CN1661076A - 过氧化氢酶基因与原发性高血压的相关性 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的过氧化氢酶基因CAT、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患原发性高血压的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。

Description

过氧化氢酶基因与原发性高血压的相关性

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及过氧化氢酶基因(catalase，CAT)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其与原发性高血压的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。

背景技术

高血压是指收缩压或舒张压升高的一组临床症侯群。血压的升高与冠心病、肾功能障碍、高血压心脏病及高血压并发脑卒中的发生存在明显的因果关系。高血压最新的诊断标准是收缩压≥19kpa(140mmHg)或舒张压≥12kpa(90mmHg)，符合其中一项者可确诊为高血压。

大多数的高血压患者在血压升高早期仅有轻微的自觉症状，如头痛、头晕、失眠、耳鸣、烦燥、工作和学习精力不易集中并容易出现疲劳等。随着病情的发展，特别是出现并发症时，症状逐渐增多并明显，如手指麻木和僵硬、多走路时出现下肢疼痛，或出现颈背部肌肉酸痛紧张感。当出现心慌、气促、胸闷、心前区疼痛时表明心脏已受累，出现夜间尿频、多尿、尿液清淡时表明肾脏受累、肾小动脉发生硬化。如果高血压患者突然出现神志不清、呼吸深沉不规则、大小便失禁等提示可能发生脑出血，如果是逐渐出现一侧肢体活动不便、麻木甚至麻痹，应当怀疑是否有脑血栓的形成。

高血压早期无明显异常体征出现。当脑、心、肾等重要器官出现轻度损害时可有异常的体征出现。常见的心脏异常表现有心尖搏动左移、心前区有抬举样搏动感，听诊心尖区第一心音增强、主动脉瓣区第二心音增强且有收缩期杂音和舒张期杂音，表明已发生动脉硬化和左心室肥厚，如果在心尖区听及奔马样心律可能表明有心力衰竭的出现。另外还常见耳垂出现折痕、毛细血管搏动、桡动脉出现硬脉或无脉及下肢间歇性跛行等。

此外，由于某些诱发因素或高血压本身的发展，可导致一些高血压患者血压显著或急骤升高，同时伴有脑、心、肾、视网膜等重要器官功能损害，严重危及生命，出现一系列临床特殊征象，称为高血压急症。高血压急症的发病率占高血压人群的5％，常见有高血压脑病、脑出血、急性左心衰竭、可乐宁急性停药综合征、急性心肌梗塞、急进型恶性高血压等。

高血压患者中约5％左右无自觉症状，也不知道血压何时升高，更不知道什么时候已产生了血管和器官损害的并发症，有些患者甚至在发生了心血管意外之后才知道自己患有高血压。所以，找出高血压发病的遗传原因，及早的进行预防以及检测，可以有效控制高血压的发病，将疾病对人体的伤害减到最小。

原发性高血压(essential hypertension，EH)也叫高血压病，是一种独立的疾病，有着自己的病因、发生发展转归的规律和临床表现。临床上主要表现为动脉血压的升高。占人群高血压患者的90％以上，目前发病机理尚未完全明了，主要依据排除了其他疾病导致的高血压后才能诊断为原发性高血压(高血压病)。动脉血压的升高主要是因外周小动脉阻力增高所致，同时有不同程度的血容量和心输出量的增加。晚期常导致心、脑、肾等脏器受累发生高血压心脏病、心力衰竭、肾功能障碍、脑出血等严重并发症。原发性高血压的治疗主要是降低血压同时防止并发症的发生。原发性高血压患者致死原因为脑血管意外、心血管意外和肾功能不全，我国以脑血管意外为多见，心力衰竭和尿毒症次之，而欧美国家以心力衰竭多见，脑血管意外和尿毒症次之。

原发性高血压作为最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。

虽然已有许多关于各种基因多态性与原发性高血压的研究，但没有证实CAT基因与原发性高血压相关性的报道，更没有证实CAT基因的SNP与原发性高血压相关性的报道。

综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻找原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)高血压的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗高血压的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗高血压的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的CAT基因、转录本和/或蛋白，并与正常的CAT基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，所述的方法中检测的是CAT的基因或转录本，并与正常CAT核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

      36535位T→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在过氧化氢酶基因CAT的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)用CAT基因特异性引物扩增样品的CAT基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

      36535位T→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ IDNO：1中第36535位。

在本发明的第三方面，提供了一种检测高血压的试剂盒，它包括特异性扩增CAT基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第36535位的扩增产物。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第36535位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第36535位的突变限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

      36535位T→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的CAT蛋白以及药学上可接受的载体。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了CAT基因的部分SNP与高血压密切相关，而且发现了它的新功能：CAT的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在CAT第36535位的SNP(36535位T→A)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，因此可作为检测高血压的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。

CAT基因

过氧化氢酶基因(catalase，CAT)的详细序列可参见登录号为AL035079的核苷酸序列(可参见网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO：1所示。

过氧化氢酶(CAT)基因属于一个结构和功能上已经比较清楚的过氧化物酶。1986年Quan等人分离人的这一基因并阐述了此基因的特征(Quan et al.NucleicAcids Res.14：5321-5335，1986.)。基因全长34Kb，由13个外显子组成。基因产物是由60Kd的四亚基组成，每个亚基包含一个高铁血红素基团，分子量为240Kd。过氧化氢酶能把有毒的H₂O₂分解成H₂O和O₂使细胞免受氧化压力的毒害。这种蛋白最早从老鼠的红细胞中被分离得到，随后在人体内的红细胞也分离得到了该蛋白。过氧化氢酶和SOD以及谷胱甘肽还原酶组成了细胞内的主要抗氧化体系。

过氧化氢酶是存在目前已知的生物体内的广泛存在的蛋白酶，并在肝脏，肾细胞以及红细胞中表达丰度较高。过氧化氢酶蛋白和SOD以及谷胱甘肽还原酶共同组成了细胞内的抗氧化体系，在红细胞内过氧化氢酶发挥了主要的抗氧化作用。有研究表明，日本人的过氧化氢酶缺乏症与红细胞中的过氧化氢酶浓度过低有关，这种疾病红细胞中过氧化氢酶的浓度只有正常人的0.2-4％(Ogata，M.Aatalasemia. Hum.Genet.86：331-340；1991)，并且是由于剪接突变造成的(第四个内含子的第五个碱基G→A)。匈牙利人中发现在上游调控区域有多态存在(-21，A→T，翻译起始位点为1；(Goth.L et al.Electrophoresis.1997jun：18(7)：1105-8)。截止到目前为止关于过氧化氢酶基因还很少有大家所认可的共同多态，大部分发现的是具有民族特征的多态。

多年的研究表明氧化压力失衡会导致疾病的产生如动脉粥样硬化等以及一些老化病等(Jose M et al.，Biochemistry，32(8)，595-603，1999)。作为红细胞内主要的抗氧化酶，过氧化氢酶在抗氧化作用发挥了很大的作用(Gaetani GF，et al.，Blood 87：1595，1996)。

