CN1524875A

CN1524875A - 核基质蛋白结合序列及其应用

Info

Publication number: CN1524875A
Application number: CNA031155286A
Authority: CN
Inventors: 赵慕钧; 答亮; 王遂泉; 李载平
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2003-02-26
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2004-09-01
Anticipated expiration: 2023-02-26
Also published as: WO2004076662A1; CN100480261C

Abstract

本发明提供了新的核基质蛋白结合序列(SAR)，这些SAR源自人，且特异性地与细胞核基质结合。本发明还公开了所述SAR序列的应用，例如用于基因表达载体的构建以及增强外源基因在真核细胞中的表达量和稳定性。

Description

核基质蛋白结合序列及其应用

技术领域

本发明涉及分子细胞生物学和真核基因表达调控领域。具体地涉及新的人核基质蛋白结合序列(SAR)，以及所述SAR序列的应用，包括用于基因表达载体的构建、以及增强外源基因在真核细胞中的表达量和稳定性。

背景技术

在真核生物细胞核内，DNA发生多级折叠包装，经历10nm核小体串珠结构、30nm螺线管结构，进一步折叠形成染色质环状结构。染色质环通过特殊的位点附着在细胞核基质上，这些特殊的DNA区域被称为核基质结合区或核骨架结合区(scaffold associated regions，SAR)。SAR是一种重要的顺式作用元件，SAR在染色质高级结构的形成与变化中起重要作用，并且从染色质水平上对DNA复制，基因的转录起着重要的调控作用。简而言之，核基质蛋白结合序列(SAR)是具有与细胞核基质特异性结合的特征的核苷酸序列。

国外最早由Mirkovitch J等报导了组蛋白基因簇SAR的检测及其特性(Mirkovitch J，et al.，Cell，1984，39：223-232)，发现SAR是富含A、T的DNA序列(A+T＞70％)，长约400～1000 bp，能特异地与核骨架蛋白结合。而后，Cockerill和Garrard报导了免疫球蛋白κ基因的MAR(Garrard W.T.，et al.，Cell，1986，44：273-282)，并发现该MAR/SAR含有拓扑异构酶II的识别位点等。

随着研究的逐步深入，九十年代初Bode J.等人发现，SAR能够增强huIFN-3基因在鼠L细胞中的表达(Bode J，et al.，Biochemistry，1991，30：1264-1270)。

对SAR功能的研究也越来越引起注意。例如发现蓖麻蚕rRNA基因簇的SAR元件对外源基因表达具有增强作用(赵慕钧等，中国科学(C辑)，1998，28(1)：42～49)。但由于SAR在染色体上的跨度较大，需要有基因组序列作为探针，因此SAR的发现和克隆有一定难度。目前报道的SAR序列并不多。

因此，本领域迫切需要开发新的SAR调控序列，尤其是随着人类基因组测序的初步完成，更迫切需要开发人源的SAR调控序列。

发明内容

本发明的目的就是提供新的来源于人的SAR调控序列及其用途。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的核基质蛋白结合序列，它含有SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7或8所示的核苷酸序列。

较佳地，所述的核基质蛋白结合序列具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种载体，它含有本发明的核基质蛋白结合序列。较佳地，所述的核基质蛋白结合序列位于启动子的上游。

在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，它本发明所述的载体。较佳地，所述的宿主细胞是真核细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种提高外源基因的表达强度的方法，该方法包含：

(a)构建从5′至3′依次还有以下元件的构建物：权利要求1所述的核基质蛋白结合序列、启动子序列、外源基因和终止序列；

(b)将步骤(a)的构建物转入宿主细胞，

(c)培养步骤(b)的宿主细胞，从而表达外源基因的编码产物。

在本发明的第五方面，提供了一种本发明核基质蛋白结合序列的用途，它们被用于构建增强外源基因在真核细胞中的表达量和/或稳定性的表达载体。较佳地，所述的表达载体是动植物的转基因载体。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示Southern印迹实验结果证明17个SAR阳性克隆能与7721肝癌细胞和L02肝细胞的总SAR探针杂交。

