KR20100061863A - 이상 세포 증식을 포함하는 질환에 연관된 폴리펩티드 항원의 인식을 위한 방법 및 상기 질환 치료에 유용한 조성물 - Google Patents

Abstract

정상의 비-암 세포 및 조직에 제한된 일반적 독성을 갖는 유사분열 억제제를 사용하는 효과적인 암 요법의 개발을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 상기 방법 및 조성물은 항-유사분열 화합물 (예, 메이탄시노이드)에 콘쥬게이트된 세포-결합제 (예, 항체)로 이루어진 세포독성 화합물을 이용한다. 본 발명은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 실질적으로 유도함으로써 치료 효과가 ADCC 및(또는) CDC에 의한 간접적 세포 살생에 의한 것이 아니라, 세포독성 화합물의 항-유사분열 성분에 의해 주로 매개되는 것임을 보증할 수 있는 항체를 추가로 제공한다. 본 발명의 항체는 증식성 비-암 세포와 비교하여 증식성 암 세포에서 더 고도로 발현된 폴리펩티드 항원을 분별할 수 있다.

Description

이상 세포 증식을 포함하는 질환에 연관된 폴리펩티드 항원의 인식을 위한 방법 및 상기 질환 치료에 유용한 조성물{Methods for the Identification of Polypeptide Antigens Associated with Disorders Involving Aberrant Cell Proliferation and Compositions Useful for the Treatment of Such Disorders}

본원 발명은 이상 세포 증식 (예를 들면, 암)을 포함하는 질환과 연관된 폴리펩티드 항원 인식에 유용한 방법에 관한 것이다. 더욱 특이적으로 본원 발명은 암 치료에 효과적인 표적인 세포성 폴리펩티드 항원 인식을 위한 신규 방법에 관한 것이다. 추가적으로, 본원 발명은 세포독성 화합물 (예를 들면, 메이탄시노이드 (maytansinoid))을 세포 결합제 (예를 들면, 항체)와 접합시켜서 특정한 세포군에 전달되는 세포독성 화합물을 포함하는 신규 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 항유사분열적 성질을 보인다.

2.1. 세포 유사분열

세포 유사분열은 세포 분열 및 복제를 포함하는 다단계 과정이다 [Alberts, B. 등, In The Cell, pp. 652-661 (1989); Stryer, E. Biochemistry (1988)]. 세포는 분열로 두개의 딸세포로 번식한다. 세포 번식 주기의 DNA 복제기는 "S 기"로 공지되어 있다. 상기 S-기 동안에, 세포 내 염색체는 복제되어 자매염색분체로 공지된 동일한 딸 DNA 쌍이 얻어지고, 그 후 유사분열 동안에 분리되어 두 개의 신규 핵이 생산된다. "유사분열"이라는 용어가 "세포 분열"이라는 용어과 동의어적으로 일반적으로 사용되지만, 유사분열은 정확하게는 세포 분열 과정의 단지 한 기를 일컫는데, 상기 과정에서 자매염색분체는 두 개의 딸세포에 동일하게 분배된다. 유핵 세포에서, 유사분열 후에 세포질이 두 개의 별개인 그러나 유전적으로는 동일한 딸세포로 쪼개지는 세포질 분열이 뒤따른다.

유사분열 개시 때, 튜불린으로 불리는 단백질이 주요 성분인 세포질 마이크로튜불로 공지된 작은 세포내 섬유성 구조물이 튜불린 분자로 해체된다. 그 후, 상기 튜불린은 "방추사"로 공지된 세포내 구조체를 형성하는 마이크로튜불로 재조립된다. 상기 방추사는 분열하는 세포내에서 두 개의 딸핵간에 정확하게 염색체를 배분한는 주요한 역할을 한다. 상기와 같이, 세포내 마이크로튜불 형성이 포유 세포 증식 과정에서 필수적인 단계라는 것이 분명하다.

그러나 불운하게도, 다양한 질환이 비정상적인 세포 증식으로 특징지어진다. 일례로서, 제어되지 않는 세포 분열은 암의 특징이다. 암은 남성 및 여성 모두에게서 심장병 다음으로 주요한 사인이다. 암과의 싸움에서, 다양한 기술이 개발되어 왔고 상기 질환의 성질 및 원인을 이해하고 그의 조절 또는 치료를 위한 방법을 제공하도록 하는 최신 연구의 주제이다.

암세포는 일반적으로 대개의 건강한 세포에서 관찰되는 것보다 더 신속한 세포 분열 및 증식으로 특징되는데, 많은 항암제는 세포 분열을 억제하여 작용한다. 암세포는 건강한 세포보다 더 신속하게 분열하기 때문에, 암세포는 바람직하게는 유사분열을 억제하는 항암제로 사멸시킨다. 상기 화합물은 종종 "항유사분열성" 화합물로 불린다.

2.2. 항종양제

오늘날까지, 세 개의 주요 항암제 패밀리가 공지이다. 종양제 패밀리 각각은 인정된 기전과 연관되어 있다. 첫째로, 항종양제는 알킬화제일 수 있는데, 상기 알킬화제는 DNA와 공유결합 방법으로 결합하여 이중기능성 상해를 형성한다. 상기 이중기능성 상해는 동일 스트랜드의 인접하거나 또는 이웃의 염기를 포함하거나, 또는 대안적으로, 스트랜드간 가교결합을 형성하는 반대편 스트랜드에 있는 염기를 포함한다. 알킬화제의 예는 니트로겐 머스타드 (mustard), 시클로포스파미드 및 클로람부실이다. 상기 알킬화제의 사용과 연관된 독성은 구역질, 구토, 탈모증, 출혈성 방광염, 폐섬유증 등을 포함한다. 둘째로, 항종양제는 DNA의 합성 또는 조립에 연루된 효소를 일반적으로 억제하는 항대사산물일 수 있다. 대체적으로, 항대사산물은 DNA 과정의 프로둘런트 (fradulent) 또는 유사 기질로 작용할 수 있다. 항대사산물의 예는 퓨린, 피리미딘 및 폴레이트 길항제 및 식물 알칼로이드, 예를 들면 빈크리스틴 (vincristine) 및 빈블라스틴 (vinblastine)을 포함한다. 상기 항대사산물을 사용하는 것과 연관된 독성은 탈모증, 골수억제, 구토, 구역질, 말초신경장애 등을 포함한다. 세째로, 항종양제는 DNA 나선에 삽입되거나 또는 DNA에 스트랜드 브레이크 (break)를 도입하여 작용하는 항생제일 수 있다. 항생제의 예는 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin) 및 악티노마이신 (actinomycin)을 포함한다. 상기 항생제를 사용하는 것과 연관된 독성은 골수억제, 과민성 반응, 거식증, 심장독성, 폐섬유증 등을 포함한다.

몇몇 종류의 항유사분열성 화합물은 분열하고 있는 세포에 투여되면 튜불린 또는 마이크로튜불에 결합하여 방추사 형성을 방해한다. 방추사 부재로 인하여 유사분열이 중단되고 가시적인 자매염색분체를 가지나 정상적인 유사분열 형태가 없는 세포가 축적된다. 분열 능력이 없는 상기 세포는 궁극적으로 세포사멸된다. 상기 화합물은 예를 들면 문헌 [E. Hamel, Medicinal Research Reviews, vol. 16, pp.207-231 (1996)]에 의논되어 있다. 방추사 형성을 방해하는 것으로 공지된 화합물의 예는 카타랄투스(Catharalthus) 알칼로이드 빈크리스틴 및 빈블라스틴; 벤즈이미다졸 카르바메이트, 예를 들면 노코다졸 (nocodazole); 콜히친 (colchicine) 및 관련된 화합물, 예를 들면 포도필로톡신 (podophyllotoxin), 스테가나이신 (steganacin) 및 콤브레타스타틴 (combretastatin); 탁산 (taxane), 예를 들면 파클리탁셀 (paclitaxel) 및 도세탁셀 (docetaxel); 및 메이탄시노이드를 포함한다. 상기 알칼로이드, 빈크리스틴 및 빈블라스틴, 상기 탁산에 기반한 화합물 및 메이탄시노이드는 항암 약물로 사용되어 왔다 [예를 들면, E. K. Rowinsky 및 R. C. Donehower, Pharmacology and Therapeutics, vol. 52, pp. 35-84(1991)].

이온화 방사선은 또한 악성 질환에 대하여 잘 자리잡은 치료법이고 치료적 및 경감성 목적 모두에 유리한 것으로 입증되어 있다. 그러나, 방사선치료는 몇몇 바람직하지 않은 합병증, 예를 들면 점막염, 백혈구 감소증, 표피탈락, 척추 괴사 및 말소성 동맥내막염이 올 수 있다. 상기 합병증은 자주 방사선의 완전한 치료적 용량을 전달하는 능력을 제한하거나 또는 치료 후에 주요하게 사망을 야기한다. 많은 화학치료제 또한 정상 조직 세포에 독성이 있어서 화학치료의 부작용은 가끔 거의 종양으로 인한 괴로움 그 자체만큼이나 환자를 황폐화시킨다. 상기 화학치료의 부작용을 감소시키는 일환으로 방사선 동이원소 및 다양한 식물 및 박테리아 독소를 포함하는 화학치료제를 종양 세포에 존재하는 항원에 특이적인 항체에 상기 치료제를 첨부하여 종양 세포에 표적화하는 시도가 있어 왔다. 예를 들면 문헌 [미국 특허 제4,348,376호 및 제4,460,559호]에 항암태아성 항원 항체를 사용하는 고형 종양 (암종 (carcinoma))의 방사선면역치료법이 기술되어 있고, 문헌[미국 특허 제5,595,721호]은 더 분산된 종양인 림프종의 방사선 면역치료법에 관한 것이다. 그러나, 항체 콘쥬게이트를 사용하는 치료법의 결과는 일반적으로 실망스러웠다. 종양 수축율은 낮고 일반적으로 반복가능하지 않았다.

2.3. 메이탄시노이드

메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제하여 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 처음에 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 단리되었다 [미국 특허 제3,896,111호]. 이어서 일련의 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예를 들면 메이타시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르 [미국 특허 제4,151,042호]를 생산하는 것이 밝혀졌다. 합성 메이탄시노이드 및 메이탄시놀 유사체가 당업계에 공지이고 문헌 [예를 들면, 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호]에 개시되어 있는데, 상기 개시 내용은 인용문헌으로 본원에 명시적으로 도입되어 있다.

메이탄신 및 메이탄시노이드는 독성이 높으나 암 치료에서 임상적으로 사용하는 것은 종양에 대하여 빈약한 선택성에 우선적으로 기인하는, 심각한 전신성 부작용에 의하여 심히 제한되어 왔다. 메이탄신을 이용하는 임상 시험은 중추 신경계 및 위장계에서 심각한 역효과 때문에 중단되었다 [Issel 등, 1978, Can Trtmmt. Rev., 5:199-207]. 더구나, 메이탄신은 말초신경장애와 연관있는 것으로 밝혀졌다. 상기와 같이 종양 치료에서 메이탄시노이드 사용은 제한적으로만 성공해 왔다.

2.4. 항체와 콘쥬게이트된 메이탄시노이드

치료 지수를 향상하려는 노력으로, 메이탄신 및 메이탄시노이드를 종양 세포 항원에 특이적으로 콘쥬게이션하는 항체에 접합시켜 왔다. 더욱 특이적으로, 치료적 양상은 종양 세포에는 존재하나 정상 세포에는 존재하지 않는 항원을 확인하고 상기 항원에 결합하는 항체에 메이탄시노이드를 접합하여 따라서 메이탄시노이드의 독성 효과를 종양 세포에만 제한시키는 것을 포함해 왔다. 상기 메이탄시노이드를 함유하는 면역콘쥬게이트의 예는, 예를 들면 문헌 [미국 특허 제5,208,020호; 제5,416,064호 및 유럽 특허 제 EP 0 425 235 B1호]에 개시되어 있는데, 상기 개시 내용은 인용문헌으로 본원에 명시적으로 도입되어 있다. 문헌 [Liu 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:8618-8623 (1996)]은 인간 대장암에 대한 모노클로날 항체 C242에 연결된 DM1으로 명시된 메이탄시노이드를 포함하는 면역콘쥬게이트를 기술하였다. 상기 콘쥬게이트는 배양된 대장암 세포에 대하여 독성이 높고 생체내 종양 성장 분석 시험에서 항종양 활성을 나타냈다. 사실, 상기 C242-DM1 콘쥬게이트는 C242 항원(CanAg)이 세포의 약 100 %에 발현되는 COLO 205 세포의 약 100 % 뿐만 아니라, 단지 세포의 약 20 - 30 %만이 상기 C242 항원을 발현하는 LoVo 세포의 약 99 %에 대하여 세포독성이 있었다. 문헌 [Chari 등, Cancer Research, 52: 127-131 (1992)]은 인간 대장암 세포주에 있는 항원에 결합하는 쥐과 항체 A7 또는 HER-2/neu 발암 유전자에 접합하는 다른 쥐과 모노클로날 항체 TA.1로 디술피드 연결자를 통하여 결합된 메이탄시노이드를 가진 면역콘쥬게이트를 기술한다. 상기 TA.1-메이탄시노이드 콘쥬게이트의 세포독성을 세포당 3 x 10⁵ HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에서 시험관적으로 시험하였다. 상기 약물 콘쥬게이트는 유리 메이탄시노이드 약물에 비슷한 정도의 세포독성을 달성했는데, 상기 세포독성은 항체 분자당 메이탄시노이드 분자수를 증가시켜서 증가될 수 있었다. 상기 A7-메이탄시노이드 콘쥬게이트는 마우스에서 낮은 전신성 세포독성을 보였다. 많은 상기된 메이탄시노이드-항체 콘쥬게이트는 항체 분자당 3 - 4 메이탄시노이드 분자를 이용하여 상기 콘쥬게이트의 세포독성을 증가시킨다.

상기된 메이탄시노이드-항체 콘쥬게이트는 일부 성공적이기는 했으나, 종양 세포에 특이적으로 결합하고 모든 정상 세포에 있는 항원에는 결합하지 않는 항체를 인지하고 생산하기가 극도로 어려운 것으로 입증이 되어 전체적인 치료 효능은 제한적이었다. 상기와 같이, 메이탄시노이드를 사용하기 전에 이용된 방법 및 조성물은 신체 정상 세포에 상대적으로 높은 수준의 전신 독성을 야기시켰다. 그러므로 상기된 전신 독성이 일어나지 않는 세포 유사분열 억제제에 대한 세포성 폴리펩티드 표적을 인지하는데 유용한 신규 방법에 대한 필요가 있다.

2.5. 추가 치료의 필요

수천개의 잠재적인 항암제가 측정되어 왔지만, 인체암 치료에서 종종 일련의 최적이지 못한 치료 선택으로 합병증이 존재한다. 상기와 같이, 독성이 거의 없거나 아예 없고, 수득하거나 생산하는데 값싸고, 환자가 잘 견딜 수 있고 쉽게 투여될 수 있는 화학치료제가 종양학자에게 현재 이용가능한 치료 양상에 바람직하게 첨가될 것이다. 건강한 조직에 더 적은 손상을 주면서 동일 치료 효과를 달성하는 더 낮은 용량의 방사선 또는 치료법이 가능하도록 악성 조직을 선택적으로 감작시키는 제제가 또한 바람직하다. 비슷하게, 암이 발생하거나 또는 재발하는 것을 방지하는 제제가 또한 바람직하다.

본 발명은 상기한 화학치료제 및 감작제를 제공하여 상기 필요 사항을 해결한다. 더구나, 본 발명은 종양 세포 표면에 있는 항체에는 특이적으로 결합하나 모든 정상 세포에 있는 항체에는 결합하지 않는 항체를 이용하는 것이 필수적이지 않은 현재의 항체-독소 콘쥬게이트 양상의 단점을 극복한다.

4. 도면의 간단한 설명
도 1은 "DM1"이라 명명된 메이탄시노이드의 구조를 나타낸다. DM1의 구조에서, "R"은 선택된 링커와 화학 결합을 형성할 수 있는 다양한 기에 의해 점유될 수 있다. 바람직하게는, "R"은 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)와 같은, 링커와 S-S 결합을 형성하는 SH 기 또는 그 보호 유도체이다.
도 2는 HERCEPTIN

-DM1 콘쥬게이트의 구조를 도시한다.
도 3은 세파크릴 S300 겔 여과 컬럼 상의 HERCEPTIN

-DM1 콘쥬게이트의 용리 프로파일이다.
도 4는 SK-BR3 세포에 대한 HERCEPTIN

및 HERCEPTIN

-DM1 콘쥬게이트의 시험관 내 항 증식성 효과를 나타낸다. 대조군으로서, 무관한 모노클로날 항체 RITUXAN

또는 RITUXAN

-DM1 콘쥬게이트를 사용하였다.
도 5 (a-d)는 정규 인간 세포 (인간 유선 상피 세포 (5a); 인간 간세포(5b); 정규 인간 표피 각질세포 (5c); 및 소(小) 기도 상피 세포 (5d))가 HERCEPTIN

-DM1 콘쥬게이트에 의해 사멸되지 않음을 보여준다.
도 6 (a-b)은 성장 정지 세포가 HERCEPTIN

-DM1에 반응하지 않음을 보여준다.

3. 발명의 요약

본 발명은 환자의 정상적이고, 비종양적인 세포 및 조직에 대하여 전신 독성을 제한하는 유사분열 억제제를 사용하는 효과적인 암치료법의 개발을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법 및 조성물은 항유사분열성 화합물에 접합된 항체로 이루어진 세포독성적 화합물을 이용한다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 주요하게 항체 의존적인 세포로 중개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적인 세포독성 (CDC)를 유발할 수 없어서, 따라서 치료 효과 (예를 들면, 단지 증식하고 있는 세포만을 사멸시키는 것)가 ADCC 및/또는 CDC를 통하여 간접적인 세포 사멸에 의한 것 보다는, 세포독성적 화합물의 항유사분열성 성분에 의하여 주로 매개되는 것을 보장한다.

본원 발명은 이상 세포 증식 (예를 들면, 암)을 포함하는 질환의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 더욱 특이적으로 본원 발명은 세포 결합제 (예를 들면, 항체)에 접합될 때, 세포 증식 증가로 특징되는 질환을 치료하는 것에 효과적인 항유사분열 성질 (예를 들면, 메이탄시노이드)을 나타내는 화합물을 발견한 것에 근거한다. 본원 발명은 세포 결합제가 종양세포 항원 (즉, 종양 세포에는 존재하나 정상 세포에는 존재하지 않는)에 특이적일 필요가 없다는 놀라운 발견에 근거한 것이다. 차라리, 세포결합제는 증식성 비-암 (non-cancer) 세포에 비하여 증식성 암세포에 더욱 높게 발현된 폴리펩티들간에서 차별화될 필요가 있다.

한 실시태양에서, 본원 발명은 암치료에 대한 표적으로 사용될 수 있는 세포 표면에 있는 폴리펩티드 항원을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서 상기 폴리펩티드 항원은 증식성 비-암 세포 표면에서보다 증식성 암세포 표면에서 더 높게 발현된다. 추가의 실시태양에서, 상기 폴리펩티드 항원은 증식성 비-암 세포에서보다 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서 더 높게 발현된다. 다른 실시태양에서, 증식성 암 세포 표면에서의 상기 폴리펩티드 항원의 발현 수준은 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에 있는 폴리펩티드 항원의 발현 수준과 거의 같거나 또는 그 미만이다. 추가의 실시태양에서 폴리펩티드 항원을 확인하는 단계는 마이크로어레이 분석을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본원 발명은 폴리펩티드 항원에 결합하는 항체를 생산하고 상기 항체에 하나 이상의 항유사분열성 화합물을 연결하는, 증식성 비-암 세포 표면에서보다 증식성 암세포 표면에서 더 높게 발현되는 폴리펩티드 항원을 확인하는 것을 포함하는 암 치료에 유용한 세포독성 화합물을 생산하는 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기 폴리펩티드 항원은 증식성 비-암 세포 표면에서보다 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서 더 높게 발현된다. 다른 실시태양에서, 증식성 암 세포 표면에서의 상기 폴리펩티드 항원의 발현 수준은 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에 있는 폴리펩티드 항원의 발현 수준과 거의 같거나 또는 그 미만이다. 추가의 실시태양에서, 폴리펩티드 항원을 확인하는 단계는 마이크로어레이 분석을 이용하는 것을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 항유사분열 화합물은 메이탄시노이드이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 폴리펩티드 항원에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 주요하게 ADCC 또는 CDC를 유발할 수 없다.

