CN1661069A - 血管紧张素i转换酶基因与原发性高血压的相关性 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的血管紧张素I转换酶基因ACE、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患原发性高血压的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。

Description

血管紧张素I转换酶基因与原发性高血压的相关性

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及血管紧张素I转换酶基因(angiotensin I converting enzyme，ACE)的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其与原发性高血压的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。

背景技术

高血压是指收缩压或舒张压升高的一组临床症侯群。血压的升高与冠心病、肾功能障碍、高血压心脏病及高血压并发脑卒中的发生存在明显的因果关系。高血压最新的诊断标准是收缩压≥19kpa(140mmHg)或舒张压≥12kpa(90mmHg)，符合其中一项者可确诊为高血压。

大多数的高血压患者在血压升高早期仅有轻微的自觉症状，如头痛、头晕、失眠、耳鸣、烦燥、工作和学习精力不易集中并容易出现疲劳等。随着病情的发展，特别是出现并发症时，症状逐渐增多并明显，如手指麻木和僵硬、多走路时出现下肢疼痛，或出现颈背部肌肉酸痛紧张感。当出现心慌、气促、胸闷、心前区疼痛时表明心脏已受累，出现夜间尿频、多尿、尿液清淡时表明肾脏受累、肾小动脉发生硬化。如果高血压患者突然出现神志不清、呼吸深沉不规则、大小便失禁等提示可能发生脑出血，如果是逐渐出现一侧肢体活动不便、麻木甚至麻痹，应当怀疑是否有脑血栓的形成。

高血压早期无明显异常体征出现。当脑、心、肾等重要器官出现轻度损害时可有异常的体征出现。常见的心脏异常表现有心尖搏动左移、心前区有抬举样搏动感，听诊心尖区第一心音增强、主动脉瓣区第二心音增强且有收缩期杂音和舒张期杂音，表明已发生动脉硬化和左心室肥厚，如果在心尖区听及奔马样心律可能表明有心力衰竭的出现。另外还常见耳垂出现折痕、毛细血管搏动、桡动脉出现硬脉或无脉及下肢间歇性跛行等。

此外，由于某些诱发因素或高血压本身的发展，可导致一些高血压患者血压显著或急骤升高，同时伴有脑、心、肾、视网膜等重要器官功能损害，严重危及生命，出现一系列临床特殊征象，称为高血压急症。高血压急症的发病率占高血压人群的5％，常见有高血压脑病、脑出血、急性左心衰竭、可乐宁急性停药综合征、急性心肌梗塞、急进型恶性高血压等。

高血压患者中约5％左右无自觉症状，也不知道血压何时升高，更不知道什么时候已产生了血管和器官损害的并发症，有些患者甚至在发生了心血管意外之后才知道自己患有高血压。所以，找出高血压发病的遗传原因，及早的进行预防以及检测，可以有效控制高血压的发病，将疾病对人体的伤害减到最小。

原发性高血压(essential hypertension，EH)也叫高血压病，是一种独立的疾病，有着自己的病因、发生发展转归的规律和临床表现。临床上主要表现为动脉血压的升高。占人群高血压患者的90％以上，目前发病机理尚未完全明了，主要依据排除了其他疾病导致的高血压后才能诊断为原发性高血压(高血压病)。动脉血压的升高主要是因外周小动脉阻力增高所致，同时有不同程度的血容量和心输出量的增加。晚期常导致心、脑、肾等脏器受累发生高血压心脏病、心力衰竭、肾功能障碍、脑出血等严重并发症。原发性高血压的治疗主要是降低血压同时防止并发症的发生。原发性高血压患者致死原因为脑血管意外、心血管意外和肾功能不全，我国以脑血管意外为多见，心力衰竭和尿毒症次之，而欧美国家以心力衰竭多见，脑血管意外和尿毒症次之。

原发性高血压作为最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。

虽然已有许多关于各种基因多态性与原发性高血压的研究，但没有证实ACE基因与原发性高血压相关性的报道，更没有证实ACE基因的SNP与原发性高血压相关性的报道。

综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻找原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)高血压的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗高血压的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗高血压的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的ACE基因、转录本和/或蛋白，并与正常的ACE基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，所述的方法中检测的是ACE的基因或转录本，并与正常ACE核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

4504位G→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在血管紧张素I转换酶基因ACE的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)用ACE基因特异性引物扩增样品的ACE基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

4504位G→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ IDNO：1中第4504位。

在本发明的第三方面，提供了一种检测高血压的试剂盒，它包括特异性扩增ACE基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第4504位的扩增产物。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第4504位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第4504位的突变限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

4504位G→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的ACE蛋白抑制剂以及药学上可接受的载体。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了ACE基因的部分SNP与高血压密切相关，而且发现了它的新功能：ACE的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在ACE第4504位的SNP(4504位G→C)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，因此可作为检测高血压的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。

ACE基因

血管紧张素I转换酶基因(angiotensin I converting enzyme，ACE)的详细序列可参见登录号为AF118569的核苷酸序列(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO：1所示。

血管紧张素I转换酶基因所编码的血管紧张素I转换酶(也称为“血管紧张素转换酶”)，具有促进血管紧张素I转化为具有活性的磷酸化多肽血管紧缩素II。血管紧张素II是一种有效的血管升压和醛固酮类激活的多肽，它可以控制血压以及流动电平衡。这个基因在肾素-血管紧张素(RAS)的系统中起着关键的作用。

RAS是肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin-System)的英文缩写，其主要功能是调节人体血压、水分、电解质和保持人体内环境的稳定性。RAS既存在于循环系统中，也存在于血管壁、心脏、中枢、肾脏和肾上腺等组织中，共同参与对靶器官的调节。血循环中肾素主要来自肾脏，它可把主要来源于肝脏的血管紧张素原转化为血管紧张素I，再在血管紧张素转化酶的作用下转化为血管紧张素II(AngII)，然后通过组织中血管紧张素II受体而发挥作用。许多组织中存在局部RAS，在相应器官、组织、细胞的功能调节中起着重要作用。如果紧张素II的生成过多，在循环中就表现为高血压。在组织中则引起结构重塑，当某个器官的组织结构重塑发展到一定程度，这个器官就无法发挥正常的生理功能了，在临床就会表现出相应的症状如心脏的心肌梗塞，肾脏的尿毒症，脑部的卒中，眼睛的失明等等。因此，血管紧张素II不仅是造成高血压的原因，也是造成心、脑、肾等器官损害的直接原因。