图2显示Southwestern实验证明SAR与SMMC-7721细胞核基质蛋白的特异性结合。其中，(a).apo基因3’SAR为阳性对照。(b).LPTS cDNA为阴性对照。(c).SAR No.8与核基质蛋白特异性结合。E.coli DNA为非特异性竞争底物，浓度分别为0、10、50μg/ml。

图3显示pLu质粒图谱，SAR插入到该质粒的BamHI-SalI酶切位点之间。

图4显示了SAR元件增强虫萤光素酶相对活力的检测结果。其中，将pLu、pLu-SAR质粒稳定转染CHO细胞，测定转染细胞株的Luciferase活性。以pLu作为对照(Luciferase活性＝1)。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过独特的技术路线和实验方案，检测并克隆人染色体8p23.1区域上的SAR。将克隆到的新的SAR序列在体外组建成真核基因表达载体，并携带外源基因导入真核细胞，获得增强外源基因稳定高效表达的SAR元件，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了8个定位于人染色体8p23.1区域的DNA片段(SAR No.1-8)，其序列SEQ ID NO：1-8所示。这8个SAR都能与核基质蛋白结合，并且此8个DNA片段都能与SMMC-7721细胞(人肝癌细胞株)和L02细胞(人永生化正常肝细胞)的总SAR杂交(见图1)。本发明的实验还证明了这些SAR能与细胞核基质蛋白特异结合(如图2所示)。用本发明所述SAR(SARNo.1-8)构建的真核表达载体，可提高外源基因稳定表达其产物(如图4所示)。

在本发明的一个实施例中，本发明人选择人BAC克隆RP11-177H2(可从CHORI，Children Hospital Oakland Research Institute购得)作为研究材料，该克隆含有162kb的人染色体8p23.1区域的DNA片段。然后通过分离细胞核基质蛋白来沉淀结合在核基质蛋白上的DNA片段，制备细胞总的SAR库。以BAC克隆RP11-177H2的DNA为探针，从总的SAR库中筛选获得8p23.1区域的SAR。DNA-蛋白质体外结合实验证实，上述SAR具有核骨架蛋白特异性结合的活性。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离或纯化的。

本发明的SAR是DNA形式。DNA形式包括基因组DNA或人工合成的DNA。

本发明还涉及所述SAR的变异体。这些变异体可以是天然发生的变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变SAR与核基质蛋白发生结合的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离SAR的核苷酸序列。

本发明中多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人SAR核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的基因组库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的DNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

根据本发明所公开的具体序列(SEQ ID NO：1-8)，可优选应用PCR技术扩增获得本发明的SAR。

本发明也涉及包含本发明的SAR的载体，以及用本发明的载体经基因操作技术产生的宿主细胞，以及用本发明SAR增强外源基因在真核细胞中的表达量和/或稳定性的方法。

本发明的SAR元件可应用于构建真核基因表达载体，并提高外源基因的稳定表达。在一优选例中，将该SAR元件克隆到真核表达载体pLu质粒(见图3中，构建成pLu-SAR表达载体。该载体含有SV40启动子和虫萤光素酶报告基因，将其导入真核细胞，通过检测虫萤光素酶的活力，来确定外源基因的表达高低。将pLu-SAR克隆稳定转化CHO细胞(中国仓鼠卵巢癌细胞)，发现本发明的SAR能增强虫萤光素酶基因表达七倍以上。

本发明主要优点在于：

(1)本发明的SAR序列，是人源的SAR调控元件，用于构建高表达载体，可在人体细胞中应用，适合于人体的转基因治疗研究。

(2)本发明的SAR元件定位于人染色体8p23.1区域，并且从肿瘤细胞中(SMMC-7721肝癌细胞株)分离获得。人染色体8p23.1区域是肝癌发生的高敏感区域。本发明的SAR是在肝癌细胞中有活性的调控元件，因此应用于肿瘤，特别是肝癌的基因治疗，有重要意义。