다른 실시태양에서, 본원 발명은 폴리펩티드 항원에 결합하는 항체를 생산하고 상기 항체에 하나 이상의 항유사분열성 화합물을 연결하고 암세포를 상기 화합물과 접촉시키는, 증식성 비-암 세포 표면에서보다 암세포 표면에서 더 높게 발현되는 폴리펩티드 항원을 확인하는 것을 포함하는 암세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기 폴리펩티드 항원은 증식성 비-암 세포 표면에서보다 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서 더 높게 발현된다. 다른 실시태양에서, 증식성 암 세포 표면에서의 폴리펩티드 항원의 발현 수준은 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서의 폴리펩티드 항원의 발현 수준과 거의 같거나 또는 그 미만이다. 추가의 실시태양에서, 폴리펩티드 항원을 확인하는 단계는 마이크로어레이 분석을 이용하는 것을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 항유사분열 화합물은 메이탄시노이드이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 폴리펩티드 항원에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 주요하게 ADCC 또는 CDC를 유발할 수 없다.

본원 발명의 다른 실시태양은 증식성 비-암 세포 표면에서보다 암세포 표면에 더 높게 발현된 폴리펩티드 항원에 결합하는 항체 및 상기 항체에 연결된 하나 이상의 항유사분열성 화합물을 포함하는 세포독성 화합물의 치료적 유효량을 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 추가의 화학치료제를 투여하는 것을 포함한다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 방법은 추가로 수술 절차를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 상기 폴리펩티드 항원은 증식성 비-암 세포 표면에서보다 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서 더 높게 발현된다. 다른 실시태양에서, 증식성 암 세포 표면에서의 폴리펩티드 항원의 발현 수준은 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서의 폴리펩티드 항원의 발현 수준과 거의 같거나 또는 그 미만이다. 추가의 실시태양에서, 폴리펩티드 항원을 확인하는 단계는 마이크로어레이 분석을 이용하는 것을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 항유사분열성 화합물은 메이탄시노이드이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 폴리펩티드 항원에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 주요하게 ADCC 또는 CDC를 유발할 수 없다.

추가의 실시태양에서, 본원 발명은 항유사분열성 화합물에 접합된 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 증식성 비-암 세포 표면에서보다 증식성 암세포 표면에서 더 높게 발현되는 폴리펩티드 항원에 결합한다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 증식성 비-암 세포 표면에서보다 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서 더 높게 발현된 폴리펩티드 항원에 결합한다. 다른 실시태양에서, 증식성 암 세포 표면에서의 폴리펩티드 항원의 발현 수준은 비증식성이거나 느리게 증식하는 비-암 세포 표면에서의 폴리펩티드 항원의 발현 수준과 거의 같거나 또는 그 미만이다. 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 항유사분열성 화합물은 메이탄시노이드이다. 추가의 실시태양에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 폴리펩티드 항원에 특이적으로 결합한다. 또한 다른 실시태양에서, 상기 항체는 주요하게 ADCC 또는 CDC를 유발할 수 없다.

다른 실시태양에서, 본원 발명은 제약학적으로 허용되는 담체를 이용하는 혼합물에서의 항체-메이탄시노이드 콘쥬게이트를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게 상기 조성물은 무균성이다. 상기 조성물은 연장된 저장 안정성을 달성하도록 보존된 액체 약학 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액체 약학 제제는 상기 조성물의 다중 용량을 함유할 수 있고, 따라서 반복 사용에 적합할 수 있다.

추가의 실시태양에서, 본원 발명은 항체-메이탄시노이드 콘쥬게이트의 치료적 유효량을 제약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것을 포함하는 암 치료에 유용한 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 추가 측면에서, 본원 발명은 하기

(a) 항체-메이탄시노이드 콘쥬게이트를 포함하는 물질의 조성물

(b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및

(c) 상기 용기에 첨부된 레이블 또는 과다증식성 질환, 바람직하게는 암의 치료 또는 완화에서 상기 항체-메이탄시노이드 콘쥬게이트의 용도에 대하여 상기 용기에서 포함된 패키지 사용설명서

를 포함하는 제품을 제공한다. 상기 조성물은 상기 항체-메이탄시노이드 콘쥬게이트의 치료적 유효량을 포함할 수 있다.

5. 발명의 상세한 설명

5.1. 정의

용어 "암", "암성" 및 "악성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 상태를 의미한다. 암의 예로는 선암을 포함하는 암종, 림프종, 아세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암 및 간세포암과 같은 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장직장암, 자궁내막암, 침샘 암종, 신세포암종 및 윌름 종양과 같은 신장암, 기저세포 암종, 흑색종, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 고환암, 식도암, 및 다양한 유형의 두부경부암을 포함한다. 본 발명에서의 치료를 위한 다양한 유형의 바람직한 암은 유방암, 결장암, 폐암, 흑색종, 난소암 및 혈관종양을 포함하는 상기한 바와 같은 기타 암들이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고(하거나) 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제 (intercalating agent); 핵분해 효소와 같은 효소 및 그의 단편; 항생제; 및 독소, 예를 들어 박테리아, 진균, 식물 또는 동물에서 기원된 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (이들의 단편 및(또는) 변이체를 포함함); 및 하기에 개시한 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다. 다른 세포독성제는 하기에 기재되어 있다. 항종양제는 종양 세포를 파괴한다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN^TM); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로리드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리키아마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모퍼, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피토스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린 산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린 산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK"; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존 산; 트리아지쿠온; 2,2',2'"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL

, 미국 뉴저지 프린스턴 소재 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지) 및 독세탁셀 (TAXOTERE

, Rhone-Poulenc Rorer, antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 플라티늄 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 플라티늄; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페르아미신; 카페시타빈; 및 상기 임의의 물질의 제약적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 타목시펜, 랄옥시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston)과 같은 항-에스트로겐; 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 이들의 제약적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 또한 포함된다.

본원에서 사용된 "프로드럭"은 제약적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태로서 모(母) 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고, 효소에 의해 더욱 활성인 모(母) 형태로 활성화 또는 전환될 수 있는 물질을 말한다. 예를 들어, [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]를 참조할 수 있다. 본 발명의 프로드럭은 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 술페이트-함유 프로드럭, 펩티드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형 프로드럭, 글리코실화된 프로드럭, β-락탐-함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로유리딘 프로드럭을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용되기 위한 프로드럭 형태로 유도화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 앞서 기재한 화학요법제를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 "성장억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포, 예를 들어 Wnt-과발현 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장억제제는 S기에서의 악성 세포의 비율(％)을 상당히 감소시키는 것이다. 성장억제제의 예로는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서) 차단하는 작용제, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제가 있다. 종래의 M기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 메이탄시노이드 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1 정지 여파로 S기 정지를 초래하는 작용제의 예로는 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C가 있다. 보다 자세한 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13쪽]에서 찾을 수 있다. 추가적인 예로는 종양 괴사 인자 (TNF), 산성 또는 염기성 FGF 또는 간세포 성장 인자 (HGF)의 혈관형성 활성을 억제 또는 중화할 수 있는 항체, 조직 인자, 단백질 C, 또는 단백질 S의 응고 활성을 억제 또는 중화할 수 있는 항체 (1991년 2월 21일 발행된 WO 91/01753 참조), 또는 HER2 수용체에 결합할 수 있는 항체 (WO 89/06692), 예를 들어 4D5 항체 (및 그 기능적 동등체) (예. WO 92/22653)가 포함된다.

"치료"는 과-증식성 질병의 진전을 방지하거나 병변을 변형시킬 의도로 수행되는 조치이다. 치료의 개념은 광의로 사용되며, 구체적으로는, 임의의 단계의 과증식성 질병의 방지 (예방), 완화, 감소 및 치유를 포함한다. 따라서, "치료"는 치료 처치와 예방 조치 또는 예방적 조치 모두를 의미하는데, 이는 그러한 질병을 예방하거나 경감 (감소)시키거나 완화시키는 것이 목적이다. 치료가 필요한 대상에는 이미 질환을 앓는 대상뿐만 아니라, 질환을 앓기 쉬운 대상 또는 질환이 예방되어야 하는 대상이 포함된다.

"만성" 투여는 초기 효과가 연장된 기간 동안 유지되도록 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제를 투여하는 것을 의미한다.

치료의 목적상 "포유동물"은 인간, 가축 및 축산용 동물, 동물원 동물, 경기용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지 등을 비롯한 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

1종 이상의 추가의 치료제와 "병용" 투여는 동시 (함께) 투여하는 것 및 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.

용어 "치료적 유효량"은 대상 또는 포유동물에서 질병 또는 질환을 "치료하기"에 효과적인 항체 또는 약물의 양을 의미한다. 암의 경우, 치료적 유효량의 약물은 암세포 수의 감소; 종양 크기의 감소; 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및(또는) 상기 암과 관련된 1종 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감을 가능하게 할 수 있다. 본원에서의 "치료"의 정의를 참조한다. 약물이 기존 암세포의 성장을 방해하고(하거나) 기존 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도이면, 이는 세포정지 및(또는) 세포독성을 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 "담체"에는 사용된 투여량 및 농도에서 그에 노출된 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화가 포함된다. 종종 생리학적으로 허용가능한 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예로는 인산, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및(또는) TWEEN, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.

"항체" (Abs) 및 "면역글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특성을 가지는 당단백질이다. 항체가 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항체 및 항원 특이성이 결여된 기타 항체-유사 분자 양자를 포함한다. 후자의 폴리펩티드는 예를 들어 림프 시스템에 의해 낮은 수준으로 그리고 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다. "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 예를 들어, 완전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 둘 이상의 완전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체 (예. 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 대개, 두 개의 동일한 경(L)사슬 및 두 개의 동일한 중(H)사슬로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종4량체 당단백질이다. 각각의 경사슬은 하나의 공유 이황 결합에 의해 중사슬에 연결되고, 이황 결합이 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중사슬 사이에서 다양하다. 각각의 중사슬 및 경사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황 브릿지를 가진다. 각각의 중사슬은 한 쪽 말단에 가변 도메인(V_H)에 이어 수 개의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경사슬은 한 쪽 말단에 가변 도메인(V_L)을, 다른 쪽 말단에 불변 도메인을 가진다; 경사슬의 불변 도메인은 중사슬의 첫번째 불변 도메인과 정렬되며, 경사슬 가변 도메인은 중사슬의 가변 도메인과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기가 경사슬 및 중사슬 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타대며, 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 이러한 가변성이 항체이 가변 도메인에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이는 경사슬 및 중사슬 가변 도메인 양자에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가면 도메인의 보존성이 더욱 높은 부분은 프레임워크 영역 (framework region, FR)이라 불리운다. 천연 중사슬 및 경사슬 각각의 가변 도메인은 주로 β-시트 구조를 취하며 3개의 CDR로 연결되어 있는 4개의 FR 영역을 포함하는데, 이는 β-시트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는 상기 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 사슬에서의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 근접하게 고정되어 있고, 다른 사슬로부터의 CDR은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데에는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포독성 (antibody-dependent cellular toxicity)에 항체가 참여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

"항체 단편"은 원형 항체의 일부, 바람직하게는 원형 항체의 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체 ([Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)] 참조); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중 특이적 항체가 포함된다.

항체를 파파인으로 절단하면 "Fab" 단편이라고 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편 (각각은 단일의 항원-결합 부위를 가짐)이 생성된다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원-결합 부위를 가지며 항원을 여전히 가교결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성시킨다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 1개의 중사슬 가변 도메인과 1개의 경사슬 가변 도메인이 비-공유 결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 구성된다. 이 구조에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 한정한다. 조합하면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 CDR을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다.

Fab 단편은 경사슬의 불변 도메인 및 중사슬의 제1 불변 도메인(CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중사슬 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가되었다는 점에서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 자유 티올 기를 가지는 Fab'를 나타낸다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래는 그 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학 커플링도 알려져 있다.

임의의 척추동물 종의 항체 (면역글로불린)의 "경사슬"은 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 명백히 다른 2가지 유형 중 하나일 수 있다.

면역글로불린은 중사슬의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다양한 클래스로 분류될 수 있다. 5가지의 주요 면역글로불린 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소타입) IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 해당하는 중사슬 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구조가 잘 알려져 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 추가로, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 채로 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 [예를 들어 미국 특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 중사슬 및(또는) 경사슬의 일부가 특정 종으로부터 유래되었거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있지만, 상기 사슬의 나머지 부분은, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종으로부터 유래되었거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라, 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 "키메릭" 항체 (면역글로불린)가 구체적으로 포함된다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조).

비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 그 단편 (예. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 기타 항원-결합 서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 CDR의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 면역글로불린의 Fv FR 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용 항체 또는 수입 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 정제하고 극대화시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 전체 또는 실질적으로 전체 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 인간화 항체는 항체의 항원-결합 영역이 마카키 원숭이를 목적하는 항원으로 면역화시켜 생성된 항체로부터 유래된 것인 "영장류화" 항체를 포함한다.

"단일-사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 중에 존재하는 V_H 및 V_L 항체 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 해주는, V_H 도메인과 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 개관을 위해서는 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (V_H-V_L) 중에 경사슬 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중사슬 가변 도메인 (V_H)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 의미한다. 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 2개의 도메인을 페어링시키지 못하는 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링하여 2개의 항원-결합 부위를 형성하게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다.

"단리된 항체"는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 측정시 항체의 95 중량％를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제한다. 단리된 항체에는 재조합 세포내의 원위치 항체가 포함되는데, 이는 항체 천연 환경 성분이 1종 이상 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.

특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 "특이적으로 결합"하거나 "특이적"인 항체는 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 실질적으로 결합하지 않고 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드의 에피토프에 결합하는 것이다.

"에피토프"라는 용어는 단백질 항원 상의 (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체의 결합 부위를 나타내기 위해 사용된다. 특정 에피토프에 결합하는 항체를 "에피토프 맵핑"에 의해 동정한다. 예를 들어 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기재된, 항체-항원 컴플렉스의 결정 구조 분석, 경쟁 검정법, 유전자 단편 발현 검정법, 및 합성 펩티드-기재 검정법을 포함하여, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 특성화하는 많은 방법이 업계에 알려져 있다. 경쟁 검정법은 이하에 논의된다. 유전자 단편 발현 검정법에 따라, 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특정 유전학적 구축물에 의해 단편화하고, 테스트할 항체를 가진 단백질의 발현된 단편의 반응성을 측정한다. 유전자 단편은 예를 들어 PCR에 의해 생성된 후 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관 내에서 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 이어 항체의 방사성 표지된 단백질 단편에의 결합을 면역침전법 및 겔 전기영동법으로 측정한다. 특정 에피토프는 파지 입자의 표면 상에 진열된 무작위 펩티드 서열의 큰 라이브러리(파지 라이브러리)를 사용하여 또한 동정 가능하다. 별법으로, 중복 펩티드 단편의 한정 라이브러리를 간단한 결합 검정법으로 테스트 항체에 대한 결합에 대해 테스트할 수 있다. 후자의 접근법은 약 5 내지 15 아미노산의 선형 에피토프를 정의하는 데 적합하다.

어느 항체가 기준 항체와 동일하거나 또는 입체적으로 중복되는 에피토프를 인식하는 경우, 두 항체는 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 두 개의 에피토프가 동일하거나 또는 입체적을 중복되는 에피토프에 결합하는지 여부를 측정하는 가장 널리 사용되고 빠른 방법은 경쟁 검정법으로, 이는 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 모든 수의 상이한 포맷으로 형성될 수 있다. 대개, 항원을 96-웰 플레이트에서 고정화시키고, 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 비표지된 항체가 표지된 항체의 결합을 차단할 수 있는 능력을 측정한다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 자연으로부터 유도된 폴리펩티드 (예. 항체)와 동일한 아미노산 서열을 가지는 것이다. 그러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리되거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 설치류 폴리펩티드 또는 기타 임의의 포유동물 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

"아미노산 서열 변이체"라는 용어는 천연 서열 폴리펩티드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 말한다. 보통, 아미노산 서열 변이체는 천연 서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 가질 것이다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내에 특정 위치에 치환, 결실 및(또는) 삽입을 가질 수 있다.

항체의 "기능적 단편 또는 유사체"라는 용어는 전장 항체와 동일한 질적 생물학적 활성을 가지는 화합물이다. 예를 들어, 항-IgE 항체의 기능적 단편 또는 유사체는 IgE 면역글로불린에 결합하여 그러한 분자가 고 친화성 수용체, FcεRI에 결합하는 능력을 가지는 것을 막거나 또는 실질적으로 감소시킬 수 있는 것이다.

"상동성"은 서열을 정렬하고, 필요하다면, 최대 서열 동일성(％)을 얻기 위해 갭 (gap)을 도입한 후 아미노산 서열 변이체의 동일한 잔기의 백분율로서 정의된다. 그러한 컴퓨터 프로그램 중 하나가 제넨테크, 인크.에 의해 개발된 "Align 2"이며, 이는 1991년 12월 10일에 워싱턴 DC 20559, 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었다.

항체의 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 말하고, 항체 이소타입에 따라 달라진다. 항체 Fc 영역이 항체 이소타입을 또한 결정한다. 다양한 항체 이소타입의 예로는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgD, IgM 및 IgE가 포함된다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 대식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절 및 B 세포 활성화가 포함된다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포로 하여금 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합한 후 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포의 "무기"이고 이러한 세포 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 추가로, 대상 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)] 등에 개시된 바와 같은 동물 모델 등에서 생체내 평가할 수 있다. 또한, 항체의 ADCC 및(또는) CDC 활성의 수준을 조절 (즉, 증가 또는 감소)하는 기술은 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호를 참조할 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는, ADCC 및(또는) CDC를 유도할 수 없거나 또는 그러한 능력이 감소되도록 변형되었다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합되는 수용체를 의미한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 이것으로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 다르게 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체에는 주로 그의 세포질 도메인이 다른, 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (개관을 위해서는 문헌 [M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]을 참조). FcR에 대한 개관을 위해서는 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)], [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]을 참조한다. 추후로 확인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어에는 모체 IgG를 태아에게 전달시키는 신생아 수용체 FcRn도 포함된다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 RcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리할 수 있다.

"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적인 보체 활성화 경로는 보체의 동종 항원과 결합한 (적절한 서브클래스의) 항체에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 결합됨으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.

본원에 사용된 단어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 기타 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)일 수 있거나 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다. 검출가능한 표지로서 작용할 수 있는 방사성 핵종에는 예를 들어 I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212 및 Pd-109가 포함된다. 표지는 독소와 같이 검출 불가능한 것일 수도 있다.

"고상"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고상은 예를 들어, 부분적으로 또는 완전히 유리로 형성된 것 (예를 들어, 조절된 다공 유리), 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올 및 실리콘을 포함한다. 특성 실시태양에서, 고상은 상황에 따라 검정 플레이트의 웰을 포함할 수 있고, 다른 경우에는 정제 컬럼이다 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼). 상기 용어는 또한, 미국 특허 제4,275,149호에 기술된 것과 같은 분리된 입자의 불연속 고상을 포함한다.

"리포좀"은 약물 (본원에 개시된 항체와 같은)을 포유류에 전달하는데 유용한 여러 가지 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면 활성제를 포함하는 소포이다. 리포좀의 성분은 통상적으로, 생체막의 지질 배열과 유사한 이중막 형태로 배열된다.

본원에 사용된 "면역 어드헤신"이라는 용어는, 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 면역 글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 결합시키는 항체-유사 분자를 의미한다. 구조적으로, 면역 어드헤신은 소정의 결합 특이성을 갖는 항체의 항원 인식 및 결합 위치 이외의 아미노산 서열, 및 면역 글로불린 불변 도메인 서열의 융합 (즉, "이종")을 포함한다. 면역 어드헤신 분자의 부착 부위는 통상적으로, 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 위치를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역 어드헤신에서 면역 글로불린 불변 도메인 서열은, 임의의 면역 글로불린, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형, IgA (IgA1 및 IgA2를 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.

