抗体。多价抗体可以包含二聚体化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚体化结构域包括Fc区或铰链区，或由其组成。在本文中，抗体包含一个Fc区和三个或更多个位于Fc区氨基端的抗原结合位点。优选的多价抗体在此包括或三到约八个抗原结合位点，或由它们组成，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包括至少一条多肽链(并优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链包括VH-CH1-柔韧接头(flexible linker)-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少两个(优选四个)轻链可变区多肽。例如本文的多价抗体可包含从约两个到约八个轻链可变区多肽。本文的轻链可变区多肽包含轻链可变区以及可选地进一步包含CL结构域。
5.2.2. 氨基酸修饰
本发明还涉及对本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可通过在抗体核酸中导入适当的核苷酸改变，或通过肽合成法来制备。所述修饰包括，如该抗体的氨基酸序列中的残基缺失，和/或插入和/或取代。可对缺失、插入、和取代进行任意组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需特性。氨基酸的变化还可改变抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。
一种鉴别抗体中处于诱变优选位置的特定残基或区域的有效方法是Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989)所述的“丙氨酸扫描诱变”。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过在取代点引入进一步的或其它的变体而改进。故，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的具有预期活性的抗体变体。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包括100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括使该抗体的N或C末端与酶(例如ADEPT)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合形成的融合体。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使抗体分子中至少一个氨基酸残基被不同残基取代。抗体抗体分子中最有兴趣进行取代诱变的位点包括高变区，也可以改变FR。保守取代见表1的“优先取代”栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表1中“取代举例”栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。
                             表1氨基酸取代
  原始残基 取代举例  优先取代
  Ala(A) val；leu；ile  val
  Arg(R) lys；gln；asn  lys
  Asn(N) gln；his；asp；lys；arg  gln
  Asp(D) glu；asn  glu
  Cys(C) ser；ala  ser
  Gln(Q) asn；glu  asn
  Glu(E) asp；gln  asp
  Gly(G) ala  ala
  His(H) Asn；gln；lys；arg  arg
  Ile(I) Leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸  leu
  Leu(L) 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe  ile
  Lys(K) arg；gln；asn  arg
 Met(M) leu；phe；ile  leu
 Phe(F) leu；val；ile；ala；tyr  tyr
 Pro(P) ala  ala
 Ser(S) thr  thr
 Thr(T) ser  ser
 Trp(W) tyr；phe  tyr
 Tyr(Y) trp；phe；thr；ser  phe
 Val(V) ile；leu；met；phe ala；正亮氨酸  leu
对抗体的生物学特性的实质性修改可通过选择性取代来完成，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为：
(1)疏水性：正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸异亮氨酸
(2)中性亲水：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸
(3)酸性：天冬氨酸，谷氨酸
(4)碱性：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸
(5)影响侧链定向的残基：甘氨酸，脯氨酸
(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。
非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。也可以将这类取代残基引入保守取代位点，更优选引入剩余(非保守)位点。
所述变异可用本领域已知的方法产生，如寡核苷酸-介导的(定点的)诱变，丙氨酸扫描，和PCR诱变。定点诱变[Carter等，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]，盒式诱变[Wells等，Gene，34：315(1985)]，限制性选择诱变[Well et al.，Philos.Treans.R.Soc.LondonserA，317：415(1986)]或本领域已知的其它技术。
扫描氨基酸分析也可用于沿邻接序列鉴定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸是相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是此组中优选的扫描氨基酸，因为它不存在β-碳上的侧链并且极少改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science，244：1081-1085(1989)]。优选丙氨酸的另一原因是因为它是最常用氨基酸。而且，它常常既出现在埋藏位置也出现在暴露位置[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，则可使用同构(isoteric)氨基酸。
任何不参与保持抗体正确构型的半胱氨酸残基可被替代，通常由丝氨酸替代，来提高分子的氧化稳定性并防止错误交联。反之，可在抗体中添加半胱氨酸连接以提高其稳定性(特别当抗体为抗体片段如FV片段时)。
5.2.2.1. 附加修饰
取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)超变区的一或多个残基。通常，所选用于进一步开发的变体相对于其亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法是利用了噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，使超变区的几个位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的超变区修饰位点，可通过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的超变区残基。或者或此外，分析抗原—抗体复合物的晶体结构以确定抗原与抗体之间的接触点也较有利。这些接触残基及其邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对它们全部进行筛选，选出在一或多个相关实验中具有优势特性的抗体以便进一步开发。
抗体的另一种氨基酸变体改变了该抗体原来的糖基化模式。所谓改变就是去掉抗体中的一或多个糖组分，和/或添加一或多个原本不存在于该抗体中的糖基化位点。此外，此术语包括抗体糖基化模式的质变，涉及现有各种糖组分的性质和比例的改变。
抗体的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指将糖组分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使糖组分与天冬酰胺进行侧链酶促相连的识别序列。因此，多肽中存在上述任一种三肽序列都可产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附着于羟基氨基酸，主要是丝氨酸、苏氨酸，但也可用5-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。
在抗体分子中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列，使其包含一或多个上述三肽序列(在添加N-连接糖基化位点的情况下)而实现。这种改变也可通过在原始抗体序列中添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(在添加O-连接的情况下)。
编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子由本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对早期制备的抗体变体或未变异的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。
增加抗体上糖组分数量的另一种方法是将糖苷通过化学处理或酶处理而与抗体偶联。此方法在本领域的例如WO 87/05330，公开于1987年11月11日，和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中描述。
抗体中糖组分的去除可以通过化学处理或酶处理来实现，或者通过使编码糖基化靶点的氨基酸残基的密码子发生突变性取代来实现。化学脱糖基化技术为本领域所公知，例如参见Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118：131(1981)。多肽上糖组分的酶切除可以利用Thotakura等，Meth.Enzymol.，138：350(1987)所述的各种内-和外-糖苷酶来实现。
抗体的另一类共价修饰包括，按照美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192 or 4,179,337所述，将抗体与诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯等各种非蛋白聚合物之一连接。
本发明的抗体也可被修饰成嵌合分子，其中包含与另一异源多肽或氨基酸序列融合的抗体。
在一个实施方案中，所述嵌合分子包含抗体与标签多肽所形成的融合体，该标签多肽提供抗-标签抗体可以选择性结合的表位。表位标签一般位于抗体的氨基-或羧基-末端。抗体的这类表位-标记形式的存在可以使用抗标签多肽的抗体来检测。另外，提供表位标签也使抗体能利用抗-标签抗体或另一类与该表位标签结合的亲和基质容易地进行亲和纯化。各种标签多肽及其各自的抗体是本领域众所周知的。实例包括聚-组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；flue HA标签多肽及其抗体12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988)]；c-myc标签以及针对它的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体[Evan等，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]；单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky等，Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其它标签多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，6：12041210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽标签[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。
5.2.3. 效应功能的工程改造(engineering)
也可预期修饰拮抗剂的效应物功能，如以此增强或抑制抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)。这可以通过在抗体Fc区引入一或多个氨基酸取代而获得。见例如美国专利6,194,551。可选地或此外，可在Fc区引入半胱氨酸残基，使得在此区形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可提高或降低内在化能力和/或增强或减少补体介导的细胞杀伤作用和ADCC。(ADCC)。见Caron等，J.Exp Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。
也可利用如Wolff等.Cancer Research 53：2560-2565(1993)所述的异源双功能交联剂制备具有增强抗肿瘤活性的同二聚体抗体。或者，可通过工程改造产生具有双Fc区并因此具有增强的补体裂解效应及ADCC能力的抗体。见Stevenson等.Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
本发明的抗体优选具有降低的诱导ADCC或CDC的能力。如上述，本领域人员熟悉修饰抗体产生具有降低的诱导ADCC和/或CDC的能力的抗体的方法。见例如美国专利6,194,551。由于本发明的抗体优选偶联于抗有丝分裂化合物以产生细胞毒性化合物，通过降低和/或消除抗体的ADCC和/或CDC能力，细胞毒性化合物的治疗效应(例如仅对增殖细胞的杀细胞作用)主要由细胞毒性化合物的抗有丝分裂组分介导，而不是通过ADCC和/或CDC的间接杀细胞作用。
为增加抗体的血清半寿期，可以按照美国专利5,739,277所述，将补救受体结合表位插入抗体(尤其是抗体片段)中。本发明术语“补救受体结合表位”指可增加IgG分子体内血清半寿期的IgG(例如IgG1，IgG2，IgG3，orIgG4)分子Fc区的表位。
5.2.4. 免疫偶联物
本发明还涉及免疫偶联物，它包含与细胞毒制剂偶联的抗体，所述细胞毒制剂例如化疗剂，毒素(例如细菌，真菌，植物或动物源性的酶活性毒素，或其片段)，放射活性同位素(例如放射偶联物)，生长抑制剂或抗有丝分裂化合物。
5.2.4.1. 美登木素生物碱免疫偶联物
在优选的实施方案中，本发明的抗体偶联于一个或多个美登木素生物碱分子而不显著降低抗体或美登木素生物碱分子的生物活性。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。因此，本发明含有美登素的免疫偶联物可以对增殖并因此正进行有丝分裂的细胞(例如癌细胞)进行有效治疗。然而同样的免疫偶联物可能对非增殖细胞无效。