已经进行了的许多试验关注于该基因内部一个287bp Alu重复序列的存在与否，与心血管的病理生理学的相关性上。2002年，Procopciuc等人在ACE基因的2号外显子上发现了一个SNP，M235T(Procopciuc et al.J Cell Mol Med.2002Apr-Jun；6(2)：245-50)。这个SNP导致了一个从甲硫氨酸到苏氨酸的转变。在38个原发性高血压病人和21个正常血压的人的对照中，他们发现，M235T在病人人群中为81.57％，而在正常对照中为66.66％。由于M235T在病人人群和正常人群对照比较中存在频率差异，说明了ACE基因是高血压的候选基因。

动物试验表明，ACE基因缺失的老鼠具有低血压，肾功能紊乱，雌性不育等表型(Ramaraj et al.J.Clin.Invest.102：371-378，1998)。

本发明人对ACE基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与高血压易感性并不相关，然而关联研究表明4504位G→C却是与高血压易感性关联性非常高的SNP。该SNP位于ACE的第2号内含子，提示对ACE的转录后的剪接过程有影响，进而导致影响ACE的活性，并最终导致携带者的高血压易感性明显高于正常人群。

基于本发明的新发现，ACE蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进ACE蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人ACE蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人ACE蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人ACE DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ACE基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ACE基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ACE蛋白的分子，也包括那些并不影响人ACE蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人ACE基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人ACE蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人ACE蛋白功能的抗体以及不影响人ACE蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ACE基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人ACE基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人ACE蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人ACE蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗ACE抗体是不识别正常ACE但识别突变ACE的抗体，或者识别正常ACE但不识别突变ACE的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。

利用本发明ACE蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与ACE蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明ACE蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

正常的ACE抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，用于高血压治疗。在使用本发明ACE蛋白抑制剂时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明ACE蛋白抑制剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的ACE蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人ACE蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于ACE蛋白的无表达或异常/无活性的ACE蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带ACE基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人ACE基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还涉及定量和定位检测人ACE蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在ACE蛋白的方法是利用ACE蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与ACE蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在ACE蛋白。

ACE蛋白的多聚核苷酸可用于ACE蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，ACE蛋白的多聚核苷酸可用于检测ACE蛋白的表达与否或在疾病状态下ACE蛋白的异常表达。如ACE DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断ACE蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用ACE蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测ACE蛋白的转录产物。

检测ACE基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。ACE蛋白突变的形式包括与正常野生型ACE DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用ACE基因特异性引物扩增样品的ACE基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：4504位G→C，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

应理解，在本发明首次揭示了ACE基因的SNP与高血压的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在4504位G→C。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：2和3的序列。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO：1中第4504位。

由于本发明的SNP与高血压具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期较准确地诊断原发性高血压，而且可以未雨绸缪地使携带者在未发病前就采取合理的预防措施(如在饮食上采取相应控制)，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.1研究对象

由于血压是多基因参与的受多种环境因素影响的数量性状，必然在分析相关基因时要考虑遗传异质性的问题。选择遗传背景相对比较单一的隔离人群作为研究多基因疾病的材料将有助于降低遗传异质性的影响，同时由于这些群体具有比较固定的生活环境和较为一致的生活习惯使得环境因素的影响大大降低。选择这样的群体，不论是用于连锁不平衡分析，还是从中选取家系进行家系分析，都有助于提高高血压易感基因位点的检测灵敏度。因此在本实施例中选定隔离群体作为研究对象(隔离群体具有遗传背景的相对一致性，奠基者数目比较少的优点)。

在知情同意的基础上随机收集了324个年龄在50岁以上的汉族个体，均来自于安徽省岳西县大别山响肠镇。80％的个体只有6个姓，奠基者数目应该比较少，并且同一性别的个体来自于同一个奠基者。选用的高血压样本要求收缩压不低于140mmHg，舒张压不低于90mmHg，测量血压两次取平均值。

挑选其中的11％位于血压分布的最顶端(37例个体；SBP＞178mmHg)和有7％位于血压分布的最底端的(22个个体；SBP＜104mmHg)共59个个体，通过直接测序的方法进行SNP的检测。

1.2实验方法和结果

1.2.1 DNA提取

用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。

1.2.2 PCR及测序引物的设计

根据GenBank中ACE的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。

             表1 引物序列表

引物名称	序列(5′-3′)	SEQ ID NO：
			有义引物	tgacccagaccctgactttc	2
反义引物	agggcaatgtgggaacacta	3

1.2.3 ACE基因的PCR扩增

以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。

结果，获得390bp的扩增产物。

1.2.4 SNP的发现和检测

PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。

结果，发现存在以下SNP：4504位G→C。

1.2.5 SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在高血压病人和正常血压对照组中进行分型和关联分析。

等位基因的频率统计出来以后进行卡方检验，通过对血压最高的11％和最低的7％个体数据进行比较，初步确定是否等位基因的频率和血压水平连锁。

结果发现SEQ ID NO：1中4504位的C型SNP在高血压个体中的频率为53.1％，而在低血压人群中的频率为37.5％。两者之间的频率差为15.6％，证实了SEQ IDNO：1中4504位的G/C型SNP与高血压的发生存在着相关性。

实施例2

原发性高血压易感性检测试剂盒

如实施例1所述，SEQ ID NO：1中4504位G→C的突变与高血压疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计ACE基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

名称	序列	浓度
			有义引物	SEQ ID NO：2	100pmol
反义引物	SEQ ID NO：3	100pmol
			PCR反应液	含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液

抽取待检测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出4504位G→C。

检测结果，含4504位G→C的检测对象的高血压易感性高于正常人群。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                 序列表

<110>复旦大学

     上海人类基因组研究中心

<120>血管紧张素I转换酶基因与原发性高血压的相关性

<130>040157

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>24070

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

tgcccagaca gccttatctc tttcctacct ttcaaggtta ttgtaaatac caaattagat      60

tgtttataca caagaattta gcactaaagc actatacaaa tgtaagctat ttatttctat     120

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cggccgccct gagcccctcc agcacctccc ggaggcgcct gcaagacacc taaggtcccc    2100