본원에 사용된 "에피토프 표지된"이라는 용어는, "표지 (tag) 폴리펩티드"에 융합된 항체 폴리펩티드를 포함하는 키메릭 폴리펩티드를 지칭한다. 표지 폴리펩티드는 그에 대해 항체가 제조될 수 있는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만, 그것이 융합되는 Ig 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을만큼 충분히 짧다. 표지 폴리펩티드는 또한 바람직하게는, 항체가 기타 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않도록 상당히 독특하다. 적절한 표지 폴리펩티드는 통상적으로, 6개 이상의 아미노산 잔기 및 통상적으로는 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 20개의 아미노산 잔기)를 갖는다.

"소분자"는 본원에서, 약 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 정의된다.

"패키지 삽입물"이라는 용어는, 상기 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용도, 용량, 투여, 금기 사항 및(또는) 주의 사항에 대한 정보를 포함하는 상업용 치료 제품 패키지에 통상적으로 포함된 지시를 나타낸다.

"단리 핵산"은 기타 게놈 DNA 서열, 및 천연 서열과 자연적으로 동반하는 단백질 또는 리보좀과 폴리머라제와 같은 복합체로부터 실절적으로 분리된 핵산, 예를 들어, RNA, DNA 또는 혼합 중합체이다. 이 용어는 천연 환경으로부터 제거된 핵산 서열을 포함하고, 재조합 또는 클로닝된 DNA 단리물 및 화학적으로 합성된 유사체 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 유사체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 분자의 단리형을 포함한다.

"벡터"는 셔틀 및 발현 벡터를 포함한다. 통상적으로, 플라스미드 구조물은 또한 박테리아에서 플라스미드의 복제 및 선택을 위해, 복제 원점 (예를 들어, ColE1 복제 원점) 및 선택 가능한 표지 (예를 들어, 암피실린 또는 테트라사이클린 내성)를 각각 포함한다. "발현 벡터"는, 본 발명의 항체 단편을 포함하는 항체의 발현에 필요한 조절 서열 또는 조절 요소를 포함하는 박테리아 또는 진핵 세포의 벡터를 나타낸다. 적절한 벡터는 하기 기술한다.

본원에서 "암치료 표적" 또는 "암치료를 위한 표적"은, 이종 분자에 대해 하나 이상의 결합 위치를 갖고 이종 분자에 의해 결합될 수 있는 분자, 통상적으로는 폴리펩티드로 정의되며, 암과 관련된 증상의 완화 또는 임의의 다른 과증식성 질병 또는 질환에 대한 치료제의 설계, 발견 또는 제조를 위한 초점이 될 수 있다. 폴리펩티드 표적 이외에, 본 발명은 또한 미국 특허 제5,091,178호에 기술된 바와 같은 종양-관련 글리코지질 표적과 같은 비-폴리펩티드 암치료 표적을 포함한다.

본원에 정의된 "항-유사분열 화합물"은, 유사분열성 세포 분열 및(또는) 세포가 세포 주기의 임의 단계를 통과하는 것을 억제, 방해 또는 지연시키는 화합물을 의미한다. 항-유사분열 화합물은 마이크로튜불의 형성 및(또는) 작용에 영향을 미침으로써 기능할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어, 마이크로튜불 안정화제 또는 마이크로튜불 형성을 중단시키는 약물일 수 있다. 마이크로튜불에 영향을 주는 본 발명에 유용한 약제는 당업자에게 공지되어 있고, 메이탄신, 메이탄신 유도체, 알로콜히친, 할리콘드린 B, 콜히친, 콜히친 유도체, 돌라스타틴 10, 리족신, 파클리탁셀, 탁솔.RTM 유도체, 티오콜히친, 트리틸 시스테인, 빈블라스틴 술페이트, 빈크리스틴 술페이트, 에포틸론 A, 에포틸론 및 디스코더모라이드 에스트라무스틴, 노코다졸, MAP4 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 약제의 예는 또한, 과학 및 특허 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Bulinski (1997) J. Cell Sci. 110:3055-3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) Cancer Res. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature 387:268-272; Vasquez (1997) Mol. Biol. Cell 8:973-985; Panda (1996) J. Biol. Chem. 271:29807-29812] 참조.

본원에 정의된 "메이탄시노이드"는, 튜불린 중합 반응을 억제함으로써 작용하는 고독성 유사분열 억제제인 고리 마크로라이드이다. 메이탄시노이드의 한 형태인 메이탄신은, 동아프리카 관목 메이테누스 세라타 (Maytenus serrata)에서 처음으로 단리되었다 (미국 특허 제3,896,111호). 본 발명의 메이탄시노이드는 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제4,137,230호; 제4,248,870호; 제4,256,746호; 제4,260,608호; 제4,265,814호; 제4,294,757호; 제4,307,016호; 제4,308,268호; 제4,308,269호; 제4,309,428호; 제4,313,946호; 제4,315,929호; 제4,317,821호; 제4,322,348호; 제4,331,598호; 제4,361,650호; 제4,364,866호; 제4,424,219호; 제4,450,254호; 제4,362,663호; 및 제4,371,533호 (이에 개시된 내용은 특히 본원에 참고자료로 혼입된다)에 개시된 합성 메이탄시노이드 및 메이탄시노이드 유사체 (예를 들어, 메이탄시놀)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

세포 표면 폴리펩티드의 발현을 나타낼 때 본원에 사용된 "더욱 고도로 발현된"이란, 세포 표면 상의 폴리펩티드의 카피수가 비교 대상이 되는 다른 세포 상에서보다 10% 이상, 바람직하게는 비교 대상이 되는 다른 세포 상에서보다 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 가장 바람직하게는 100% 높은 것을 의미한다.

세포 표면 폴리펩티드의 발현을 나타낼 때 "거의 동일한"이란, 다른 세포에 비해 세포 표면 상의 폴리펩티드 카피수의 차이가 10% 미만, 바람직하게는 다른 세포에 비해 세포 표면 상의 폴리펩티드 카피수의 차이가 5%, 2%, 1% 미만, 가장 바람직하게는 0%임을 의미한다.

"DNA 마이크로어레이 (microarray)"는 종이, 나일론 또는 기타 형태의 막, 필터, 겔, 폴리머, 칩, 유리 슬라이드, 또는 고체 지지체를 포함하는 다른 적절한 지지체와 같은 기질 상에 배열된 별개의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 어레이를 나타낸다. DNA 마이크로어레이는 다수 유전자의 차등적인 발현 수준을 동시에 관찰하고 (전사체 이미지를 생성하기 위해), 유전적 변이체, 돌연변이 및 다형성을 동정하기 위해 사용된다. 특히, DNA 마이크로어레이는 제2 세포 형태 (통상적으로 제1 세포 형태는 비-질병 조직이고, 제2 세포 형태는 질병 세포이다)에서 동일한 유전자의 발현에 대해, 제1 세포 형태로부터 유도된 유전자의 차등적인 또는 변화된 발현을 탐지하기 위해 설계된다. 단백질 어레이 또한, 본 발명의 영역에 포함된다. 상기 단백질 어레이는 예를 들어, 미국 특허 제6,197,599호에서 찾을 수 있다. 통상적으로, DNA 마이크로어레이는 로봇에 의해 단일 현미경 슬라이드 상에 배열된 유전자 단편에 상당하는 수천개의 각각 다른 선택된 핵산 서열 데이터베이스의 사용에 기초한다. 그 다음, 특정 세포 형태의 mRNA (다양한 유전자의 세포 특이적 발현을 반영함)는 RT/PCR법에 의해 cDNA로 전환되고 형광 표지로 표시되어, 슬라이드 상에서 선택된 핵산 서열에 혼성화된다. 그 다음, 스캐너가 슬라이드 상의 각 표본의 형광을 탐지 및 측정하는데, 여기서 형광은 시험 세포로부터의 표지된 메신저가 슬라이드 상의 알려진 위치에서 알려진 핵산 서열과 혼성화됨으로 인해 동정될 수 있음을 나타낸다. 상대적 형광은 유전자의 상대적 활성을 나타내어, 강한 형광은 활성 유전자가 상대적으로 다량의 메신저를 발현하고 있음을 나타낸다. 약한 형광 또는 무형광은 표지된 메신저가 알려진 핵산 서열에 전혀 혼성화되지 않았음을 나타낸다.

본원에 사용된 "증식성" 세포란, 세포 생식 주기의 M 기 (M = 유사 분열)가 적어도 약 8시간마다 나타남을 의미한다. 본원에 사용된 "느리게 증식하는" 세포란, 세포 생식 주기의 M 기가 약 8시간마다 보다는 적게 일어나지만 약 72시간마다 보다는 많이 또는 동일하게 나타나는 세포를 의미한다. 본원에 사용된 "비-증식성" 세포란, 세포 생식 주기의 M 기가 약 72시간마다 보다 적게 나타나는 세포를 의미한다.

5.2. 본 발명의 조성 및 방법

5.2.1. 본 발명의 항체

이하, 본 발명에 유용한 항체의 생산을 위한 예시적 기술들을 설명한다. 일부 경우에 있어서, 항체는 표준 재조합 DNA 방법에 의해 박테리아 또는 진핵 세포에서 재조합적으로, 및 단리형으로 제조될 수 있다.

5.2.1.1. 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는, 적절한 항원 및 보강제를 동물에게 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 주사하여 생성된다. 적절한 항원을 면역화될 종에서 면역원성인 단백질과 콘쥬게이션시키는 것이 유용할 수 있다 (특히, 합성 펩티드가 사용되는 경우). 예를 들어, 항원은 이관능성 또는 유도화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기로 결합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기로 콘쥬게이션), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂ 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 각각 다른 알킬기임)을 사용하여, 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole limpet hemocyanin, KLH), 혈청 알부민, 소 갑상선 글로불린 또는 콩 트립신 억제제와 콘쥬게이션될 수 있다.

동물은 예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 콘쥬게이트 (각각, 토끼 또는 쥐에 대해)를 3 부피의 프로인드 완전 보강제 (Freund's complete adjuvant)와 배합하여 그 용액을 여러 부위에 진피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 콘쥬게이트 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후, 동물에게 프로인드 완전 보강제 중의 원래 양의 1/5 내지 1/10의 펩티드 또는 콘쥬게이트를, 여러 부위에 피하 주사하여 부스팅한다. 7 내지 14일 후, 동물의 피를 뽑아 혈청의 항체 역가를 측정했다. 역가가 정체기에 이를 때까지 동물을 부스팅했다. 콘쥬게이트는 또한, 단백질 융합체로서 재조합 세포 배양에서 제조될 수 있다. 또한, 면역 반응을 증강시키기 위해 명반과 같은 응집제가 적절하게 사용된다.

5.2.1.2. 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 콜러 (Kohler) 등의 문헌 [Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마법으로 제조될 수 있거나, 또는 제조합 DNA법 (미국 특허 제4,816,567호)으로 제조될 수 있다.

하이브리도마법에서 쥐 또는 햄스터와 같은 기타 적절한 숙주 동물은, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있는 림프구를 유발하기 위해, 상기 기술된 바와 같이 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구는 단리된 다음 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제로 골수종 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 적절한 배지에 시딩되고 배양되는데, 상기 배지는 바람직하게는 비융합된 부모 골수종 세포 (융합 파트너라고도 지칭됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 예를 들어, 만일 부모 골수종 세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결여되면, 하이브리도마에 대한 선택적 배지는 통상적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 상기 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.

융합 파트너 골수종 세포는, 효과적으로 융합하고 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 고농도의 항체 생성을 지속시키며, 비융합된 부모 세포를 선택하는 선택적 배지에 민감한 것이 바람직하다. 바람직한 골수종 세포주는 솔크 연구소 세포 분배 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주, 샌디에고 소재)로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 쥐 종양으로부터 유도된 것, 및 SP-2와 유도체, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주, 록빌 소재)으로부터 입수 가능한 X63-Ag8-653 세포와 같은 쥐 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 및 쥐-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되어 있다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].

하이브리도마 세포가 성장하는 배지는, 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역 침강 또는 시험관내 결합 검정법, 예를 들어 방사 면역 검정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역 흡착 검정법 (ELISA)에 의해 측정된다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기술된 스캐차드 분석으로 측정될 수 있다.

일단 소정의 특이성, 친화도 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 동정되면, 희석 과정을 제한하여 서브클로닝하고 표준 방법으로 배양할 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 상기 목적을 위한 적절한 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어, 세포를 쥐에게 주사하여 동물의 복수 종양으로서 생체내에서 배양될 수 있다.

서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 통상적인 항체 정제 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스를 사용하여) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석 등에 의해 적절하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코드하는 DNA는, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중사슬 및 경사슬을 코드하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 원천으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 그 다음 이것을 대장균 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 (만일 그렇지 않으면 항체 단백질을 생산하지 않음)와 같은 숙주 세포에 트랜스펙션시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성한다. 박테리아에서 항체를 코드하는 DNA의 재조합 발현에 대한 평가 논문은, 스케라 (Skerra) 등의 문헌 [Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 플뤽툰 (Plueckthun)의 문헌 [Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.

추가의 실시태양에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 설명된 기술을 사용하여 제조된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클락손 (Clackson) 등의 문헌 [Nature, 352:624-628 (1991)] 및 마크스 (Marks) 등의 문헌 [J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은, 파지 라이브러리를 사용한 각각의 쥐 및 인간 항체의 단리에 대해 기술하고 있다. 다음의 간행물들은 사슬 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)], 및 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 방법으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))을 기술한다. 따라서, 상기 기술들은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 통상적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.

항체를 코드하는 DNA는 예를 들어, 인간 중사슬 및 경사슬 불변 도메인 (C_H 및 C_L) 서열을 쥐의 상동 서열로 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 또는 면역 글로불린 코딩 서열을 비-면역 글로불린 폴리펩티드 코딩 서열의 전체 또는 일부와 융합시킴으로써 (이종 폴리펩티드), 키메릭 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산하도록 개질될 수 있다. 비-면역 글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 치환할 수 있거나, 또는 항체의 한 항원-결합 위치의 가변 도메인으로 치환되어 항원에 대해 특이성을 갖는 한 항원-결합 위치 및 다른 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-결합 위치를 포함하는 키메릭 이가 항체를 생성할 수 있다.

5.2.1.3. 인간화 항체

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당 분야에 기술되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비-인간 근원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진 "임포트" 잔기로서 종종 지칭된다. 인간화는 실질적으로 다음과 같은 윈터 (Winter)와 그 동료들의 방법 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)]에 따라, 고가변 부위 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행된다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 실질적으로, 완전한 인간 가변 도메인보다 적은 부위가 비-인간 종의 상응하는 서열로 치환된 키메릭 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제적으로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 고가변 부위 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기들이 설치류 항체의 유사 위치의 잔기로 치환된 인간 항체이다.

인간화 항체의 제조에 사용되는 경사슬 및 중사슬의 인간 가변 도메인의 선택은, 항체를 인간의 치료용으로 사용하고자 할 때 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-쥐 항체)을 줄이기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적합 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류 V 도메인과 가장 가까운 인간 V 도메인 서열 및 인간화 항체에 대해 허용된 그 내부의 인간 프레임워크 부위 (FR)를 동정했다 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. 다른 방법은 모든 인간 항체의 특정 경사슬 또는 중사슬 서브그룹의 공통 서열로부터 유도된 특정 프레임워크 부위를 사용한다. 다수의 각각 다른 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)].

또한, 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 항체를 인간화하는 것이 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 부모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 부모 서열 및 여러 가지의 개념적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 면역 글로불린 모델은 시판되며 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 형태 구조를 도시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 이용될 수 있다. 상기 디스플레이의 검사는 후보 면역 글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 면역 글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능케 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 선택되고 수용자로부터의 임포트 서열과 조합되어, 표적 항원에 대한 친화도의 증가와 같은 소정의 항체 특성이 달성될 수 있다. 통상적으로, 고가변 부위 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 직접적으로, 및 가장 실질적으로 관련된다.

여러 가지 형태의 인간화 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 Fab와 같은 항체 단편일 수 있고, 이는 면역콘쥬게이트를 생성하기 위해 임의로 하나 이상의 세포독성제와 결합된다. 다르게는, 인간화 항체는 완전한 IgG1 항체와 같은 완전한 항체일 수 있다.

5.2.1.4. 인간 항체

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 이제 면역화에 의해서 내인성 면역 글로불린의 생산없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들어, 쥐)이 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 생식세포 계열 돌연변이 쥐의 항체 중사슬 연결 부위 (J_H) 유전자가 동형접합성 결손되면, 내인성 항체 생산이 완전히 억제되는 것으로 기술되어 있다. 인간 생식세포계 면역 글로불린 유전자의 어레이를 상기 생식세포계 돌연변이 쥐에게 전달하면, 쥐는 항원 투여에 대해 인간 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호 (모두 젠팜 (GenPharm)의 특허); 제5,545,807호; 및 WO 97/17852] 참조.

이와 달리, 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]은 비면역화된 공여자의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 사상 박테리오파지 (filamentous bacteriophage)의 주외피 또는 부외피 단백질 유전자 내에 인-프레임으로 클로닝되어, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 또한 항체의 기능적 특성에 기초한 선택으로 상기 특성을 갖는 항체를 코드하는 유전자를 선택하게 된다. 따라서, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있으며, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 개관되어 있다. V-유전자 단편의 여러 가지 근원이 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 클락손 (Clackson) 등의 문헌 [Nature, 352:624-628 (1991)]에서, 면역화된 쥐의 비장에서 유래한 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체의 어레이를 단리했다. 실질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 설명된 기술에 따라, 비면역화 인간 공여자의 V 유전자 레퍼토리가 구성될 수 있고, 다양한 어레이의 항체 (자가-항체를 포함)가 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조.

상기 논의한 바와 같이, 인간 항체는 또한 활성화 B 세포에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).

5.2.1.5. 항체 단편

특정 상황에서는, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 단편의 크기가 작을수록 신속한 제거가 가능하고, 고형 종양에 대한 접근이 개선될 수 있다.

항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술들이 개발되었다. 통상적으로, 상기 단편들은 완전한 항체의 단백 분해성 소화에 의해 유도된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 하지만, 상기 단편들은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 대장균 (E. coli)에서 발현되고 분비될 수 있어, 다량의 상기 단편을 쉽게 생산할 수 있게 한다. 항체 단편은 상기와 같이, 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 대장균 (E. coli)으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편이 형성될 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 또 다른 접근법에 따라, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 회수 수용체 (salvage receptor) 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')₂ 단편은, 미국 특허 제5,869,046호에 기술된다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 기술들은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 실시태양에서, 선택된 항체는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호 참조. Fv 및 sFv는 불변 부위가 결여된 완전한 조합 위치를 갖는 유일한 종류이므로, 생체내에서 사용하는 동안 비특이적인 결합을 줄이는데 적합할 수 있다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질을 융합시키기 위해 구성될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra] 참조. 항체 단편은 또한, 미국 특허 제5,641,870호에 예를 들어 기술된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일 특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

5.2.1.6. 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 둘 이상의 각각 다른 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 이중특이적 항체는 예를 들어, 항원의 각각 다른 두 가지의 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 다른 항체는 항원 결합 위치를 다른 단백질에 대한 결합 위치와 조합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한, 세포독성제를 특정 항원을 발현하는 세포에 국부화시키는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 항원-결합 암 (arm) 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 갖는다. 이중특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 완전한 길이의 이중특이적 항체의 통상적인 생산은, 두 가지의 면역 글로불린 중사슬-경사슬 쌍의 공동-발현에 기초되며, 여기서 두 개의 사슬은 각각 다른 특이성을 갖는다 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 무작위적인 편성 때문에, 상기 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 각각 다른 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중 단 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는, 상당히 번거로우며 생성물 수율도 낮다. 유사한 방법이 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기술되어 있다.