(3)利用SAR构建的真核表达载体pLu-SAR，将外源基因导入真核细胞并整合到染色体上，SAR能在染色体上增强启动子活力，使基因表达增强。由于外源基因整合在染色体上，随细胞分裂而分配到后代子细胞中，不易丢失，因此SAR增强基因表达的能力具有稳定高效的优点，特别适用于基因治疗，以提高治疗基因的表达。

由于SAR/MAR能结合在核基质上，有利于提高表达蛋白的水平及其稳定性，适用于真核细胞生产基因工程产品，提高质量。因此在基因工程生产和基因治疗中有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：人染色体8p23.1区域SAR的筛选和克隆

a.细胞核基质的制备

首先从市售的肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝细胞株L02分离出核基质蛋白，即分别收集5×10⁷细胞，悬于5ml TM-2溶液(10mM Tris-HCl[pH 7.4]，2mM MgCl₂，0.5mM PMSF)中。冰上放置5分钟，加入0.25ml 10％Triton x-100，混匀，再放置冰上5分钟。通过离心(800rpm×10min，4℃)将细胞核沉淀下来，然后用TM-2溶液洗两次。得到的细胞核用溶液I(10mM NaCl，10mMTris-HCl[pH 7.4]，3mM MgCl₂，0.25M sucrose，0.5mM PMSF)洗两次，再悬于0.6ml溶液I，加入350U DNase I(Takara公司)，于23℃反应2小时。离心，得到的沉淀用溶液II(2M NaCl，10mM EDTA，10mM Tris-HCl[pH 7.4]，0.5mM PMSF)悬浮，再离心后沉淀即为细胞核基质，悬于0.05ml溶液I。

b.人染色体8p23.1区域候选SAR库的建立

选择BAC克隆RP11-177H2(可从CHORI，Children Hospital OaklandResearch Institute购得)作为探针，该克隆含有162kb的人染色体8p23.1区域的DNA片段。将BAC克隆用Csp6I限制性内切酶(Takara公司)完全酶解，在酶解片段的两端装连上PCR接头：

引物1：ACTGAGCTCGAGTATCCATGAACA(SEQ ID NO：9)

引物2：TATGTTCATGG(SEQ ID NO：10)

以PCR接头为引物，DNA小片段混合物为模板，进行PCR扩增。然后将扩增产物与SMMC-7721细胞的核基质做体外结合试验。

向步骤a分离制备的基质蛋白加入0.04mg鲑精DNA，室温温浴并振荡30分钟之后，加入20ng PCR扩增得到的DNA混合物，继续温浴振荡2小时。离心得到的沉淀用蛋白酶K消化过夜，用酚、氯仿抽提去除蛋白，最后乙醇沉淀DNA。筛选得到的DNA混合物装入pMD 18-T载体(Takara公司)，转化E.coli细胞，得到的阳性克隆，即为人染色体8p23.1区域候选的SAR克隆库。

c.Southern点杂交筛选SAR

将实施例1a中得到的核基质蛋白悬液用蛋白酶K消化，经酚、氯仿抽提去除蛋白，最后乙醇沉淀DNA，得到SMMC-7721细胞和L02细胞的总SAR。用[α-³²P]dATP分别标记(随机引物标记试剂盒，Takara公司)两种细胞的总SAR。

用单引物(SEQ ID NO：9)，通过PCR扩增候选SAR库中约80个克隆上的插入片段，将这些PCR产物分别点在尼龙膜上。用前面标记得到的探针通过Southern实验(快速杂交试剂盒，Amersham Life Science公司)，对候选SAR库中所有克隆做进一步筛选，得到的17个阳性克隆(图1)。

对17个阳性克隆全部进行测序，结果获得定位于8个SAR，其序列分别列于SEQ ID NO：1-8。

实施例2：SAR与细胞核基质蛋白的特异性结合

将实施例1a中得到的核基质蛋白进行8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用Bio-Rad公司的蛋白转膜装置，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。采用PCR的方法将地高辛(Roche Applied Science公司)标记到SAR片段上，进行Southwestern杂交实验。杂交反应中，设立的阳性对照为apo基因3’SAR，阴性对照为LPTS基因的cDNA序列。杂交液中用E.coli DNA作为非竞争性底物，浓度分别为0、10和50ug/ml。

实验结果如图2所示，待测的SAR片段与核基质蛋白有强的结合作用，从而鉴定该片段为细胞核基质特异的结合元件，即SAR元件。8个SAR(SEQ ID NO：1-8)都经上述实验验证，具有与核基质蛋白结合的特征。

实施例3：SAR元件增强外源基因在真核细胞中的表达.