2000年Goth L和Eaton JW发现过氧化氢酶缺陷会导致较高的糖尿病的发生(Goth et al，Lancet 2000 25；356(9244)：1820-1)。

由于过氧化氢酶能够降解有毒的H₂O₂避免对细胞造成氧化压力的危害，因此作为高血压病的候选基因在中国的隔离群体进行筛查。

本发明人对CAT基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与高血压易感性并不相关，然而关联研究表明36535位T→A却是与高血压易感性关联性非常高的SNP。该SNP位于CAT的启动子区，提示对CAT的转录水平有影响，进而导致影响过氧化氢酶的表达，并最终导致携带者的高血压易感性明显高于正常人群。

基于本发明的新发现，CAT蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗CAT蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如高血压)，和用于筛选促进CAT蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人CAT蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人CAT蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人CAT DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CAT基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CAT基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CAT蛋白的分子，也包括那些并不影响人CAT蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CAT基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CAT蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人CAT蛋白功能的抗体以及不影响人CAT蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CAT基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CAT基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人CAT蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CAT蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗CAT抗体是不识别正常CAT但识别突变CAT的抗体，或者识别正常CAT但不识别突变CAT的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。

利用本发明CAT蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CAT蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明CAT蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

正常的CAT多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于高血压治疗。在使用本发明CAT蛋白时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CAT蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的CAT蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人CAT蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于CAT蛋白的无表达或异常/无活性的CAT蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带CAT基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人CAT基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还涉及定量和定位检测人CAT蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在CAT蛋白的方法是利用CAT蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CAT蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CAT蛋白。

CAT蛋白的多聚核苷酸可用于CAT蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，CAT蛋白的多聚核苷酸可用于检测CAT蛋白的表达与否或在疾病状态下CAT蛋白的异常表达。如CAT-DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CAT蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CAT蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CAT蛋白的转录产物。

检测CAT基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。CAT蛋白突变的形式包括与正常野生型CAT DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用CAT基因特异性引物扩增样品的CAT基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：36535位T→A，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

应理解，在本发明首次揭示了CAT基因的SNP与高血压的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在36535位T→A。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：2和3的序列。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO：1中第36535位。

由于本发明的SNP与高血压具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期较准确地诊断原发性高血压，而且可以未雨绸缪地使携带者在未发病前就采取合理的预防措施(如在饮食上采取相应控制)，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.1研究对象

由于血压是多基因参与的受多种环境因素影响的数量性状，必然在分析相关基因时要考虑遗传异质性的问题。选择遗传背景相对比较单一的隔离人群作为研究多基因疾病的材料将有助于降低遗传异质性的影响，同时由于这些群体具有比较固定的生活环境和较为一致的生活习惯使得环境因素的影响大大降低。选择这样的群体，不论是用于连锁不平衡分析，还是从中选取家系进行家系分析，都有助于提高高血压易感基因位点的检测灵敏度。因此在本实施例中选定隔离群体作为研究对象(隔离群体具有遗传背景的相对一致性，奠基者数目比较少的优点)。

在知情同意的基础上随机收集了324个年龄在50岁以上的汉族个体，均来自于安徽省岳西县大别山响肠镇。80％的个体只有6个姓，奠基者数目应该比较少，并且同一性别的个体来自于同一个奠基者。选用的高血压样本要求收缩压不低于140mmHg，舒张压不低于90mmHg，测量血压两次取平均值。

挑选其中的11％位于血压分布的最顶端(37例个体；SBP＞178mmHg)和有7％位于血压分布的最底端的(22个个体；SBP＜104mmHg)共59个个体，通过直接测序的方法进行SNP的检测。

1.2实验方法和结果

1.2.1 DNA提取

用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。

1.2.2 PCR及测序引物的设计

根据GenBank中CAT的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。

               表1引物序列表

引物名称	序列(5′-3′)	SEQ ID NO：
			有义引物	tgtgcagaacactgcagga	2
反义引物	tattccgtctgcaaaactgg	3

1.2.3 CAT基因的PCR扩增

以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。

结果，获得412bp的扩增产物。

1.2.4 SNP的发现和检测

PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http：//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。

结果，发现存在以下SNP：36535位T→A。

1.2.5 SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在高血压病人和正常血压对照组中进行分型和关联分析。

等位基因的频率统计出来以后进行卡方检验，通过对血压最高的11％和最低的7％个体数据进行比较，初步确定是否等位基因的频率和血压水平连锁。

结果发现SEQ ID NO：1中36535位的A型SNP在高血压个体中的频率为37.5％，而在低血压人群中的频率为21.4％。两者之间的频率差为16.1％，证实了SEQ IDNO：1中36535位的A/T型SNP与高血压的发生存在着相关性。

实施例2

原发性高血压易感性检测试剂盒

如实施例1所述，SEQ ID NO：1中36535位T→A的突变与高血压疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计CAT基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

名称	序列	浓度
			有义引物	SEQ ID NO：2	100pmol
反义引物	SEQ ID NO：3	100pmol
			PCR反应液	含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液

抽取待检测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl，以所提取377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出36535位T→A。

检测结果，含36535位T→A的检测对象的高血压易感性高于正常人群。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                            序列表

<110>复旦大学

     上海人类基因组研究中心

<120>过氧化氢酶基因与原发性高血压的相关性

<130>040170

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>38100

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gatctcccct cctcagcctc ccaaagtgct gggcttacag gcatgaacca ccgtgcctgg    60

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ccatcaccac caaccatctc cagaagttct cacctttccc aataaaaagt gcagtggcgc    2220