다른 접근법에 따르면, 소정의 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 위치)는 면역 글로불린 불변 도메인 서열과 융합된다. 바람직하게는, 힌지 (hinge)의 적어도 일부분을 포함하는 Ig 중사슬 불변 도메인, C_H2 및 C_H3 부위와 융합된다. 하나 이상의 융합체에 존재하는, 경사슬 결합에 필요한 위치를 포함하는 제1 중사슬 불변 부위 (C_H1)를 갖는 것이 바람직하다. 면역 글로불린 중사슬 융합체, 및 필요에 따라 면역 글로불린 경사슬을 코드하는 DNA는, 별도의 발현 벡터에 삽입되어 적절한 숙주 세포에 코트랜스펙션된다. 이는 구성에 사용된 세 가지 폴리펩티드 사슬의 동일하지 않은 비율이 최적 수율의 소정의 이중특이적 항체를 제공하는 경우, 실시태양에서 세 가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 보다 큰 유연성을 제공한다. 하지만, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현으로 인해 높은 수율을 얻거나 또는 비율이 소정의 사슬 조합의 수율에 현저한 영향을 주지 않는 경우, 두 개 또는 세 개의 모든 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

상기 접근법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한 암 (arm)에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역 글로불린 중사슬, 및 다른 암에 하이브리드 면역 글로불린 중사슬-경사슬 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 하나의 절반에만 면역 글로불린 경사슬이 존재하면 손쉬운 단리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원하지 않는 면역 글로불린 사슬 조합으로부터 소정의 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 보다 자세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

미국 특허 제5,731,168호에 기술된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 간의 경계면이 엔지니어링되어 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종 이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은, C_H3 도메인의 적어도 일부분을 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면에서 하나 이상의 작은 아미노산 측사슬은 보다 큰 측사슬 (예를 들어, 티오신 또는 트립토판)로 치환된다. 큰 측사슬에 대한 동일하거나 유사한 크기의 대상성 "공동"은, 제2 항체 분자의 경계면 상에서 큰 아미노산 측사슬을 보다 작은 측사슬 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환하여 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 기타 원하지 않는 최종 생성물에 비해 이종 이량체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종콘쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종콘쥬게이트에서 항체 중의 하나는 아비딘과, 다른 하나는 비오틴과 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종콘쥬게이트 항체는 임의의 통상적인 가교법을 사용하여 제조될 수 있다. 적절한 가교제는, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 또한, 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합으로 제조될 수 있다. 브레난 (Brennan) 등은 문헌 [Science, 229:81 (1985)]에서, 완전한 항체가 단백 분해적으로 절단되어 F(ab')₂ 단편이 생성되는 과정을 기술하고 있다. 상기 단편들은 인접한 디티올을 안정화하고 분자간 디술파이드 형성을 예방하기 위한 디티올 복합체화제, 아비산나트륨의 존재하에 감소된다. 생성된 Fab' 단편은 그 다음, 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 그리고, Fab'-TNB 유도체 중의 하나는 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 동일한 몰 양의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는, 효소의 선택적인 고정을 위한 시약으로서 사용될 수 있다.

최근의 진전으로 대장균 (E. coli)으로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이하게 되었고, 이는 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 샬라비 (Shalaby) 등은 문헌 [J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에서, 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생산에 대해 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 대장균 (E. coli)으로부터 개별적으로 분비되고, 시험관내에서 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는, ErbB2 수용체를 과다 발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있다. 재조합 세포 배양으로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술들도 개시되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되어 왔다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는, 유전자 융합에 의해 두 가지의 각각 다른 항체 Fab' 부분에 연결된다. 항체 동종이량체는 힌지 부분에서 감소되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 상기 방법은 또한, 항체 동종이량체의 생산에 사용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디 (diabody)" 기술은, 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 별도의 기전을 제공한다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 개의 도메인 간에 짝을 이루기에는 너무 짧은 링커에 의해 V_L에 연결된 V_H를 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 짝을 이루게 되고, 이에 의해 두 개의 항원-결합 위치를 형성하게 된다. 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 방법도 보고되어 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조.

2 이상의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60(1991)] 참조.

5.2.1.7. 다가 항체

다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 이가 항체보다 신속하게 흡수 (및(또는) 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 군과는 다름)일 수 있고 (예를 들어, 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 사슬을 코드하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이합체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 위치를 포함할 수 있다. 바람직한 이합체화 도메인은 Fc 부위 또는 힌지 부위를 포함한다 (또는 구성된다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 부위 및 Fc 부위에 대한 3개 이상의 항원 결합 부위 아미노-말단을 포함할 수 있다. 본원의 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 위치를 포함한다 (또는 구성된다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 사슬 (및 바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 사슬은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬은 VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc를 포함할 수 있는데, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 부위의 한 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드이며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬은 VH-CH1-유연한 링커-VH-CH1-Fc 부위 사슬, 또는 VH-CH1-VH-CHl-Fc 부위 사슬을 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 바람직하게는, 2개 이상 (바람직하게는 4개)의 경사슬 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원의 다가 항체는 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경사슬 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 여기서 고려된 경사슬 가변 도메인 폴리펩티드는, 경사슬 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.

5.2.2. 아미노산 개질

본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 개질이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 개질은 예를 들어, 항체 아미노산 서열 내 잔기의 결손 및(또는) 삽입 및(또는) 치환을 포함한다. 단, 최종 구성체가 소정의 특징을 갖는다면, 최종 구성체에 도달하기 위한 결손, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 수행된다. 아미노산 변화는 또한 항체의 번역후 과정, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화를 변경시킬 수 있다.

돌연변이 유발을 위한 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 부위를 동정하는 유용한 방법은, 문헌 [Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 동정되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전 잔기), 아미노산의 항원과의 상호작용에 영향을 미치기 위해 중성 또는 음전하 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환된다. 그 다음, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 상기 아미노산 위치는 치환 위치에, 또는 치환 위치에 대해 추가의 또는 기타의 변이체를 도입함으로써 정확해진다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하는 위치는 미리 결정되는 반면, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 소정 위치에서 돌연변이의 달성을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 부위에서 수행되고, 발현된 항체 변이체는 소정 활성에 대해서 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입체는 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합체, 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입은 예를 들어, N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 효소에 대한 (예를 들어, ADEPT에 대한), 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단의 융합체를 포함한다.

또 다른 형태의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 상기 변이체는 항체 분자 내에 다른 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 유발에 대해 가장 관심의 대상이 되는 위치는 고가변 부위를 포함하지만, FR 변화 또한 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 제목하에 표 1에 도시된다. 만일 상기 치환으로 생물학적 활성에 변화가 야기된다면, 표 1에 "예시적 치환"으로 명명되었거나 또는 아미노산 군과 관련하여 하기 추가로 기술할 바와 같은, 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 스크리닝된다.

아미노산 치환

원래의 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르류신	leu
Leu (L)	노르류신; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르류신	leu

항체의 생물학적 성질에 있어서의 실질적인 변화는, (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어 판형 또는 나선형 입체 구조, (b) 표적 위치에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측사슬 부피의 유지에 대한 영향에 있어서 현저하게 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 잔기는 공통적인 측사슬의 성질에 기초하여 여러 군으로 분류된다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 사슬 배열에 영향을 미치는 잔기: gly, pro 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 상기 군 중 한 구성원의 또 다른 군으로의 교체를 수반할 수 있다. 상기 치환 잔기는 또한, 보존적 치환 위치, 또는 더욱 바람직하게는 잔류 (비-보존된) 위치로 도입될 수 있다.

변화는 당 분야에 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-매개 (위치-지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발을 사용하여 이루어질 수 있다. 위치-지정 돌연변이 유발 [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 또는 기타 기술들이 당 분야에 공지되어 있다.

스캐닝 아미노산 분석 또한, 인접 서열과 함께 하나 이상의 아미노산을 동정하는데 사용될 수 있다. 스캐닝 아미노산 중에서 상대적으로 작고 중성인 아미노산이 바람직하다. 그러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 상의 측사슬을 제거하고 변이체의 주사슬 입체 형태를 적게 변화시킬 것이기 때문에, 상기 군 중에서 통상적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이다 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. 알라닌은 또한, 가장 흔한 아미노산이기 때문에 통상적으로 바람직하다. 또한, 매몰되고 노출된 위치 모두에서 흔히 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y. ); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 만일 알라닌 치환으로 적절한 양의 변이체가 산출되지 않으면, 등전자 아미노산이 사용될 수 있다.

항체의 적절한 입체 구조를 유지하는데 관련되지 않는 임의의 시스테인 잔기 또한, 분자의 산화 안정성을 개선하고 이상 가교를 방지하기 위해 통상적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합은 그 안정성을 개선하기 위해 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우) 항체에 첨가될 수 있다.

5.2.2.1. 추가의 개질

치환 변이체의 특히 바람직한 형태는, 부모 항체의 하나 이상의 고가변 부위 잔기를 치환하는 것을 포함한다 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체). 통상적으로, 추가의 개선을 위해 선택된 결과적인 변이체는 그것이 생성된 부모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 수 있다. 상기 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은, 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간단히 말해서, 여러 가지의 고가변 부위 위치 (예를 들어, 6-7 위치)가 돌연변이되어 각 위치에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서, 사상 파지 입자로부터 일가 방식으로 디스플레이된다. 그 다음, 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 개시된 바와 같이 그 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 개질을 위한 후보 고가변 부위 위치를 동정하기 위해 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이 수행되어, 항원 결합에 현저하게 기여하는 고가변 부위 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 간의 접촉점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기는, 본원에서 설명된 기술에 따른 치환에 대한 후보이다. 일단 상기 변이체가 생성되면 변이체의 패널이 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝되고, 하나 이상의 적절한 검정법에서 우수한 특성을 갖는 항체는 추가의 개선을 위해서 선택될 수 있다.

항체의 또 다른 형태의 아미노산 변이체는, 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변화시킨다. 변화란, 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 위치의 첨가를 의미한다. 또한, 이 구절은 존재하는 여러 가지의 탄수화물 잔기의 성질 및 비율의 변화를 포함하는, 항체의 글리코실화 패턴의 질적인 변화를 포함한다.

항체의 글리코실화는 통상적으로, N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측사슬에 결합됨을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은, 탄수화물 잔기가 아스파라긴 측사슬에 효소적으로 결합하기 위한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중에 상기 트리펩티드 서열 중 하나가 존재하면 잠재적인 글리코실화 위치를 형성하게 된다. O-결합 글리코실화는 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있지만, N-아세일갈락토스아민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 당이 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 결합하는 것을 나타낸다.

항체에 대한 글리코실화 위치의 추가는 통상적으로, 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열 (N-결합 글리코실화 위치에 대해)을 포함하도록 아미노산 서열을 변화시켜 달성된다. 변화는 또한, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 원래 항체의 서열에 첨가, 또는 치환시켜 (O-결합 글리코실화 부위에 대해) 이루어질 수 있다.

항체의 아미노산 서열 변이체를 코드하는 핵산 분자는, 당 분야에 공지된 여러 가지 방법으로 제조된다. 상기 방법은 천연원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 위치-지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 과거에 제조된 항체의 변이체 또는 비-변이체 구조의 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

항체 중의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 방법은 글리코시드를 항체에 화학적 또는 효소적 커플링하는 것이다. 이같은 방법은 문헌 예를 들어, WO 제87/05330호 (1987. 9. 11 공개) 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.

항체에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 화학적 또는 효소적으로 또는 돌연변이 치환으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 문헌 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기술되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기술되어 있는 것과 같은 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 사용하여 달성될 수 있다.

다른 유형의 항체의 공유결합 변형은 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 기술된 방식으로 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 결합시키는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 항체는 또 다른 이종의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 항체를 포함하는 키메릭 분자를 형성하는 방식으로 개질될 수 있다.

한 실시태양에서, 이같은 키메릭 분자는 항-표지 (tag) 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 표지 폴리펩티드와 항체의 융합체를 포함한다. 에피토프 표지는 일반적으로 항체의 아미노- 또는 카르복시- 말단에 위치한다. 항체의 이같은 에피토프-표지 형태의 존재는 표지 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 탐지될 수 있다. 또한, 에피토프 표지의 제공은 항-표지 항체 또는 에피토프 표지가 결합하는 다른 유형의 친화도 매트릭스를 사용하여 친화도 정제로 항체가 쉽게 정제될 수 있도록 한다. 다양한 표지 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체가 당업계에 공지되어 있다. 그 예는 폴리-히스티딘 (poly-His) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-His-gly) 표지; flu HA 표지 폴리펩티드 및 그 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 표지 및 이들에 대한 항체 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:361-3616 (1985)]; 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 당단백질 D (gD) 표지 및 그 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 기타 표지 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; 튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem, 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 표지 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]을 포함한다.

5.2.3 이펙터 기능 엔지니어링

이펙터 기능과 관련하여 예를 들어, 항체의 항원-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 증가시키거나 또는 억제하기 위해서 본 발명의 항체를 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역 중에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호 참조. 별법으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)이 Fc 영역 중에 도입될 수 있고, 이에 따라 이 영역 중에서 사슬간 디술파이드 결합 형성을 허용할 수 있다. 따라서, 생성된 동종이량체 항체는 향상되거나 또는 감소된 세포내이동(internalization) 능력 및(또는) 증가되거나 또는 감소된 보체-의존적 세포 사멸 및 항체-의존적 세포독성 (ADCC)을 나타낼 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 문헌 [Shopes, B. J. Immunol.148:2918-2922 (1992)] 참조.

또한, 증가된 항-종양 활성을 가진 동종이량체 항체가 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 것과 같이 제조될 수 있다. 별법으로, 두개의 Fc 영역을 가지며, 이에 따라 증가된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가진 항체가 제조될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)] 참조.

본 발명의 항체는 바람직하게는 ADCC 또는 CDC를 유도하는 능력이 감소된 것이다. 상기에서 언급된 바와 같이, ADCC 및(또는) CDC를 유도하는 능력이 감소된 항체를 제조하기 위해 항체를 개질시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호 참조. 본 발명의 항체는 바람직하게는 항체의 ADCC 및(또는) CDC 능력을 감소시키고(또는) 제거하여 항-유사분열 화합물과 콘쥬게이트되어 세포독성 화합물을 생성하므로, 세포독성 화합물의 치료적 효과 (예를 들어, 증식하는 세포만을 세포 사멸함)는 ADCC 및(또는) CDC를 통한 간접적인 세포 사멸보다는, 주로 세포독성 화합물의 항-유사분열 성분에 의해 매개된다.

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해서, 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기술된 것과 같이 항체 (특히, 항체 단편) 중으로 회수 수용체 결합 에피토프를 도입할 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같이, "회수 수용체 결합 에피토프"란 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 관여하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

5.2.4 면역콘쥬게이트

또한, 본 발명은 화학치료제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이들의 단편), 방사능 동위원소 (즉, 방사능콘쥬게이트), 성장 억제제 또는 항-유사분열 화합물을 포함하는 면역콘쥬게이트에 관한 것이다.

5.2.4.1 메이탄시노이드 (Maytansinoid) 면역콘쥬게이트

바람직한 실시태양에서, 항체 또는 메이탄시노이드 분자(들)의 생물학적 활성을 많이 감소시키지 않으면서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 콘쥬게이트된다. 메이탄시노이드는 튜불린 중합화를 억제하여 작용하는 유사분열 억제제이다. 따라서, 본 발명의 메이탄시노이드와의 면역콘쥬게이트는 증식하는 세포 (예를 들어, 암 세포), 따라서 유사분열이 일어나고 있는 세포에 대해서 치료적으로 효과적이다. 그러나, 동일한 면역콘쥬게이트는 증식하지 않는 세포에 대해서는 효과적이지 않다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 메이탄시노이드 면역콘쥬게이트는 메이탄시노이드-유도된 독성이 일어나지 않는 조직 및(또는) 세포에 대해 표적화될 것이다. 메이탄시노이드-유도된 독성이 일어나는 것으로 입증된 조직/세포의 예는 위장관 (GI) 조직 및 신경 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다 (Issel et al., 1978, Can. Trtmnt. Rev., 5:199-207). GI 시스템은 메이탄시노이드에 대한 반응으로 독성을 나타내기 쉬운데, 이는 GI 내의 세포들이 활발히 증식하고, 따라서 메이탄시노이드의 항-유사분열 성질이 이같은 세포들을 사멸시키려 하기 때문이다. 신경 세포들은 활발히 증식하는 세포들이 아니지만, 신경세포는 축삭 소포 운반을 위해 마이크로튜불에 의존한다. 상기에서 언급된 바와 같이 메이탄시노이드는 유사분열 억제제인데, 이는 이들이 튜불린 중합을 억제하기 때문이다. 따라서, 신경세포가 활발히 증식하지는 않지만, 메이탄시노이드에 의한 튜불린 중합 억제는 신경 세포에 불리한 영향을 미칠 수 있다.

메이탄시노이드는 당업계에 공지되어 있으며, 공지 기술로 합성되거나 또는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 및 상기에서 언급된 기타 특허 및 비기타 공개문헌 중에 기술되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀 또는 방향족 환 중에서 또는 메이탄시놀 분자의 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어, 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.

항체-메이탄시노이드 콘쥬게이트를 제조하기 위해 당업계에 공지된, 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 또는 유럽 특허 제0,425,235 B1호 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)]에 개시된 것들을 포함하여 다수의 결합기들이 존재한다. 결합기들은 상기에서 언급된 특허 중에서 개시된 것과 같은 디술파이드기, 티오에테르기, 산 불안정성기, 광불안정성기, 펩티다제 불안정성기, 또는 에스테라제 불안정성기를 포함하고, 디술파이드기 및 티오에테르기가 바람직하다.

항체 및 메이탄시노이드의 콘쥬게이트는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성기 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아미도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체, (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)를 사용하여 제조될 수 있다. 특히 바람직한 커플링제는 디술파이드 결합을 제공하기 위한 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.

링커는 결합 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 결합될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 결합은 통상의 결합 기술을 사용하여 히드록실기와의 반응으로 형성될 수 있다. 반응은 히드록실기를 가진 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치 및 히드록실기를 가진 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 결합은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.

5.2.4.2. 기타 면역콘쥬게이트

본 발명의 항체와 콘쥬게이트될 수 있는 기타 항종양제는 BCNU, 스트렙토조신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호 및 제5,770,710호에 기술되어 있는 총체적으로 LL-E33288 복합체로 알려진 물질들의 패밀리와 더불어 에스페라미신 (미국 특허 제5,877,296호)를 포함한다.

효소적으로 활성인 독소 및 사용될 수 있는 이들의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 엑소토신 A 사슬 (슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래함), 리신 A 사슬, 아비린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알루리티스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리토테센스를 포함한다. 예를 들어, WO 제93/212232 (1993. 10. 28 공개) 참조.

본 발명은 추가적으로 항체와 핵산분해 활성이 있는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레이즈 또는 DNA 엔도뉴클레이즈, 예를 들어, 디옥시리보뉴클레이즈; DNase) 사이에 형성된 면역콘쥬게이트에 관한 것이다.

종약의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 방사능성이 강한 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사능성 동위원소가 방사능콘쥬게이트된 항체의 제조를 위해 사용가능하다. 그 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² 및 Lu의 방사능활성 동위원소를 포함한다. 콘쥬게이트가 진단을 위해 사용될 때, 이는 신티그램 촬영 연구를 위한 방사능활성 원소, 예를 들어, tc^99m 또는 I¹²³, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 이미지 (자기 공명 이미지, mri로도 알려져 있음)를 위한 스핀 라벨, 예를 들어, 요오드-123 및 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.

방사능 또는 기타 표지는 공지의 방식으로 콘쥬게이트 중으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성되거나 또는 적합한 아미노산 전구체 (예를 들어, 수소 대신 불소-19)를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc^99m 또는 I¹²³, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 및 In¹¹¹과 같은 표지는 펩티드 중에 시스테인 잔기를 통해 결합될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 결합될 수 있따. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commu. 80:49-57)은 요오드-123을 도입하기 위해 사용될 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)는 기타 방법들을 상세히 기술하고 있다.