在本发明优选的实施方案中，美登木素生物碱免疫偶联物可定位于未遭受(undergo)美登素诱导的毒性的组织和/或细胞。已证明遭受美登木素生物碱诱导的毒性的组织/细胞的实例包括但不限于，胃肠(GI)组织和神经细胞(Issel等，1978，Can.Trtmnt.Rev.，5：199-207)。GI系统对美登木素生物碱的反应很可能显示为中毒，因为GI中的细胞高度增殖并因此美登木素生物碱的抗有丝分裂特性可杀死此种细胞。尽管神经细胞不是高度增殖的细胞，神经元轴突的囊泡转运依赖微管蛋白。过去注意到，美登木素生物碱由于抑制微管蛋白聚合而成为有丝分裂抑制物。因此，即便神经元不是高度增殖的细胞，美登木素生物碱对微管蛋白聚合的抑制也对神经细胞有负面影响。
本领域人员了解美登木素生物碱并可通过已知技术合成或从天然来源分离它。适宜的美登木素生物碱在例如美国专利5,208,020和上述的其它专利以及非专利文献中公开。优选的美登木素生物碱是美登木醇和对美登木醇分子的芳香环或其它位点进行修饰的美登木醇类似物，例如美登木醇的各种酯。
本领域已知多种制造抗体—美登木素生物碱偶联物的连接基团，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利EP 0 425 235 B1，和Chari等CancerResearch 52：127-131(1992)公开的那些。连接基团包括二硫基，硫醚基，酸不稳定基团，光不稳定基团，肽酶不稳定基团，或酯酶不稳定基团，如上述专利所公开，优选二硫基和硫醚基。
抗体和美登木素生物碱的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯(dimethyladipimidate HCl))，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双—重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)来提供二硫连接。
接头可附着于美登木素生物碱分子的不同位点，这取决于连接的类型。例如，使用传统的偶联技术通过与羟基反应形成酯连接。该反应可出现在含有羟基的C-3位置，经羟甲基修饰的C-14位置，经羟基修饰的C-15位置，以及含羟基的C-20位置。在优选的实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位置形成连接。
5.2.4.2. 其它免疫偶联物
其它可与本发明的抗体偶联的抗肿瘤药剂包括BCNU，链脲菌素(streptozoicin)，长春新碱和5-氟尿嘧啶，美国专利5,053,394，5,770,710所述的已知统称为LL-E33288复合物的药剂家族，以及esperamicins(美国专利5,877,296)。
可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。
本发明还涉及一种免疫偶联物，其由抗体与具有核酸分解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)偶联。
为选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射活性原子。多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。当偶联物用于诊断时，它包含可用于闪烁照相研究的放射活性原子，例如tc99m或I123，或可以用于核磁共振(NMR)成像(也称磁共振现象，mri)的旋转标记(spin label)，例如碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。
放射性标记或其它标记可通过已知方法掺入偶联物中。例如，所述肽可以生物合成，或使用涉及例如氟-19取代氢的适宜氨基酸前体进行化学氨基酸合成。标记物例如tc99m或I123，Re186，Re188和In111可以借助所述肽中的半胱氨酸残基来附着。钇-90可以借助赖氨酸残基来附着。可用IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57掺入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其它方法。
抗体和细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。这种接头可能是有利于细胞毒药物在细胞内释放的“可断开的接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，光不稳定型接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。
可选地，通过例如重组技术或肽合成制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含分别编码该偶联物的两个部分的区域，它们彼此邻接，或被编码接头肽但不破坏该偶联物的所需特性的区域分开。
在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉亲和素)偶联，将该抗体-受体偶联物给予患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。
5.2.5. 免疫脂质体
本文公开的抗体还可配成免疫脂质体。含有所述抗体的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545。在美国专利5,013,566中公开了循环时间已增加了的脂质体。
特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。通过使脂质体在挤压之下穿过指定孔径大小的滤膜，可获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)所述，经二硫键交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含一种化疗药物。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。
5.2.6. 用药方案，程序，剂量和配方
本文的化合物可以作为预防药和治疗药用于上述多种疾病。
可以制备所述化合物的治疗组合物用于保存，方法是将具有适当纯度的所需化合物与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington′s PharmaceuticalSciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成冻干配制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌—蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或乙二醇(PEG)。
其它这类载体包括离子交换剂，矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，缓冲物质如甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐，或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，硅胶，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，和聚乙二醇。局部用药的载体或基于凝胶的载体包括多糖如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素钠，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段共聚物，聚乙二醇，木蜡醇。对所有给药而言，适合用常规的延效型制剂。这类剂型包括，例如微胶囊，纳米胶囊(nano-capsules)，脂质体，药膏，吸入剂型，喷鼻剂型(nose spray)，舌下片剂和缓释制剂。所述化合物通常以大约0.1mg/ml到100mg/ml的浓度配制在这类赋形剂中。
用于体内给药的本发明化合物必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。化合物通常以冻干形式保存，如果是全身性用药，可以为溶液形式。如果是冻干形式，化合物通常与其它成分一起配制，以便使用时用适当的稀释剂重配。本发明化合物的液体配制剂的实例是用于皮下注射、充满单剂药瓶的无菌，澄清，无色、未加保存剂的溶液。适宜重复使用的经保存(preserved)的药物组合物，可以主要根据适应症和多肽的类型而包括例如：
a)本发明的化合物；
b)缓冲液，它能将pH维持在使得溶液中所述多肽或其它分子最稳定的范围(优选约4-8)内；
c)去污剂/表面活性剂，主要用于稳定化合物，使其对抗搅拌所致聚集；
d)等渗剂；
e)保存剂，选自酚，苯甲醇，和苄索卤铵，例如苄索氯铵；和
f)水。
若使用非离子型清洁剂，它可以是polysorbate(如POLYSORBATETM(TWEENTM)20，80等)或poloxamers(例如POLOXAMERTM 188)。非离子表面活性剂的使用允许配制剂暴露于表面剪切力而不造成多肽变性。而且，此种包含表面活性剂的配制剂可用于气溶胶装置中，例如用于肺部给药(dosing)，和无针注射枪(needleless jet injector guns)(见例如EP 257,956)中的那些。
等渗剂的存在可保证该化合物液体组合物的等渗性，它包括多羟基糖醇，优选三羟基糖醇或更高级糖醇，例如甘油，赤藓醇，阿糖醇，木糖醇，山梨糖醇和甘露糖醇。这些糖醇可单独使用或组合使用。可选地，氯化钠或其它适当的无机盐可用来使溶液等渗。
缓冲剂可以是例如醋酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，或磷酸盐缓冲液，这取决于所需的pH。本发明一种液体配制剂的pH被缓冲到大约4-8的范围，优选约生理pH。
已知保存剂酚，苯甲醇和苄索卤铵(如苄索氯铵)是可用的抗微生物制剂。
治疗组合物通常置于具有无菌存取口的容器中，例如静脉注射袋或带有能通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。配制剂优选通过反复静脉内(i.v.)，皮下(s.c.)，或肌肉内(i.m.)注射来给药，或作为适宜鼻内或肺内传送的气溶胶配制剂来给药(肺内传送见EP 257,956)。
所述组合物可以以缓释制剂的形式给药。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有本发明化合物的固体疏水聚合物半通透基质，如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸(EP 133,988)。
聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化蛋白长时间停留在体内时，它们可能由于暴露在37℃潮湿环境中而变性或凝聚，导致损失生物活性，且免疫原性可能会改变。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定。
持续释放组合物也包括脂质体包裹的化合物。包含本发明化合物的脂质体可通过已知的方法制备：DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利4,485,045和4,544,545；和EP 102,324。脂质体通常为小单层(unilamelar)(约200-800)，其中的脂质含量超过约30mol.％胆固醇，调整所选比例以便使治疗效果最佳。
本发明化合物的治疗有效量当然可以根据诸如待治疗(包括预防)的病理状况，给药方法，用于治疗的化合物的类型，同时进行的任何相关治疗，病人的年龄，体重，总体医学情况，用药史等因素的不同而不同，这可以由医生依经验来确定。因此，临床医师必需根据获得最佳治疗效果的需要来滴定剂量并调整给药途径。临床医师会持续给药该化合物直到获得治疗目的疾病的所需效果。
根据以上原则，有效剂量通常在约0.001到约1.0mg/kg的范围内，更优选约0.01-1.0mg/kg，最优选约0.01-0.1mg/kg。
化合物的给药途径与已知方法相符，例如通过静脉内，肌肉内，脑内，腹膜内，脑脊髓内，皮下，眼内，关节内，滑膜内，鞘内，口腔，局部或吸入途径注入或输入，或通过缓释系统来给药，如下述。所述化合物也可以通过肿瘤内，肿瘤外周，损伤内，或损伤外周的途径进行适当给药，从而赋予局部及全身的疗效。据信腹膜内途径对例如卵巢肿瘤的治疗尤其有用。
用于形成盐并且在下文中有效的分子的可药用盐实例包括碱金属盐(例如钠盐，钾盐)，碱土金属盐(例如钙盐，镁盐)，铵盐，有机碱盐(例如吡啶盐，三乙胺盐)，无机酸盐(例如盐酸，硫酸，硝酸)和有机酸的盐(例如醋酸盐，草酸盐，对甲苯磺酸盐)。
5.2.7. 联合治疗
本发明化合物在预防和治疗目的疾病方面的有效性，可以通过将活性制剂与对所述目的而言有效的另一种制剂依次给药或联合给药来改进，上述两种制剂可以在同一组合物中或在不同组合物中。
本发明的化合物用于治疗癌症时，可与上述的细胞毒制剂，化疗剂，或生长抑制剂联合使用。并且，对于癌症的治疗，所述化合物的给药可以适当的与放射学治疗(无论是否涉及辐射或给药放射活性物质)先后进行或联合进行。
与本发明的化合物联合给药的治疗剂的有效量可由内科医生或有经验的护士决定。定量给药和调整是为了获得对所治疗疾病最大程度的管理(management)。剂量还有赖诸如所用治疗剂的类型和所治疗的具体病人等因素。
5.2.8. 制品
含有对治疗上述病症有用的本发明化合物的制品例如试剂盒包含容器和标签。适宜容器包括，例如，瓶，小瓶，注射器，和试管。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器内盛放能有效治疗病症的组合物，并具有无菌存取口(例如该容器可以是静脉注射袋或带有能通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是本发明的化合物。在容器上的或容器附带的标签说明该组合物用于诊断或治疗所选疾病。产品还包括第二个容器，其中含可药用的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。产品还可进一步包括具有商业需要以及符合用户需要的其它材料，如其它缓冲液、稀释剂，滤器，针头，注射器，以及带有使用说明的包装插页。制品还可包括具有上述另一种活性剂的第二或第三容器。
5.2.9. 抗体的药物组合物
根据本发明使用的抗体和免疫偶联物的药用配制剂通过将具有所需纯度的抗体与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s PharmaceuticalSciences第16版，Osol，A.编(1980))混合形成冻干配制剂或水溶液的形式而制备，用于保存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如乙酸盐，Tris，磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；保存剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；张力调节剂(tonicifier)如海藻糖和氯化钠；糖类如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂如polysorbate；成盐反离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。抗体优选包含浓度为5-200mg/ml，优选10-100mg/ml的抗体。
如果抗原是细胞内抗原并且用完整抗体作为抑制剂，优选内化抗体。但也可以用脂转染(lipofection)或脂质体将抗体或抗体片段运送到细胞内。使用抗体片段时，优选与靶蛋白的结合结构域特异性结合的最小抑制性片段。例如，可以根据抗体的可变区序列来设计肽分子，使之保持与靶蛋白序列结合的能力。此种肽可通过化学方法合成和/或通过重组DNA技术制备。见例如Marasco等，Proc-Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-7893(1993).