gcctccctcc tctccccccc gccacacccc tacccccggc aggcgacgtc cccgcccctc    2160

gaccatggcc tggtgaagaa gccggccagg cccgatcagc cccatccccg ccgcacgagc    2220

ggcgcctgcg gacagctcct ggggccccgg ccttgtcact ccggaggcgg gaggctccgg    2280

ggggtcgggc tgggaagatc gagccggagg ccgctaggct cccaggcccc ggccgaggct    2340

gcgcggccgc acggtgggca ggctcgggtg ttccggcaaa ctgccgggtc cccatcttca    2400

aaagagagga ggccctttct ccagcttcct ctgcgggagc ccgacccagc cccatcccgc    2460

cacccccggg ctgcacctcg gcccctcccc ggcccgcgcc cctgcccggg gcgggccagg    2520

aacctcggcc cgcgccgctg gggactttgg agcggaggag gaagcgcggc ggggcggggg    2580

cgggggtgtg tcgggtttta taacccgcag ggcggccgcg gcgcaggaga aggggcagag    2640

ccgagcaccg cgcaccgggt catgggggcc gcctcgggcc gccgggggcc ggggctgctg    2700

ctgcccctgc cgctgctgtt gctgctgccg ccgcagcccg ccctggcgtt ggaccccggg    2760

ctgcagcccg gcaacttttc tgctgacgag gccggggcgc agctcttcgc gcagagctac    2820

aactccagcg ccgaacaggt gctgttccag agcgtggccg ccagctgggc gcacgacacc    2880

aacatcaccg cggagaatgc aaggcgccag gtgggcgccc gggcccgggc gggggcgggg    2940

cggggccgcg gcggccaatc acagcacgcg gccggcttgt ggggcgggca ggctggcgcc    3000

cccgacccga accccacccc gaccccggac cctcgccccg acagtcagcc gcggggcccg    3060

agcgccgggc tgcgcgcacg gcctacgctc ccagcatgca cgagttggat ggatgaaggt    3120

ggctgctccc aggccgcgcc cgccttcgcc gaaggtgctg ggcttggctc tggggccccc    3180

gcgctctcgg gcagctgcct tctcacctcc ggacgctgtc gctgtcaccg tcaccgcact    3240

gcactgtcca tccaccctcc actcgcccgg cctcttttct ggtcccaatt tctgctccac    3300

cattcccatg aggcagattc cctccagaag gaggaagcgc ggcttccgca aactaaggtc    3360

tcccgcaggg atctccccag ggcccgggct ctggaagccc ttggccttcc tcccctcccc    3420

cagcaccgtg gcttctcctt tatggcctgc atctaagcag ggtcctacac cctccctgcc    3480

ctcctggtgc ccaataggag gaagcagccc tgctcagcca ggagtttgcg gaggcctggg    3540

gccagaaggc caaggagctg tatgaaccga tctggcagaa cttcacggac ccgcagctgc    3600

gcaggatcat cggagctgtg cgcaccctgg gctctgccaa cctgcccctg gctaagcggc    3660

agcaggtggg ctgagggctg aggcagagct cgggggcggc ctcctagtgc cccatcgtgg    3720

gggtcggggg agagcagccc atcagggagg gaggaaccct gggatccaca tgggccctga    3780

cagaagggaa agcccaggta agcacagaat ggctttctga gcattgattt ttcttggaga    3840

tggggtgggg agttactttc tgttaaagga agcattctgg agtaggaagc caaattcaaa    3900

tacacttctc cctaggctgg tttatgagct tctttggaag agttgagaag ggctgggcgt    3960

ggtggctcaa gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggtgggcgca tcgcttgagc    4020