항체 및 세포독성제의 콘쥬게이트는 다양한 이관능기 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-이다조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술된 것과 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 는 방사능뉴클레오티드를 항체에 콘쥬게이션하기 위한 킬레이팅제의 에이다. WO 제94/11026호 참조. 링커는 세포독성 약물을 세포 중으로 방출하는 것을 용이하게 하는 "절단될 수 있는 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광 불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드-함유 링커 (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); 미국특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.

별법으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질이 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성으로 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 또는 콘쥬게이트의 목적하는 성질을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역으로 분리되어 있는 두 부분의 콘쥬게이트를 각각 코딩하는 영역들을 포함한다.

다른 실시태양에서, 항체는 항체-수용체 콘쥬게이트가 환자에 투여된 후, 제거제를 사용하여 비결합된 콘쥬게이트를 순환으로부터 제거한 후, 세포독성제 (예를 들어, 방사능뉴클레오티드)에 콘쥬게이트된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여하는, 종양 사전-표적화의 이용을 위한 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 콘쥬게이트될 수 있다.

5.2.5 면역리포좀

또한, 본원에서 기술된 항체는 면역리포좀으로 제제화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 기술, 예를 들어, 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기술된 것과 같이 제조될 수 있다. 증가된 순환 시간을 가진 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 기술되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)를 사용하여 역상 증발법으로 제조될 수 있다. 한정된 공극 크기를 통해 압출된 리포좀은 목적한 직경을 가진 리포좀을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술파이드-교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)]에 기술된 것과 같이 리포좀에 콘쥬게이트될 수 있다. 화학치료제 (예를 들어, 독소루비신)가 리포좀 내에 임의로 함유될 수 있다. 문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)] 참조.

5.2.6 투여 프로토콜, 스케쥴, 투여량 및 제제화

본원에서 화합물들은 상기에서 기술된 것과 같은 다양한 질환 및 질병의 예방제 및 치료제로 유용하다.

화합물의 치료 조성물은 적절한 정도의 순도를 가진 목적한 화합물을 임의의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))과 함께 동결건조된 제제 또는 수용성 용액 형태로 혼합하여 저장용으로 제조된다. 적합한 담체, 부형체 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충용액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이팅제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 자당, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.

이같은 담체의 추가적인 예는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 완충용액 물질, 예를 들어, 인산, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어, 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오즈-기재 물질, 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 화합물의 국소적 또는 젤-기재 형태의 담체는 다당류, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오즈 또는 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 및 목재 왁스 알콜을 포함한다. 모든 투여를 위해, 통상적인 저장 (depot) 형태가 적합하게 사용된다. 이같은 형태는 예를 들어, 마이크로캡슐, 나노-캡슐, 리포좀, 반죽 (plaster), 흡입 형태, 코 분무기, 설하 정제 및 서방성 제제를 포함한다. 화합물은 일반적으로 이같은 비히클 중에서 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 제제화된다.

생체내 투여를 위해 사용되는 본 발명의 화합물은 멸균되어야 한다. 이는 동결건조 및 복원 (reconstitution) 전 또는 후에 멸균 여과막을 통해 여과시켜 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로 화합물은 동결건조된 형태 또는 전신적으로 투여된다면 용액 형태로 저장될 것이다. 동결건조된 형태라면, 화합물은 사용시 적절한 희석제를 사용하여 복원되기 위해 일반적으로 다른 성분들과 함께 제제화된다. 본 발명의 액체 제제의 예는 피하 주사용으로 단일-투여 바이알 중에 충전된, 멸균된 맑은 무색의 비보조된 용액이다. 반복된 사용에 적합한 보조된 제약학적 조성물은 주로 징후 및 폴리펩티드의 유형에 따라, 예를 들어,

a) 본 발명의 화합물;

b) 용액 중의 폴리펩티드 또는 기타 분자의 최대 안정성 범위 중에 pH (바람직하게는 pH 약 4-8)를 유지할 수 있는 완충용액;

c) 주로 교반-유도된 응집에 대해서 화합물을 안정화시키기 위한 세정제/계면활성제;

d) 등장액;

e) 페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드로부터 선택된 보존제, 예를 들어, 염화물; 및

f) 물을 함유할 수 있다.

사용된 세정제가 비이온성이라면, 예를 들어, 폴리소르베이트 (예를 들어, POLYSORBATE™ (TWEEN™) 20, 80 등) 또는 폴로사메르 (예를 들어, POLOXAMER™ 188)일 수 있다. 비이온계 계면활성제의 사용은 폴리펩티드의 변성을 일으키지 않으면서 제제가 전단 표면 응력에 노출되도록 한다. 아울러, 이같은 계면활성제-함유 제제는 폐 투여에서 사용되는 것과 같은 에어로졸 기구 및 바늘이 사용되지 않는 제트 주사기 건에서 사용될 수 있다 (예를 들어, EP 제257,956호 참조).

화합물의 액체 조성물의 등장성을 보증하기 위해서 등장액이 존재할 수 있고, 이는 다가 당 알콜, 바람직하게는 삼가 또는 고가 당 알콜, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 이들 당 알콜은 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다. 별법으로, 용액을 등장성으로 만들기 위해서 염화나트륨 또는 기타 적절한 무기염이 사용될 수 있다.

완충용액은 목적한 pH에 따라 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 또는 포스페이트 완충용액일 수 있다. 본 발명의 한 유형의 액체 제제의 pH는 약 4 내지 8 범위, 바람직하게는 생리적 pH 근방에서 완충된다.

보존제 페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드, 예를 들어, 염화물은 사용가능한 항미생물제로 공지되어 있다.

치료적 조성물은 일반적으로 멸균 액세스 포트를 가진 용기, 예를 들어, 정맥 용액 봉지 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 가진 바이알 중에 놓인다. 제제는 바람직하게는 반복된 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.) 또는 근육내 (i.m.) 주사로, 또는 비강내 또는 폐내 전달에 적합한 에어로졸 제제 (폐내 전달의 경우는 EP 제257,956호 참조)로 투여될 수 있다.

또한, 조성물은 서방성 제제 형태로 투여될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 본 발명의 화합물을 함유하고, 그 매트릭스가 성형된 제품 형태, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐인 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 문헌 [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)] 및 [Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)]에 기술된 것과 같은 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호, EP 제58,481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트 (Langer et al., supra), 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, Lupron Depot (젖산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 제133,988호)를 포함한다.

에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산의 중합체가 100 일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 체내에 보다 긴 시간 동안 유지되는 경우, 이들은 37℃에서 습기에 노출된 결과 변성하거나 응집하여 생물학적 활성을 잃고 면역원성에 변화가 일어날 수 있다. 관여하는 기작에 따라 단백질을 안정화시키기기 위한 합리적인 계획이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기작이 티오-디술파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성으로 일어나는 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기를 변형시키거거나, 산 용액으로부터 동결건조시키거나, 수분 성분을 조절하거나, 적절한 첨가제를 사용하거나 또는 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 안정화를 달성할 수 있다.

또한, 서방성 조성물은 리포좀에 갇힌 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물을 포함하는 리포좀은 그 자체로 공지된 방법으로 제조될 수 있다: DE 제3,218,121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 제52,322호; EP 제36,676호; EP 제88,046호; EP 제143,949호; EP 제142,641호; 일본 특허 출원 제83,118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 제102,324호. 일반적으로, 리포좀은 그 지질 성분이 최적의 치료를 위해 조정된 선택된 비율로 약 30 몰% 콜레스테롤을 초과하는 작은 (약 200-800 Å) 단층형이다.

본 발명의 화합물의 치료적으로 효과적인 투여량은 당연히 치료되는 (예방을 포함) 병리학적 증상, 투여 방법, 치료를 위해 사용되는 화합물의 유형, 공동 사용되는 임의의 치료법, 환자의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 의료 기록 등과 같은 인자에 따라 달라지고, 그 결정은 실무 의료진의 통상의 지식 범위 내에 있다. 따라서, 치료자가 투여량을 측정하고 최적의 치료 효과를 달성하기 위해서 요구되는 투여 경로를 조절하는 것이 필요할 것이다. 임상의는 투여량이 문제의 증상의 치료를 위해 목적한 효과가 달성되는 투여량에 도달할 때까지 화합물을 투여할 것이다.

상기 지침에 따르면, 일반적으로 효과적인 투여량은 약 0.001 내지 약 1.0 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.01-1.0 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01-0.1 mg/kg의 범위 내에 있다.

화합물의 투여 경로는 주사 또는 정맥내, 근육내, 뇌내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 안내, 관절내, 활액내, 포막내, 경구, 국소적 또는 흡입 경로에 의한 주입, 또는 상기에서 기술된 것과 같은 서방성 시스템과 같은 공지의 방법에 따른 것이다. 또한, 화합물은 국부적 또는 전신적 치료효과를 발휘하기 위해 종양내로, 종양주변으로, 병변내로, 또는 병변주변으로 적합하게 투여된다. 복강내 경로는 예를 들어, 난소 종양 치료에서 특히 유용한 것으로 기대된다.

염을 형성하고, 하기 기재에 따라 유용한 분자의 제약학적으로 허용되는 염의 예는 알칼리 금속염 (예를 들어, 나트륨염, 칼륨염), 알칼리 토금속염 (예를 들어, 칼슘염, 마그네슘염), 암모늄염, 유기 염기염 (예를 들어, 피리딘염, 트리에틸아민염), 무기산염 (예를 들어, 인산염, 황산염, 질산염) 및 유기산염 (예를 들어, 아세테이트, 옥살레이트, p-톨루엔술포네이트)를 포함한다.

5.2.7 병용 치료법

문제의 질환을 예방 또는 치료하는 데 있어서 본 발명의 화합물의 효과는 활성 약물을 이같은 목적을 위해 효과적인 다른 약물과 동일한 조성물 또는 별개의 조성물로 연속적으로 투여하거나 또는 함께 투여하여 향상될 수 있다.

암을 치료하기 위해 사용될 때, 본 발명의 화합물은 상기에서 언급된 것과 같은 세포독성제, 화학치료제, 또는 성장 억제제와 함께 병용될 수 있다. 또한, 암 치료를 위해, 화합물은 조사를 하거나 또는 방사능활성 물질을 투여하는 방사능물질 치료법과 적합하게 연속적으로 또는 병용하여 투여된다.

본 발명의 화합물과 함께 투여되는 치료제의 효과적인 양은 의사 또는 수의사의 판단에 따른다. 투여 방법 및 조정은 치료되는 증상의 최대 조정을 달성하기 위해 수행된다. 투여량은 추가적으로 사용되는 치료제의 유형 및 치료되는 특정 환자와 같은 인자에 따라 달라진다.

5.2.8 제조 제품

상기에서 기술된 질환의 치료를 위해 유용한 본 발명의 화합물을 함유하는 키트와 같은 제품의 제조는 하나 이상의 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 테스트 튜브를 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있다. 용기는 증상을 진단 또는 치료하기 위해 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균된 액세스 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥 용액 봉지 또는 피하 주사 바늘로 관통될 수 있는 마개를 가진 바이알일 수 있음). 조성물 중의 활성 약물은 본 발명의 화합물이다. 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨은 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료용이라는 것을 나타낸다. 제조 제품은 추가적으로 제약학적으로 허용되는 완충용액, 예를 들어, 인산 완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 이는 추가적으로, 완충용액, 희석제, 충전재, 바늘, 주사기 및 사용 지시를 포함한 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함할 수 있다. 또한, 제조 제품은 상기에서 기술된 것과 같은 다른 활성 약물을 포함하는 제2 또는 제3 용기를 포함할 수 있다.

5.2.9 항체의 제약학적 조성물

본 발명에 따라 사용되는 항체 및 면역콘쥬게이트의 치료적 제제는 적절한 정도의 순도를 가진 항체를 임의의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))과 함께 동결건조된 제제 또는 수용성 용액 형태로 혼합하여 저장용으로 제조된다. 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 아세테이트, Tris, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충용액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시콜; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이팅제, 예를 들어, EDTA; 강화제, 예를 들어, 트레할로즈 및 염화나트륨; 당, 예를 들어, 자당, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨; 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트; 염-형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어, TWEEN, PLURONICS 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 5-200 mg/ml, 보다 바람직하게는 10-100 mg/ml의 항체를 포함한다.

항원이 세포내성이고, 전체 항체가 억제제로 사용된다면, 세포내로 이동하는 항체가 바람직하다. 그러나, 항체, 또는 항체 단편을 세포 중으로 전달하기 위해서 리포펙션 또는 리포좀이 또한 사용될 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합할 수 있는 능력을 보유하도록 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이같은 펩티드는 화학적으로 합성되고(또는) 재조합 DNA 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, [Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조.

또한, 본원에서 제제는 치료되는 특정 증상에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 가진 것들을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 조성물은 그 기능을 증가시키는 약물, 예를 들어, 세포독성 약물, 사이토카인, 화학치료제, 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이같은 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적합하게 공존할 수 있다.

또한, 활성 성분은 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합화로 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 또는 매크로에멀젼 중의 히드록시메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 중에 갇혀 있을 수 있다. 이같은 기술은 문헌 [Remington's Pharamaceutical Sciences, supra]에 기술되어 있다.

생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시켜 달성될 수 있다.

서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하고, 그 매트릭스가 성형된 제품 형태, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐인 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 젖산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, LUPRON DEPOT™ (젖산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산의 중합체가 100 일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 체내에 보다 긴 시간 동안 유지되는 경우, 이들은 37℃에서 습기에 노출된 결과 변성하거나 응집하여 생물학적 활성을 잃고 면역원성에 변화가 일어날 수 있다. 관여하는 기작에 따라 단백질을 안정화시키기기 위한 합리적인 계획이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기작이 티오-디술파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성으로 일어나는 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기를 변형시키거거나, 산 용액으로부터 동결건조시키거나, 수분 성분을 조절하거나, 적절한 첨가제를 사용하거나 또는 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 안정화를 달성할 수 있다.

5.2.10 항체를 사용한 치료 방법

본 발명의 G항체 및 특히 본 발명의 면역콘쥬게이트 (예를 들어, 메이탄시노이드-항체 콘쥬게이트)가 상기에서 언급된 것과 같은 다양한 질환 및 질병을 치료하기 위해 사용되도록 고안되었다.

항체는 공지의 방법, 예를 들어, 볼루스 또는 일정 기간 동안 연속적인 주입하는 방법에 의한 정맥 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 포막내, 경구, 국소적 또는 흡입 경로로 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.

일반적으로 치료되어야 하는 질환 또는 질병은 암이다. 치료되어야 하는 암의 예는 암종, 임파종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프계 암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이같은 암의 보다 구체적인 예는 편평 세포 암종 (예를 들어, 상피 편평 세포 암종), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 샘암종 및 페의 편평 세포 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암, 췌장암을 포함하는 장 또는 위암, 아교모세포종, 자궁암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 직장결장암, 자궁내막암종 또는 자궁암종, 침샘암종, 신장 또는 콩팥암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 항문 암종, 음경암과 아울러 뇌 및 경부 암을 포함한다.

기타 치료 요법은 상기에서 언급된 것과 같은 본 발명의 항체의 투여와 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체가 암을 치료하기 위한 것이라면, 이같은 항체를 사용하여 치료될 환자는 방사능 치료법도 받을 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 화학치료제가 환자에게 투여될 수 있다. 이같은 화학치료제의 제조 및 투여 스케쥴은 제조자의 지시에 따라 또는 당업계의 실시자들에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이같은 화학치료법의 제조 및 투여 스케쥴은 문헌 [Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992)]에 기술되어 있다. 화학치료제는 항체의 투여 전에 또는 그 후에 병용되거나, 또는 이들과 동시에 투여될 수 있다. 항체는 항-에스트로겐 화합물, 예를 들어, EVISTA™ 또는 항-프로게스테론, 예를 들어, 오나프리스톤 (EP 제616812호 참조)을 이들 분자들에 대해 공지된 투여량으로 병용될 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 항체 치료적 치료법은 항체 (또는 항체들) 및 하나 이상의 화학치료제 또는 성장 억제제의 병용 투여를 포함한다 (상이한 화학치료제들의 칵테일 공동 투여를 포함). 화학치료제는 에스트라무스틴 포스페이트, 프레드니무스틴, 시스플라틴, 5-플루오르우라실, 멜팔란, 시클로포스파미드, 히드록시우레아 및 히드록시우레아타산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 및(또는) 안트라시클린 항체를 포함한다. 이같은 화학치료제의 제조 및 투여 스케쥴은 제조자의 지시에 따라 또는 당업계의 실시자들에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이같은 화학치료법의 제조 및 투여 스케쥴은 문헌 [Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, MD, 1992)]에 기술되어 있다.

항체는 항-호르몬성 화합물, 예를 들어, 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물; 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 (EP 제616,812호); 또는 플루타미드와 같은 항-안드로겐을 이들 분자들에 대해 공지된 투여량으로 병용될 수 있다. 치료되어야 할 암이 안드로겐 비의존적 암이라면, 환자는 항-안드로겐 치료법을 사전에 받을 수 있고, 암이 안드로겐 비의존적이 된 후, 항체 (및 임의로 상기에서 기술된 것과 같은 다른 약물)이 환자에 투여될 수 있다.

때때로, 심장보호제 (치료와 관련된 심장근육 기능장애를 방지 또는 감소시키기 위해) 또는 하나 이상의 사이토카인을 환자에게 공동 투여하는 것이 유익할 것이다. 상기 치료 요법에 추가하여, 환자는 항체 치료 전, 이와 동시에 또는 그 후에 암 세포의 수술에 의한 제거 및(또는) 방사능 치료를 받을 수 있다. 상기 공동 투여되는 임의의 약물의 적합한 투여량은 현재 사용되는 것들이고, 약물 및 항체의 결합된 작용 (상승작용)으로 인해 감소될 수 있다.

암을 치료하기 위해 항체가 사용된다면, 다른 암 관련 항원에 대한 항체, 예를 들어, 하나 이상의 ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체(들)에 결합하는 항체들을 투여하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 이들은 상기에서 언급된 약물들을 포함한다. 또한, 항체는 적합하게는 조사를 실시하거나 또는 방사능활성 물질을 투여하는 방사능물질 치료법과 연속적으로 투여되거나 또는 병용된다. 별법으로, 또는 추가적으로, 본원에서 기술된 동일하거나 또는 두개 이상의 상이한 항원에 결합하는 두개 이상의 항체가 환자에게 공동 투여될 수 있다. 때때로, 하나 이상의 사이토카인을 환자에게 투여하는 것이 또한 바람직할 것이다. 바람직한 실시태양에서, 본원의 항체는 성장 억제제와 함께 공동 투여된다. 예를 들어, 성장 억제제는 본 발명의 항체보다 먼저, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 그러나, 동시적 투여 또는 본 발명의 항체를 먼저 투여하는 것도 고안될 수 있다.

한 실시태양에서, 종양의 혈관신생은 병용 요법으로 공격된다. 본 발명의 항체 및 기타 공지된 항체 (예를 들어, 항-VEGF)는 예를 들어, 종양의 괴사 또는 존재한다면, 그 전이 위치를 관찰하여 결정된 것과 같은 치료적으로 효과적인 투여량으로 종양을 가진 환자에게 투여된다. 이 치료법은 더 이상의 유리한 효과가 관찰되지 않거나, 임상 진찰이 종양 또는 어떠한 전이 위치의 흔적도 보이지 않을 때까지 계속된다. TNF가 단독으로 또는 알파-, 베타- 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린, 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 과립백혈구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 또는 종양 중의 미세혈관 응고를 촉진하는 약물, 예를 들어, 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체, 또는 C4b 결합 단백질 (참조, WO 제91/01753호, 1991. 2. 21 공개) 또는 열 또는 방사능과 함께 투여된다.

보조제는 그 효과면에서 상이할 수 있으므로, 통상의 방식으로 매트릭스 스크리닝에 의해 종양에 대한 이들의 영향을 비교하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체와 TNF의 투여는 목적한 임상 효과가 달성될 때까지 반복된다. 별법으로, 본 발명의 항체는 TNF와 함께 및 임의로 보조 약물(들)과 함께 투여된다. 사지 또는 일반적 순환으로부터 고립되기 쉬운 장소에서 고형 종양이 발견되는 경우, 본원에서 기술된 치료제는 고립된 종양 또는 기관에 투여된다. 한 실시태양에서, FGF 또는 PDGF 길항제, 예를 들어, 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항원은 본 발명의 항체와 함께 환자에 투여된다. 본 발명의 항체를 사용한 치료는 바람직하게는 상처 치료 또는 바람직한 혈관신생 기간 동안 중지될 수 있다.