本文的配制剂也可包含一种以上治疗特定适应症所必需的活性化合物，优选那些彼此间具有互补活性而没有不利影响的活性化合物。或者或此外，该组合物可包含增强其功能的制剂，例如细胞毒制剂，细胞因子，化疗剂，或生长抑制剂。这些分子以对所需目的有效的总量在组合中适当地存在。
也可以将活性成分包封在按照例如凝聚技术或界面聚合技术制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物释放系统(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和毫微胶囊)中或在大乳剂中。这类技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences，出处同上中。
用于体内给药的配制剂必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且包含所述抗体的固体疏水聚合物半通透基质，如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化抗体长时间停留在体内时，它们可能由于暴露在37℃潮湿环境中而变性或凝聚，导致损失生物活性，且免疫原性可能会改变。可以根据相关机理来设计合理的稳定策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定。
5.2.10. 用抗体进行治疗的方法
本发明还设计用本发明的抗体，尤其本发明的免疫偶联物(例如美登木素生物碱-抗体偶联物)治疗上述多种疾病。
所述抗体可根据已知方法对哺乳动物(优选人)给药，所述方法例如，经集合药团(bolus)或一定期间内持续输注的方式静脉给药，经肌内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径给药。优选静脉给药所述抗体。
总体上，将要进行治疗的疾病是癌症。待治疗癌症的实例包括，但不限于，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，和白血病或淋巴细胞恶性疾病。这种癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌，(例如鳞状上皮细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌包括胃肠道癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(hepaticcarcinoma)，肛门癌，阴茎癌，以及头颈部癌。
其它治疗方案可与给药本发明抗体联合进行。例如，当本发明抗体用于治疗癌症时，接受本发明抗体治疗的患者，也可接受放射治疗。或者或此外，可以将其它化疗剂给药该患者。此类化疗剂的配制和给药方案可以按照制造商的指示进行或者由熟练的临床医师根据经验决定。此类化疗的配制和给药方案也可以参见Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。化疗剂可以在给药本发明抗体之前或之后给药，或者二者同时给药。此外，抗体可与抗-雌激素化合物如他莫昔芬或EVISTATM或抗-孕激素如奥那司酮(onapristone)(见EP 616812)按照这些分子的已知用量联合给药。
在另一实施方案中，本发明的抗体治疗法涉及抗体与一种或多种化疗剂或生长抑制剂的联合用药，包括不同化疗剂的混合物的共同用药。化疗剂包括磷酸雌氮芥，松龙苯芥，顺铂，5氟尿嘧啶，美法仑，环磷酰胺，羟基脲和hydroxyureataxanes例如(紫杉醇和紫杉萜)和/或蒽环类抗生素。此类化疗剂的配制和给药方案，可以按照制造商的指示进行，或者由熟练的临床医师根据经验决定。此类化疗的配制和给药方案在Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)中也有描述。
抗体可与抗激素化合物按照这些分子的已知用量联合给药，所述抗激素化合物例如，抗-雌激素化合物如他莫昔芬；或抗-孕激素如奥那司酮(见EP616812)；或抗雄激素例如氟他米特。当待治疗癌症是雄激素非依赖的癌症时，病人可预先接受抗雄激素治疗，在该癌症变得不依赖雄激素后，对病人施用本发明抗体(以及可选的本文所述其它制剂)。
有时，向患者共-给药(co-administration)心脏保护剂(以阻止或减少与该治疗相关的心肌功能障碍)或一个或多种细胞因子也是有益的。除了上述治疗方案外，可在抗体治疗之前、同时、或之后对患者进行切除癌的手术和/或放疗。上述任一种共给药制剂的适宜剂量是目前使用的那些，而且由于该制剂与抗体的联合作用(协同作用)，所述剂量可以更低。
当抗体用于治疗癌症时，可能还希望给药抗其它肿瘤相关抗原的抗体，例如与ErbB2，EGFR，ErbB3，ErbB4，或VEGF受体中的一种或多种结合的抗体。这些还包括前述制剂。此外，也可以将所述抗体与放射学治疗(无论是否涉及辐射或给药放射活性物质)适当地依次给药或联合给药。可选地或此外，可将本文公开的结合相同或两种或多种不同抗原的两种或多种抗体对病人共-给药。有时，对患者给药一或多种细胞因子也是有益的。在优选的实施方案中，本文的抗体与生长抑制剂共-给药。例如，可以先给药生长抑制剂，然后给药本发明的抗体。也可以同时给药，或先给药本发明的抗体。
在一个实施方案中，肿瘤的血管生成在联合治疗中受到攻击。本发明的抗体和另一种已知抗体(例如抗VEGF)，按照通过例如观察肿瘤坏死或其转移灶(如果有的话)所确定的治疗有效剂量来给药肿瘤病人。持续该治疗，直到不再观察到进一步的有益效应或临床检查显示不存在肿瘤或任何转移灶的迹象(trace)。然后给药TNF，可以是单独给药或与以下助剂联合给药：例如α、β或γ干扰素，抗HER2抗体，heregulin，抗heregulin抗体，D因子，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，或促进肿瘤中微血管血凝固的制剂，例如抗蛋白C抗体，抗蛋白S抗体，或C4b结合蛋白(见WO 91/01753，公开于1991年2月21日)，或热或辐射。
由于助剂的有效性各不相同，故希望通过传统方式的基质筛选来比较其对肿瘤的影响。可以反复施用本发明抗体和TNF直到获得所需的临床效应。可选地，本发明的抗体与TNF以及可选的助剂一起施用。如果是在四肢中或在其它易于与体循环分离的部位发现实体肿瘤，可以将本文所述治疗剂施用于该分离的肿瘤或器官。在其它的实施方案中，将FGF或PDGF拮抗剂(例如抗FGF或抗PDGF中和抗体)与本发明的抗体联合施用于病人。优选在伤口愈合期或所需新生血管形成期暂停本发明抗体的治疗。
进行疾病的预防或治疗时，内科医生可以根据已知的标准选择用药的剂量和模式。抗体的适当剂量依赖于所治疾病的类型(如上所述)，疾病的严重程度和进程，抗体给药的目的是预防还是治疗，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的应答，以及主治医生的判断。抗体适宜一次性地或在一系列治疗中施用于患者。优选通过静脉内注射或皮下注射来给药抗体。根据受治疾病的严重程度和类型，施用于患者的抗体的初始侯选剂量是约1μg/kg到约50mg/kg体重(例如约0.1-15mg/kg/剂)，无论是例如通过一次或分多次给药，还是通过连续输注给药。剂量方案可包括施用约4mg/kg起始负荷量的抗体，随后的每周维持量是2mg/kg的抗体。但也可以采用其它剂量方案。典型的日剂量可从约1μg/kg到约100mg/kg或更多，根据上述因素不同而变化。对于同一数天或更长时间的重复给药，视具体情况而将治疗持续到出现对疾病症状的所需抑制为止。治疗的进展很容易根据医师或本领域其他技术人员已知的标准、通过常规技术和试验来监测。
除了对病人施用所述抗体蛋白，本申请还涉及通过基因治疗施用所述抗体。编码该抗体的核酸的所述施用包括在“施用治疗有效量的抗体”的表达中。见例如1996年3月14日公开的WO 96/07321关于基因治疗在制备细胞内抗体方面的用途。
使核酸(可选地包含于载体中)进入病人细胞有两种主要的方法：体内和回体(ex vivo)。在体内运输中，核酸被直接注入病人体内，通常在需要该抗体的部位。在回体治疗中，取出患者的细胞，将核酸导入这些离体的细胞中，然后将改良的细胞直接回输给患者或将其包被在多孔膜中移植至患者体内(见例如美国专利4892538和5283187)。多种技术可将核酸引入活细胞。根据所述核酸是在体外转移入培养细胞中，还是在体内转移入目的宿主细胞中，所应用的技术不同。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞中的技术包括脂质体的使用，电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸钙沉淀法等。基因的回体传递常用的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(例如腺病毒、单纯疱疹病毒I型或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(用于脂质介导的基因转移的有效脂质体是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行转染。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述见Anderson等，Science 256：808-813(1992)。也见WO 93/25673及其引用的参考文献。