本实施例以SAR NO.8为例(SEQ ID NO：8)，证明本发明SAR元件可增强外源基因在真核细胞中的表达。

a.真核表达载体的构建

用实施例2中获得SAR NO.8元件的核苷酸序列，或者用分别带有BamHI和SalI酶切位点且对应于SEQ ID NO：8序列头尾各20个核苷酸序列的引物，以BAC克隆RP11-177H2(可从CHORI购得)为模板，通过PCR扩增获得SAR No.8序列。然后将SAR片段经酶切后插入pLu质粒的BamHI-SalI位点，构建成pLu-SAR真核表达载体。pLu质粒是一种实验室常用的质粒，结构图见图3。pLu质粒含有青霉素抗性基因(Amp^R)和新霉素抗性基因Neo^R作为筛选标记，含有SV40启动子和作为外源基因的虫萤光素酶报告基因(Luc)，通过测定虫萤光素酶的活力来确定外源基因的表达高低。pLu质粒表达Luc的活力很低，因此可以作为对照。

将SAR元件插入到pLu质粒SV40启动子的上游(BamH I和Sal I位点之间)，构建成pLu-SAR质粒。如果该SAR元件能够增强基因的表达，经检测虫萤光素酶的活力就提高。

b.SAR元件增强外源基因在真核细胞中表达活性的检测

将构建的真核表达载体pLu-SAR，以及作为对照的pLu分别转染CHO细胞。CHO细胞培养在6孔板上，细胞数约为2.5×10⁵/孔，加入pLu-SAR质粒2ug/孔，脂质体转染试剂(Invitrogen公司产品)5μl/孔，转染方法按公司提供的操作手册进行。在转染48小时后用0.7mg/mL G418进行筛选，得到抗G418抗性克隆后，，然后检测虫萤光素酶活性。虫萤光素酶的活性用虫萤光素酶检测系统(Promega公司产品)进行测定，方法见Promega公司产品说明书，LB9507荧光计数仪为EG&G Berthold公司产品。

测定结果如图4所示，CHO/pLu-SAR细胞相对荧光强度比CHO/pLu细胞大7倍。这说明SAR No.8应用于构建真核细胞表达载体可显著增强外源基因表达的能力。

用相同的方法测试SAR No：1-7，结果表明它们也可不同程度地增强外源基因表达的能力。

SAR是一种新的在染色体水平调控基因表达的元件。本发明SAR元件的作用位点，可以置于基因5’上游或3’下游，位置可以正向或反向插入启动子的上游，并且没有严格的距离要求。因此，SAR在调控基因表达的途中，应用十分广泛。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>核基质蛋白结合序列及其应用

<130>030712

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>998

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gaattcagct ggagagcaag gatgtcatga ggatgtttaa tggaattttt tgagggtgct 60

tcagtgctgg gaatagcctg gtccagacta tgaagatgtg atttcagcaa ggcgtggtga 120

ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gtcaaagtgg gaggattgtt tgagccaaga 180

gttcgagatc agcctgggca atgtgttgaa actctgtctc taggctgggt acagtggctc 240

atgcctgtaa ttccagcaca ttgggaggcc aaggtgggca gatcacttga ggtcaggagt 300

tcaagaccag cctggccaac atggtgaaat cctgtctcta ctaaaaatac aaaaattacc 360

caggcatggt ggtgtgcacc tgtagtccca gctactctgg aggctgaggc aggagaatca 420

cttgaacctg gcaagtggag gtcacaatga gtggagatca tgccactgca ctccagcctg 480

ggtgacagag tgggactcca tcttaaaaaa aaaaaaaaaa aagaagtaga aactctgtct 540

ctacaaaaaa taaaaataaa aatcttagct gggctcactg gagcatgcct gcggtcccat 600

gtatgggaga cgggaggatc acttgagcac aggaggttga ggcttcagtg agcaatgatt 660

atgcctctgc actccagcct gagcgacagg gtaaaaccct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa 720