질환의 예방 또는 치료를 위해서, 투여량 및 투여 방식은 공지의 기준에 따라 의사에 의해 선택될 것이다. 항체의 적절한 투여량은 상기에서 정의된 것과 같이 치료될 질환 유형, 질환의 심도 및 경로, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되느냐 여부, 이전의 치료, 환자의 임상 경력 및 항체에 대한 반응 및 주치 의사의 재량에 의존할 것이다. 항체는 적합하게는 한 번에 또는 여러번의 치료로 환자에 투여된다. 바람직하게는, 항체는 정맥내 주입 또는 피하 주사로 투여된다. 질환의 유형 및 심도에 따라, 한번 이상의 개별적 투여 또는 연속 주입이든, 약 1 mg/체중 kg 내지 약 50 mg/체중 kg (예를 들어, 약 0.1-15 mg/kg/투여량)의 항체가 예를 들어, 환자에 투여되기 위한 최초 후보 투여량이 될 수 있다. 투여 계획은 약 4 mg/kg의 최초 투여량 로딩 후 1 주일 간 약 2 mg/kg의 항체를 유지하는 것을 포함한다. 그러나, 기타 투여 계획이 유용할 수 있다. 일반적인 일일 투여량은 상기에서 언급된 인자에 따라 약 1 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위일 수 있다. 수일 또는 그 이상의 반복된 투여를 위해, 증상에 따라, 질환 증상의 목적한 억제가 일어날 때까지 치료가 지속된다. 이 치료의 진행은 통상의 방법 및 분석법 및 의사 또는 당업자들에게 공지된 기준에 기초해 용이하게 모니터될 수 있다.

항체 단백질을 환자에게 투여하는 것을 별도로 하고, 본원은 유전자 치료법으로 항체를 투여하는 것을 고안하고 있다. 항체를 코딩하는 핵산의 이같은 투여는 "치료적으로 유효한 양의 항체 투여"라는 표현으로 포괄된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 치료법의 사용에 관한 WO 제96/07321호 (1996. 3. 14 공개) 참조.

환자 세포 중으로 핵산 (임의로 벡터 중에 함유됨)을 도입시키기 위한 두가지 중요한 접근법, 생체내 및 생체외 접근법이 있다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 일반적으로 항체가 요구되는 위치에서 환자에게 직접적으로 주사된다. 생체외 치료의 경우, 환자 세포가 제거되고, 핵산이 이들 단리된 세포 중으로 도입되고, 변형된 세포가 직접적으로, 또는 예를 들어, 환자에 이식된 다공성 막 내에 캡슐화되어 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조) 환자에게 투여된다. 핵산을 생세포 중으로 도입하기 위해 사용되는 다양한 기술들이 존재한다. 이 기술들은 핵산이 배양된 세포 중으로 전달되는 것이 목적한 숙주의 세포 내로 시험관내, 또는 생체내 세포로 전달되느냐에 의존하여 달라진다. 시험관내에서 포유동물 세포 중으로 핵산을 전달하는 데 적합한 기술은 리포좀, 전기천공법, 미세주입법, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼륨 침전법 등을 포함한다. 유전자의 생체 외 전달을 위해 흔히 사용되는 벡터는 레트로바이러스계 벡터이다.

현재 바람직한 생체 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스)을 사용한 트랜스펙션 및 지질 기재 시스템 (지질 매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 포함한다. 현재 공지된 유전자 제조 및 유전자 치료법 프로토콜의 고찰은 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)] 참조. 또한, WO 제93/25673호 및 이 중 인용된 문헌들을 참조.

5.2.10.1 항체 표적화

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 메이탄시노이드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 항-유사분열 화합물과 콘쥬게이션되는 것이 고안되었다. 유사분열은 세포 분열 및 복제에 수반되는 세포 내 과정이다. 불행하게도, 다수의 질환 및 질병들은 비정상적 유사분열이라는 특징이 있다. 예를 들어, 암은 세포 유사분열이 조절되지 않게 되는 이같은 예의 하나이다. 따라서, 비정상적 세포 유사분열에 관여하는 세포에 대해 치료 약물이 표적화되는 것이 바람직하다.

본 발명은 항체-항-유사분열 콘쥬게이트가 유사분열이 일어나고 있는 세포를 살생시키는데 매우 효과적이라는 관찰에 기초하고 있다. 아울러, 본 발명은 항체 또는 기타 세포 결합 약물이 종양 세포에서만 발현되는 폴리펩티드 항원에 특이적일 필요가 없다는 놀라운 발견에 기초하고 있다. 오히려, 본 발명의 항체 또는 기타 세포 결합 약물은 증식성 비-암 세포에 비교하여 증식성 암 세포에서 보다 발현이 많이되는 폴리펩티드 항원들을 구분하기만 하면 된다. 항체 또는 기타 세포 결합 약물은 항-유사분열 약물에 콘쥬게이트되므로, 비증식 또는 느리게 증식하는 세포로의 항체의 결합은 비증식 또는 느리게 증식하는 세포의 사멸을 초래하지 않는데, 이는 유사분열이 일어나고 있는 세포들 (즉, 증식 세포들)만이 사멸되기 때문이다.

바람직한 실시태양에서, 항체가 메이탄시노이드에 콘쥬게이트되었을 때, 항체는 바람직하게는 메이탄시노이드-유도된 독성을 일으키지 않는 조직 및(또는) 세포에 표적화된다. 메이탄시노이드-유도된 독성을 일으키는 것으로 이전에 입증된 조직들의 예는 위장관 (GI) 조직 및 신경 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다 (Issel et al., 1978, Can. Trtmnt. Rev., 5:199-207). GI 시스템은 메이탄시노이드에 대한 독성을 나타내기 쉬운데, 이는 GI 내의 세포들이 활발히 증식하고 있고, 따라서, 메이탄시노이드의 항-유사분열 성질이 이같은 세포를 사멸시키는 경향이 있기 때문이다. 신경 세포들은 활발히 증식하는 세포가 아니지만, 신경세포가 축삭 폐포 운반을 위해 마이크로튜불에 의존하기 때문이다. 상기에서 언급된 바와 같이, 메이탄시노이드는 유사분열 억제제인데, 이는 이들이 튜불린 중합을 억제하기 때문이다. 따라서, 신경세포가 활발히 증식하는 세포는 아니지만, 메이탄시노이드에 의한 튜불린 중합의 억제는 신경 세포에 불리한 영향을 미칠 수 있다.

따라서, 본 발명은 이전의 종양 항원 스크리닝 방법의 한계 및 결함을 극복한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 이전에는, 종양 세포의 표면 및 정상, 비증식 또는 느리게 증식하는 세포의 표면 양쪽에서 발견되는 폴리펩티드 항원은 비증식 또는 느리게 증식하는 세포에 대한 독성 부작용의 우려로 인해 암 치료법 표적으로 사용될 것이 고려되지 않았다. 그러나, 상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 항체는 항-유사분열 화합물 (예를 들어, 메이탄시노이드)에 콘쥬게이트되고, 따라서, 비증식 또는 느리게 증식하는 세포에 불리한 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 놀라운 발견은 암 치료법에서 사용될 수 있는 잠재적인 폴리펩티드의 범위를 상당히 확장시켰다.

5.2.11. 세포 표면 폴리펩티드 스크리닝 기술

증식성이거나, 느리게 증식하거나 또는 비증식성인 비-암 세포들 및 조직들과 비교하여 증식하는 암 세포 및 기타 질환 조직 중의 세포 표면 폴리펩티드의 상이한 발현 및(또는) 변형된 발현을 동정하는 것은 유전자 기능, 질환의 유전적 기초 및 이같은 질환의 치료를 위한 치료 약물에 대한 매우 유익한 통찰을 제공할 것이다. 다른 세포 유형에 비해 한 세포 유형에서 보다 많이 발현되는 폴리펩티드 항원을 동정하기 위해 사용될 수 있는 다수의 기술이 현재 존재한다. 바람직한 일면에서, 이들 기술들은 증식성 비-암 세포의 표면에서 보다 증식성 암 세포의 표면에서 보다 많이 발현되는 폴리펩티드 항원을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이같은 기술의 예는 마이크로어레이 분석, 노던, 웨스턴, PCR-기재 방법, TAQMAN, 유전자 발현 데이타베이스, 예를 들어, 공개 (예를 들어, Genbank) 및(또는) 비공개 (LIFESEQ, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA; 및 GENEEXPRESS, GeneLogic, Inc., Gaithersberg, MD) 유전자 발현 데이타베이스의 유전자 증폭 및 스크리닝을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

5.2.11.1 마이크로어레이 분석 (Microarray Analysis)

과거 수년 동안, DNA 마이크로어레이라 불리는 신기술이 분자 생물학자 사이에서 광범위한 관심을 받게 되었고, 복합 질환을 프로파일하고, 신규 질환-관련 유전자를 발견하기 위해 사용되어왔다 (Ekins, R. et al., "Microarrays; their origins and application," Trends in Biotechnology, 17:217-218 (1999); Heller, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2150-2155 (1997)).

DNA 마이크로어레이는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 샘플의 규칙적인 배열로 구성된다. 이 기술은 염기-쌍 규칙에 기초하여 공지 및 비공지 DNA 샘플을 매칭하기 위한 수단 및 비공지 샘플을 동정하는 공정의 자동화를 가능하게 한다. DNA 마이크로어레이는 고속 로봇공학으로 제작되거나 또는 수동 제작될 수 있고, 일반적으로, 유리 또는 때때로 나일론 기타 물질 상에서 제조되고, 서열이 공지된 cDNA 프로브가 상보성 결합을 측정하기 위해 사용되고, 이에 따라 대규모의 병렬 유전자 발현 및 유전자 발견 연구를 가능하게 한다. 단일 DNA 칩을 사용한 실험은 수천개의 유전자에 대한 정보를 동시에 제공할 수 있게 한다 (Schena, M. et al., Science, 270: 467-470 (1995); Shalon, D. et al., Genome Res., 6(7): 639-645 (1996)).

DNA 마이크로어레이를 사용하여, 시험 및 대조구 샘플 유래의 시험 및 대조구 mRNA 샘플이 역전사되고 표지되어 cDNA 프로브를 생성한다. 이후, 프로브는 고체 지지체 상에 고정화된 핵산 배열에 혼성화된다. 배열의 각각의 구성원의 서열 및 위치을 알 수 있도록 배열이 형상화된다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현되는 것으로 알려진 유전자의 선택이 고체 지지체 상에서 배열될 수 있다. 특정 배열 구성원과 표지된 프로브의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자 발현을 유도한다는 것을 나타낸다. 시험구 (질환 조직) 샘플 유래 프로브의 이같은 혼성화가 대조구 (비-질환 조직) 샘플 유래 프로브의 혼성화보다 크다면, 질환 조직에서 발현되는 유전자 또는 유전자들이 동정된다. 별법으로, 마이크로어레이는 다른 세포 유형과 비교해 한 세포 유형에서 높은 수준으로 발현되는 유전자들을 동정하는데 사용될 수 있다.

검출 감도가 시험구와 대조구 샘플을 비교하여 효과적으로 분석하여 질환 관련된 유전자 발현이 인지될 수 있도록 하는데 제한 인자이다. DNA 마이크로어레이를 사용한 인간 유전자의 연구를 위해서, 다수의 질환 상태의 성공적인 분석은 제한적인 양의 샘플을 사용하여 작업하기 위해 충분히 민감한 검출을 요구한다.

따라서, DNA 마이크로어레이는 두번째 세포 유형의 동일한 유전자의 발현에 대해서 첫번째 세포 유형으로부터 유래하는 공지의 유전자들의 상이한 발현을 검출하기 위해 고안될 수 있다. (일반적으로, 첫번째 세포 유형은 비질환 조직에 상응하고, 두번째 세포 유형은 종양을 포함하는 질환 조직에 상응한다). 특히 중요한 것은 특정 유전자의 변형된 발현이 정상 조직에 비해서 질환 조직에서 검출되고, 여기서 이같은 유전자가 보고된 질환에 대한 약물 간섭을 위한 표적으로 사용될 수 있는 경우이다. 따라서, DNA 마이크로어레이 기술은 질환을 프로파일링하고 또한 복합성 만성 질환의 향상된 치료를 위해서 치료제 및 질환 치료법을 개발하도록 이끄는 질환 관련 유전자를 동정하는 데 매우 적합하다.

상이하고(또는) 변형된 유전자 발현은 폴리펩티드 항원을 코딩하는 다수의 목적 유전자의 발현 수준을 모니터링하여 DNA 마이크로어레이를 사용하여 측정될 수 있다. DNA 마이크로어레이는 다수의 유전자의 발현 수준을 동시에 모니터링하고 (전사체 이미지를 생성) 또한, 유전자 변이체, 돌연변이 및 다형성을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, DNA 마이크로어레이는는 두번째 세포 유형의 동일한 유전자의 발현에 대해서 첫번째 세포 유형으로부터 유래하는 폴리펩티드 항원을 코딩하는 유전자의 상이한 발현을 탐지하기 위해 고안될 수 있다 (일반적으로, 첫번째 세포 유형은 정상 조직에 상응하고, 두번째 세포 유형은 질환 조직에 상응한다). mRNA 유래의 형광-표지된 cDNA는 두가지 세포 유형으로부터 단리되고, 여기서, 첫번째 및 두번째 세포 유형의 cDNA는 서로 상이한 제1 및 제2 형광 리포터로 표지된다. 바람직한 실시태양에서, 마이크로어레이는 다른 세포 유형에 비해서 한 세포 유형에서 보다 높은 수준으로 발현되는 유전자를 동정하기 위해 사용될 수 있다.

한 실시태양에서, DNA 마이크로어레이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, WO 제95/11995호에 기술된 것 (Chee et al., Lckart, D.J. et al., Nat. Biotech., 14:1675-1680 (1996) 및 Schena, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:10614-10619 (1996))과 같은 방법에 따라 제조되고 사용될 수 있다.

DNA 마이크로어레이는 바람직하게는 다수의 독특한, 단일-사슬 핵산 서열, 일반적으로 고체 지지체 상에 고정된 합성 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA의 단편으로 구성된다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 약 6-60 뉴클레오티드의 길이이고, 보다 바람직하게는 약 15 내지 30 뉴클레오티드의 길이이고, 가장 바람직하게는 약 20 내지 25 뉴클레오티드의 길이이다. 특정 유형의 DNA 마이크로어레이의 경우, 단지 7 내지 10 뉴클레오티드의 길이인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. DNA 마이크로어레이는 공지의 5' (또는 3') 서열을 커버하는 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있거나, 또는 전장 서열을 커버하는 연속적인 올리고뉴클레오티드들; 또는 서열의 길이를 따라 특정 영역으로부터 선택된 독특한 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. DNA 마이크로어레이에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 서열의 하나 이상의 단편이 공지되어 있는 목적하는 유전자 또는 유전자들에 특이적이거나, 또는 특정 세포 또는 조직 유형에 공통되거나, 또는 정상, 발달 또는 질환 상태에 공통된 미확인된 하나 이상의 cDNA에 특이적인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 특정 상황에서, 마이크로어레이 상에서 올리고뉴클레오티드의 쌍을 사용하는 것이 적절할 수 있다. 이들 쌍은 동일하지만, 바람직하게는 서열의 중심부에 위치하는 한개의 뉴클레오티드가 상이하다. 쌍 중의 두번째 올리고뉴클레오티드 (다른 것과 미스매치됨)가 대조구로 기능한다. 올리고뉴클레오티드 쌍의 수는 2 내지 1,000,000의 범위일 수 있다.

마이크로어레이를 위해 공지의 서열에 대해 올리고뉴클레오티드를 제조하는 경우, 목적하는 폴리펩티드 항원을 코딩하는 유전자는 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 보다 바람직하게는 3' 말단에서 시작하는 컴퓨터 연산방식을 사용하여 조사된다. 연산방식은 유전자에 특이적인 한정된 길이를 가지고, 혼성화에 적합한 범위 내의 GC 함유량을 가지며, 혼성화를 방해할 수 있는 예정된 2차 구조가 결여된 올리고머를 확인한다.

한 측면에서, 빛-유도 화학적 커플링 방법 및 W0 95/251116 (Balderschweiler et al.)에 기재된 것과 같은 잉크젯 적용 기구를 사용함으로써, 기질 표면 상의 지정된 영역에서 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 기질은 페이퍼, 나일론 또는 임의의 다른 형태의 막, 필터, 칩, 유리 슬라이드 또는 임의의 다른 적당한 고체 지지체일 수 있다. 또 다른 측면에서, 도트 또는 슬롯 불롯에 유사한 "격자상" 어레이 (HYBRIDOT 기구, GIBCO/BRL)를 사용하여, cDNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 배열하고, 진공 시스템, 열, UV, 기계적 또는 화학적 결합 방법을 사용하여 기질의 표면에 연결할 수 있다. 또 다른 측면에서, 수동으로, 또는 이용가능한 장치, 물질 및 기계 (BRINKMAN 멀티채널 피페터 또는 로봇식 기구 포함)를 사용하여 어레이를 제조할 수 있다. 상기 어레이는 8, 24, 96, 384, 1536 또는 6144 올리고뉴클레오티드, 또는 상업적으로 이용가능한 수단을 효과적으로 사용할 수 있게 하는 2 내지 1,000,000의 임의의 다른 복수 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 소량의 핵산, 특히 리보핵산으로부터 형광 표지된 cDNA 프로브를 제조하는 개선된 방법을 포함한다. 예를 들면, 포유류 조직에서, 총 RNA의 약 1%가 메신저 RNA/polyA+ RNA이다. mRNA/polyA+ RNA는 cDNA 프로브 합성을 위한 초기 주형을 제공하는 물질이므로, 비-메신저 RNA (리보솜 RNA, 전달 RNA 등)의 복합체 백그라운드에 대해 매우 소량으로 이용가능하다. 따라서, cDNA 프로브 합성을 위한 본 발명의 방법은, 본 발명에 따른 주형으로서 유용한 RNA의 양이 이전에 공지된 방법에서 유용한 양보다 100 - 1000 배 적기 때문에 이점을 제공한다.

한 태양에서, 형광 표지된 cDNA 프로브의 제조 방법은 총 세포 RNA의 나노그램 양의 사용을 포함한다. 상기 소량의 총 RNA는, mRNA가 cDNA로의 역전사를 위한 실제 주형인 경우, 세포 메신저 RNA의 피코그램 양과 동등하다. 본 발명의 부가의 태양은 병에 걸린 인간 조직, 병에 걸린 조직으로부터의 현미해부된 종양 조직, 및 포르말린-고정된 파라핀-개입된 병에 걸린 조직 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 cDNA 프로브의 제조를 포함한다.

생물학적 샘플로부터 폴리뉴클레오티드를 추출함으로써, DNA 마이크로어레이를 사용한 샘플 분석을 수행할 수 있다. 생물학적 샘플은 임의의 체액 (혈액, 뇨, 타액, 점액, 위액 등), 배양된 세포, 생검 또는 기타 조직 표본으로부터 얻어질 수 있다. 샘플로부터의 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 마이크로어레이 상의 핵산에 상보적인 핵산 서열을 프로브로서 제조할 수 있다. 마이크로어레이가 cDNA로 이루어진 경우, 안티센스 RNA (aRNA)가 적당한 프로브이다. 따라서, 한 측면에서, mRNA는 cDNA를 제조하는데 사용되고, cDNA는 다시 형광 뉴클레오티드의 존재 하에서 단편 또는 올리고뉴클레오티드 aRNA 프로브를 제조하는데 사용된다. 상기 형광 표지된 프로브는, 프로브 서열이 마이크로어레이의 cDNA 올리고뉴클레오티드와 혼성화되도록, DNA 마이크로어레이와 배양된다. 또 다른 측면에서, 프로브로 사용된 핵산 서열은 혼성화 기술 분야에서 널리 알려진 제한 효소, PCR 기술, 및 OLIGOLABELING™ 또는 TRANSPROBE™ 키트 (파마시아)를 사용하여 제조된 cDNA 올리고뉴클레오티드, 단편, 및 상보적 또는 안티센스 서열을 포함할 수 있다.