5.2.10.1. 抗体定位
在优选的实施方案中，本发明的抗体与抗有丝分裂化合物(包括但不限于美登木素生物碱)偶联。有丝分裂是在细胞分裂和复制中涉及的细胞程序。不幸的是，许多疾病和失调是以异常的有丝分裂为特征。例如癌症是此种实例之一，在癌症中，细胞有丝分裂变得失控。因此，需要将治疗剂定位于涉及异常有丝分裂的细胞。
本发明基于抗体-抗有丝分裂偶联物对杀死进行有丝分裂的细胞高度有效的发现。而且，本发明还基于所述抗体或其它细胞结合剂无需对只在肿瘤细胞上表达的多肽抗原特异的惊人发现。进一步，本发明的抗体或其它细胞结合剂只需区分在增殖的癌细胞上的表达高于在增殖的非癌细胞上的表达的多肽抗原。由于抗体或其它细胞结合剂与抗有丝分裂剂偶联，抗体与非增殖或缓慢增殖细胞的结合不会导致非增殖或缓慢增殖细胞的死亡，因为只有正处在有丝分裂期细胞(例如增殖的细胞)会被杀死。
在优选的实施方案中，抗体与美登木素生物碱偶联，优选抗体被定位于未遭受美登木素生物碱诱导的毒性的组织和/或细胞。先前被证明遭受美登木素生物碱诱导的毒性的组织举例包括，但不限于，消化道(GI)组织和神经细胞(Issel等，1978，Can.Trtmnt.Rev.，5：199-207)。GI系统很可能显示对美登木素生物碱的毒性反应，因为GI内的细胞是高度增殖的，并因此，美登木素生物碱的抗有丝分裂特性会杀死此种细胞。尽管神经细胞不是高度增殖的细胞，神经元轴突的囊泡运输依赖微管蛋白。如前所述，由于美登木素生物碱抑制微管蛋白的聚合，它们是有丝分裂抑制剂。因此，尽管神经元不是高度增殖的，美登木素生物碱对微管蛋白聚合的抑制也对神经元细胞有副作用。
因此，本发明克服了以前肿瘤抗原筛查法的限制和缺陷。更具体地，在本发明以前，由于害怕对非增殖或缓慢增殖细胞的毒副作用，在肿瘤细胞表面和在正常的非增殖或缓慢增殖细胞表面都可找到的多肽抗原没有被作为癌症治疗的靶点。然而，如上所述，本发明的抗体与抗有丝分裂化合物(例如美登木素生物碱)偶联，并因此不会对非增殖或缓慢增殖的细胞产生副作用。因此，本发明惊人的发现显著扩大了可能被用作癌症治疗剂的多肽抗原靶点的范围。
5.2.11. 筛选细胞表面多肽的技术
鉴定与增殖、缓慢增殖和非增殖的非癌细胞和组织相比，在增殖的癌细胞和其它患病组织中细胞表面多肽的差异表达和/或改变表达将有利于了解基因功能、疾病的遗传基础和治疗此种疾病的治疗靶点。现有许多技术用于鉴定在一种细胞类型比在另一种细胞类型的表达更高的多肽抗原。在优选的方面，这些技术可被用来鉴定在增殖的癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面的表达更高的多肽抗原。此种技术的实例包括，但不限于，微阵列分析，Northems，Westems，以PCR为基础的策略，TAQMAN，基因扩增和筛选基因表达数据库，包括例如公共数据库(例如Genbank)和/或私有数据库(LIFESEQ，Incyte Pharmaceuticals，Inc.，Palo Alto，CA；和GENEEXPRESS，GeneLogic，Inc.，Gaithersberg，MD)。
5.2.11.1. 微阵列分析
在过去几年中，一种称为DNA微阵列的新技术引起了分子生物学家的广泛兴趣并被用于描画复杂疾病和发现新的疾病相关基因。(Ekins，R.等，“Microarrays：their origins and applications”，Trends in Biotechnology，17：217-218(1999)；Heller，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，94：2150-2155(1997))。
DNA微阵列包括多核苷酸或寡核苷酸样品的有序排列。该技术允许一种介质基于配对规则而与已知和未知的DNA样品来匹配，并自动进行鉴定未知样品的程序。DNA微阵列可通过高速机器人技术来制作或人工制作，通常制作在玻璃上但有时也制作在尼龙或其它基座上，它用已知的cDNA探针测定互补结合，并因此允许平行进行大批量的基因表达和基因发现研究。用单个DNA芯片进行的实验可同时提供成千上万种基因的信息(Schena，M.等，Science，270：467-470(1995)；Shalon，D.等，Genome Res.，6(7)：639-645(1996))。
使用DNA微阵列，来自检验和对照样品的检验和对照mRNA样品被逆转录并标记产生cDNA探针。探针随后与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。该阵列被设置成阵列每个成员的序列和位置都已知。例如，可将选定的已知在特定疾病状态下表达的基因排列在固体支持物上。标记探针与特定阵列成员的杂交表示衍生出该探针的样品表达该基因。如果来自检验(疾病组织)样品的探针的此种杂交多于来自对照(非疾病组织)样品的探针的杂交，就鉴定了在疾病组织中表达的一或多个基因。可选地，可使用微阵列鉴定在一种细胞类型上较另一种细胞类型上表达水平更高的基因。
检测敏感性是有效分析检验与对照样品以识别与疾病相关的基因表达的限制性因素。为使用DNA微阵列研究人类基因，成功分析许多疾病状态需要对有限数量的样品进行足够敏感的检测。
因此，DNA微阵列可被设计为检测来自第一种细胞类型的已知基因较第二细胞类型中同一基因的差异性表达(通常第一细胞类型相应于非疾病组织而第二细胞类型相应于疾病组织(包括肿瘤))。尤其重要的情况是检测到与正常细胞相比，具体基因在疾病组织中的表达发生变化，然后可以用此种基因作为所报道的疾病的药物干预靶点。DNA微阵列技术因此非常适合于研究疾病的变化特性并鉴定疾病相关基因，从而开发出治疗物(therapeutics)和疾病治疗来改进复杂慢性疾病的治疗。
可以用DNA微阵列测量基因表达的差异和/或变化，从而监测编码多肽抗原的大量兴趣基因的表达水平。可以用DNA微阵列同时监测大量基因的表达水平(以产生转录像(image))并鉴定遗传变异体、突变和多态性。具体地，可以设计DNA微阵列以检测来自第一细胞类型的编码多肽抗原的基因较第二细胞类型中同一基因的差异性表达(通常第一细胞类型相应于正常组织而第二细胞类型相应于疾病组织)。从两种细胞类型中分离出由mRNA转化成的荧光标记cDNA，其中来自第一和第二细胞类型的cDNAs由第一种和第二种不同的荧光报道分子(fluorescent reporters)标记。在优选的实施方案中，微阵列被用于鉴定在一种细胞类型上较另一种细胞类型上表达水平更高的基因。
在一个实施方案中，DNA微阵列根据本领域已知方法制备并使用，所述方法例如在WO95/11995(Chee等，Lockart，D.J.，等，Nat.Biotech.，14：1675-1680(1996)，和Schena，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：10614-10619(1996))中所述的那些。
DNA微阵列优选由固定在固体支持物上的大量独特的单链核酸序列(通常是合成反义寡核苷酸或cDNA片段)组成。优选寡核苷酸长度约为6-60个核苷酸，更优选约15-30个核苷酸，最优选长度约20-25个核苷酸。对一种类型的DNA微阵列，优选使用长度只有7-10个核苷酸的寡核苷酸。DNA微阵列在沿该序列的全长范围内，包含跨已知的5′(或3′)序列的寡核苷酸，或包含跨全长序列的寡核苷酸；或选自特定区域的独特寡核苷酸。用于DNA微阵列的多核苷酸可以是对一或多种目的基因(至少已知其中的序列片段)具有特异性的寡核苷酸，或者是对一种或几种在具体细胞或组织类型中常见的或在正常状态、已发育状态或疾病状态中常见的未鉴定cDNA具有特异性的寡核苷酸。在一些情况下，微阵列适合使用寡核苷酸对。这些寡核苷酸对是相同的，只有优选位于该序列中心的一个核苷酸例外。寡核苷酸对中的第二个寡核苷酸(被错配)作为对照。寡核苷酸对的数量可以是2到1,000,000。
为产生已知序列的微阵列寡核苷酸，编码兴趣多肽抗原的基因使用始于该核酸序列5′末端或更优选3′末端的计算机算法来检查。该算法鉴定了基因独有的限定长度的寡聚物，其GC含量在适于杂交的范围内，并且缺乏可能干扰杂交的预计二级结构。
在一方面，可使用光导化学偶联法和喷墨应用装置(inkjet applicationapparatus)在基座表面的指定区域合成寡核苷酸，如WO95/251116(Balderschweiler等)所述。该基座可以是纸，尼龙或任何其它类型的膜，滤纸，芯片，玻片，或任何其它适宜的固体支持物。在另一方面，可以用类似于斑点(dot)或斜槽(slot blot)(HYBRIDOT仪器，GIBCO/BRL)的“栅格状(gridded)”阵列经过真空系统、热、UV、机械或化学键合法将cDNA片段或寡核苷酸排列并连接在基座表面。在另一方面，可手工制作阵列，或使用可以获得的装置、材料和机器(包括BRINKMAN多通道移液管或自动装置)制作阵列。此种阵列可以包含8，24，96，384，1536，或6144个寡核苷酸，或从到1,000,000的任何其它倍数(multiple)，以使其自身能有效用于市售仪器。