ggtaattgca catcctctgc cctccagaaa tctgcaacct acatcacatt actcctaagg 780

ggagttctcc ctgctgcacc ctaacagaca atgtgagcac taaaaggttc cctgaccaac 840

catgtgcagc cactgcagac acacatgaga tgtcttgtgt gtaccacaag tgaggcagga 900

catgtgtcat gttcagaact ttctagaaaa gaaaaggaaa attgccatga atgctctttg 960

gatgttttcc agatagattt ccatggagaa cttgggat 998

<210>2

<211>548

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

agatcgcacc actgcactcc agcctgggtg acagagcaag actccatctc aaaaacaaaa 60

acaaaagaga gaaatgagag aagagcataa gggagagggt gatggggaga agagcagaaa 120

tggacaggaa gaaagagatt agagagattg gtgcgagggg aatgataaga ctgccatgtt 180

cttcctccac cagcagtctc gtgttttatg tttgtttaca acaattacat cagcttaatg 240

gctaccgagc accctctgag tgaggacatg cacacacaca cacacacaca cacacacaca 300

cacacacaca cacaagttat tctaatcctg ccaatgtcca gtggttaccc atggggaaaa 360

tccctcagtc cttgagcata gctggggctt cttcagagca caaggaacag tggaatctca 420

gagtttgaag gagactcaga caccacctaa tttttgctca tccacgcagt cactgacaaa 480

aggctatcat acttattgtc acaggcctcc aaggacagaa gctccttgcc tccattcatg 540

attgagta 548

<210>3

<211>154

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

gaatgtaaga atgtaagcat gaacatataa gacttggaga ttaaatagaa tgcagtggtt 60

tagagacaaa caccagagtt agactgcctg gattttaatc ctggtctgac ttttcatttg 120

tatgacattc ggtaaattgc tgaacatggc tgta 154

<210>4

<211>196

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

gatcaacctt tcaggcaagg acctactttc tggctcacat tttcccttcc gtcaaaggcg 60

ttaccactcg gatgtcttcc tcaatggtgt gttcctgctc cttttgccct tccagttgtc 120

cttcccgaaa ccctgaaaag gtggcttgga gctattgctg ctcctccatg cgtcacctaa 180

tcgtcatctc tgatct 196

<210>5

<211>509

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

cagatcactt gaggtcagga gttcaagacc agcctggcca atgtggtgaa accccatctc 60

tactaaaaat gcaaacatta actgggtgtg gtggtgtgca cctgtaatcc cagctattca 120

ggaggctgag gtaggagaat tgcttgaacc cagaaggcgg aggctgcagt gagctgagat 180

cacgccactg cactccagcc tgggcaacag agtgagactt gctctcaaaa aaaaaaaaaa 240

aaagtttatt ctcagtcaga tcatgtaaat aaactccatt ctattgtttt agaatgatca 300

tgaccaagaa gaacccaagt tacttataac agctctttca gtaaaagaat cgcaaaataa 360

ttatcattga cattatttaa aactctgcgg taacatctga ttgcatcagt gtcgtttagc 420

aacaggttga ctcttaagtc ggacaagttc atttatacat acgcagtgtt cttgttcatg 480

aatccttaag aataatacca aatgctgta 509

<210>6

<211>418

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

tactgagcat ttgcgatgtg tgcttccacc gaggagggac gggagtcact agaggcttca 60

gatgctttag ctgcagctgg atgttgaaaa acagagtctt gttatgaatt aattttgact 120

tttctggtgg gtgttgaaaa ataagctgag gatctaaaaa ggggggattt tggctgggca 180

tgatggctca tgcctgtcat cccagcactt tggaaggctg aggcaggcag atcacgaggt 240

caggaattca agaccagact ggccaacata gtgaaacccc atctctacta aaaatacaaa 300

aaattagcca ggtgtggtgg tgcgcacttg taatcccagt tactcgggag gctgaggcag 360

gagaatcaca tgaacttggg aagcggaggc tgcagtgagc caagattgcg cctttgta 418