ccaggagttc aagaccagcc tggccaacat ggcaaaacct cgtctctaca aaaaaaaaat    4080

agctgggctt ggtggtgcgt gcacctacag tcccagctac tcttgaaact gagggggaag    4140

gatcacctga gcccaggagg tcaaggctac agtgagctgt gattgcacta ctgcacccca    4200

gcctgcgtga cagagtgaga cctcccccca aaaaaaagag agagagaaaa ggttgagaaa    4260

gactgggaag tcaccaaagc cagagaatgg gagggatctg ccctcactgc agggtggtgc    4320

caagctggga cttgacccag accctgactt tcaggactcc tgtcccccac tccacaggct    4380

gcctccactg gcaggggact cagaagtgat ccggtcacac taagtgacac ttagtgatca    4440

gaagtgcccc ggtgccactg agtggccttg tccaagctac atccactctg tgggctcctc    4500

cttgtagcag cgaggggagg gcagatgtcc caggggctgg tcactggagc attcctcccc    4560

tctgactccc cagtacaacg ccctgctaag caacatgagc aggatctact ccaccgccaa    4620

ggtctgcctc cccaacaaga ctgccacctg ctggtccctg gacccaggta cggcccttgc    4680

agctcccctc tcggcggtgc cctagtgttc ccacattgcc ctgctgcact ccggaccatg    4740

cagttgtgta gggtctgtgg agacagcagg taaacccaaa ggtgttgccc tccaactggg    4800

gctggacggt gcagataccc ccacgccctg cttctcttgg caagtggact tccggaatct    4860

ccagctgcag cccccacttc tgtgtgtacc tcggcctctc ccatcacccc taggccttcc    4920

tcctggctgc ctggtttccc ctttcgtggg tcctctcatg ttccccaaga gccctcaggc    4980

cagggacccc tcgtggcttc cccttaaacc ccgctccagc cccctttatg agcagcttcg    6040

aggaaggcac tccatccaat aggccgctaa gtgtctgtct gggttttggc ctttgggtgt    5100

ccccttggtg tcagccacct taggtggtca tgtctctggg gcaggggccc tgcctgggtg    5160

tttctgtagc tcccagcccc ctcccaccag gcctgtaggt ggcccctgtc tctgggggca    5220

ccgtgatgtt caggaagctg gtgggagcag taaggactgg tgcaggctct ggtgaaggcc    5280

gttgaagact tcaacgtgga ggcctcctca ccgaccctgc ctgcctgtgt ctcagatctc    5340

accaacatcc tggcttcctc gcgaagctac gccatgctcc tgtttgcctg ggagggctgg    5400

cacaacgctg cgggcatccc gctgaaaccg ctgtacgagg atttcactgc cctcagcaat    5460

gaagcctaca agcaggacgg tgagcaggcc tctccctgtc caggaaccac gccaggtgtc    5520

ctctctcagc tgtctcccca gagtcccagc ccagagtcag gcagagcagc tggtatgaca    5580

attccagcag gccctgagtt tcccagaaag tggaggtggg accggcctgc acccagtgtg    5640

cctggacttt gctgctggcc tgccccacgt ggccatcctg ctgtcactcc tggccctgat    5700

gctcctcttt gcctctggga acctccagga tctgtttagc tggctgtagc taattagaaa    5760

ttgtagagtg gcaaccccca agccaatttt ccagctagct gcagatccac gggcctcgag    5820

ccagtggaag agccgactta cagctgagag gctgaggtcc gagcctttgg cctgagctac    5880

atacctcacc cccacgcccc caggcttcac agacacgggg gcctactggc gctcctggta    5940

caactccccc accttcgagg acgatctgga acacctctac caacagctag agcccctcta    6000

cctgaacctc catgccttcg tccgccgcgc actgcatcgc cgatacggag acagatacat    6060

caacctcagg ggacccatcc ctgctcatct gctgggtaag gacctggcct cgcctccaca    6120

tgagtcccac ggaagtgtgg gtcccgaggt aggggtgggg gatgtccagg gtaagggaag    6180

gtgggttgtg accctcacat ctcacatgtg tggggcatca tactgtttgc ttcacatgca    6240

ggagaccatt cgtgttccca ctttacaggt ggggaccctg aggcttaggg tcgtgaggga    6300

cttagtggtc agagagctag gggccaaacc aaaggctctg gccctgggtc cagtggggga    6360

gccatcagcc tagctcatgc ccaaggaaac aagcactgtg gccctgcctc aggattgagt    6420

ggctggggcc tggcacagcc agaaatgaca gtggcagcat cttgcagccc caggacatgt    6480

ggccctcgga ggagtgtggg tgggactgat gtgtgagatt tctggcccta agccaggcct    6540

gcagcccttg agggccccag ggtacaggtg ccggccccag ggtgccactc agcgatgcat    6600

gaagaagcag gcacagccag gcagggagcc aagctgtccc cttccttcct tatctaggag    6660

acatgtgggc ccagagctgg gaaaacatct acgacatggt ggtgcctttc ccagacaagc    6720

ccaacctcga tgtcaccagt actatgctgc agcaggtaag ctctgggctc aagcctgggg    6780

tggtgggggt cgggggtggg gcgcaaaaaa agggagtcac agatgggcac aggggcggga    6840

aggtttcggg tactgagcag cagcctggtg tgtctgtagg agcagtgagc tggggtcggc    6900

cccctcagtg aggtgccagc tcctccctcc aggctccaca gtggcaggat gagagcaaca    6960

acgcactttc actcatctgc tgtgggagtg agggccctgc ctctgggaat ggtggccaca    7020

gagcagagaa gctttcatgc acagggagtt gacccgagat ggggacccca gccctgtccc    7080

caggccagcc agagtgggct ccccctgacc tggctccaca cccctcctcc agggctggaa    7140

cgccacgcac atgttccggg tggcagagga gttcttcacc tccctggagc tctcccccat    7200

gcctcccgag ttctgggaag ggtcgatgct ggagaagccg gccgacgggc gggaagtggt    7260

gtgccacgcc tcggcttggg acttctacaa caggaaagac ttcaggttca gacatgggaa    7320

gagcacgttc tggggttccc cggttctggg gcccggggaa aggcaggcag cccaggcgca    7380

gggaagctgg ttcccaggcc tgcctctacc ctaccccagc actggttgga ggctgggtct    7440

gttccagggc tagggggtat aggaggccta ttagtccacc ttctctggca gctttgacaa    7500

atagtcactt ctataccttg gaatggagga agaaggccca agtggtggtg agccagggca    7560

gggtaaagaa tttgcttgtt tctgccaggc acggtggtca cacctgtaat cccagcactt    7620