在另一方面，本发明涉及从小量核酸，尤其是核糖核酸产生荧光标记cDNA探针的改良方法。例如在哺乳动物组织中，总RNA的约1％是信使RNA/polyA+RNA。由于mRNA/polyA+RNA是为cDNA探针合成提供原始模板的物质，相对于非信使RNA(核糖体RNA，转运RNA，等)的复杂本底而言，mRNA可以在非常小量的水平获得。因此，本发明合成cDNA探针的方法提供了一种优势，因为根据本发明可用作模板的RNA量比以前已知方法中有效的量低100-1000倍。
在一个实施方案中，产生荧光标记cDNA探针的方法涉及使用毫微克量的细胞总RNA。这样小量的总RNA与皮克量的细胞信使RNA相当，其中mRNA是逆转录成cDNA的真正模板。本发明额外的实施方案包括从患病的人组织分离的RNA，来自患病组织的经显微解剖的肿瘤细胞，和福尔马林固定、石蜡包埋的患病组织样品中产生荧光标记cDNA探针。
使用DNA微阵列进行的样品分析可通过从生物样品提取多核苷酸来进行。生物样品可自任何体液(血液，尿液，唾液，痰液，胃液等)，培养的细胞，活检，或其它组织制备物中获得。来自样品的多核苷酸可作为探针用于制备与微阵列上的核酸互补的核酸序列。如果微阵列由cDNAs组成，反义RNAs(aRNA)是合适的探针。因此，在一方面，用mRNA来制备cDNA，而存在荧光核苷酸时，用cDNA来制备片段或寡核苷酸aRNA探针。这些荧光标记的探针与DNA微阵列共同孵育使探针序列与微阵列的cDNA寡核苷酸杂交。在另一方面，用作探针的核酸序列可包括利用杂交技术领域熟悉的限制性酶，PCR技术，和OLIGOLABELINGTM或TRANSPROBETM试剂盒(Pharmacia)制备的cDNA寡核苷酸，片段，以及互补或反义序列。
可以通过调整孵育条件来导致发生具有精确互补配对的杂交或具有各种程度弱互补的杂交。可以在去除未杂交的探针后，利用扫描仪确定荧光的水平和模式。通过检查扫描成像可以确定微阵列上每种寡核苷酸序列的互补程度和相对丰度。可以使用监测系统同时测量所有不同序列(在本例中指编码抗原的基因)的缺失、存在和杂交量。该数据可用于大规模相关研究或样品中序列、突变、变异体或多态性的功能分析。(Heller，R.A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci，94：2150-55(1997))。此外，该数据可用来鉴定在增殖的癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面的表达更高的多肽抗原。
5.2.11.2. 分析表达水平的其它技术
基因扩增和/或表达可在样品中直接测量，方法可以是例如传统的Southern印迹，定量mRNA转录的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]，斑点印迹(DNA分析)，或原位杂交，其中用到适合的标记探针。可选地，可使用识别特异性双链体(包括DNA双链体，RNA双链体，和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白双链体)的抗体。对抗体本身进行标记，并在所述双链体与表面结合之处进行试验，从而通过双链体在该表面的形成来检测与该双链体结合的抗体的存在。
可选地，基因表达可通过免疫学方法检测，例如对细胞或组织切片进行免疫组化染色和分析细胞培养物或体液，从而直接定量基因产物的表达。用于对样品液进行免疫组化染色和/或分析的抗体可以是单克隆或多克隆的，并如上文详细论述，可在任何哺乳动物中制备。
5.2.11.2.1. 多肽的纯化
可从培养基或宿主细胞裂解物中回收多肽形式。如果这些多肽与膜结合，可以用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解使之从膜上释放。可以使用各种物理或化学手段，如冻融循环、超声、机械破裂或细胞溶解剂，使在该多肽的表达中用到的细胞破裂。
可以期望从重组细胞蛋白或多肽中纯化所述多肽。下述方法是适宜的纯化方法的举例：在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或阳离子-交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75进行凝胶过滤；过蛋白质A Sepharose柱以除去污染物如IgG；用金属螯合柱结合表位-标记形式的所述多肽。蛋白质纯化的各种方法都可以采用，这些方法是本领域熟知的，可以参见例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principesand Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。纯化方法的选择，取决于例如所采用的生产方法和所制备的具体多肽的性质。
5.2.11.2.2. 扩增编码多肽抗原的基因
本发明基于鉴定在特定癌细胞中扩增并因此可被用作癌症治疗靶点的基因。在优选的实施方案中，鉴定的编码多肽抗原的基因在增殖的癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面的表达更高。
原核生物和真核生物的基因组服从两种看似矛盾的要求。一种是将DNA作为遗传信息的原始形式予以保存和繁殖以便保证多代稳定遗传。另一方面，细胞或生物必须能够适应长期的环境变化。适应机制可包括对遗传物质的质和量的修饰。质的修饰包括DNA突变，其中编码序列发生改变，从而产生具有不同的结构和/或功能的蛋白。基因扩增是量的修饰，其中完整编码序列即基因的实际量增加，导致可用于转录的模板的量增加，可翻译的转录子的量增加，并最终导致由扩增的基因所编码的蛋白的丰度增加。
基因扩增的现象和其内在的机制已在体外若干原核和真核培养系统中进行了研究。基因扩增的最佳实例涉及在含有不同浓度的细胞毒药物氨甲蝶呤(MTX)的培养基中培养真核细胞。MTX是叶酸类似物，并通过阻断二氢叶酸还原酶(DHFR)干扰DNA合成。最初暴露于低浓度的MTX时，大多数细胞(＞99.9％)会死亡。少数细胞存活，并通过产生大量DHFR-RNA和蛋白而能够在浓度增加的MTX中生长。这种过度生产的基础是单个DHFR基因的扩增。已发现该基因的附加拷贝是小的超数染色体(双微染色体)形式的染色体外拷贝或完整的染色体拷贝。
基因扩增最常见于细胞毒药物(对抗细菌的抗生素和对抗真核细胞的化疗剂)的抗性的产生和肿瘤转化中。自发的或由于病毒或化学/环境干扰造成的真核细胞转化通常与该细胞遗传物质中的改变相关。在人恶性疾病中观察到最常见的遗传改变之一是p53蛋白的突变。P53控制细胞从静止期(G1)到复制期(S)的转变并在DNA损伤存在时阻止该转变。换言之，使p53失活的突变的主要后果之一是DNA损伤的积累和繁殖，即遗传改变。除点突变外，肿瘤细胞中遗传改变的常见类型是，扩增和大的结构变异，例如转位。
DNA序列的扩增可以指示特定的功能要求，如DHFR实验系统中显示的那样。因此，恶性疾病中一些癌基因的扩增使这些基因在恶性转化的进程中以及在转化后表型的维持中变成引发因素。该假设在最近的研究中获得了支持。例如，发现bcl-2蛋白在一些类型的非何杰金氏淋巴瘤中扩增。该蛋白抑制凋亡，并导致肿瘤细胞渐进地积累。已发现生长因子受体基因家族的多个成员在多种类型癌症中扩增，这提示这些受体的过度表达使肿瘤细胞对有限量的现有生长因子较不敏感。实例包括在雄激素去除的治疗过程中复发性前列腺癌中雄激素受体的扩增和在乳腺癌中生长因子受体类似物ERB2的扩增。最后，与细胞内信号传递和细胞周期进程的控制相关的基因在恶性转化中可进行扩增。这可以由bcl-I和ras基因在多种上皮和淋巴肿瘤中的扩增来例证。
这些在先研究说明了鉴定肿瘤中扩增的DNA序列的可行性，因为该方法可以鉴定对恶性转化而言重要的基因。ERB2的例子也从治疗角度证明该可行性，因为转化蛋白可能代表新的和特定的肿瘤治疗靶点。
若干不同技术可用来显示扩增后的基因组序列。自癌细胞制备的染色体涂片(spread)的经典细胞发生分析适合鉴定大的结构变异，例如转位，缺失和倒位。扩增的基因组区只有在涉及具有高拷贝数的大区域或为染色体外物质时才能被观察到。细胞遗传学是首先证实具体染色体改变与特定肿瘤的稳定相关性的技术，它不适于鉴定和分离可管理的DNA序列。最新开发的对比型基因组杂交(CGH)技术说明了肿瘤中基因组扩增的普遍现象。肿瘤DNA和正常DNA与处在中期的正常细胞同时杂交，整个基因组可通过对肿瘤中的出现频率增加的DNA序列进行影像分析而筛选。(WO 93/18,186；Gray等，Radiation Res.，137：275-289[1994])。作为筛选方法，该类型的分析显示了各种人肿瘤中大量的复现(recurring)扩增子(一段扩增的DNA)。尽管CGH比传统的细胞遗传学分析对鉴定扩增的DNA链更敏感，但它不能通过标准分子遗传技术在扩增子内部快速鉴定和分离编码序列。然而，CGH可有效用于鉴定在增殖的癌细胞上的表达比在增殖的非癌细胞上更高的多肽抗原。
最敏感的检测基因扩增的方法是基于聚合酶链反应(PCR)的试验。这些试验利用非常小量的肿瘤DNA作为起始物质，十分灵敏，提供了可进一步分析(例如测序)的DNA，并适宜大流量的分析。
上述试验不互相排斥，而是常联合使用来鉴定肿瘤中的扩增。细胞遗传分析和CGH代表测定整个基因组的扩增区的筛选法，基于PCR的方法最适宜最终鉴定编码序列，即扩增区的基因。