혼성화가 정확한 상보적 적합 또는 다양한 수준의 더 적은 상보성으로 일어나도록 배양 조건을 조절한다. 혼성화되지 않은 프로브의 제거 후, 스캐너를 사용하여 형광의 수준 및 패턴을 측정한다. 스캐닝된 영상을 조사하여 상보성의 정도및 마이크로어레이 상에서 각 올리고뉴클레오티드 서열의 상대적 풍부함을 측정한다. 검출 시스템을 사용하여, 모든 독특한 서열 (이 경우, 항원 코딩 유전자)의 부재, 존재 및 혼성화 양을 동시에 측정할 수 있다. 이 데이타를 대규모 상호관계 연구, 또는 샘플 중의 서열, 돌연변이, 변이체 또는 다형태의 기능적 분석에 사용할 수 있다. (Heller, R. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 94:2150-55 (1997)). 또한, 상기 데이타를 사용하여 증식성 비-암 세포에서보다 증식성 암 세포 표면에서 더 고도로 발현되는 폴리펩티드 항원을 확인할 수 있다.

5.2.11.2. 발현 수준의 분석을 위한 부가의 기술

유전자 증폭 및(또는) 발현은 적절하게 표지된 프로브를 사용하여, 예를 들어, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 서던 블롯팅, 노던 블롯팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 제자리 혼성화에 의해 샘플에서 직접 측정될 수 있다. 별법으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 비롯한 특이적 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 항체는 다시 표지될 수 있고, 표면 상에 듀플렉스가 형성될 때 상기 듀플렉스에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있도록 듀플렉스가 표면에 결합된 경우 분석이 수행될 수 있다.

별법으로, 면역학적 방법, 예를 들면, 세포 또는 조직 부분의 면역조직화학 염색 및 세포 배양 또는 체액 분석에 의해 유전자 발현을 측정하여, 유전자 산물의 발현을 직접 정량화할 수 있다. 면역조직화학 염색 및(또는) 샘플 체액의 분석에 유용한 항체는 모노클론 또는 폴리클론일 수 있고, 위에서 더 충분히 논의된 바와 같이, 임의의 포유류에서 제조될 수 있다.

5.2.11.2.1. 폴리펩티드의 정제

폴리펩티드 형태가 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막-결합된 경우, 이들은 적당한 세정 용액 (예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 폴리펩티드의 발현에 사용된 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들면, 냉동-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제에 의해 파괴될 수 있다.

재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터의 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 방법은 적당한 정제 방법을 예시한다: 이온-교환 칼럼 상에서 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지 (예, DEAE) 상에서 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 사용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스; 및 폴리펩티드의 에피토프-태그된 형태에 결합하는 금속 킬레이트 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법이 사용될 수 있고, 상기 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은, 예를 들면, 사용된 제조 방법의 성질 및 제조된 특정 폴리펩티드에 의존할 것이다.

5.2.11.2.2. 폴리펩티드 항원을 코딩하는 유전자의 증폭

본 발명은 일정 암 세포에서 증폭되므로 암 요법에 대한 표적으로 사용될 수 있는 유전자의 확인에 기초한다. 바람직한 태양에서, 폴리펩티드 항원을 코딩하는 확인된 유전자는 증식성 비-암 세포에서보다 증식성 암 세포의 표면에서 더 고도로 발현된다.

원핵 및 진핵 유기체의 게놈은 2개의 표면상 충돌하는 요건하에 있다. 하나는 유전적 정보로서의 DNA를 그의 원래 형태로 보존 및 전파하여, 복수 세대를 거쳐 안정한 유전을 보증한다. 한편, 세포 또는 유기체는 지속되는 환경의 변화에 적응할 수 있어야 한다. 적응 기전은 유전적 물질의 질적 또는 양적 변형을 포함할 수 있다. 질적 변형은 코딩 서열이 변경되어 구조적 및(또는) 기능적으로 상이한 단백질을 가져오는, DNA 돌연변이를 포함한다. 유전자 증폭은 완전한 코딩 서열, 즉, 유전자의 실제 숫자가 증가하여 전사에 이용가능한 주형의 증가된 수, 해독가능한 전사물의 증가된 수, 및 궁극적으로, 증폭된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 증가에 이르는 양적 변형이다.

유전자 증폭 현상 및 이의 근본 기전은 몇몇 원핵 및 진핵 배양 시스템에서 시험관내 연구되었다. 유전자 증폭의 가장 잘 특성화된 예는 가변 농도의 세포독성 약물 메토트렉세이트 (MTX)를 함유하는 배지에서 진핵 세포를 배양하는 것을 포함한다. MTX는 엽산 유사체이고, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR)를 차단함으로써 DNA 합성을 방해한다. 낮은 농도의 MTX에의 초기 노출 동안, 대부분이 세포 (>99.9%)가 죽을 것이다. 소수의 세포가 생존하고, 다량의 DHFR-RNA 및 단백질을 생성함으로써 증가된 농도의 MTX에서 성장할 수 있다. 이 과다생성의 기초는 단일 DHFR 유전자의 증폭이다. 부가의 유전자 카피가 작은 과잉 염색체 형태의 염색체외 카피 (double minutes)로서, 또는 합체된 염색체 카피로서 발견된다.

유전자 증폭은 세포독성 약물 (박테리아의 경우 항생제, 진핵 세포의 경우 화학요법제)에 대한 저항성의 발생 및 종양 형질전환에서 가장 흔히 일어난다. 자연발생적 사건으로서, 또는 바이러스 또는 화학적/환경적 손상에 기인한 진핵 세포의 형질전환은 일반적으로 상기 세포의 유전적 물질의 변화와 연관된다. 인간 종양에서 관찰되는 가장 흔한 유전적 변화 중 하나는 p53 단백질의 돌연변이이다. p53은 제자리 성장기 (G1)로부터 복제기 (S)로의 세포의 이행을 조절하고, DNA 손상의 존재 하에서 이 이행을 방지한다. 즉, p53 돌연변이를 손상시키는 주요 결과 중 하나는 DNA 손상, 즉, 유전적 변화의 축적 및 전파이다. 점 돌연변이 이외에, 종양 세포에서 유전적 변화의 일반적 형태는 증폭, 및 전위와 같은 총 구조적 변경이다.

DNA 서열의 증폭은 DHFR 실험 시스템에서 예시되는 바와 같이, 특정 기능적 요건을 암시할 수 있다. 따라서, 종양에서 일정 종양유전자의 증폭은 악성 형질전환의 진행 및 형질전환된 표현형의 유지에 있어서 이들 유전자의 원인성 역할을 지시한다. 이 가설은 최근의 연구에서 지지되었다. 예를 들면, 비호지킨 림프종의 일정 유형에서 bcl-2 단백질이 증폭되는 것으로 밝혀졌다. 이 단백질은 세포고사를 억제하고, 종양 세포의 진행성 축적을 가져온다. 다양한 종류의 암에서 성장 인자 수용체의 유전자 패밀리원이 증폭되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 상기 수용체의 과다발현으로 인해 종양 세포가 제한된 양의 이용가능한 성장 인자에 의해 영향을 덜 받을 수 있음을 암시한다. 그 예는 안드로겐 박탈 요법 동안 재발성 전립선 암에서 안드로겐 수용체의 증폭 및 유방암에서 성장 인자 수용체 동종체 ERB2의 증폭을 포함한다. 마지막으로, 세포내 신호전달 및 세포 주기 진행에 관련된 유전자가 악성 형질전환 동안 증폭될 수 있다. 이것은 다양한 상피 및 림프 종양에서 bcl-I 및 ras 유전자의 증폭에 의해 예시된다.

상기 초기 연구들은 종양에서 증폭된 DNA 서열을 확인할 수 있음을 예시하는데, 이 방법이 악성 형질전환에 중요한 유전자를 확인할 수 있기 때문이다. 또한, ERB2의 경우는, 형질전환 단백질이 종양 요법에 신규하고 특이적인 표적을 제시할 수 있으므로, 치료적 측면에서의 가능성을 설명한다.

몇몇 상이한 기술을 사용하여 증폭된 게놈 서열을 증명할 수 있다. 암 세포로부터 제조된 염색체 스프레드 (spread)의 전형적 세포유전적 분석은 전위, 결실 및 역전과 같은 총 구조적 변경을 확인하는데 적합하다. 증폭된 게놈 부위는, 이들이 높은 카피 수를 갖는 큰 영역을 포함하거나 또는 염색체외 물질로서 존재할 경우, 유일하게 가시화될 수 있다. 세포유전학이 특정 염색체 변화와 특정 종양과의 일관된 관계를 증명하기 위한 첫 번째 기술이었으나, 이것은 제어가능한 DNA 서열의 확인 및 단리에는 부적합하다. 더 최근에 개발된 비교 게놈 혼성화 (CGH) 기술은 종양에서 광범위한 게놈 증폭 현상을 예시하였다. 종양 및 정상 DNA는 정상 세포의 중기로 동시에 혼성화되고, 종양에서 증가된 빈도로 존재하는 DNA 서열의 영상 분석에 의해 전체 게놈을 선별할 수 있다. (WO 93/18, 186; Gray et al., Radiation Res., 137:275-289 [1994]). 선별 방법으로서, 이러한 종류의 분석은 다양한 인간 종양에서 다수의 순환 앰플리콘 (amplicons) (증폭된 DNA의 신장)을 나타내었다. DNA의 증폭된 신장을 확인하는데 전형적인 세포유전적 분석보다 CGH가 더 민감하긴 하지만, 이것으로는 일반적인 분자 유전학 기술에 의해 앰플리콘 내의 코딩 서열을 신속하게 확인 및 단리할 수 없다. 그러나, CGH는 증식성 비-암 세포에서보다 증식성 암 세포의 표면에서 더 고도로 발현되는 폴리펩티드 항원을 확인하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

유전자 증폭을 검출하기 위한 가장 민감한 방법은 중합효소 연사슬 반응 (PCR)에 기초한 분석이다. 이 분석은 매우 소량의 종양 DNA를 출발 물질로 사용하고, 매우 민감하며, 서열화와 같은 추가의 분석에 적당한 DNA를 제공하고, 고-용량 처리량 분석에 적합하다.

상기 언급된 분석은 상호 배타적이지 않으며, 종양에서 증폭을 확인하기 위해 자주 조합하여 사용된다. 세포유전적 분석 및 CGH가 증폭된 부분의 전체 게놈을 조사하기 위한 선별 방법을 대표하나, PCR에 기초한 분석이 코딩 서열, 즉, 증폭된 부분의 유전자의 최종 확인에 가장 적합하다.

본 발명에 따르면, 폴리펩티드 항원을 코딩하는 상기 유전자는 양적 PCR (S. Gelmini et al., Clin. Chem., 43:752 [1997])에 의해, 유방, 폐, 결장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 이자, 비장, 흉부, 고환, 난소, 자궁암을 비롯한 다양한 원발성 종양 또는 종양 세포 혈통으로부터의 DNA를 건강한 공여자로부터 수집된 DNA와 비교함으로써 확인될 수 있다. 양적 PCR은 TaqMan™ 기구 (ABI)를 사용하여 수행될 수 있다. DNA의 코딩 서열에 기초하여 유전자-특이적 프라이머 및 플루오로형성 프로브가 고안될 것이다.

5.2.11.2.3. 조직 분포

유전자 증폭 분석의 결과는 추가의 연구, 예를 들면, 다양한 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정함으로써 검증될 수 있다.

상술한 바와 같이, 다양한 조직에서 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 적절하게 표지된 프로브를 사용하여, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 통상의 서던 블롯팅, 노던 블롯팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 제자리 혼성화에 의해 측정될 수 있다. 별법으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 비롯한 특이적 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다.

별법으로, 면역학적 방법, 예를 들면, 조직 부분의 면역조직화학 염색 및 세포 배양 또는 체액 분석에 의해 다양한 조직에서의 유전자 발현을 측정하여, 유전자 산물의 발현을 직접 정량화할 수 있다. 면역조직화학 염색 및(또는) 샘플 체액의 분석에 유용한 항체는 모노클론 또는 폴리클론일 수 있고, 임의의 포유류에서 제조될 수 있다. 항체를 생산하기 위한 일반적인 기술, 및 노던 블롯팅 및 제자리 혼성화를 위한 구체적인 프로토콜이 본원에 제공되었고(되었거나) 당업계에 널리 공지되어 있다.

따라서, 또 다른 세포형에 대해 한 세포형에서 더 고도로 발현되는 폴리펩티드 항원의 확인에 사용될 수 있는, 상기 논의된 다수의 기술이 현재 존재한다. 바람직한 측면에서, 상기 기술을 사용하여 증식성 비-암 세포의 표면에서보다 증식성 암 세포의 표면에서 더 고도로 발현되는, 따라서, 암 치료제의 확인, 특성화 및 제조를 위한 표적으로 사용될 수 있는 폴리펩티드 항원을 확인할 수 있다.

하기 실시예는 예시적 목적으로만 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하지 않는다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌의 개시는 전체가 본원에 참고문헌으로 인용된다.

[실시예]

6. 실시예

실시예에 언급된 상업적으로 이용가능한 시약을, 달리 지적되지 않는 한, 제조자 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예 및 명세서 전반에서 ATCC 접근 번호에 의해 확인된 세포의 공급원은 미국 버니지아주 마나싸스 소재 더 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (The American Type Culture Collection)이다. 달리 적시되지 않는 한, 본 발명은 상기 및 하기 교과서에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 기술의 일반적인 방법을 사용한다: Sambrook et al., 상기문헌; Ausubel et aL, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N. Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

6.1. 실시예 1: HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트

6.1.1. HERCEPTIN (등록상표)의 정제

HERCEPTIN (등록상표) (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 미국 특허 제5,821,337호) (440 mg 항체를 함유하는 1 바이알)을 50 mL MES 완충액 (25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.6)에 용해시켰다. 샘플을 동일한 완충액에서 평형화된 양이온 교환 칼럼 (세파로스 S, 15 cm x 1.7 cm)에 로딩하였다. 이어서, 칼럼을 동일한 완충액 (5 칼럼 부피)으로 세척하였다. 완충액의 NaCl 농도를 200 mM로 올림으로써 HERCEPTIN (등록상표)을 용리하였다. 항체를 함유하는 분획을 수집하여, 10 mg/mL로 희석하고, 50 mm 인산칼륨, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 6.5를 함유하는 완충액으로 투석하였다.

6.1.2. SPP를 사용한 HERCEPTIN (등록상표)의 변형

정제된 HERCEPTIN (등록상표) 항체를 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)로 변형시켜 디티오피리딜기를 도입하였다. NaCl (50 mM) 및 EDTA (1 mM)를 함유하는 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.5) 44.7 mL 중의 항체 (376.0 mg, 8 mg/mL)를 SPP (2.3 mL 에탄올 중 5.3몰 동등물)로 처리하였다. 주위 온도의 아르곤 하에서 90분 동안 배양 후, 반응 혼합물을 35 mM 소듐 시트레이트, 154 mM NaCl, 2 mM EDTA로 평형화된 세파덱스 G25 칼럼을 통해 겔 여과하였다. 항체 함유 분획을 수집하여 분석하였다. 항체의 변형 정도를 상술한 바와 같이 측정하였다. 변형된 항체 (HERCEPTIN (등록상표)-SPP-Py)의 회수율은 337 mg (89.7%)이었고, 항체 당 4.5개의 이탈가능한 2-티오피리딘기가 연결되었다.

6.1.3. HERCEPTIN (등록상표)-SPP-Py와 DM1의 콘쥬게이션

변형된 항체 (337.0 mg, 이탈가능한 2-티오피리딘기의 9.5 μmols)를 상기 35 mM 소듐 시트레이트 완충액, pH 6.5으로 2.5 mg/mL의 최종 농도로 희석하였다. 이어서, 3.0 mM 디메틸아세트아미드 (DMA, 최종 반응 혼합물 중 3% v/v) 중의 DM1 (1.7 동등물, 16.1 μmols)를 항체 용액에 첨가하였다. DM1의 구조를 도 1에 나타내었으며, "R"기의 성질은 중요하지 않고, 예를 들어, 연결기와 화학적 결합을 형성할 수 있는 다양한 기일 수 있다. 본 반응에 사용된 DM1은 더 안정한 S-S 형태로 저장되었고, HERCEPTIN (등록상표) 항체와의 콘쥬게이션을 위해 SH 형태로 환원되었다. 반응은 주위 온도에서 20시간 동안 아르곤 하에서 진행되었다. HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트의 구조가 도 2에 예시되어 있다.

반응 용액을 35 mM 소듐 시트레이트, 154 mM NaCl, pH 6.5로 평형화된 세파크릴 S300 겔 여과 칼럼 (5.0 cm x 90.0 cm, 1.77 L)에 로딩하였다. 유속은 5.0 mL/분이었고, 65 분획 (각 20.0 mL)을 수집하였다. 주 피크가 분획 번호 47 주위에 집중되었다 (도 3). 주 피크는 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 단량체를 포함한다. 분획 44-51을 수집하고, 분석하였다. 252 nm 및 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 항체 분자 당 연결된 DM1 약물 분자 수를 측정하였으며, 항체 분자 당 3.7 약물 분자인 것으로 밝혀졌다.

6.1.4. HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트의 시험관내 항-증식 효과

세포 표면 상에 3+ 수준의 HER2 (약 2 백만 개의 HER2 분자/세포)를 발현하는 SK-BR3 세포를 HERCEPTIN (등록상표), HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트, 대조 mAb RITUXAN (등록상표) 또는 RITUXAN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트로 처리하고, 세포증식에 대한 이들 처리군의 효과를 모니터하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, HERCEPTIN (등록상표)-DM1 처리에 의한 세포 성장 억제 정도가 HERCEPTIN (등록상표) 처리보다 더 현저하게 나타났고, 대조 RITUXAN (등록상표) 항체는 세포 성장을 억제하지 못했다. RITUXAN (등록상표)-DM1은 고 농도에서만 세포 성장을 억제했다. 예를 들면, RITUXAN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트는 1 ㎍/ml 이하의 농도에서는 성장을 그다지 억제하지 못했다. 이와 달리, HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트는 매우 강력했고, 0.01 ㎍/ml에서부터 세포 성장을 크게 억제하였고, 0.1 ㎍/ml에서 고조기에 도달하였다. RITUXAN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트는 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트와 동일한 수준의 세포 성장 억제를 달성하기 위해 약 100 배 더 높은 농도를 요구하였다. 이것은 각 콘쥬게이트의 세포 성장을 50% 억제하는데 요구되는 농도인 IC₅₀ 값의 100 배 차이에서도 반영된다.

6.2. 실시예 2: HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트에서 독성의 결여

하기 실험은 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트와 관련된 생체내 독성의 결여를 설명한다.

6.2.1. 실험 디자인

HERCEPTIN (등록상표)-DM1을 4주 동안 주 1회 젊은 성숙한 암컷 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis; Primate Products, Inc., 미국 플로리다주 마이애미 소재)에게 투여하였다. 원숭이의 평균 체중은 3 kg이었다 (2.7 내지 3.4 kg 범위). 각각 2 마리씩 4 군으로 나누어 총 8 마리의 원숭이를 시험에 사용하였다. 시험한 HERCEPTIN (등록상표)-DM1의 용량은 2, 10 및 30 mg/kg이었다. 대조군은 처리군 동물에게 투여된 것과 동일한 용량 부피의 비히클 (소듐 숙시네이트 (1O mM), 수크로스 (100 mg/ml) 및 트윈 20 (0.1%)을 함유하는 수성 완충액 (pH 5.0))만을 투여받았다. 신경독성 및 심장독성을 비롯한 다양한 독성에 대해 원숭이를 분석하였다. 하기 표 2는 본 실험을 위한 실험 디자인의 세부사항을 더 구체적으로 제시한다.