aatcttggct cactgcaacc tccacctcct gggttcaagc gattctccca cctcagcctc    2280

acgagtagct gggattacac gcacatgcca ccacacccag ctaatttttg tatttttagt    2340

agaaatgggg tttcaccacg ttggccaggc tgatctcaaa ctcctgacct caggtgttcc    2400

acccgccttg gcctcccaaa gtgctgggtt tacaggcgtg agccactgca cccagcccga    2460

tatatctatt ttctatgtct acaaatataa cagtctcaaa gcatactcaa atacgggggg    2520

aattaggcag gagggtttga cagaggagta aagaaatttg agctaaaaga ccaagaatga    2580

gtttgtatct gtctgctagt ggtctgtttc ctgaagcccg taactcagga actcctgaaa    2640

gtataaactg gtttggtttt ttgtttttag ttgttattgt tgttgttttc agacaaggtc    2700

tcactctgtt gcccagactg gagtgcagtg gtgcaatcac gactcactgc agcctcaacc    2760

tcctgggctc aagagatcct cccgcctcag cctccctagt aactgggact acaggcatgc    2820

gttaccatac tcggctaatt tttgtatttt ttgtacagac agggcttcgc catgttgccc    2880

cggctggtct caaactcctg agttcaagtg atcctcctgc cttggcttcc caaagtgctg    2940

ggtttacagg catatgagcc accacacccg gcacaaactg gttttgaata tgaacggaat    3000

aaagattttc aaggaaaaca aattttcatt tagtattcag aactcatctt taaagtcttc    3060

catgtgattt tcaaccatga taggcaaata tgggctttaa aaagaaggaa gaggaaagtg    3120

accagtggtt ctgagccctt gttttaaaaa gtcaatcaca ggtaagtgag caaatggaca    3180

agagatttaa gtaattttca aagttggggc atttgctatt ttatcagtgt ctcagaaggc    3240

tgtccaaagg ctatagattt aaacaaataa catggagtcc tcgagatact ggcatttcca    3300

tttttaaggg taaacatctg aaaatgatga tgttcaaatt aagagtctgg tagcagttta    3360

cagttacata tggagtcgaa agaaagaaaa taccatctct gttcttacgt acagattatt    3420

tattgtaaaa atgtaagcaa ttacaaattg atctgttgtg aaatcagtgc tgaattaaca    3480

ttaatgtaac tccagtgaaa aaaatgaatt tgatcaatta ttatcaggaa taaacattaa    3540

gccatgacgg tgctcaagtt atcttctgat gacactgctg tattaaatgt acttttccta    3600

tgagaacctt agaaaaataa aaatttctga gtagatcatc tttatctttt ctttttatat    3660

atttatagcc atattttaat ataataggcc atgaggtgat atgtaaacat acataatttc    3720

aacaaatttt gtcaaataaa atcatatttc tagctagaaa cttgccttct aatcatttta    3780

aatgaataat ccaatcatcc gtcaaaacaa attttttttt taaatgactg ttaaatccta    3840

accttcattt tcccctgggg aaatagcatt aaaattgtta cacaatctgc tatagaaagt    3900

gggattctct attttgaagc cactagcttg catttgcaca tctagcacag gagaatcttc    3960

atccagtgat gagcgggtta cacggatgaa cgctaagctt cgctgcacag gtgcagggcc    4020

ccggcctcac agatttgcct tctcccttgc cgccaagtga gatccggact gcacaaaggt    4080

gtgaatcgca ttctgtttta aaagaacaag atgagcaggt taatcacctc atgggcagca    4140

acgtgatatt tactcagttt taatatgtat gcaaatgaaa ataataattc agaattcatt    4200

cactttaact gtcttaaatt gcccagcgct aaaatgaaga gtatgtgttt tgccagtgaa    4260

ttctttatct ctcaaatgaa tttctgcaca gctgcctaag aaatctaaca gtggcaggta    4320

atggcccctg cagactgtaa tgctaagtgg taactaagtc atgcctactc caacccagca    4380

cacacagcct ctgcatggcc aggctgctcc cagcttacct taggcttctc agcattgtac    4440

ttgtccagaa gagcctggat gtggctcccg tagtcagggt ggacctcagt gaagttcttg    4500

acctaaggcc aaaggaaaat aaatgcaagc attactctaa ctccctacta tatcactccc    4560

cagggactgt ggtttcccag tgtttattcc ataggggagg aaagacgttt cagcaggagg    4620

cagtactaca ggtgtttaac aatgccagcc tcagagttaa gatgcaggtc cagtgaacac    4680

tctgacatat actggctgag caacctcgga taggtcactt aacttactga gcttatgtcc    4740

ctctgccgaa atgcgcaaga aaatgacacc taatcagtat aattttaaaa atactatttg    4800

gtctttgtcc cccattcctg acacagatct aaaacccttc gaatgtactg tcttttatat    4860

actactaaga tgattcatgg gggcctacat agattcctga tggaggctca caccaggaag    4920

aacaagcacg cgatcagaag gttagaactt ctagccccac ccccaaacct ccagggatgg    4980

gagaggggct ggagattgta ttcaatcacc catagccaat aatttcatca atcatgccta    5040

tgtcataaaa cctccagaaa aacccacaac tggcaaggtc agggagtgtc tggattagtg    5100

cacacatcca ggagctagaa gggtggtcca ctcagggagg cacagaagct ccgaggcctt    5160

cccccatgcc cctcttccat ttgtctattc ctgagttgta ttctttataa taaattggta    5220

atcataagta aatcattttc ctgagttcta tgagtctttc cagcaaatta tcaaacctga    5280

ggaaagggtt tgatttgcag tcagaatctg cagaagtgtg catagccagg gtacctcatt    5340

tgttatctaa agtgggaaat gacccctaaa tctttgggtt ctgactctag ctccaggagc    5400

tactgttaga attgaattga gttataggac acacagttac tgtcaaagaa ttacagaatt    5460

gcttattgtc ggggaaaaaa acccatacaa cctaggccag gcgcagtggc tcacgcccga    5520

aatcccagca ctttgggagg ccaagatggg tggatcacct gaggtcagta gttcaagacc    5580

agcctggtta acatggcaaa accccatctc tactaaaaac acaaaaatta gtcgggcatg    5640

gtggggcatg cctgtagtcc aagctactgg ggaggctgag gcaggaaaat ctcttgaacc    5700

caggaggcag aggttgcagt gagccgagat catgccactg cagtccagcc tgggtgacag    5760

aacaagactc catcttaaaa aaaaaaaacc cacacaacct acctcacagg atgctgtgag    5820

aaaaatgctg agaagtgagg tgcatttact gcatgaaaag agctgacctc agagtaagcg    5880

cttaacaaat tacagtgatt tacattgaga aacgggccca gacacagcct aaagttaatg    5940

tgaaggatac aagaacactg gtacatgcag cacaactcca cacacttcag gcaggaattc    6000

cccagtggac agcaagagga ggcagggcat tgggaaccca taaaagcctt acagtttcag    6060

catatgtgaa aggagaatgc caagggttcc agcccagttc tgctatttac aagctgtcgt    6120

atccattctc tccagtaaaa ggagataaat cctgccctgc ctaccacaca gagcgcctgt    6180

caagctctct gctgatactg gaacccaggc tctgggacac agcccagaca gctgctagcc    6240

cagctgcccc taggaactga gaagcagcaa ctaggggcca aggaaaaagg gggatttcta    6300

gatttgcaaa aagcttagct ctgggacagg ccaggaaacc agaagtgaga gggcttcact    6360

cagctcgatg agcggccatc agaaataccc cagcacctta gcatgaaagt ctagcctgcc    6420

ttttggaagc attgcagttc ttattccaga aatcatgcaa atttctagtc tgcatctgaa    6480

ggaggatcga ggtattatga cattaagcct ttaggcaggt tttaaaccat aaaaatgcaa    6540

aaaagaaaga cagactgatt gactgattga ctgattttag agacagggtc tccctatgtt    6600

gtccaggctg gccctgtatt cctgggctca agcgatcctc ccatctcaac ctcctaagta    6660

gctaggacta caggtgcatg ccatcacacc ggctgatata tttattatca tccaaagttt    6720

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ttggctgcag ctgaattaaa cagaatagga caaaattcag tctgaacaca actaaattag    6840