根据本发明，所述编码多肽抗原的基因可通过定量PCR来鉴定(S.Gelmini等，Clin.Chem.，43：752[1997])，其中可以将来自多种原发肿瘤(包括乳腺、肺、结肠、前列腺、脑、肝、肾、胰腺、脾、胸腺、睾丸、卵巢、子宫等)，肿瘤，或肿瘤细胞系的DNA与来自健康供者的混合DNA进行比较。定量PCR可以用TaqManTM仪(ABI)进行。基因特异性引物和荧光探针可以根据这些DNA的编码序列来设计。
5.2.11.2.3. 组织分布
本文基因扩增试验的结果可以通过进一步研究，例如通过测定各种人体组织中mRNA的表达来验证。
如上述，各种组织中的基因扩增和/或基因表达，可通过常规的Southern印迹、定量测定mRNA转录的Northern印迹(Thomas，Proc.NatL Acad.Sci.USA，77：5201-5205[1980])、斑点印迹(DNA分析)或原位杂交技术，用适当标记的探针来测定。可选地，可以使用识别特定的双链体(包括DNA双链体，RNA双链体，和DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白双链体)的抗体。
可选地，多种组织中的基因表达可通过免疫学方法检测，例如对细胞或组织切片进行免疫组化染色以及对细胞培养物或体液进行分析，从而直接定量基因产物的表达。用于对样品液进行免疫组化染色和/或分析的抗体可以是单克隆或多克隆的，并如上文详细论述，可在任何哺乳动物中制备。用于制备抗体的一般技术，用于Northern印迹和原位杂交的特定方案由本文提供和/或为本领域已知。
因此，如上述，目前存在多种如上文所述的、可用于鉴定在一种细胞类型比在另一种细胞类型的表达更高的多肽抗原的技术。在优选的方面，这些技术可以用来鉴定在增殖的癌细胞表面比在增殖的非癌细胞表面的表达更高的多肽抗原，并因此，可用作癌症治疗物的鉴定、表征和制备的靶点。
以下实施例只用来举例，而不是用来在任一方面限制本发明的范围。
本说明中所有专利的公开内容和引用的参考文献的全文均包含在此作为参考。
6. 实施例
除非另有说明，根据生产商说明使用实施例中的商品制剂。以下实施例和说明书中通过ATCC保藏号鉴定的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Colleotion，Manassas，VA)。除非另外说明，本发明使用重组DNA技术的标准方法，例如在上文和以下教课书中所述的那些：Sambrook等，见上文；Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y，1989)；Innis等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，Inc.：N.Y，1990)；Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborPress：Cold Spring Harbor，1988)；Gait，Oligonucleotide Synthesis(IRL Press：Oxford，1984)；Freshney，Animal Cell Culture，1987；Coligan等，CurrentProtocols in Immunology，1991。
6.1.实施例1： HERCEPTIN-DM1偶联物
6.1.1. HERCEPTIN的纯化
HERCEPTIN(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，美国专利5,821,337)(1瓶含440 mg抗体)溶解于50mL MES缓冲液(25mM MES，50mM NaCl，pH5.6)中。将该样品加载到已在相同缓冲液中平衡的阳离子交换柱(SepharoseS，15cm×1.7cm)上。然后用相同缓冲液洗柱(5倍柱体积)。将缓冲液的NaCl浓度增加至200 mM来洗脱HERCEPTIN。汇集包含抗体的级分，稀释至10mg/mL，并在包含50mM磷酸钾，50mM NaCl，2mM EDTA，pH6.5的缓冲液中透析。
6.1.2. 以SPP修饰HERCEPTIN
以N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)修饰纯化后的HERCEPTIN抗体，以便引入二硫代吡啶基。使用SPP(2.3mL乙醇中的5.3摩尔当量)处理含NaCl(50mM)和EDTA(1mM)的44.7mL 50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中的抗体(376.0mg，8mg/mL)。室温氩气氛中孵育90分钟后，反应混合物通过以35mM柠檬酸钠，154mM NaCl，2mM EDTA平衡的Sephadex G25柱进行凝胶过滤。收集含有抗体的级分并进行分析。如上述确定抗体的修饰程度。回收的修饰后抗体(HERCEPTIN-SPP-Py)为337mg(89.7％)，每个抗体具有4.5个可释放的2-二硫代吡啶基。
6.1.3. HERCEPTIN -SPP-Py与DMl的偶联
修饰后的抗体(337.0mg，9.5μmol可释放的2-二硫代吡啶基)在上述的35mM柠檬酸钠缓冲液，pH6.5中稀释至终浓度2.5mg/mL。随后将3.0mM二甲基乙酰胺(DMA，终反应混合物中3％v/v)中的DM1(1.7当量，16.1μmol)加入抗体溶液。DM1的结构显示于图1中，其中“R”基团的性质并非关键，可被例如多种能够与接头形成化学键的基团占据。以更稳定的S-S的形式储存本反应使用的DM1，并还原成SH形式以便与HERCEPTIN抗体偶联。反应在室温氩气氛中进行20小时。HERCEPTIN-DM1偶联物的结构在图2中显示。
反应物加于以35mM柠檬酸钠，154mM NaCl，pH6.5平衡的SephacrylS300凝胶过滤柱(5.0cm×90.0cm，1.77L)上。流率是5.0mL/min，收集65个级分(每个20.0ml)。主峰机制在级分47周围(图3)。主峰包含单体HERCEPTIN-DM1。收集级分44-51进行分析。通过测量252nm和280nm处的吸收率确定每个抗体分子连接的DM1药物分子的数目，并发现该数目为每抗体分子3.7个药物分子。
6.1.4. HERCEPTIN -DM1偶联物在体外的抗增殖效应
以HERCEPTIN，HERCEPTIN-DM1偶联物，对照mAb RITUXAN或RITUXANu-DM1偶联物处理在细胞表面表达3+水平的HER2(约2百万HER2分子/细胞)的SK-BR3细胞，并监测这些处理对细胞增殖的效果。如图4所示，HERCEPTIN-DM1处理对细胞生长抑制的程度比HERCEPTIN明显，而对照RITUXAN抗体不抑制细胞生长。尽管RITUXAN-DM1抑制细胞生长，它只在高浓度时抑制细胞生长。例如RITUXAN-DM1偶联物在浓度高达1μg/ml时不显著抑制生长。反之，HERCEPTIN-DM1偶联物高度有效，它从0.01μg/ml起显著抑制细胞生长，并在0.1μg/ml时到达平台期。RITUXAN-DM1偶联物达到与HERCEPTIN-DM1偶联物相同水平的细胞生长抑制需要约高100倍的浓度。这也反映在各偶联物IC50值100倍的差异上，该值是抑制细胞生长的50％所需的浓度。
6.2.实施例2： HERCEPTIN -DM1偶联物不具有毒性以下实验显示与HERCEPTIN-DM1偶联物相关的体内毒性的缺乏。
6.2.1. 实验设计
将HERCEPTIN-DM1施用于年轻的成年雌性食蟹猴(Macacafascicularis；Primate Products，Inc.，Miami Florida)，每周一次共四周。猴子的平均体重是3千克(从2.7到3.4千克)。共8只猴子，分成4组，每组2只，用于研究。HERCEPTIN-DM1的测验剂量是2，10和30mg/kg。对照组只接受与用于待处理动物的剂量体积相同的赋形剂(一种包含琥珀酸钠(10mM)，蔗糖(100mg/ml)和吐温Tween20(0.1％)的缓冲水溶液(pH5.0))。分析对猴子的各种毒性，包括但不限于，神经毒性和心脏毒性。下面的表2更具体地给出本实验的实验设计的细节。
                          表2
每周一次共四周通过静脉内注射(缓慢的集合药团(slow bolus)，在30-60秒内)施用测试/对照药剂。通过外科手术将遥感勘测探针植入动物内，使用来自DSI(Data Sciences International)的ART(1.0版)软件包收集心血管数据。使用2D多普勒超声心动图收集其它心血管数据。
  组别             剂量＝1x/周                  动物数量(雌性)
   剂量(mg/kg)    体积(mL/kg)    浓度(mg/mL)   总数   毒性动力学1  临床病理2  抗体分析3  尸检(第4周)   显微病理
  1    0    6    0   2   2  2  2  2   2
  2    2    6    0.333   2   2  2  2  1   2
  3    10    6    1.67   2   2  2  2  2   2
  4    30    6    5.0   2   2  2  2  2   2
1毒性动力学样品的采集时间是，第0天：给药前，和给药后1小时，48小时和72小时；第7天：给药前，和给药后1小时；第14天；给药前，和给药后1小时；第21天：给药前，和给药后1小时，8小时，24小时和48小时；第28天：最后处死前。
