CN1526823A - 烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺 - Google Patents
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Abstract
烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺：菌种接种到含底物1烟酸的发酵培养液中进行转化发酵培养，同时使烟酸转化为6－羟基烟酸，过程中不断添加烟酸；培养结束后将培养液与菌体分离，去除菌体的培养液酸化静置使结晶析出得产品1，6－羟基烟酸；分离所得的菌体再加入到含底物2，3－氰基吡啶转化液中，将3－氰基吡啶转化为6－羟基3－氰基吡啶，过程中不断添加3－氰基吡啶；转化结束后，将菌体去除，澄清的转化液酸化静置使结晶析出得产品6－羟基3－氰基吡啶。本发明可有效地解决含3－氰基吡啶羟化酶菌体细胞培养中使用大量的烟酸的问题，变烟酸消耗为烟酸底物转化生产6－羟基烟酸，节约了成本还可获得额外生产效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时生产6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶的微生物转化方法，具体涉及一种烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺。
背景技术
6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶是一类重要的合成医药、农药、染料等化合物的中间体。如合成农药吡虫啉、啶虫脒等，其关键中间体是6-氯-3-羟甲基吡啶或6-氯-3-氯甲基吡啶。烟酸和3-氰基吡啶可分别被微生物羟基化为6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶。以烟酸为原料通过微生物转化方法羟基化得到6-羟基烟酸，再进一步酰氯化、还原，可达到6-氯-3-羟甲基吡啶；以3-氰基吡啶为原料，先用微生物羟基化为6-羟基-3-氰基吡啶，然后氯化，再还原水解可得到6-氯-3-氯甲基吡啶。
利用微生物羟基化烟酸已有瑞士公司申请欧洲专利(Lehky，P et al，Eur.Pat.Appl.No.0152948，1985；Kulla H and Lehky，P.，Eur.Pat.Appl.No.0152949，1985)，该专利采用Achromobacter xylosoxydans DSM2783菌株和Pseudomonasputida NCIB 10521菌株和8176菌株进行微生物转化，其专利生产工艺分为两步：第一步是先培养一定生物量的具有高活性烟酸羟基化酶的菌体，第二步是利用菌体进行烟酸的羟基化反应。该专利强调这两步过程不可能合并为一个过程。日本学者Nagasawa等人(Biosci.Biotech.Biochem.58(4)，665-668，1994)和Hurh等人(J Fermentation and bioengineering，77(4)，382-385，1994)也分别报道首先在一定培养基中培养荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens TN5)或沙雷铁氏菌(Serratia marcescens IFO 12648)，培养过程中可加烟酸、6-羟基烟酸诱导羟基化酶的形成，然后通过离心获得静息菌体细胞，再使用静息细胞在含有烟酸的缓冲溶液中进行羟基化反应。
利用微生物羟基化3-氰基吡啶为6-羟基-3-氰基吡啶已有日本和美国专利(Yasuda，M et al，US Pat.Appl.No.246570，1995；JP 4039562，1992；JP 4-0774 61，1992)。但已有专利是先培养具有转化活力的微生物，然后分离、回收获得静息菌体细胞，再将获得的菌体与3-氰基吡啶水溶液混合反应，使3-氰基吡啶被微生物羟基化为6-羟基-3-氰基吡啶。Yasuda et al(Biosci.Biotech.Biochem.，59(4)，572-575，1995)报道一种睾丸酮假单胞菌MCI-2848菌株(Comamonastestosterone MCI-2848)，可使3-氰基吡啶6位羟基化，其过程为向培养介质中加入烟酸诱导所培养的菌体具有较高的羟基化转化活力，然后分离、回收获得静息菌体细胞，再利用获得的静息菌体细胞转化3-氰基吡啶为6-羟基-3-氰基吡啶。