tgggaggtca aggcgggtgg atcacctgag gccaggagtt cgagaccagc ctggccaaca    7680

tggcgaaacc ccgtctctac taaaaataca aaaataaatt agccaggggt gatggcgggc     7740

gcctgtaatc ccagctactc aggaggctga ggcaggagaa tctcttgaac ccgggaggcg     7800

gaggttgcag tgagctgaga ttgtgccact gcaggccagc ctgtgcaaaa gagtgagacg     7860

ctgtctcaaa aaaaaaaaga aaaaaagaag ttacttgttt ctactgcggc ttcatgcccc     7920

agggcagctc cctcctcatt cctgtctttc aggtgccaat ctgccctgtg ccctggccct     7980

gccctgttct gtccatccgt cactctcacc ctcgccctct ctacgcccca ggatcaagca     8040

gtgcacacgg gtcacgatgg accagctctc cacagtgcac catgagatgg gccatataca     8100

gtactacctg cagtacaagg atctgcccgt ctccctgcgt cggggggcca accccggctt     8160

ccatgaggcc attggggacg tgctggcgct ctcggtctcc actcctgaac atctgcacaa     8220

aatcggcctg ctggaccgtg tcaccaatga cacgggtatg ggagggctga gaggccccca     8280

cccagcctca cctaaacccc gctccacccc acagcaggac ctcacttgcc ccactcagct     8340

ctgcccttct ttctgcctcc cggccccagg tcaggcaggg ttcgggatcc tcctagagcc     8400

tcacggtgca cactgcgccc agctcagcac acctgggggt cctcttccaa gcagggccca     8460

gggtctcgag ggccagccat accttctctg catctccctg gcctcacttt ctgctgcccc     8520

gccagcccac actcttaggg gaccctcttc tccctctgac ctcttccctc tcctttcatc     8580

tcatctccca acagaaagtg acatcaatta cttgctaaaa atggcactgg aaaaaattgc     8640

cttcctgccc tttggctact tggtggacca gtggcgctgg ggggtcttta gtgggcgtac     8700

ccccccttcc cgctacaact tcgactggtg gtatcttcgg tgagaggagg gatagaaaag     8760

ccttcgcccc agctagccct ccccagcctc ctggacagcc aggcgcctcc tgccccagcc     8820

agttctagcc tctcctctct aatgatgtcc cccgctgtga cccaccgcct tctcctttcc     8880

tgcctgaaac tccctcttcc aggaagtctt ccccagttcc tcaggatggg gaagggttgc     8940

cgggtggaaa tgccttttct acaaaagcta aatccatctg tttgcaacct ctaggcccta     9000

agacaattta accatccttt tccagaacca agtatcaggg gatctgtcct cctgttaccc     9060

gaaacgaaac ccactttgat gctggagcta agtttcatgt tccaaatgtg acaccataca     9120

tcaggtatta gcgcccccac cccacccacc cccagtactg tcacaccctc aatccacttc     9180

tcctcctgtg atcctagctg cctcatcccc agggcttgtc cccatgctcc tccagacctc     9240

aaaggcctgg agttagagtg gcccactctc ctgagcctgt cttgggtctc ccttctcccc     9300

caagatagct tctggtccag cctctgccct gcaggaagct ggatggtgcc tgggtaagga     9360

acccctgttc ctggcccccc atgatcttcc ctgactccca ccctgtgcct gcaggtactt     9420

tgtgagtttt gtcctgcagt tccagttcca tgaagccctg tgcaaggagg caggctatga     9480

gggcccactg caccagtgtg acatctaccg gtccaccaag gcaggggcca agctccggtg     9540

tgtggtggga agccggggga agtgggaggc agagaggagc ggctggcaaa gggtgtggca     9600

ggaggtgtct ggctgctctg atggggtggg gggcaccaac cacagagctg gactgatgtg     9660

gatgcctgtc tcctcgctat gtcatcaaat atttattgag tgggccttct ggctggcatg     9720

gggcgacaca aatgccccct gccaccatca gagagatccc aggccccagg gtcttattgc     9780

cacagtttct gcagtccatt ggggggcgga agtggccagg ggcatgtggg ccggggtcca     9840

ggagcagact ccagcctgag tcccctgtgc ccatggtacc cactctgccc accaggaagg     9900

tgctgcaggc tggctcctcc aggccctggc aggaggtgct gaaggacatg gtcggcttag     9960

atgccctgga tgcccagccg ctgctcaagt acttccagcc agtcacccag tggctgcagg    10020

agcagaacca gcagaacggc gaggtcctgg gctggcccga gtaccagtgg cacccgccgt    10080

tgcctgacaa ctacccggag ggcataggta aagccctgag tgaggatggt gtggggctaa    10140

ggtgggtcct caactctggg cttggcccag gccccaggtt cctggtcagc tcctaccagc    10200

tgagccctgg taccctgtcc tggagggcca ggcagccccc caagctcatc agcagggcct    10260

gcgagtgggg acaggcatgt ctttccccca gcatcctaga gagggtgtgc tcagacctga    10320

gggcccctcc ccttccagag gaagccagac acaaggctct gtgaggtcac actgcgggct    10380

ccgctcttat tggccagggg acggtagctg caggactctg ctctcctgcg gccatgggcc    10440

agggttgggc tactgcagga cttcccagcc tcctcttcct gctgctctgc tacgggcacc    10500

ctctgctggt ccccagccag gaggcatccc aacaggtgac agtcacccat gggacaagca    10560

gccaggcaac aaccagcagc cagacaacca cccaccaggc gacggcccac cagacatcag    10620

cccagagccc aagtgggacc atgcagggga ggggcagggt gccaggggtg ggagaggcgg    10680

ggccgggtag ggacagggca gggtacaagg gagtgcgaga gggataatgg cttctggtga    10740

gaccacaaac ctggagaggg gaggcagagg tttgtctgtt tccctgcact ctgtcccaca    10800

gacctggtga ctgatgaggc tgaggccagc aagtttgtgg aggaatatga ccggacatcc    10860

caggtggtgt ggaacgagta tgccgaggcc aactggaact acaacaccaa catcaccaca    10920

gagaccagca agattctggt gggagccacc tccccacccc caaacctgag catgtgcata    10980

cacacagaga tgctgtcccg ctcaccacac agtggggctg ccaccacatt ttaaattgaa    11040

tatttaaaac aatactcaat ttcgggccgg gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca    11100