2检验前和每次给药(第5，12，19，和26天)的5天后评估所有动物的血液学，临床化学，包括心脏肌钙蛋白(肌钙蛋白I和肌钙蛋白T)以及肌酸激酶同工酶两次。也可在每次用药(第0，7，14，和21天)的约6小时后评估心脏肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶。
3检验前，用药前第14天和研究终止(第28天)时采集血样进行抗体分析。
Mg/kg＝每公斤体重mg测试药剂
给药第一天定为第0天。
6.2.2. 动物管理
6.2.2.1. 住所
根据USDA动物福利法案(USDA Animal Welfare Act)(8 CFR Parts 1，2和3)，在检疫期间动物成对居住在高架不锈钢笼中。由于进行遥感勘测评估，从手术到研究结束的时间内动物独自居住。
6.2.2.2. 喂养
经认证的(certified)灵长类饮食第5048号(PMI Nutrition International，St.Louis，Missouri)。每天喂一次新鲜食物。喂食的重量约为房间内动物平均体重的4％重量。每周三次补充水果和蔬菜。在本研究中每批(lot)饲料的分析均由生产商进行。
6.2.2.3. 水
通过自动给水系统(Elizabethtown Water Company，Westfield，New Jersey)无限制供水。水的分析由Elizabethtown Water Company，Westfield，New Jersey(Raritan-East Millstone Plant)进行，以保证水达到EPA Federal Safe DrinkingWater Act Regulations(40 CFR Part 141)指定的标准。此外，每半年从代表性房间采集水样品置于检验设备(Testing Facility)中；由转包的实验室对这些样品进行化学和微生物水分析。
6.2.2.4. 环境条件
通过自动定时器控制12小时昼/夜循环。必要时打断昼循环以收集毒性动力血样。
监控温度，每日纪录两次并尽最大可能保持在指定的范围内。温度的范围是17℃到29℃。
监控相对湿度，每日纪录一次并尽最大可能保持在指定的范围内。湿度的范围是20％到80％。
6.2.3. HERCEPTIN -DM1用药
6.2.3.1. 用药途径
使用不锈钢剂量针和相应大小的注射器，在30到60秒内，通过静脉内注射将测试药剂和对照药剂注入已插入大隐或头静脉中的留置导管中。留置导管在使用前以无菌盐溶液冲洗并进行检验以保证它被正确插入静脉中。给药后，使用约2 ml无菌盐水冲洗导管。使用最新获得的体重计算剂量。
6.2.3.1. 频率，持续时间和剂量水平
四周内每周一次(第0，7，14和21天)施用额是药剂。剂量水平如下：第1组-0mg/kg；第2组-2mg/kg；第3组-10mg/kg；第4组4-30mg/kg。所有药物均以6ml/kg的体积用药。
6.2.4. 动物的手术准备
6.2.4.1. 遥感勘测探针植入
手术前一天，手术当天和手术后5天预防性地使用抗生素(Baytril一种DNA旋转酶抑制剂，5mg/kg，肌肉内)处理猴子。手术前动物被禁食最少12小时，但总共不超过18小时(包括手术时间)。麻醉前使用氯胺酮(ketamine)(10mg/kg)和阿托品(atropine)(0.05mg/kg)处理动物。麻醉用异氟醚(isoflurane)来诱导和维持。动物在整个手术期间一直维持麻醉状态。一旦被麻醉，在适宜的腹部和腹股沟区剃毛并准备手术植入程序。在左腹股沟区和腹膜腔内作小切口。遥感勘测仪/传送器(Dara Sciences International，St.Paul，MN)被置于腹膜腔内并通过与网膜或腹膜的粘膜面(根据动物情况而不同)缝合固定。遥感勘测探针的血压导管经由腹部肌肉层而外露，并经皮下直通到左腹股沟区。将血压导管插入左股动脉，导管尖端置于腹主动脉内，并缝合固定。心电图电极也外露，并穿过皮下直通到适当的解剖部位。然后将两电极缝合固定。
6.2.4.1. 术后程序
手术后(从麻醉中恢复以前)马上施用止痛的非类固醇型抗炎药氟尼辛葡甲铵(flunixin meglumine)(1mg/kg，肌肉内)。研究主任和/或兽医认为必要还可施用额外的氟尼辛葡甲铵。在手术当天的术后恢复期，观察动物直到它们从麻醉中恢复，过夜喂养。手术后对猴子预防性施用抗生素(Baytril，5mg/kg，肌肉内)5天。开始用药前允许猴子恢复至少14天。为避免腹部缝合可能开线，手术后至少7-10天不对动物进行处理。
6.2.5. 概要和结论
本实验设计为评估在2，10或30mg/kg剂量下HERCEPTIN-DM1通过每周一次共四次的静脉内注射给药雌性猕猴时可能的毒性(例如心脏毒性和神经毒性)。对照组(2只动物)接受与给药测试动物相同剂量的赋形剂(一种包含琥珀酸钠(10mM)，蔗糖(100mg/ml)和Tween20(0.1％)的缓冲水溶液(pH5.0))。
检验前进行两次体查，并在研究期间每周一次。检验前记录两次体重，实验期间和终止前每周一次。施用检验药品当天和研究终止时在选定的时间间隔收集用于毒性动力学分析的血样。预实验、第14天预给药和研究终止时收集用于抗体分析的血样。血液学和临床化学，包括对肌酸激酶同工酶和心脏肌钙蛋白(肌钙蛋白I和肌钙蛋白T)的分析预实验两次，并在第5，12，19和26天进行。肌酸激酶同工酶和心脏肌钙蛋白的样品也在第0，7，14和21给药后约6小时被收集。
检验前进行两次24小时的放射遥感勘测心血管评估。施用检验药剂当天，以如下方式检测动物：给药前约2小时，给药后每分钟一次共4小时，给药后4小时到给药后24小时期间每30分钟一次和余下的给药周内每小时一次。检验前两次，和给药期终止时记录手动9电极心电图。超声心动测定检验前进行3次，并在第5，12，19和26天进行。
处理4周后，所有的存活动物均被处死。对所有动物的选定组织进行完整的宏观尸检和组织病理评估。自每只动物收集心脏和神经组织并进行分析。
在研究期间未发生与HERCEPTIN-DM1相关的死亡。没有与HERCEPTIN-DM1相关的临床发现或对体重的影响。在终止时记录的多电极心电图或在该研究全过程中以频繁间隔记录的单电极遥感勘测心电图中，都没有与HERCEPTIN-DM1相关的毒性的心电图证据。每次给药后的五天中，通过心电图测定多个2D/M模式心脏尺寸和多普勒血液流变图时，动物中任何剂量下(2，10或30mg/kg)都没有左心室功能进行性减退的证据。在2，10或30mg/kg的剂量下，没有HERCEPTIN-DM1对血压值(均值，收缩压和舒张压)的影响的证据。没有与HERCEPTIN-DM1相关的影响血液学参数的明确证据。没有与HERCEPTIN-DM1相关的对临床化学值或肌酸激酶MB和心肌肌钙蛋白I和T的血清水平的影响，所述蛋白都是心脏损害的特定标志。没有由于使用HERCEPTIN-DM1进行治疗所带来的宏观发现。然而，对于使用高剂量水平30mg/kg处理的动物，HERCEPTIN-DM1相关的微观发现包括坐骨神经和迷走神经的显微神经退变性改变，以及骨骼肌中的次级影响。然而30mg/kg的水平，代表预期治疗水平的约10倍增加。进一步根据笼边观察，使用HERCEPTIN-DM1治疗后没有出现神经或上皮细胞相关的(例如胃肠道，皮肤，感染等)改变。
总之，根据临床评估，心脏损伤的特定血清标志的检测和通过光血显微镜对心脏组织的检查，在以每周一次，共四周静脉注射剂量为2，10或30mg/kg的HERCEPTIN-DM1处理的雌性食蟹猴中没有心脏毒性的证据。在以每周一次，共四周静脉注射剂量为30mg/kg的HERCEPTIN-DM1处理的雌性食蟹猴中观察到外周神经疾病。然而，如上述，30mg/kg的水平代表较预期治疗水平大约10倍的增加。此外，使用HERCEPTIN-DM1治疗后没有发现神经学或上皮细胞相关性(例如胃肠道，皮肤，感染等)改变。
6.3.实施例3： HERCEPTIN -DM1偶联物对正常人细胞或对生长停滞细 胞没有毒性
以下实验显示HERCEPTIN-DM1偶联物对正常人细胞或对生长停滞细胞没有相关的毒性。
6.3.1. 实验设计
正常人乳腺上皮细胞(HMEC)，小气道上皮细胞(SAEC)和成人表皮角质细胞(NHEK)来自Clonetics/BioWhittaker(San Diego，CA)。人肝细胞来自In V二itro Technologies(Baltimore，MD)。SK-BR-3人乳腺癌细胞来自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。使用的培养基是：MEGM(乳腺上皮细胞生长培养基)，SAGM(小气道上皮细胞生长培养基)和KGM(角质细胞生长培养基)，均来自Clonetics/BioWhittaker；肝细胞孵育培养基(In VitroTechnologies)。在补充10％热灭活的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺(均来自GIBCO/BRL，Grand Island，NY)的高葡萄糖DMEM：Ham’s F-12(50：50)中培养SK-BR-3细胞。