tacacactgg acaaacagct aaggacgatg gatatgccag accagataaa acatggaaag    6900

aaaataatca gaagttggtt ggggattact agtttatttt ttttttttta agttctctta    6960

agtcaagtaa aacagaaatg gcactttctt tttagggttc tcccacacag ctgcactgtc    7020

ttccttagcc agcagaggac acccttcagc ttacaaagac tcaccgcttt cttctggatg    7080

aaaatttgtg catccttcag gtggccggca atgttctcac acagacgttt cctctgttcc    7140

tcattcagca cgttcacata gaatgcccgc acctgctcag agaaaagagc aagtgcagag    7200

aattgaatca ccagtttatc accaacaaaa ttcacctact acaacactta ggaaatcaat    7260

gataaaaaaa actttagaag ttaagaataa ttttaaattt taaatttggg ttgtgtcctt    7320

cactttttgt tttaagcaaa ataagtaaaa ttcatttgtt aatagctcat acctgctttc    7380

taataatatc ctttatagta actgctataa atctcttata aatagatcta caatttaaaa    7440

cctcaccaca ttcttaatac tgacaagtct aaaatgtgca agctgccttt gaatgtaaac    7500

ttagcacaat acctttgttc aattctccca gaaccatgga ggaaaattaa ctaatttagc    7560

tagagatata atttgatata tagataatta tatctatata tagacatcta aaaaactacc    7620

tcatttatac atgtgtatct gtagttattc agaagccaat atttcttaag caagacatat    7680

taatagtgat attttgctag attattgggt tgacctctaa aataaatatc cataaattaa    7740

aatgaaaaat aggagcttag tatcagatat gtgaatccga gcagcctctg ccccattctg    7800

aaatcaaaag gttgtagcta tgattttatt cttacatttc attcattcat tccactcatt    7860

caacaaatat tgagtatcta taatgtgcga gactctgttc tacgtgctgt tctattaatg    7920

tttatgaagt ccaataatat ccaattatcc aaagtatcaa cttcataaaa tattaagaga    7980

tgcatcattt ccataagtca tcaaatatca ggctataatt atgtttttaa atttttgagt    8040

aaagtttaaa cctgatacca aagttaatca gacattttcg attaacacaa tctaatcaaa    8100

gtactatatc ctggggattt cctcagacct atctccaatt cactaattct ctcttcagct    8160

gtatttgaca tattgcgtga aaacatcgac tgggtcacta tatctgttga ctttttattt    8220

cacagattgt aatttttgtt tctagaaaat attatttggt tatttttcaa atctacctgt    8280

ttttctcctc atatcctatt gtcttaataa tattcctttt ttgcatctct ttaaatatgt    8340

atgtttattt taaagcctct ttccaattat catgtctatg attcttccat ctattattgc    8400

atgtgtaatt tctcattgga tttccttgta tgtattctaa tttttcacta tgactcatca    8460

gatgaagtag tcttgataac atctattgtt ctatcttcca attcactaat cttctcttca    8520

gccatgttaa cctcctttaa aagccatcta ttaaattcta atttcagttg ttacattttc    8580

tagttatgtc cattcaactc tttttctata gcttaaagtt ctcttactaa attcttcaag    8640

cagtcatcta ttttcttttt tttttttttt tttttttttg agacggagtc tcgctctgtc    8700

gcccaggctg gagtgcagtg gcgcgatctc ggctcactgc aagctccgcc tcccgggttc    8760

acgccattct cctgcctcag cctcctgagt agctgggact acaggcgccc gccaccacgc    8820

ccggctaatt ttttttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccgtgt tagccaggat    8880