ctttgggagg gggaggcggg cggatcacga ggtcagatca agaccatcct ggctaacacg    11160

gtgaaacccc atctctagta aaaatacaaa aattagccgg gtgtggtggc gagcacctgt    11220

agtcccagta ctcaggaggc tgaggcagga gaatggcatg aacccgggag gcagagcttg    11280

cagtgagccg agatggcacc actgcactcc agcctgggcg acagagcgag actccatcaa    11340

aaaaaaaaaa aaaaaaaact caatttcaga ttttgatgaa catttactca atgcctgagc    11400

aattcttctt tccttaaaaa tcagtctctg ggaggcctag gtgggaggat cacttgaagc    11460

caggagttgg agactagcct gggcaacata gcaagatccc atctctattc aaacaaacaa    11520

ataaacaaaa atcaatctct agtaacagaa taatttgtac ataaataagt ggtgctcaag    11580

tcgtttttta aaagattgaa agcctctgtt tgtctcctct acaaaagggg ctacacttcc    11640

tctttaccct cattccctgc ctatttggct gagcacaaat tatgccactg agccacacac    11700

tgttactgtt ccttggcact ttgatctgtt gcctcatctt tttctcaaca gccttgcaaa    11760

attggtgagc ttattcccat tttacagatg ggatttgata ttaactctga ggttcagaaa    11820

ggccacagag ctaataccaa gctggctcct tcctaagggc ctttaagaca cttgggggtc    11880

ttctcttctc tgcccctgcc tggatatgtg ttgcttgacc gcaggcatcc agggagggtg    11940

agtactgcat ccaggacgtt atcagcgtcc agcttgcaga gagtcttata ggcaaaggtt    12000

gcaacttaat tccactgccc cctcaccacc acctccagcc ctcagctccc acttggggcc    12060

tcccgctcag aggctgctct ggagctcctg ggccctgtga caccatcccc ctgtgccctc    12120

agctgcagaa gaacatgcaa atagccaacc acaccctgaa gtacggcacc caggccagga    12180

agtttgatgt gaaccagttg cagaacacca ctatcaagcg gatcataaag aaggttcagg    12240

acctagaacg ggcagcactg cctgcccagg agctggagga ggtgtgtggc tcgcaaggta    12300

cagggagagg ggaatcctgg ggcagtgagc ccaacacagg gtctggcctg gccttcacgc    12360

tgcttcctct tcctcgttgt atcaagtcat ggcatctgcc atgcgatgtg cacctcagaa    12420

ctgctgagag ggcagcgctc cccagctccc tggctcccca cctgccagcc catggggcct    12480

gggggtagtg caggccccag agagaccaag tgcaaaggag tacagctcat tgcctctcct    12540

tcctcctgca gtacaacaag atcctgttgg atatggaaac cacctacagc gtggccactg    12600

tgtgccaccc gaatggcagc tgcctgcagc tcgagccagg tgagagctca tgtgcaggct    12660

gagtgagagg cgagggctgg gactggcatg gggcccgggg gtgctgggtg agagcacaga    12720

gttgggttcc cctcgctctt ggggtcagcg tgcccaggaa atgccctttc ttgttttcca    12780

cgaggggggc ttctctgccc cactgagagc cggcacctac ttcataccat gccccgatca    12840

gctgcccctc cctcagaacc gccctctgct taagggtgtc cactctctcc tgtcctctct    12900

gcatgccgcc cctcagagca gcgggatctc aaagttatat ttcatgggct tggactccaa    12960

atggggggaa ctcggggaca ctagctcccc ccggcctcct ttcgtgaccc tgcccttgac    13020

ttcctcacct tctctgtctt tcctgagccc ctctcccagc atgtgactga taaggaaatt    13080

gagtcacaca gcccctgaaa gcgccagact agaacctgag cctctgattc ctctcacttc    13140

cctcacctac cctgccactt cctactggat agaagtagac agctcttgac tgtcctcttt    13200

tctccccact ggctggtcct tcttacccca gcccgtttga aagagctcac ccccgacaca    13260

aggacccgca cacagatacc tcccagctcc ctctcaaccc accctttcca gggttggaga    13320

acttgaggca taaacttgct tccatgagga atctccaccc agaaatgggt ctttctggcc    13380

cccagcccag ctcccacatt agaacaatga caaatagaag gggaaatgga aaataaacag    13440

gagaaacggt tttcccagga cagggtttgg cctacaagtt gtggatgtgg gtacccatgc    13500

caagtgtgag gggaggctgg ccgggtgtgg tggctcatgc ctctaatccc agcactttgg    13560

gaggccaagg tgagtagatc acttgaggcc gggagtttga gaccagcctg gccaacatgg  13620

tgaaacccca tctgtactaa aaatacaaaa gttagctggg cgtggtggta gatgcctgta  13680

gtcccagcta cttgggaggc tgaggcatga gaatcgcttg agcccagcca gggcaataca  13740

gcaagacccc gtctctacaa ataaaataca aaaaattagt tggatgtggt ggtgcatgcc  13800

tgtagtccta gctgctaggg aggctgagat ggaaggattg cttgagcctg ggaggtcaag  13860

gctgcagtga gccgagatgg cgccactgca ctccagcctg ggcaacagag tgagaccctg  13920

tctcagaaag aaaaaaaaaa aaaaaggaga ggagagagac tcaagcacgc ccctcacagg  13980

actgctgagg ccctgcaggt gtctgcagca tgtgccccag gccggggact ctgtaagcca  14040

ctgctggaga ccactcccat cctttctccc atttctctag acctgctgcc tatacagtca  14100

cttttttttt ttttttgaga cggagtctcg ctctgtcgcc caggctggag tgcagtggcg  14160

ggatctcggc tcactgcaag ctccgcctcc cgggttcacg ccattctcct gcctcagcct  14220

cccaagtagc tgggaccaca ggcgcccgcc actacgcccg gctaattttt tgtattttta  14280

gtagagacgg ggtttcaccg ttttagccgg gatggtctcg atctcctgac ctcgtgatcc  14340

gcccgcctcg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcgtg atacagtcac ttttatgtgg  14400