将细胞以如下密度铺于96孔培养板中：SK-BR-3细胞每孔2×104；HMEC、SAEC和NHEK细胞每孔104；和人肝细胞每孔3.5×104(预铺于来自In Vitro Technologies的胶原蛋白所包被的板上)并在培养箱中(37℃，5％CO2)贴壁过夜。第二天，加入浓度在0.1ng/ml至10mg/ml的抗体(Herceptin或Rituxan)或抗体-美登木素生物碱偶联物(HERCEPTIN-DM1或RITUXAN-DM1)。孵育3天后，除去培养基，细胞单层以PBS洗涤一次，并用结晶紫染料染色(0.5％结晶紫，20％甲醇)。
对于生长停滞的细胞的实验，以每孔5×103(对于将保持在含10％PBS的培养基中的细胞)或2×104(对处于生长停滞的细胞)密度将SK-BR-3乳腺肿瘤细胞铺于96孔板的完全培养基中。过夜孵育后，取出培养基，并换成含有10％PBS的培养基使正常细胞生长，或换成含有0.1％FBS的培养基以便开始对细胞周期的抑制。经过3天孵育使生长完全停滞后，再次去除培养基并用含有10％FBS或0.1％FBS和Herceptin或抗体-DM1偶联物(0.1ng/ml-10mg/ml)的培养基替换。随后孵育细胞3天，并如上述用结晶紫染色单层细胞。
对所有试验，去除结晶紫染料后，在空气中将板过夜晾干。以0.1M柠檬酸钠：乙醇(50：50)pH4.2洗脱染料，并在SLT 340 ATC读板仪中540nm波长下读板。每个治疗组由4份平行样品组成，将数据表示为O.D.540均值+/-标准误差或相对细胞增殖(与未处理的对照细胞比较)(均值+/-s.e.)。
6.3.2. HERCEPTIN -DM1偶联物对正常细胞没有毒性
HERCEPTIN-DM1治疗SK-BR-3乳腺肿瘤细胞导致剂量依赖的细胞毒性，其EC50为约0.005mg/ml(33pM)(图4)。单用Herceptin造成SK-BR-3细胞生长轻度降低。而对照抗体-美登木素生物碱偶联物RITUXAN-DM1，只有在最高检验剂量(10μg/ml)时显示毒性。相反，HERCEPTIN-DM1对正常人乳腺上皮细胞(图5A)，正常人肝细胞(图5B)；正常人表皮角质细胞(图5C)或正常人小气道上皮细胞(图5D)没有影响。
6.3.3. HERCEPTIN -DM1偶联物对生长停滞细胞无毒
如上所述，以HERCEPTIN-DM1治疗SK-BR-3乳腺肿瘤细胞导致剂量依赖的细胞毒性(图4)。图6A显示以HERCEPTIN-DM1治疗SK-BR-3乳腺肿瘤细胞导致剂量依赖的细胞增殖降低。单用Herceptin造成SK-BR-3细胞增殖的轻度(modest)降低，而对照抗体-美登木素生物碱偶联物RITUXAN-DM1，只有在最高检验剂量(1和10μg/ml)时显示细胞增殖显著减少。
在造成细胞生长停滞的血清剥夺(deprivation)期后，以HERCEPTIN-DM1治疗SK-BR-3乳腺肿瘤细胞不引起细胞毒性反应。即使在最高检验剂量(10μg/ml)，生长停滞的SK-BR-3乳腺肿瘤细胞对HERCEPTIN-DM1(或高剂量RITUXAN-DM1)的细胞毒性完全抵抗(图6B)。此外，如上述，人肝细胞对抗体-美登素的杀伤作用不敏感。由于肝细胞为非分裂的细胞，这些结果进一步支持HERCEPTIN-DM1对非分裂细胞没有影响的发现。

Claims (36)

1.鉴定可作为癌症治疗靶点的细胞表面多肽抗原的方法，包括鉴定在增殖的癌细胞表面的表达水平高于在增殖的非癌细胞表面的表达水平的多肽抗原，从而鉴定所述多肽抗原。
2.权利要求1的方法，其中所述多肽抗原在所述增殖的癌细胞表面的表达比在多数增殖的非癌细胞表面的表达更高。
3.权利要求1的方法，其中所述多肽抗原在所述增殖的癌细胞表面的表达比在所有增殖的非癌细胞表面的表达更高。
4.权利要求1的方法，其中所述多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的癌细胞表面的表达比在增殖的非癌细胞表面的表达更高。
5.权利要求1的方法，其中所述多肽抗原在多数非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面上的表达比在多数增殖的非癌细胞表面的表达更高。
6.权利要求1的方法，其中所述多肽抗原在多数非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面上的表达比在所有增殖的非癌细胞表面的表达更高。
7.权利要求1的方法，其中所述多肽抗原在所述增殖的癌细胞表面的表达与在非增殖或缓慢增殖的细胞表面的表达大体相同。
8.权利要求1的方法，其中所述多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面上的表达比在所述增殖的癌细胞表面上的表达更高。
9.权利要求1的方法，其中鉴定在增殖的癌细胞表面上的表达比在增殖的非癌细胞表面的表达更高的多肽抗原的步骤包括使用微阵列分析。
10.产生用于治疗癌症的细胞毒性化合物的方法，所述方法包括：
(a)鉴定多肽抗原，它在增殖的癌细胞表面的表达比在增殖的非癌细胞表面的表达更高；
(b)产生结合所述多肽抗原的抗体；和
(c)将至少一种抗有丝分裂化合物连接于所述抗体，从而产生所述细胞毒化合物。
11.权利要求10的方法，其中所述多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达比在所述增殖的非癌细胞表面的表达更高。
12.权利要求10的方法，其中所述至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。
13.权利要求10的方法，其中所述抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。
14.权利要求10的方法，其中所述抗体特异结合所述多肽抗原。
15.权利要求10的方法，其中所述抗体基本不能诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)或补体介导的细胞毒(CDC)。
16.抑制癌细胞增殖的方法，包括：
(a)鉴定多肽抗原，它在所述癌细胞表面的表达比在增殖的非癌细胞表面的表达更高；
(b)产生与所述多肽抗原结合的抗体；
(c)将至少一种抗有丝分裂化合物连接于所述抗体以提供细胞毒化合物，并；
(d)将所述癌细胞与所述细胞毒性化合物接触，从而抑制其增殖。
17.权利要求16的方法，其中所述多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达比在所述增殖的非癌细胞表面的表达更高。
18.权利要求16的方法，其中所述至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。
19.权利要求16的方法，其中所述抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。
20.权利要求16的方法，其中所述抗体特异结合所述多肽抗原。
21.权利要求16的方法，其中所述抗体基本不能诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)或补体介导的细胞毒(CDC)。
22.治疗哺乳动物中的癌症的方法，包括：
对所述哺乳动物施用治疗有效量的细胞毒性化合物，该化合物包括：(i)结合多肽抗原的抗体，该抗原在癌细胞表面的表达比在增殖的非癌细胞表面的表达更高，和(ii)至少一种连接于所述抗体的抗有丝分裂化合物，其中所述哺乳动物中的所述癌症被有效地治疗。
23.权利要求22的方法，进一步包括对所述哺乳动物施用另外的化疗剂。
24.权利要求22的方法，进一步包括外科方法。
25.权利要求22的方法，其中所述哺乳动物是人。
26.权利要求22的方法，其中所述多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达比在所述增殖的非癌细胞表面的表达更高。
27.权利要求22的方法，其中所述至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。
28.权利要求22的方法，其中所述抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。
29.权利要求22的方法，其中所述抗体特异结合所述多肽抗原。
30.权利要求22的方法，其中所述抗体基本不能诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)或补体介导的细胞毒(CDC)。
31.包含连接于抗体的抗有丝分裂化合物的组合物，该抗体结合一种多肽抗原，该抗原在增殖的癌细胞表面的表达比在增殖的非癌细胞表面的表达更高。
32.权利要求31的方法，其中所述多肽抗原在非增殖或缓慢增殖的非癌细胞表面的表达比在所述增殖的非癌细胞表面的表达更高。
33.权利要求31的方法，其中所述至少一种抗有丝分裂化合物是美登木素生物碱。
34.权利要求31的方法，其中所述抗体是抗体片段，单克隆抗体，人抗体或人源化抗体。
35.权利要求31的方法，其中所述抗体特异结合所述多肽抗原。
36.权利要求31的方法，其中所述抗体基本不能诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)或补体介导的细胞毒(CDC)。
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