ggtcttgatc tcctgacctc gtgatccgcc cacctcagcc tcccaaagtg ctgggattac    8940

aggcgtgagc caccgcgccc agcccatcta ttttctcaaa cctattaatc agtcatttta    9000

aaacctgtat ctgacagttc cattatttaa gcctccatta ggtttgtttc tactgtcagt    9060

ttgtaggggg ttttttctcc ctcttgattt tcagtcataa ggtcttaatg tgttaggtgc    9120

ctggtcattt attgttgaat gctgaacatt tccatataaa aaggtctaga atcatttgag    9180

tttctatttt ccaccaaaga aaattttgtt tgcttctgac agatggcgta gaaagagatc    9240

accttaatcc aatctgagac tgagcagagg caaagttatg tttcctgtat tgtgaaagca    9300

agtttatttc atgtttgccc ttattcctag gcatggccct ttaaggattt caactgaaag    9360

ccttgagtat aactagaggc tctgcttctt agcagacctt gaattccaat ttttgtccct    9420

tcagactcat gagactgctg taaacaccac tcagcttctg gaccagtgct tacaaattaa    9480

caaatacctt aagaggaaag gaaaccaaat gtcaagctta cttcactgca cttttttttc    9540

ctgcacttct tttccatctt tgatcttggt cccttaaatc cttgttgctt tgttagctct    9600

ccaaagcctt caaacaagtg ctttatgtat tttacctacc ttttcaatgt tctccatgaa    9660

acggtaagta agatacaagc tagtctgcca tagacagatg caagcccaag tgaatcattt    9720

ttaagagaat aaatctggac cttcttatgt atttcccatg tgatacatca tcacagaatt    9780

atgctatgaa tctataacaa tagtattgtg attacttaaa aaccacacta tatcctatat    9840

agtgataaga aattctctca ataagaatga gcacataata aattttcatg tgtaagcaat    9900

agcctcatta atttttgcag gggttgtatg agctggttta atacctgtat tgacctcaca    9960

taggcaaaat tctttgagag gcagggaatg tactgtaata tacttggtgt catctgcatc   10020

accaaaaata atgcagttac ataaaaggta tgcaggaaat gttttaagct catctaaaaa   10080

tggtttatat cccacaataa tgtaatttct tttttatata tacgtatata tgtatatacg   10140

taaatgcttt tcaagcaaag atatcctcac agcgaattaa ttcatgtata agtatttttt   10200

acttggaacc cacattcaca aactgagaaa ctagaaatag gttctaatct aatttaaata   10260

ctaagtttaa cactaactgc tcaaacagag ctctagaaca actatacctt taactttatt   10320

attttattgt gtgtggtata agttgcactg gacacattaa ggaggcagct gcccacctac   10380

agcccttcca agtccaaggg cctccttcat agcatgtgct gaaacagctc ttagggcagc   10440

cataggcaac tggaaagagg atgagcattt gccctggggc ggttaactag agcctgacca   10500

aggccaatgg tgcaacctgg ggtgaaaaga ttagccaagt caataggatt ccatctctct   10560

agaatctaga gatagacatg ttgagagaag gagtaaaagg tggtccaaaa aaaaaaagta   10620

ataatggaga aagacgccat aaaggagagt tttccattgt tgtggaagag ccacaaccat  10680

gataaaacag aagctctgac gcagatagga gaaaacagga agctgtggta aaaataatca  10740

attagcattg gcaagcagaa gcagacagat ggagaataag ccacgtgaag gacgagccct  10800

gcagtggaaa cgcccacact cttgtggccg aggctcctgg agctattttg gatctctagt  10860

tctagtcctt gaacctggac tgtcctgccc agattcttag atttgtctcc acgtaagctg  10920

tacatgctca tttcttaaat tcccatgaga taactgtttc cccaatgccc cctccccata  10980

tcccttcaat aaagtttgaa gaaactgaga cggagtctgc atgctttgag gcaaaagacc  11040

agagtaatat aacccttcaa ctccacccag taaggggccc aatttactat tacagatgag  11100

tcttccttga attcaattta agatacatca gacagttggg gcatttgcag ggagggggat  11160

tatgcaggca ttgacaagga gaattagcag gtgacttcca tagcagataa agagaagtca  11220

ttacctgagt aacgttatca tcattggcag tgttgaatct ccgcacttct ccagaatatt  11280

ggatgctgtg ctccagggca gaaggctgtt gttccggagc accaaagctg ttggggtagt  11340

aatttggagc accaccttca aaacaaaacc acccagatgc acttaggaat aagaaaagtc  11400

aagtaagtct gcaaataatc actgtgatga gaaataaatt caagtggtaa tcaaatacac  11460

acgtacacat acacagatat aaacacaacg cacacatatt atttttaatt tcccgcattt  11520

agctacaggt agtatgaaga ttcttaggga acgctgccat ctgctaaatg cttgcacagg  11580

ctgccgcact ttatgaatga atctcaaagt cccttttgac acttcaaagg gtctcatcta  11640

tcaagtcttc tgaggggtac agcacatgta gaagtttata caggcttgat ttggccacca  11700

tatagggatg aggctcaaag acacatttca aaattgactt gaaaaattgt gtcatttgga  11760

cttgggctca attcaaacac tgcatcacaa aattcttgag ggaaatctga aagttctggt  11820

tctgctcctt gaatctacag acacaagcat ggagctctgt gatgggacct gactgctgca  11880

aggtcacacg gtagccagtg gtagatatgg ggttggaact ctgggttttt tgtctcctcc  11940

agcccagcat atacagtatt tccattacag aactctactt tgctattccg taaagtgttt  12000

ttaggattct cagggtatct ctcctttact gacaatgatg actttgttcc attgtagctt  12060

cactttcata ccctccacag accaataaac aaagaatttt ttaaaatgtg gtaattgtat  12120

atcagcactt acttatctgg acttataaga aacagtgaca aatacaatca aaatattttc  12180

tatgactttt gaaataaatt ataaggcttt tttttcgttt tagcatattt attttctcaa  12240

ctatgctttg gctgacatta gcagaagctt tcattacccg agcacacact gcctaaacag  12300

gagtggccca gaaacatatt aagtggtttg agcaaaccaa tctggggttg gaattttagc  12360

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caattattca ctcaacaaat tcaacagatc agtcacatct acatgaaaag caaaatgctc  12540

caaaaaccag ccatcacagt gttttcttca ttaagaacta gctctttgaa atgtgcctag  12600

ttaattttta aaatcctact tccaaatgag ccctgacctt tactcaaagt ggtagttgtc  12660

tttaaagcac tgaccacagg aacaattaag ctctttcact gagcttcagg gtcacagccc  12720

aaatgctcta cttttacaat caagccaggc gcggtggctc atgcctgtaa tctcagcact  12780

ttggggggcc aaagtgggtg ggtcacctga ggtcaagagt tcaggaccag cctggccaat  12840

gaaaccctgt ctctactaaa aatacaaaaa ttagctggcg tggtggcaca ctcctatact  12900

tccagctact cgggaggctg aggcatgaga atctcttgaa cccagaggca gaggctgcag  12960

tgagccaaga tcatgcactg cactccagcc tgggcaacag agtgagactc tgtctaaaaa  13020

ataaataaat agataaataa atatagcaaa atgtaatagc tatgaccttt gggtgttggg  13080

actatatggg aatttttctt ttttcttctt tttcctatat attccaaatt ttctttagga  13140

cacttgtatt atttttatca tagaaaaata aactttgttt gaatatagac atctgtggct  13200

ataaatataa atcatcagta aaatttctaa agggatcaat gcatgcagtc tatattacta  13260

aaacacgtgt cctaaatggg aaaagaaaat aactaagatc tatattaaac tgtggaatag  13320

taaaaggaaa aaactttaat caagcattct gcttgactta ttagaaaaag taattagaac  13380

cagaggctgt ttgtatacga caccaaaaaa aaagtagtta aaagaaaaag atcctaagtt  13440

tgataaatga gttccaaaaa acaaaaagtg gtaagttgat tcacctaact ttattcactt  13500

aggaaaaaat gaagggaggg gaatcctttg acttgctctg cctcccctac tctcttctcc  13560

ccagccttcc ctgctaattc tagctcccct ccaaattcta gctagacctg ctcctccagg  13620

gccacagcag aactgcaaag agaaacagaa gactccaact cttggctttc gcacttccaa  13680

gggtctaagt cttggtgatt tcacagtgag ttaaggaatt gtccattttg gtgaagtgtc  13740

ttcaaaacct aactcccaag ctggatgtta ctgtactcta gccagtgtga aagatctttc  13800

tccctgcttt taactactgg atacaagtaa catctgaggt ggaaatgctc aataaaatat  13860

ataaaataga taaaaagcat ggagagtcct caggcagcct aaatcttcac tgctgggcaa  13920

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ccagcttgag agccactggc ctggcctccc gcccatctgc tccacgtgcc ctctgcccac  14040

gcagggggag cccaacgtct ttaggcctac cctgattgtc ctgcatgcac atcgggccgt  14100

cacgctggta gttggccact cgagcacggt agggacagtt cacaggtata tgaagataat  14160

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tgaattaatt ctattcctcc tcattccccc actccaggga aggaaccaat catttgctct  14640

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tctacaaaaa aaaaaattaa aacattagcc gagcatggtg gcatgtgcct gtagtcccag  14880

ctactccaac aggctgaagt gggaggactg cttggcccag gggattgagg cagcagtgag  14940

ctgcaatcgt gtcactgcaa tccagcctgg gcaacaaagc aagatcagaa aaaaaaaaaa  15000

aaaaaaaaaa aaagtaccgc ccactcccat gctgccttct gaattatctc agaaacactt  15060

tgagctctga gactttctag atataaacaa caataacaaa aaatctgtgg ttcaaaatga  15120

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tcctttggct caaaaagttg tgctcttgac tccatcaaca ggataggaga tacaatcctg  15660

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caatgtcata agcaaaaaag ttatttttta aaaacggaat cttagcttgt cctccatgca  17580