tttcgccaat tttattccag ctctgaaatt ctctgagctc cccttacaag cagaggtgag  14460

ctaagggctg gagctcaagg cattcaaacc cctaccagat ctgacgaatg tgatggccac  14520

atcccggaaa tatgaagacc tgttatgggc atgggagggc tggcgagaca aggcggggag  14580

agccatcctc cagttttacc cgaaatacgt ggaactcatc aaccaggctg cccggctcaa  14640

tggtgagtcc ctgctgccaa catcactggc acttgggtcc cttcattttc ctcaaagagg  14700

tgctgtgaaa ccccaagcct aggaaaaggt agatccctgg aggaggcagg taatgtggtg  14760

ttgggagagc ctggctgtgt cccctctgta ggctatgtag atgcagggga ctcgtggagg  14820

tctatgtacg agacaccatc cctggagcaa gacctggagc ggctcttcca ggagctgcag  14880

ccactctacc tcaacctgca tgcctacgtg cgccgggccc tgcaccgtca ctacggggcc  14940

cagcacatca acctggaggg gcccattcct gctcacctgc tgggtaaggg cacatgtcgg  15000

gccttgagga gggtaaagac ggaccacagt gtgagtgagg gttgggacag ggctgactag  15060

agggtaggga gcaggctggg gactgagaga ctccagccct gtgggggatg gttgcccagg  15120

ctggaggggg gtgggcgctg ggagtgggga gccccccact tgcatctggt gccacattca  15180

ctgcagatct atgtcgggca agtcaccatg gatgggggaa gaagttaata atcttgtcca  15240

ggagaccacg gcacccatca caacattgtg tgatcttaga gggcgaggaa gaggctgtga  15300

gtgggagctg gggaggcttt gccaagaggt ggcctgtgag cagggcctcg gaagatgaca  15360

gggtttgaca gatgggaagt gggggatgag aggacagacg cagtgttcag gccaagggaa  15420

ctggaacaaa gaagaacctg agaatgtaaa tctacttcaa ccctggaccc tcctttgcca  15480

agggctgcaa tctcagatgc cctgaatgtg tgaagtaggc ggtgaggaca gtaagggatg  15540

gtagggagta aggcaaagca gaggctactg gttctctgtc cctgatgggc tgttaggaac  15600

actttcctgg agcagagaga ccagacaggc cctcagacca tttagaaact ataagggagg  15660

ccccagagga cggcctggct gtgggtctag ctcccacaca ggctgggagt ccagccctct  15720

tcagcccctc tctggtgaga ccaaagaaca tctggtgatg tcacagtgga cgtcagttca  15780

ccaactggga gacacaggcc ccgggaagaa aagcaacatg cccagcgtgg cctgggagct  15840

ggggcagagc tggccttaga actcagcccc tgacaattgg taaaagggga aaggggagca  15900

acctaacact gatgcgctct ctgtctctct ctctggctct ctccctggct ctctccctct  15960

tctctctcat gttctctcca tcactcatcg ctctaaccct ctctcactgg tttgcacttt  16020

agacttcatc tgatgtcagc cgaagcttca cctcacttgg ctaggaaaga gccttgagtc  16080

caaatctgtt tctgagcctt ccattcatcc tgagtttctt ccttttcctc tgtcgtggag  16140

aactaggctc ttttcttaca ctaaactcag aggcatcagc ctctcctgaa ggagacggct  16200

ggttcctgtc agagttgctg agctgcagac accgacctca ggtggtgcgg aggggacatg  16260

gcagagtggc tggtgaagag agcagcctgc cagcctttca atcccagccc tgccacttag  16320

gagccgtggg cccccggcga ggggggcggt cacttaactc tccagcctgt ttcctttact  16380

agccaatggg aatcgtgaca gtacctgggt gcagacagga ttgaaagtga attcacacaa  16440

tgttcttggt gcagagccaa taagaggtgg ccaccggggt gtaggtgttc tggggacctg  16500

taatgtcctc acatgtcagc agttgctagt cacattggtc tccactgctc acggacagtg  16560

aagaccacct ggattccctg ataaccagca aggcccccac ctagagccag gcagtaatga  16620

cctactgggc tggatatgca caccaaagat gatgtgtgcc tcaaagcttg caaacagtag  16680

gtgctcaaga aatgccacta tgattagcag gactgggatc tggagcgctc ttcctgcagg  16740

agggcattga gcctaagtaa catttgtctt tcctctctct gccgtccccc acactcgcct  16800

ccagggaaca tgtgggcgca gacctggtcc aacatctatg acttggtggt gcccttccct  16860

tcagccccct cgatggacac cacagaggct atgctaaagc aggtccgcac cagcccaggg  16920

gcagggaggc cccgccggga tgggagggac cctctgattc aggagttccc tccagtttag  16980

ccctcccccg ggatccccac ggcagcacgc agtctgtccc cggaaccccc agtttgggca  17040

gaactccctc tgcttgcagg gctggacgcc caggaggatg tttaaggagg ctgatgattt  17100

cttcacctcc ctggggctgc tgcccgtgcc tcctgagttc tggaacaagt cgatgctgga  17160

gaagccaacc gacgggcggg aggtggtctg ccacgcctcg gcctgggact tctacaacgg  17220

caaggacttc cggtacatcc agctagggct caggtctcgt tcctgagccc cacgggcaag  17280

ggaaatgaac caagcaaagg gtccactact gtcccccagc tggagccagc agggcaggat  17340

ggggacaggg ccagagtttg ggactgagtg tctagagagg tgttggcttc tggcaggaaa  17400

accccatccg cctgatgggg acttctgaag cacgcaacag ctctgtcagc ctggccgctg  17460

ggaagtgctc aaggtcccag tcctgggttt gagcatggta ggctgccccg cgtccctcct  17520

tgggagcagc ccctgcatgg agctggcctc tccctggggg cacatgctgt gacacaggga  17580

ggcacacgag gatgttgggt gctctgtaca gatccactct cacccctgac aggctcagaa  17640

gctgccttcc ttggaggatg gcgttttagt tacctattgc tgtgcaacca agcaccccag  17700

agcttagcct tacgaaacaa ccagttgatt ttgcttatga ttttatgtgc caggaattca  17760

ggcagtacac agtggaaatg gcctttctct acagggcccc ctctgttggg ggcagctctc  17820

acagccggga tggctcaatg ggggccatac gtccagagcc ccagttctgg ctgtcggttg  17880

aggtcctcgg tttttcccat gtggcagatg ctggggcaca tgttcccagt ggcctcttgg  17940

ctcacatgtt gggtgcttgg ggtgagatgg ctggaacggc tggaggtggg tcaggcatct  18000

ctccaggcta gctcgggcgc cctcccagcg tggaatctga ggtgggcaga tttacctggc  18060

agccagcatc ccccacagca actactgacg cagccagttc tcaaggctag gtccaaaact  18120

ggcccagagt cacttctgcc atgttttatt ggctagaaca agtcacaagt tcacccagat  18180

tcaagagaag agaaaaaagt ccctcccact tgggagaagt ggcaaagacc atctgtcaca  18240

gctgaagaag tgtctcttac aaggagaaca gacacgggga gcctgaaaca aaacccgatg  18300

ggattccctg ggctgtgcag gcccttccag gcatgaggac tcagccacag ggctgagagg  18360

agacaggatc tgggggatga gagcccttgt ggggtcttcc cttttatggg gagtcagagg  18420

agaagctgga tagatcccca gccttgtggc caggatgctg ggcagctctt ccttccccct  18480

ccccgatgag aatgacagaa aaacaggatt cacctgagcc aaaaggcttc cagttagatc  18540

caagagagaa tttcccgcag tttgaattgg tttgctaaac aacaaggaag ggctgggtgc  18600

ggtggctcac acctgtaatc tcagcacttt gggaagccga ggcaggaggt ctgcttgagc  18660

tcaggggttc gagaccatcc tgggcaacat agcgagaccc catttcataa aaaataaata  18720

agtaaatgag aacaaggaag gactgacgag agacggtaga accttctggt ttgggcagct  18780

ctgcagctgc cattcatcct ggccataaga attcttgggg tgaataagtt tgtcgctgtt  18840

gggccgcatg agatgcagaa tcgcccactc tcacccctga cagaaacagt tgtttccttc  18900

agggagcctc catcttggga gataaagcat gtgtacatgg gaacccactg gccacacatt  18960

ctctagaaag tacacaatgt cccagtgcct ctagagcaag cactttgtac agtcagaaag  19020

caacaggtgg tgggggctgg agtcattcag gaaaatggga ggcagaggaa tggcctgaac  19080

ggcccgatgc taggggcttc tgcccccaga ttccctctta cgcacactca gtggttgccc  19140

ttcccctccc tccccacagt gctgtgtccc ctgcatgctg cagtgctggg gtctgccctg  19200

ggtatagcaa ggcccactgt tcccttatgc ccagggcttc tcactgtcct ctcccaacac  19260

cctctccccc actccactat tcctaggatc aagcagtgca ccaccgtgaa cttggaggac  19320

ctggtggtgg cccaccacga aatgggccac atccagtatt tcatgcagta caaagactta  19380

cctgtggcct tgagggaggg tgccaacccc ggcttccatg aggccattgg ggacgtgcta  19440

gccctctcag tgtctacgcc caagcacctg cacagtctca acctgctgag cagtgagggt  19500

ggcagcgacg gtgagagaga agcgggaggc cctggtgggc tgaggaccaa gaaagggtgg  19560

tgagcttggg aggtgggaaa ggggcactta gtggcccatg ggcagaggtg tggggcagag  19620

caatcggaag gaagggagcc acccagacca tcccaggagg caggtcacag ggcccaaaag  19680

gtacagcacc cccacccctc caccatcaca ggcacaccag ggccaagccg ctaggaccct  19740