以往生产工艺存在两个主要缺点：(1)是6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶的微生物转化工艺都是分开独立进行的；(2)是3-氰基吡啶羟化酶的产生需要使用大量的烟酸作为诱导物加入到微生物培养的介质中，在培养过程中诱导菌体产生较高的羟基化酶活性，然后收获静息菌体细胞，再将收获的静息菌体细胞加入到转化液中，转化3-氰基吡啶为6-羟基-3-氰基吡啶，由于菌体培养时使用的诱导剂浓度通常为1％烟酸，结果每转化一定量的3-氰基吡啶几乎需要消耗同样量的烟酸，由于烟酸的市场价格高于氰基吡啶，因而从经济角度讲是无法应用于生产的。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以满足商业目的的方法，解决6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶的工业生产工艺课题。解决含3-氰基吡啶羟化酶菌体细胞培养过程中需要使用大量的烟酸作为诱导物的问题，将培养基中诱导物烟酸的使用作为6-羟基烟酸的生产过程，在诱导菌体产生3-氰基吡啶羟化酶活力的同时，将烟酸羟基化为6-羟基烟酸。本发明采用所分离保藏的可羟基化3-氰基吡啶的菌种，分析烟酸作为诱导物培养微生物时的代谢去向，发现在微生物培养过程中，诱导物烟酸并没有被彻底降解，而只是被羟基化成6-羟基烟酸，进一步研究证明高浓度6-羟基烟酸在培养基中积累不影响微生物的生长，因而建立了将烟酸和3-氰基吡啶的微生物羟基化偶联生产的工艺。
本发明的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺步骤如下：
将微生物菌种接种到含底物1(烟酸)的发酵培养液中，先进行微生物烟酸转化发酵培养，在微生物发酵培养的同时使底物1(烟酸)转化为6-羟基烟酸，发酵培养过程中要不断添加被消耗的底物1(烟酸)到发酵培养液中；
转化发酵培养结束后，将培养液与菌体离心或过滤分离，去除菌体的烟酸转化发酵培养液酸化静置后，使结晶析出得产品1，6-羟基烟酸；
从烟酸转化发酵培养液中分离所得的菌体，可直接或经适当处理后，再加入到含底物2(3-氰基吡啶)转化液中，进行氰基吡啶转化反应，将3-氰基吡啶转化为6-羟基3-氰基吡啶，转化过程中要不断添加被消耗的3-氰基吡啶；
转化结束后，将菌体去除，澄清的转化液酸化静置后，使结晶析出得产品2，6-羟基3-氰基吡啶。
上述微生物烟酸转化发酵培养接种采用的可羟基化3-氰基吡啶的微生物菌种，可以是Achromobacter spp.，Acinetobacter spp.，Alcaligenes spp.，Comamonas spp.，Micrococcus spp.，Pseudomonas spp.，Serratia spp.等中的一种，也可以是任何其他可羟基化3-氰基吡啶的微生物。
上述用于微生物烟酸转化发酵培养所用的含底物1(烟酸)的培养基，可以是任何一种适合于微生物生长的营养介质，但是其中要加入0.1％以上的烟酸。
上述微生物烟酸转化发酵培养条件是，10-60℃，1-300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，发酵培养1-96小时，但与众不同的是需要在培养过程中不断添加底物1(烟酸)到发酵培养液中，维持诱导物烟酸浓度在0.1％以上，接种之前需要进行灭菌处理。
上述微生物烟酸转化发酵培养生产过程中，添加底物1(烟酸)到发酵培养液中时，可使用含0.5％以上烟酸的水溶液、或含0.5％以上烟酸的发酵培养基、或含0.5％以上烟酸的任何一种缓冲溶液，也可以直接使用烟酸固体。添加方式可通过管道流加、或滴加或直接间歇添加。
上述微生物烟酸转化发酵培养生产结束后，与以往不同的是，菌液分离后，发酵培养液不是排放丢弃，而是需要回收。回收得到的烟酸转化发酵培养液，需要用盐酸、或硫酸、或其他任意一种有机或无机酸调至pH1-5，低温静置使6-羟基烟酸结晶析出，回收晶体并用酸化水溶液(pH1-5)洗涤、干燥后为6-羟基烟酸成品，若产品不纯，可通过中性水溶液或缓冲溶液重新溶解晶体，再酸化重结晶予以纯化。
上述底物2(3-氰基吡啶)的转化反应时，可直接使用的菌体是指将烟酸转化发酵培养结束后经离心或过滤获得的菌体沉淀。可使用经适当处理的菌体既可是指前述的菌体沉淀经30-90℃加热处理一段时间后所获得的死菌体；也可是指前述的菌体沉淀经任意一种已知的固定化方法(如凝胶包埋法和离子吸附法)处理所获得的固定化菌体；也可是指前述的菌体沉淀，通过细胞自溶、或细胞破碎等方法使酶释放到溶液中，通过离心或过滤等方法除去菌体细胞碎片后，所得的细胞酶提取液，或经硫酸铵盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等纯化后的羟基化酶制剂。