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aaaaaaaaaa aaaaagaaca agaaaataaa gttaggctta ccaaggtatt ataattaatt  18300

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ttctattatg tctttttttt ttaattaaga gagtaagtat tcttgtcttc acatatgtag  18420

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ctaattaggt aagaagagac ttaaaaaaga aaacaatata gttgtttact gactcacctt  19260

ggtgagatcg aatggattaa atggaaaagt ttctgcctga ttaaatgtca tgacctggat  19320

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ctggtcagtc tacaaaatga aagaaagaag ctccaatgga aacttattgt caaagttatc  19500

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ctttacaaca atacttctat tgttcaaatc tgatactaat gaatttatca acaagaaatt  19620

ctacttgatt atcccaatac ttttaaatgt caagggaatc ccatctacac atttcatatt  19680

taaaatcagt cctatctttc cctttatgta ttctattatt tgaattttta cactcatgtt  19740

actttccaaa tcagaaaaat caaaatatac ttaaaagtag gcaaaagatt aataaaatta  19800

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tcaattactg agactgtgct cggccagtat cccttcaccc ctgtcctatt cctttttttt  19920

ttttttttaa taaatcatag aatcatagct catagagttg aaaagaactt cagtacagcc  19980

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taagatattc cttagtttcc agaaagtccc ttaatgacat aaaacatact agccaatttc  21780

ccatgggaag ggttaccatt attatttcac ttgtagaaaa taacaaacag aaaaatttta  21840

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tttcaaatat actcaaaact atagtctttt cttttttttt ttttttaaga cagggtctca  22620

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tgtctatgac aaaactcaac agaccaactt cacacacaga gaaaagcact atttttagta  27240

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aaccacaaaa gatctgtgag ctgtttgaaa aaagatattg aataaaggag accgtgcaat  27420

ttgcaaaact aataaacaag accctctcac acactagtaa atgcccttgc cactagagtt  27480

atatcttcat ccaagtagga agaggccaac atggcagcag ggagaaacta tgagtgccag  27540

cactagagcc tgggtccaac ttccagttct accaattacc agctatgtag ctgctggtaa  27600

gttacttatt tatgagtctc cattttcatc tgcaaaatag aataataagt acctcctaag  27660

gttaacacat gaattaaaag agttaaatgt aaaatgcaag ccacacattc aacacatata  27720

tgctgtcact tcactggctg tgagaacatg acctcgcagc agaaggagca aagcatttga  27780

agttttattt ttctagtaat catgacagat gcatactcct ccatccacac tctctcactc  27840

taccatctct gtccctaaac ccatctagca aagccccttc taaactgtca cagtttaagg  27900

gtccaatcaa cacttaccac ccagtcacat cactcttttg aagatacata tgttgctaat  27960

acgtgtgacc ctctgtgacg tgctaatacg tgttaccctc tgtaggttta tttttaattt  28020

aaagtagaaa atgaaccaga aaaaaaattt ctactttcta aagtagaaaa tgaaccagaa  28080

aaagagcaat ttcaccttta gtttaaacct aaagccttgg ttttcaacct tggcaatgca  28140

ctaaaatcac ctgaggagct ttttaaagcc tcctgatgcc tgggccatcc cccctagaga  28200

tgtctgatag aagtgccctg ggtgaggcct gggctatttt taaatgactc ctgttcaagc  28260

taggattgaa aaccactaac ctagaactat tgggtgataa caaagttaaa ataattagag  28320

agccagagca aaccaaatct gttcactctt taaatgctct tttcaactta caaacaaggt  28380

atttaaggaa gcctttaaaa aataaaggga catccaggct gggcgcggtg gctcacacct  28440

gtaatcccaa cacttcggga ggctgcagca ggtggatcac ctgagatcag gagttcgaga  28500

ccagcctgac caacatggag aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaatt agtaccaggt  28560

gcagtggagg ggtgactgta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga gaatcgcttg  28620