gggtctgaca gctgggctcc cttcccttgc agagcatgac atcaactttc tgatgaagat  19800

ggcccttgac aagatcgcct ttatcccctt cagctacctc gtcgatcagt ggcgctggag  19860

ggtatttgat ggaagcatca ccaaggagaa ctataaccag gagtggtgga gcctcaggtt  19920

ctggaacact cccacgggat gcgggctggg ggatctctgc gagtgtctgc atgtgcctgg  19980

gtgtctggat gggccagggt aggggagtgt gtgtgtgtgt gtacactatt gtgtctgtgc  20040

atatgatgtg tgtggtgtaa gtgatgggga aaacggggtg attgtgcaca gaggcccagc  20100

acgcaggaga atggggtgcc cagtatagcc ccaagtgcag ggaccctccc tcaagtcaaa  20160

aatgccaccc ccagcctggt tctccccaaa ctcatcttcc aacatatatt cccactcgac  20220

aggctgaagt accagggcct ctgcccccca gtgcccagga ctcaaggtga ctttgaccca  20280

ggggccaagt tccacattcc ttctagcgtg ccttacatca ggtaacggga aaggcaggag  20340

ggcacattgt gaggggcagt acccacagct ttgtgtttca actgcggcca ctgcccggtc  20400

cacaagctct gtcagtcagg gcagacccgg gggagccggc cgcacggtgc aggtgcctgg  20460

gcccactcac actgccaagg ctgatgggtt ttttcttgaa cattcttttg atgagagtct  20520

gtaccatcca aacagttgaa cacagaaact caacctaata attggctaat ggttaccaga  20580

ccttggttaa gtagttaaca ttaaccacga ctcatggctg gatcatgagc tctgcactgt  20640

tttgttttgc ttttaaaaca agactgtgat tcttttacta ttattgaaca ttgtctgcga  20700

tacaatttga attgtacctg gaagcccttc tagacactaa aatgtaggat tggagatcgg  20760

ttaaggtggg aggcagggtt gctggggcaa gttacagtca caggctgggg tcagacagaa  20820

ctgggttcaa accccgtctc cattactttg tttccttgag aaaattcctc aatttctgtg  20880

agcttccatt tcctgacctg tgaaccccat ttcacaggat gcacgatggc taacttctta  20940

gcattctgtc tcatacacag cctcctcagg gaggggtggc caggacccca ctattcatca  21000

ctctctagtg gaatgtagct gcacactagg tctgcaggtc acatggccac agatgagtgt  21060

gcccaatgca gcccctctcc ttctgtgtgc cccgggagag cacttgctga gggctagcaa  21120

ggctgtttgt gatccgggag gctccctggg aggctggggg ctagagagac ctcaggctgg  21180

agttccaggt gcccccgggc tacaggtagc ccaggccacc cccagagggc tgtggctgcc  21240

tctggccctg gcctcccgtg gttcctggaa gcccagcaag ggcagggccc atgcccacct  21300

tgcctcctgg cacctgggat gatgccagca catcatcaag tgctaataac tgattgtggg  21360

atggatgaag tctgtcccca gagtccagga agagggcatc cctggagcac ctcagatagg  21420

cctgacctag acggtgctcc agagatgaca cttaggacag ggctcccgcc tgcctgctgg  21480

agtggtccct ggggttccca gccggcgctg gctctcaccc gggagccagc tggtgtgatg  21540

gctagcttcc cagcttaatg cagacaattc tccaaacagg ggtgggcaaa ggagacttgg  21600

ctgctctaga aaaacattcc ggattctggc cagcagcctt cacaaagcac ttttaggaaa  21660

gaccagggaa ctaggtggta catgcttgca cccagcattc aaagtgagag gcctgtgcca  21720

ctggctcagg acatttaaaa cctcttcaga ctttaagctg gggagaatcc tccagccttg  21780

actggcagat ttctaccagg gaattcgtga tgctttggat aagatcatgt aggactggct  21840

tccctgccca gaccacccta gtagatccac acggcccatt tggccacacc ttgcctctac  21900

ttgcatatac cccagggatg gagacctcac tgcctccaaa gccacctgcc agatctctga  21960

aggctctgcc ctgaccccat ggagcaggcc ctcctgagtt gtggaggcag ctctgtgggt  22020

gggaggcatc tacacaggca cggctaggaa gaggctcaga caatgctaag agctggggtg  22080

ggggagctca ccctgatagc tgtgggcaga gttggggggc cttggctctg ctgtgcgcat  22140

gtgacttagc acacatcaca tgtgatgtgc agaagggcct ggggcccagt ggcacaaggc  22200

cctcaaccaa ctccgccccg ggccacggcc tcgctctgct ccaggtactt cgtcagcttc  22260

atcatccagt tccagttcca cgaggcactg tgccaggcag ctggccacac gggccccctg  22320

cacaagtgtg acatctacca gtccaaggag gccgggcagc gcctggcgtg agtgtcctcc  22380

agccctcctt tgtttccatg ctctggcctg cgcccctggg ccttgagggg tctgtccact  22440

ggagcttttg tgggaacact tgccattttg agccgggaac tcccacctgc agcgtgggcc  22500

aggcctgatt gccatctcct taggcacctg gagccctggg gccctgggac aagtttcagc  22560

tgggagtggg tatggagagt ggatgtcagg tgggggcaag aggggccatg tccttctgac  22620

tctgcctccc tgtctcatgc ctccccagga ccgccatgaa gctgggcttc agtaggccgt  22680

ggccggaagc catgcagctg atcacgggcc agcccaacat gagcgcctcg gccatgttga  22740

gctacttcaa gccgctgctg gactggctcc gcacggagaa cgagctgcat ggggagaagc  22800

tgggctggcc gcagtacaac tggacgccga actccggtac cgccacccac cccacctcca  22860

gccttgggtc ttaaccccct ccccaggctg ggcagccatg cggctgacct cggagcctgg  22920

ccctgccccg cacccttgcc ctgccctgcc ctgccctgcc catgctgtct ccttgcttcc  22980

cactcagctc gctcagaagg gcccctccca gacagcggcc gcgtcagctt cctgggcctg  23040

gacctggatg cgcagcaggc ccgcgtgggc cagtggctgc tgctcttcct gggcatcgcc  23100

ctgctggtag ccaccctggg cctcagccag cggctcttca gcatccgcca ccgcagcctc  23160

caccggcact cccacgggcc ccagttcggc tccgaggtgg agctgagaca ctcctgaggt  23220

gacccggctg ggtcggccct gcccaagggc ctcccaccag agactgggat gggaacactg  23280

gtgggcagct gaggacacac cccacacccc agcccaccct gctcctcctg ccctgtccct  23340

gtccccctcc cctcccagtc ctccagacca ccagccgccc cagccccttc tcccagcaca  23400

cggctgcctg acactgagcc ccacctctcc aagtctctct gtgaatacaa ttaaaggtcc  23460

tgccctcccc atctgagtct gtgtccctca cagggaagcc agggacaggg acaggctgct  23520

ttcctgcctc ctggcagtca agtgggtccc gttactaggt ttgttcctcc atcctccttc  23580

aggagccggg gaggatcccc agagctctgc cccagcacct cctggcgctg gcgcctgtct  23640

tccctccagc ccaggcagcc cgccactgtc ctgccaccgc aggcagcccc tgtctggccc  23700

aagcactgac ccacgcggac tctgggaagc agacatcctg ggctgctggc ctcacatttc  23760

cactggcagt ggagcctttc cctgctccac aaatggccag gtccccccag gggaaggctt  23820

ccggctgtta tcggctgcct cagggggcga gtaccttgga gggcctgctt caaggagggt  23880

gccccctgga gggcacacac cagcctagtg cttaccttgg ctcctgcctg taccagctcc  23940

atgactctct gctcgggtga acagccttgg ctctcagaca gccattctaa cactgccagt  24000

gcagaggggc ctcagacgct ggagtgtagc agtggctgca cctgcacagg gattagctgc  24060

cagcagccac                                                         24070

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

tgacccagac cctgactttc                                                20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

agggcaatgt gggaacacta                                            20

Claims (10)

1.一种体外检测样品是否存在血管紧张素I转换酶基因ACE的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用ACE基因特异性引物扩增样品的ACE基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

4504位G→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQID NO：2和3的序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第4504位。

4.一种检测高血压的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增ACE基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第4504位的扩增产物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第4504位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第4504位的突变限制性内切酶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是以下的单核苷酸多态性：

4504位G→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

8.一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测该个体的ACE基因、转录本和/或蛋白，并与正常的ACE基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，检测的是ACE的基因或转录本，并与正常ACE核苷酸序列比较差异。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

4504位G→C；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。