上述底物2(3-氰基吡啶)的转化反应条件是，底物2(3-氰基吡啶)浓度＞0.1％(在任意一种pH6-8的溶液中)，温度范围在10-60℃，1-300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，反应时间1-96小时。转化过程中要流加或间歇添加含0.5％以上的3-氰基吡啶水溶液、或含0.5％以上的发酵培养液、或含0.5％以上的任何一种缓冲溶液，也可以直接添加3-氰基吡啶固体，以维持底物2(3-氰基吡啶)浓度在0.1％以上。转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开。所获转化液用任意一种有机或无机酸调至pH1-6，低温或室温静置使6-羟基3-氰基吡啶结晶析出，回收晶体并用酸化水洗涤、干燥后为成品，若产品不纯，可通过中性水溶液或缓冲溶液重新溶解晶体，再酸化重结晶予以纯化。
使用本发明的专利技术，可有效地解决含3-氰基吡啶羟化酶菌体细胞培养过程中需要使用大量的烟酸作为诱导物的问题，变烟酸诱导物的消耗为烟酸底物转化生产6-羟基烟酸的过程，不但节约了诱导物的成本支出，还获得了额外的转化产物的生产效益。同时本专利为了进行烟酸的转化生产，需要维持菌体烟酸转化发酵培养基中的烟酸在一个恒定的较高浓度水平，结果使所获得的静息菌体细胞相对于以往的培养方法获得的静息菌体细胞，具有更高的3-氰基吡啶羟化酶活力，使6-羟基-3-氰基吡啶的转化率提高了20％以上。
具体实施方式
实施例1，将50ml含1％烟酸的LB培养基放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Pseudomonas sp.NJ，28℃，200rpm震荡培养进行烟酸羟基化转化反应，培养过程中每2h补充一次因转化消耗了的烟酸，使之浓度恢复到1％，24h后停止诱导转化发酵培养，5000rpm离心3分钟，使菌体和发酵培养液分离。用1M硫酸将去除菌体的发酵培养液调至pH2.0，静置过夜待晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥后，得3.2克羟基烟酸。将菌体加入到50ml含1％3-氰基吡啶的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，28℃，200rpm震荡通气进行3-氰基吡啶羟基化转化反应，转化过程中每2h补充一次因转化消耗了的3-氰基吡啶，使之浓度恢复到1％，24h后停止转化反应，5000rpm离心3分钟去除菌体，上清液用1M硫酸调至pH3.0，静置过夜待晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥后，得1.4克6-羟基3-氰基吡啶。
实施例2、将50ml含1.0％烟酸的牛肉膏蛋白胨培养基放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入沙雷铁氏菌(Serratia sp.NJ)，28℃，200rpm震荡培养进行烟酸羟基化转化反应，培养过程中每3h补充一次因转化消耗了的烟酸，使之浓度恢复到1.0％，32h后停止诱导转化发酵培养，离心使菌体和发酵培养液分离。用1M盐酸将去除菌体的发酵培养液调至pH2.0，静置使晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥后，得2.2克羟基烟酸。将菌体加入到50ml含1％3-氰基吡啶的20mM硼酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，28℃，200rpm震荡通气进行3-氰基吡啶羟基化转化反应，转化过程中每4h补充一次因转化消耗了的3-氰基吡啶，使之浓度恢复到1％，24h后停止转化反应，离心去除菌体，上清液用1M盐酸调至pH3.0，静置晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥，得0.8克6-羟基3-氰基吡啶。
Claims (8)
1、一种烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，步骤如下：
将微生物菌种接种到含底物1烟酸的发酵培养液中，先进行微生物烟酸转化发酵培养，在微生物发酵培养的同时使底物1烟酸转化为6-羟基烟酸，发酵培养过程中要不断添加被消耗的底物1烟酸到发酵培养液中；
转化发酵培养结束后，将培养液与菌体离心或过滤分离，去除菌体的烟酸转化发酵培养液酸化静置后，使结晶析出得产品1，6-羟基烟酸；