aacccagcag gcggaggttg cggtgagctg agatcgtgcc attgcactcc agcctgggca  28680

acagcagcga aactccgtct caaaaaaaaa aaggggggga catcccataa aaggtacaag  28740

tatgagaaaa gataccaaga agctcagtaa aaggaacgct aaacagatga gagtgttatt  28800

tacatgccag cattcttaac gtggggaggg agctgcccct aaggcagaga tgagagcaca  28860

tcacatgttc ccttctggtt accgggtcag ggtgatatgg tcaagaataa ataccacacc  28920

caaaggcagc aggtgcagag ttggataaat gaataaagta ctaaagcttg aggtggtctt  28980

tcctgatgac actgactatt aagagtggga atgctggaat tatggcagtc ctccctcctg  29040

cccaatgaag gaatcccctc cttaacatca atcctgttaa gaaatgaaac ctgagttttt  29100

aagttacaaa tggaggcttc agaatctctt ccatttcccc actctaacag ttagatcaat  29160

tgtcctcatt tatataacag ctttccccac aagctcatgt atatacaatt taccttcaaa  29220

gccagtgggg caggaaagct tcaacagtca gcaacagaaa agggaagcca gggagcaaaa  29280

actagaaagg aaaagatccc ccaacttcag gggatgttta gcgcaacatt ggataagagg  29340

aactgatcta aactgaaaga tagagtatta atattagaag gtgaggagca ggatgcggtg  29400

tatttaagat gaaaataatt aatgcaatga agatttacta gatgaaatga gagggtgggg  29460

ctagaaaacg gaccacgcaa gttatctcac ttaagcctgt caataatcca gagatcaata  29520

ttattaatcc catttaatgg gcgatactac aaactcagaa aacttaagta actttgcaga  29580

gatgtcagtg ttgtggcaca ggtttacttg ttacatgtaa cacgtaagga caggcaaaga  29640

gatttcctcc aacttgcaat tattgttttt aactcaatga ataactttag agccagaata  29700

tttttaaaga gagaaaagct tctctatggc tggataattt taagacctct ctctggagag  29760

gtccttgtta acatgtttac atcttcctgg ctgctagctc ccatgacatc catacgtacc  29820

tctcctgaac tgctctctct accctgcccc acaccactca tgaagcaggg ccaagggcat  29880

cttcttgtgc cccatataac aaaatattgt aattgcctgt ttatgtcact gtttttcttt  29940

tttttttttt tttttttttt ttttgagatg gagtctcgct ctattgccca ggctggagtg  30000

cagtggcatg gtctcagctc actgtaacct ccacctcctc ccgggttcaa gcaattctcc  30060

cgtctcagcc tcccaagtag ttgggattac aggcgaccac caccacaccc agctaatttt  30120

tgtattttta gtaaagacag ggttccatca tgttggccag gctgatgatc tcaaactcct  30180

gacctcaaga aatccgccca tcttggcctc ccaaagtgct gggattatag gcgtgagcca  30240

ccgcgcccag cctgtcacta tttttcctct ctagactgtg tactcctttt acatctatat  30300

acctgatccc taatacactg ctcaatatac taacaaacat aaaacaaatg tgtgtggatt  30360

cagcatgcaa ataaactaaa ccacggacca atatgatatg gccaagagcc tttctaacaa  30420

gcaggaggaa gcagcaacag tctatccctc tccctgcatc gcccctccaa aaaatgagag  30480

aaatatttta atttataaat tctgatcaaa cacctttaga cacacttgtt atgaaaactg  30540

ccacagaaat tagcttggct aaaaactagc acaattatta gaagtaggga cttaaagtaa  30600

aattctattt tgactttgct gcctttatag gcttcttttg gccagagcta atacataaat  30660

gaagaagttt tcctgggagg agtaaggttg gcttcatctg gtgaaatatt ttatcaacat  30720

attacacttt ccacttagta gttcccttca ctcacagaag tttcaagaac ctaaacatat  30780

tcttccactt ttaattaaaa gattggttaa tgcaaattgc ccatcagtcc cagaggagtc  30840

ataatgacgt cttttcattc tgtgataaag aatgtgccta gcgttttcta gcaaataact  30900

gcctaacatt ctccatttat tcaacaaaga ttcaagtgcc tacaacgtat acacccacgt  30960

acaggaaacc aaagactgtc ctgaccttca aatttcttgg tctgtgggaa aataataagg  31020

gtggtctaga tattgactgc tgtggaagct aaagcaattc cgtcttagat actgatccac  31080

catgctgact tctgattaac tccagtttta agatttccag tttatctatt attccttgtg  31140

aaagagcccc tatttactat aaatcctgcc ctgaggtcaa acaaccttga cattatcata  31200

cttcagtcat gccatacctc ccttctgaat cgcccttccc tatggtatta agccctgggt  31260

ctgaggggta atggtatggg atccaccatc ttgtctcgcc aacacgcaag acacagacat  31320

ggtttctggt cctaagtccc tactaaacat ttctttctga gaaacttgat ttgtcagcct  31380

ctttctttgg cctctcagct tcctcagact ttgggggtag gtttgcatag acctacccac  31440

catgcaaaag ctaaaaaaaa gaaatgaaac cttaaaaatt tctgtcccat ctcccatagt  31500

ctctcccact gcacataatg acttagcgat tccataccta ggtatatttc aggagaaatg  31560

aaagcacatg tggaccaagg gttaagtcac tcagtcaccc cttctccatc ccaaatgtta  31620

gcagtgtaac atcaatgcag ttattaccag gattacccta aaaaaatata gaccctcaca  31680

ggctataatg cataggcaac tcactgacag aaatggatag tctaagactt aacctctctc  31740

ccaggtaata agagaactgt ataaaaaggt aaggtttgaa atgttcaaat tctcccattt  31800

taaagggatc agaggctact tattaacatt tcccatttac ccccaagaaa agagcactgg  31860

cagcaagctg cacttaaaaa aaaaaaaagg aaatgggtta aaggtaagta tctcaaaaga  31920

agagcccatg gcattctaag cagtgagcaa taaagttccc atttaagttc ccttcaaagt  31980

ggctgggaat acctgcacaa ccacctccct cctgccaaga gagaaaaaga aataagaatt  32040

tttaagtgga tcgaggtcat actcatgaac acatctgact caatgctcac ttattaaagt  32100

ttacaaaact cccaattcac ctgtcagcaa accaaatctg accacagaag atacgcccaa  32160

taaattgctt tcacatggtt gactgtgttt ccaaaatagg acactctgat tcttgagaga  32220

ggaggcaaca gagtgttcgc ctatagtagt cccaaaccat aaagctctcc tagatcagta  32280

aagcatcaca actaattggg aagtggaaga catcatatta gcacaaagct gcccacttag  32340

ataaaagcat ttaccaagca aggggagatt tttttttaat accatctgtt actgtcataa  32400

ttttctaaca gaatatctta atgtcagaaa gtaaaaatga catattcttt aaaaagaaat  32460

tatgttgcat gtccattgcc gcatcacaag aaaatggctg gacagatttt caccaaatat  32520

gaaatgtacg ctttggataa tatagtagag tcagcttcct ggacaggggg tagactaccc  32580

caggtgtggc ctgtaacaga gttctagcca acagaatgta agtggcagtg accctggacc  32640

ctaaaccttc ccacactcat atacccttct ccacgctctt gagccttctg tgctggacag  32700

tgacgcccat aaaagccatg tttgaccaag ggggagcttc cttcagcctg gtgccctcaa  32760

taactgtggg aagcagagca cccacccacc tccttcaacc tcaaaccact ttgggccatt  32820

catgtaggaa aggaatacat ttcttttttt ttctttttga gatggagttt cactcttgtt  32880

gcccaggctg gagtgcaatg gcaggatctc ggcttactgc aacctccgcc tccagggttc  32940

aagtgattat cctgcctcag cctcccaagc agctgggatt acaggcatgt gccaccacgc  33000

ccagctaatt ttgtattttt agtagagaca gggtttctcc atattggtca ggctagtttt  33060

gaactcctga cctcaggtga tccgcccacc tcagcctccc aaagtgctgg attataggtg  33120

tgagtcactg cacccggcca taaatttcta atatgtttat accatgatac atgttgagat  33180

ttattattat aacacttagc ctacacatga ttccacatga ttgaacttaa aatatgggct  33240

atgaattaat aatttaaaag caattcaatt tttaaaaaga cagaaaattt gaacatatac  33300