시험/대조 약물을 4주 동안 주 1회 정맥내 주사 (30-60초에 걸친 느린 볼루스) 투여하였다. DSI (데이타 사이언시스 인터내셔널)로부터의 ART (version 1.0) 소프트웨어 패키지를 사용하는 심혈관 데이타의 수집을 위한 원격측정 프로브를 동물에 외과적으로 삽입하였다. 2D 도플러 심전도를 사용하여 부가의 심혈관 데이타를 수집하였다.
군	용량 = 1x /주			동물 수 (암컷)
	용량 (mg/kg)	부피 (mL/kg)	농도 (mg/mL)	총	독성 동력학1	임상 병리학2	항체 분석3	부검 (제4주)	현미경 병리학
1	0	6	0	2	2	2	2	2	2
2	2	6	0.333	2	2	2	2	1	2
3	10	6	1.67	2	2	2	2	2	2
4	30	6	5.0	2	2	2	2	2	2
1독성동력학 샘플을 제0일:투여전, 및 투여후 1, 48, 72 시간; 제7일: 투여전, 및 투여후 1시간; 제14일: 투여전, 및 투여후 1시간; 제21일: 투여전, 및 투여후 1, 8, 24 및 48시간; 제28일 최종 희생 전에 수집하였다. 2모든 동물에 대해 시험전 2회 및 각 투여 후 5일 (제5일, 12일, 19일 및 26일)에 심장 트로포닌 (트로포닌 I 및 트로포닌 T) 및 크레아틴 키나제 동질효소를 비롯한, 혈액학, 임상 화학론을 평가하였다. 심장 트로포닌 및 크레아틴 키나제 동질효소는 각 용량 투여 (제0일, 7일, 14일 및 21일) 후 약 6시간에도 평가되었다. 3시험전, 제14일에 투여후, 및 시험 종결시 (제28일)에 항체 분석을 위한 혈액 샘플을 수집하였다. mg/kg = 체중 kg 당 시험 약물의 mg. 투여 첫 날을 제0일로 표시함.

6.2.2. 동물 관리

6.2.2.1. 주거

동물을 USDA 동물 복지법 (8 CFR 파트 1, 2 및 3)의 사항에 따라, 격리 기간 동안 높은 스테인레스 우리에서 쌍으로 거주하게 하였다. 동물을 수술시부터 원격측정법 평가로 인한 시험 종결까지 개별적으로 거주하게 하였다.

6.2.2.2. 먹이

보증된 영장류 음식물, 제5048호 (PMI 뉴트리션 인터내셔널, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재). 신선한 먹이를 일일 1회 제공하였다. 제공된 먹이의 양은 방에 거주하는 동물의 평균 체중의 약 4 중량%였다. 주 3회 과일 및 야채로 음식물을 보강하였다. 이 시험 중에 사용된 각 먹이 롯트의 분석은 제조자에 의해 수행되었다.

6.2.2.3. 물

자동 급수 시스템 (엘리자베스타운 워터 캄파니, 미국 뉴저지주 웨스트필드 소재)에 의해 물은 제한없이 이용가능하였다. 미국 뉴저지주 웨스트필드 소재의 엘리자베스타운 워터 캄파니 (라리탄-이스트 밀스톤 플랜트)에 의해 물 분석을 수행하여, 물이 EPA 연방 안전한 음료수 규칙 (40 CFR 파트 141) 하에 설명된 기준을 만족한다는 것을 보장하였다. 또한, 시험 기관에서 물 샘플을 대표 룸으로부터 6개월 마다 수집하여, 하도급 실험실에서 상기 샘플에서 화학적 및 미생물학적 물 분석을 수행하였다.

6.2.2.4. 환경 조건

자동 타이머로 조절된 12시간 낮/밤 주기. 낮 주기는 필요한 경우 독성동력학적 (toxicokinetic) 혈액 샘플의 수집을 위해 중단되었다.

일일 2회 온도를 모니터하고 기록하였으며, 가능한 최대 한도까지 특정 범위 내에서 유지하였다. 온도 범위는 17℃ 내지 29℃였다.

일일 1회 상대 습도를 모니터하고 기록하였으며, 가능한 최대 한도까지 특정 범위 내에서 유지하였다. 상대 습도는 20% 내지 80%였다.

6.2.3. HERCEPTIN (등록상표)-DMl 투여

6.2.3.1. 투여 경로

시험 및 대조 약물을 스테인레스 강철 투여 바늘 및 적당한 크기의 실린지를 사용하여, 두렁 또는 뇌 정맥에 삽입된 내재 카테터 내로 정맥 주사하여 30초 내지 60초에 걸쳐 투여하였다. 사용전 내재 카테터에 멸균 식염수를 흘려보내고, 정맥에 적당하게 삽입되었는지 확인 시험하였다. 투여 후, 카테터에 약 2 mL의 멸균 식염수를 흘려보냈다. 가장 최근의 체중을 사용하여 용량을 계산하였다.

6.2.3.1. 투여 빈도, 기간 및 농도

시험 약물을 4주 동안 주 1회 (0, 7, 14 및 21일에) 투여하였다. 투여량은 다음과 같았다: 그룹 1 - 0 mg/kg; 그룹 2 - 2 mg/kg; 그룹 3 - 10 mg/kg 및 그룹 4 - 30 mg/kg. 모든 투여량은 6 ml/kg 부피로 투여하였다.

6.2.4. 동물의 수술 작업

6.2.4.1. 원격측정 프로브 삽입

수술 전날, 수술 당일 및 수술 후 5일 동안 동물을 항생제 (베이트릴 (등록상표), DNA 기라제 억제제, 5 mg/kg, 근육내)로 예방적 처리하였다. 수술 전 동물을 최소 12시간 동안 단식시켰으나, 총 18시간 (수술 시간을 포함)이 넘지 않게 하였다. 마취 전에 동물을 케타민 (10 mg/kg) 및 아트로핀 (0.05 mg/kg)으로 처리하였다. 이소플루란으로 마취를 유도하고 유지하였다. 전체 수술 기간 동안 동물을 마취 하에 두었다. 마취되면, 적당한 배 및 서혜부를 면도하고, 외과적 삽입 절차를 준비하였다. 좌측 서혜부 및 복막강을 조금 절개하였다. 원격측정 장치/전달기 (미국 미네소타주 세인트 폴 소재, 데이타 사이언시스 인터내셔널)를 복막강 사이에 위치시키고, 봉합선으로 복강내의 망 또는 복강 점막 표면 (동물 의존적 선택)에 고정하였다. 원격측정 프로브의 혈압 카테터를 배 근육조직을 통해 몸 밖으로 꺼내고, 피하적으로 좌측 사타구니 부분으로 향하게 했다. 카테터 팁을 배 대동맥에 위치시키고 봉합선으로 고정하여, 혈압 카테터를 좌측 대퇴부 동맥에 삽입하였다. 또한, 심전도 전극을 몸 밖으로 꺼내고, 적당한 해부 부위로 피하적으로 관통시켰다. 전극 둘 다를 봉합선으로 고정하였다.

6.2.4.1. 수술후 처리

비스테로이드성 소염진통제인 플루닉신 메글루민 (1 mg/kg, 근육내)을 수술 직후 (마취로부터 회복 전) 투여하였다. 시험 지휘자 및(또는) 수의사에 의해 필요하다고 생각되는 경우 추가의 플루닉신 메글루민을 투여하였다. 수술 당일 수술 후 기간 동안, 동물이 마취에서 회복될 때까지 동물을 관찰하고, 밤새 먹이를 제공하였다. 수술 후 5일 동안 원숭이를 항생제 (베이트릴 (등록상표), 5 mg/kg, 근육내)로 예방적 처리하였다. 투여 개시 전 적어도 14일 동안 원숭이가 회복되도록 하였다. 배 봉합선이 개방되는 것을 피하기 위해, 수술 후 7-10일 동안 동물을 전혀 다루지 않았다.

6.2.5. 요약 및 결론

본 실험은 4주 동안 주 1회 정맥내 주사에 의해 암컷 시노몰구스 원숭이에게 투여된 2, 10 또는 30 mg/kg 용량에서의 HERCEPTIN (등록상표)-DM1의 잠재적 독성 (예, 신경독성 및 심장독성) 영향을 평가하기 위해 디자인되었다. 대조군 (2 마리)은 처리군 동물에게 투여된 것과 동일한 용량 부피의 비히클 (소듐 숙시네이트 (10 mM), 수크로스 (100 mg/ml) 및 트윈 20 (0.1%)을 함유하는 수성 완충액 (pH 5.0))을 투여받았다.

시험 전 2회 및 시험 기간 동안 주 1회 신체 관찰을 수행하였다. 시험 전 2회, 시험 기간 동안 주 1회 및 종결 전 체중을 기록하였다. 시험 약물 투여 당일 선택된 간격으로 및 시험 종결 시에 독성동력학적 분석을 위한 혈액 샘플을 수집하였다. 시험 전, 시험 제14일에 투여전, 및 시험 종결시에 항체 분석을 위한 혈액 샘플을 수집하였다. 시험 전 2회 및 시험 제5일, 12일, 19일, 26일에, 크레아티닌 키나제 동질효소 및 심장 트로포닌 (트로포닌 I 및 트로포닌 T)을 위한 분석을 비롯한, 혈액학 및 임상 화학론을 수행하였다. 또한, 크레아티닌 키나제 동질효소 및 심장 트로포닌을 위한 샘플을 시험 제0일, 7일, 14일 및 21일에 투여후 약 6시간에 수집하였다.

시험 전 2회 24시간 동안 심혈관 평가를 무선원격측정법으로 수행하였다. 시험 약물 투여 당일, 투여 전 약 2시간 동안, 투여 후 4시간 동안 매 분, 투여 후 4시간에서부터 투여 후 24시간 동안 매 30분 및 투여한 주의 나머지 기간 동안 매 시간 동물을 모니터하였다. 시험 전 2회 및 투여 기간의 종결시에 수동 9-전극 심전도를 기록하였다. 시험 전 3회 및 시험 제5일, 12일, 19일 및 26일에 초음파 심장 진단도를 수행하였다.

치료 4주 후, 모든 생존 동물을 희생시켰다. 모든 동물에 대해 완전한 육안사후 검사 및 선택된 조직의 조직병리학적 평가를 수행하였다. 각 동물로부터 심장 및 신경 조직을 수집하고 분석하였다.

시험 동안 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 관련 사망은 없었다. HERCEPTIN (등록상표)-DM1 관련 임상적 소견 또는 체중에 대한 영향은 없었다. 시험 종결시 기록된 복수전극 심전도 또는 시험 전반에서 빈번한 간격으로 기록된 단일 전극 원격측정된 심전도에서 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 관련 독성에 대한 심전도 측면의 증거는 없었다. 각 투여 후 5일에 초음파 심장 검진에 의해 몇몇 2D/M-양식 심장 크기 및 도플러 혈류 변수를 측정하였을 때, 2, 10 또는 30 mg/kg의 용량에서 혈압치 (평균, 수축기 및 확장기)에 대한 HERCEPTIN (등록상표)-DM1의 영향을 암시하지 않았다. 혈액학 값에 대한 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 관련 영향을 확실하게 암시하지 않았다. 임상 화학론 값 또는 크레아틴 키나제 MB, 및 심장 손상에 대한 특이적 마커인 심장 트로포닌 I 및 T의 혈청 수준에 대한 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 관련 영향은 없었다. HERCEPTIN (등록상표)-DM1 처리에 기인한 육안 소견은 없었다. 그러나, HERCEPTIN (등록상표)-DM1 관련 현미경 소견은 30 mg/kg의 고 용량 수준에서 처리된 동물에 대해, 골격근에서의 2차적 영향뿐만 아니라 좌골 및 미주 신경에서 미세한 신경퇴행 변화를 포함하였다. 그러나, 30 mg/kg 수준은 에상되는 치료적 수준의 약 10 배 증가를 나타낸다. 게다가, 우리-측 관찰을 기준으로 할 때, HERCEPTIN (등록상표)-DM1 치료 후 어떠한 신경학적 또는 상피 세포 관련 (예, 위장관, 피부, 감염 등) 변화도 일어나지 않았다.

결론적으로, 임상적 평가, 즉, 광학 현미경에 의한 심장 조직의 검사 및 심장 병변에 특이적인 혈청 마커의 측정에 기초할 때, 4주 동안 주 1회 정맥내 주사에 의해 2, 10 또는 30 mg/kg의 용량에서 HERCEPTIN (등록상표)-DM1으로 치료된 암컷 시노몰구스 원숭이에서 어떠한 심장독성의 암시도 없었다. 4주 동안 주 1회 정맥내 주사에 의해 30 mg/kg의 용량에서 HERCEPTIN (등록상표)-DM1으로 치료된 암컷 시노몰구스 원숭이에서 말초 신경병증이 관찰되었다. 그러나, 상술한 바와 같이, 30 mg/kg 수준은 에상되는 치료적 수준에 비해 약 10 배 증가를 나타낸다. 게다가, HERCEPTIN (등록상표)-DM1 치료 후 어떠한 신경학적 또는 상피 세포 관련 (예, 위장관, 피부, 감염 등) 변화도 일어나지 않았다.

6.3. 실시예 3: HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트는 정상 인간 세포 또는 성장-정지된 세포에는 비독성이다.

하기 실험은 정상 인간 세포 또는 성장-정지된 세포에 대한 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트와 관련된 독성의 결여를 설명한다.

6.3.1. 실험 디자인

정상 인간 유방 상피 세포 (HMEC), 소 기도 상피 세포 (SAEC) 및 성인 표피 각질세포 (NHEK)를 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 클로네틱스/바이오휘태커 (Clonetics/BioWhittaker)로부터 얻었다. 인간 간세포를 미국 매릴랜드주 발티모어 소재의 인비트로 테크놀로지스 (In Vitro Technologies)로부터 얻었다. SK-BR-3 인간 유방 암종 세포를 미국 매릴랜드주 록빌 소재의 더 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 얻었다. 사용된 배지는 다음과 같다: MEGM (유방 상피 세포 성장 배지), SAGM (소 기도 상피 세포 성장 배지) 및 KGM (각질세포 성장 배지) (이상, 클로네틱스/바이오휘태커로부터 입수); 및 간세포 배지 (인비트로 테크놀로지스). SK-BR-3 세포를 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 및 2 mM 1-글루카민이 보강된 고 글루코스 DMEM:햄스 F-12 (50:50) (모두 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 GIBCO/BRL로부터 입수)에서 배양하였다.

세포를 96-웰 마이크로타이터 배양판에 다음 밀도로 평판 배양하고: SK-BR-3에 대해 2 x 10⁴/웰; HMEC, SAEC 및 NHEK에 대해 10⁴/웰; 인간 간세포에 대해 3.5 x 10⁴/웰 (인비트로 테크놀로지스에 의해 콜라겐-코팅된 판에 예비-배양됨), 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 밤새 부착시켰다. 다음 날, 항체 단독 (Herceptin 또는 Rituxan) 또는 항체-메이탄시노이드콘쥬게이트 (HERCEPTIN (등록상표)-DM1 또는 RITUXAN (등록상표)-DMl)를 0.1 ng/ml - 10 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 3일 배양 후, 배지를 제거하고, 세포 단일층을 PBS로 1회 세척하고, 크리스탈 바이올렛 염료 (0.5% 크리스탈 바이올렛, 20% 메탄올)로 염색하였다.

성장-정지된 세포에서의 실험을 위해, SK-BR-3 유방 종양 세포를 5 x 10³/ 웰 (10% FBS를 함유하는 배지에 잔류할 세포의 경우) 또는 2 x 10⁴/웰 (성장 정지될 세포의 경우)의 밀도로 완전히 보강된 배지 중의 96-웰 마이크로타이터 배양판에 평판 배양하였다. 밤새 배양 후, 배지를 제거하고, 10% FBS가 보강된 배지로 대체하여 정상 세포가 성장되게 하거나, 0.1% FBS가 보강된 배지로 대체하여 세포 주기 정지를 개시하였다. 3일 동안 배양하여 세포 성장이 완전히 정지되게 한 후, 배지를 다시 제거하고, 10% FBS 또는 0.1% FBS 및 Herceptin 또는 항체-DM1 콘쥬게이트 (0.1 ng/ml - 10 mg/ml)를 함유하는 배지로 대체하였다. 이어서, 세포를 3일 동안 배양하고, 딘일층을 상술한 바와 같이 크리스탈 바이올렛 염료로 염색하였다.

모든 실험에 대해, 크리스탈 바이올렛 염료를 제거한 후, 배양판을 밤새 공기 건조하였다. 이어서, 염료를 0.1 M 소듐 시트레이트:에탄올 (50:50), pH 4.2로 용리하고, 540 nm 파장에서 SLT 340 ATC 배양판-판독기로 배양판을 판독하였다. 각 처리군은 4개의 부본으로 이루어졌고, 데이타는 평균 O.D.₅₄₀ ±표준 오차를 나타내거나, 또는 비처리 대조군 세포와 비교한 세포 증식 (평균 ±표준 오차)에 대한 것이다.

6.3.2. HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트는 정상 세포에 비독성이다.

SK-BR-3 유방 종양 세포의 HERCEPTIN (등록상표)-DM1으로의 처리는 용량-의존적 세포독성을 가져왔으며, EC₅₀은 약 0.005 mg/ml (33 pM)이었다 (도 4). Herceptin 단독은 SK-BR-3 세포 성장에서 중간의 감소 (35%)를 일으켰다. 대조 항체-메이탄시노이드콘쥬게이트, RITUXAN (등록상표)-DM1은 시험한 가장 높은 용량 (10 ㎍/ml)에서만 독성을 나타내었다. 이와 달리, HERCEPTIN (등록상표)-DM1은 정상 인간 유방 상피 세포 (도 5a), 정상 인간 간세포 (도 5b); 정상 인간 표피 각질세포 (도 5c) 또는 정상 인간 소 기도 상피 세포 (도 5d)에 대해 영향을 미치지 않았다.

6.3.3. HERCEPTIN (등록상표)-DM1 콘쥬게이트는 성장-정지된 세포에는 비독성이다.

상술한 바와 같이, SK-BR-3 유방 종양 세포의 HERCEPTIN (등록상표)-DM1으로의 처리는 용량-의존성 세포독성을 가져왔다 (도 4). 도 6a는 SK-BR-3 유방 종양 세포의 HERCEPTIN (등록상표)-DM1으로의 처리가 용량-의존적 세포 증식의 감소를 가져왔음을 나타낸다. Herceptin 단독은 SK-BR-3 세포 증식에서 중간의 감소를 일으킨 반면, 대조 항체-메이탄시노이드콘쥬게이트, RITUXAN (등록상표)-DM1은 시험한 가장 높은 용량 (1 및 10 ㎍/ml)에서만 세포 증식의 상당한 감소를 나타내었다.

세포 성장 정지를 가져오는 혈청-박탈 기간 후, SK-BR-3 세포의 HERCEPTIN (등록상표)-DM1으로의 처리는 세포독성 반응을 가져오지 않았다. 성장-정지된 SK-BR-3 유방 종양 세포는 시험한 가장 높은 용량 (10 ㎍/ml)에서도 HERCEPTIN (등록상표)-DM1 (또는 고 용량 RITUXAN (등록상표)-DM1) 세포독성에 완전히 저항성이었다 (도 6b). 또한, 위에서 언급한 바와 같이, 인간 간세포는 항체-메이탄시노이드살생에 영향을 받지 않았다. 간세포가 비분할 세포이므로, 상기 결과는 HERCEPTIN (등록상표)-DM1이 비-분할 세포에 대해 영향을 미치지 않음을 더 지지한다.

Claims (1)

1. (i) 증식성 비-암 세포의 표면에서보다 암 세포의 표면에서 더 고도로 발현된 폴리펩티드 항원에 결합하는 항체, 및 (ii) 상기 항체에 연결된 하나 이상의 항-유사분열 화합물을 포함하는 세포독성 화합물의 치료학적 유효량을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류의 효과적 암 치료 방법.

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