<210>7

<211>317

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

gatcacttga gcccaggagg tcgagactgc agtgagccat gtttgtgcca ttgcactcca 60

gcctgggtga cagagcaaga ccctgcttca gaaaaaagaa agtctttttc aaaaatgcca 120

agtgctcctc acgtgatact agggaaccca gtcctggtca ggagggtagc ttccatcctc 180

tctccgatga gggactggca ccagcaggcc ccgtcctctg aagagccatc cctaaggctc 240

ctgagccact ttttacctgc tcctgtgact gtcacccagg accaacaggc tccaggatgt 300

gccacaggaa ggtgtgt 317

<210>8

<211>1215

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

tactgaggag ccctatttcc ctgtcttgca aatgattgca tttgaggcct ggaaaggccg 60

gtgacttgtc ctagatcaca tgttctgtca gttgtgcttc caatcttctg acagccaggt 120

cattgccact tatactatct taaattgagt acccgttttc tgtcctttgc tagctgatat 180

tttatagcag tgccactcaa attatggtcc atagacaaga taaagacaga aattaagagt 240

aagcatttag aagcttttct agtagtttga caatatttta ggacttgggt tttagatgtc 300

ttttttaaaa cttcattttt ctgctaactt ttttaacttt ataaaaatct tgccctgtaa 360

tcctgtaatg gattcaaaat ttttaaaggc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420

ccacaaaaca gacagaacta atcctttacc cctgatagtt tgagaagcag catgctggag 480

ggcattgaat ttctggtggt tgggtgggtt cagaactgca agcaatgctt tgttgccagc 540

gaggcaggtc ttgcttcaag aacctttttg gattctgaac atgcagggag acagtctttc 600

ttgtactttt tcacttaagt tttcaatata ttttttgttt ataaaataaa aacttacagc 660

ttgtgtaaaa caagagaaga ggttatagga ttatatattt aatagcagta acaattttta 720

ttttttatga gctccttgga attacagtct cagtgtaact ggttagggtt tttcttgagt 780

agaattggct ttgtagttgg tttgttgttg tttagttttt gtctatgcta aaaataagtt 840

gtgccggtat attgcctttt ttttattgtg ataagaacac tgtctgatgt attattttat 900

atcatttact cttttaacat gactaatttc ggaattttat ttattcttac taatttcggt 960

atcttttaaa catagaatga ctttgctttg ccaaatttac tcctaaaaat atttctcaaa 1020

tatttttatt tgctacattg atttctggtg aaagaaagag tatgtgaaaa tattagcctt 1080

atgtagttta taagaattga aagacgagac tttttttgtt agtcaactat attcacctaa 1140

tttacctttc ttttataaac aatcatgact acttaattat tccatgtaac tatgcatacc 1200

ctattcctag tttca 1215

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>9

actgagctcg agtatccatg aaca 24

<210>10

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(11)

<223>引物

<400>10

tatgttcatg g 11

Claims

1.一种分离的核基质蛋白结合序列，其特征在于，它含有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的核基质蛋白结合序列，其特征在于，具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7或8所示的核苷酸序列。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的核基质蛋白结合序列。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的核基质蛋白结合序列位于启动子的上游。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是真核细胞。

7.一种提高外源基因的表达强度的方法，其特征在于，该方法包含：

(b)将步骤(a)的构建物转入宿主细胞，

(c)培养步骤(b)的宿主细胞，从而表达外源基因的编码产物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是真核细胞。

9.一种权利要求1所述的核基质蛋白结合序列的用途，其特征在于，用于构建增强外源基因在真核细胞中的表达量和/或稳定性的表达载体。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的表达载体是动植物的转基因载体。