从烟酸转化发酵培养液中分离所得的菌体，直接或经适当处理后，再加入到含底物2，3-氰基吡啶转化液中，进行氰基吡啶转化反应，将3-氰基吡啶转化为6-羟基3-氰基吡啶，转化过程中要不断添加被消耗的3-氰基吡啶；转化结束后，将菌体去除，澄清的转化液酸化静置后，使结晶析出得产品2，6-羟基3-氰基吡啶。
2、按照权利要求1所述的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，其特征在于：所述微生物烟酸转化发酵培养接种采用的可羟基化3-氰基吡啶的微生物菌种，是Achromobacter spp.，Acinetobacter spp.，Alcaligenes spp.，Comamonas spp.，Micrococcus spp.，Pseudomonas spp.，Serratia spp.中的一种。
3、按照权利要求1所述的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，其特征在于：微生物烟酸转化发酵培养所用的含底物1烟酸的培养基，可以是任何一种适合于微生物生长的营养介质，但是其中要加入0.1％以上的烟酸。
4、按照权利要求1或2或3所述的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，其特征在于：微生物烟酸转化发酵培养条件是，10-60℃，1-300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，发酵培养1-96小时，但与众不同的是需要在培养过程中不断添加底物1烟酸到发酵培养液中，维持诱导物烟酸浓度在0.1％以上。
5、按照权利要求4所述的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，其特征在于：所述添加底物1烟酸到发酵培养液中时，使用含0.5％以上烟酸的水溶液、或含0.5％以上烟酸的发酵培养基、或含0.5％以上烟酸的任何一种缓冲溶液，也可以直接使用烟酸固体；添加方式可通过管道流加、或滴加或直接间歇添加。
6、按照权利要求1所述的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，其特征在于：菌液分离后，回收得到烟酸转化发酵培养液，其方法是：
用盐酸、或硫酸、或其他任意一种有机或无机酸调至pH1-5，低温静置使6-羟基烟酸结晶析出，回收晶体并用酸化水溶液pH1-5洗涤、干燥后为6-羟基烟酸成品；
或通过中性水溶液或缓冲溶液重新溶解晶体，再酸化重结晶予以纯化。
7、按照权利要求1所述的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，其特征在于：底物2，3-氰基吡啶的转化反应，直接使用的菌体是指：
将烟酸转化发酵培养结束后经离心或过滤获得的菌体沉淀；
使用经适当处理的菌体是指：
所述的菌体沉淀经30-90℃加热处理一段时间后所获得的死菌体；或是指前述的菌体沉淀经任意一种已知的固定化方法处理所获得的固定化菌体；也可是指前述的菌体沉淀，通过细胞自溶、或细胞破碎等方法使酶释放到溶液中，通过离心或过滤等方法除去菌体细胞碎片后，所得的细胞酶提取液，或经硫酸铵盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等纯化后的羟基化酶制剂。
8、按照权利要求5或6或7所述的烟酸、氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺，其特征在于：所述底物2，3-氰基吡啶的转化反应条件是，底物2，3-氰基吡啶浓度＞0.1％，pH6-8，温度范围在10-60℃，1-300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，反应时间1-96小时，转化过程中要流加或间歇添加含0.5％以上的3-氰基吡啶水溶液、或含0.5％以上的3-氰基吡啶发酵培养液、或含0.5％以上3-氰基吡啶的任何一种缓冲溶液，也可以直接添加3-氰基吡啶固体，以维持底物2，3-氰基吡啶浓度在0.1％以上；
转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开；
所获转化液用任意一种有机或无机酸调至pH1-6，低温或室温静置使6-羟基3-氰基吡啶结晶析出，回收晶体并用酸化水洗涤、干燥后为成品，
或通过中性水溶液或缓冲溶液重新溶解晶体，再酸化重结晶予以纯化。
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