ttcaaaggaa tatataccaa tggtcaataa gcatgtaaaa agatgctttg catcattagt  33360

catcagagca aagcaaatta aaaccataat gagataccac tgcacaccca acaactaaat  33420

gtaaaagact gacaacacca aaagttggta ggatgtggag caactggaac tcccatacac  33480

tgctgatgaa gtataaaatg gtacaaccac tttggaaaaa ggctcagcag tttctcataa  33540

cacattcact taccttatga cccaataaat ctactcctag gtatttccta agagaaataa  33600

aaccacctgt gcacaaaaag acttatgtaa gaatttttat agcagcttta tttattttta  33660

atttttaaga cagggtctcc ctctgtcacc caggctagag tgcagtcatg taatcatggc  33720

tcactgcagc ctccacaccc caagctcaag caatcctccc aactcaactt cccgagtagc  33780

tgggactaca ggcatgtgtc accatgtctg gctacttctt ttatttgttg tagagatggg  33840

ttttcaccat gttgcttagg ctggtctcaa ctcctgagct caaactatcc tcccacctca  33900

gcctccaaaa gtggtagggt tataggcata agccttcatg cccagccaca gcagctttac  33960

ttacaataga aaaaaaatta aatagcccag gtgtccagca acaggatatc caaatggtgg  34020

tatattcaaa taatggaatc ttactcagca atgaaaagaa caaactgcta atacatgaaa  34080

caacttgaat gaattaaagg atggacagac agatggagta acgtaataaa agacacaggg  34140

caaaatgttc cttgtagaat ctagatggca gatatataga tatacactgc aaaatttttt  34200

caacttttct gaatatttga aatttttcat ttaaaaaaag tgtttgaaaa ttatataggc  34260

tataaggcat atgcataatt ccttttggag ggccctgggt ggagggagaa gtgcctaaaa  34320

gaagtaagcg gtttttacta agagcagcta aaactgagga acagtaagac atcaatgtga  34380

ctgccaatca ggacgatgta cacagtgccc tgagatgtca tggacaaagg ggatggctgt  34440

atttcaatta agagcctccc aactatagat gtgttttgga gtcagccatt tctcacatgg  34500

gcaactatgt aaggtaaatc aacagcaggg acttcaacag ttcatgattc tcccaaacaa  34560

ggaagaaggc agctagtctc agaataaagg ggagtccttt aaaaatgaaa atattacacc  34620

tgtaatctcg gtactttggg aggccaaggc gggcagatct cctgaggtca ggagttccag  34680

tccagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggt  34740

gtggtggtgg acacctgtaa tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aattgcttga  34800

atccgggagg cggagtttgc agtgagtgga gatcatacca ctgcactcca gcctgggcaa  34860

cagagcaaga ctccgtctca aaaaaaaaaa aagaaaagaa aagaaaaaga aaaagaaaat  34920

attttgtttt gtaaaaatct cactactttg tccacacttt tctcaattca ccgagtattc  34980

atgaaaactt cagtgtgaac caggatttgc acccactggg taaggaaaga gtcttgggtc  35040

caagaagctg aattctaacc ttgtctctgc cagtaagtag tggcacatcc tttactaaga  35100

ctctacctct ctctggttta ctttaagagc tcatgaacca acctaatggt atataacaaa  35160

gaacagggcc aagaggggag attttccagg cccttggagg agaatggcag ccttttccca  35220

aacagggaac cattaaagca atccatgagc acttagcatt aataccccag ttcacgaacc  35280

tgagttttga gcaagagcac taggcagaat agggaaaaca gggctgcagt cctctgtcta  35340

ccattaacca gcagccaggg aacagggcaa gacctttaga ctccctgggc caatctgcca  35400

acagtagact cagaccagat gtggtctcat ctaatccaac ctcctcatag atgccctctg  35460

agactctgca gccgtgggca caggccagga atgcctcccc caccaccaag ttaaaatcct  35520

actcatttaa aaaaattcct gttcaaatgt cacctgcttt gtccggccca cctggtcact  35580

ccctctacat tctacagata acctctatta gagccctcac cacgctggag tgtaatcatc  35640

tgtttatgtg tctcgtctcc cagactagac tctcagcttc tcaagggtgt tgttcttgcc  35700

gcactggaat ttgtacacct tgccccgaac agtgcctagc acctacaggt gctcaaagaa  35760

tagaataaac gcattaatca atccctaatg tcacccccca gctctaaaat gctaggcttg  35820

acattttgaa gtgcaaatga gacaatgaat gtaaaagttc ttttatttag tcgtttaata  35880

atgtgcatag tacgtaccag tcactgtgac tggtgctgga gacctcaaga ttgtaaaaca  35940

caatccctgc cctgctggga ccccacaact atgaaagcgt gtaaacagta tttcaagaag  36000

ggcaccatta gagcctggtt ccacttctcc cctcactgac ttccttgcag ctgcagctct  36060

ctgcctcttt ccccatgagc cctcaatctg tcctcaagct gcgacctctg tcccagttgg  36120

caaaagtgca aaattctgaa gcaaccaccc gagcctgtcg cggacaacaa agcctgcagt  36180

cccgcgcccc actacccgga cccccctccc ctgcttcggc gaatgtaaaa gtccgtctgc  36240

accgaagggg atcccccctg cccagtgagc cgcggtacag tccctccaag cgccgccccg  36300

ggggaagccg ggcctttact tgccgacgcc cccgctttct aaacggacct tcgggcccgc  36360

tcggggagca cagagtgtac ctgcgcggcc cgctgctcct tccagtgctg catctggtcg  36420

ctggcgggat cccggctgtc agccatagcg tgcggtttgc tgtgcagaac actgcaggag  36480

gcctcggctc gtgggtctcc accctcagca ggcaaatctg cctgttgccc cgagtccgtg  36540

gcgacttcag gctcagccaa tcagcaccac cccctcgtcc cgccccctcg ggaggactgc  36600

cttctgattg gctgctcggc gctaggcagg ccaagattgg aagcccaatg ggctcggagc  36660

agggctctcc gaaggaggcc tgaagaccgg agatacccag gagggtgcgg aaaggaaggg  36720

tcccgctctg gcccagcaat tggagagcct cgccccgccg gcccggggtg cccgggatag  36780

ccgaacccag ggcggggctc ccggttatca gcatccttca ggccgccctg ggacgcggcc  36840

gttggtggcc tgccagtttt gcagacggaa tacttagacc ctgctgggtg gggccttgcg  36900

ctccatagct atgctttctc agctcttaaa aagtcagcaa tcctgggtta aattactctg  36960

tacaaaatta aattttgcca tacgctaatg taagtattat ttgcaaccaa aggatggatg  37020

gatgcttttc tttttctttc ttagctcttc ttaacttatt cgtggattat cacttactag  37080

actagtatac taattattta atataaaaac actctgaaac gtttatctcc gtacagatgg  37140

gtgttgattt cctcctttac cagagaaaaa caacttaact tagatgggaa aaatgtattc  37200

ccttgtgatg ggaaaaatgt attcaactct ggtacactgc caaattggct tctttaaaca  37260

ctggagaaat ctgcttcccc aaattttacc cccaggtaag caggaatttt gaaaagcttt  37320

gtgtctttaa aaagctatgt tgaagagtaa aatacttagt aatatatagt acaatattta  37380

gtaagttact gactagtttg tcattgtaat caaagagttt gaatgatttc tacacctcct  37440

caggtgctag gatttatctt taagcacctt aatatatata catagtatat accatcatct  37500

tcaaattaaa agttatcagc ttttaatttt ttccagtaca actacatata atgggtggat  37560

atataatagt ggaaacttca catgttgttc ttgatcttac aaaagtatga taagaatctt  37620

gggcataaaa gtggaacttt agcagttcat tggaaaagaa agccacaaat tgatctttag  37680

caccctatac ttttcctata ttaaaaacaa ttataaagat gctgttggct gtgtaatttg  37740

gtgtcttttt ctacctgccc gatccatact gccaagactg taaactccat gtgggtcagg  37800

atcctcccat ccataattta ttgagcactt actatatacc agggactatt ctcagctttt  37860

tgtatatttg cttagttaac cctcccaaca accctatgag ttagatacta atattatctt  37920

cattttacag attaggaaac agaggtatag ggaggttaaa taacttgccc aaagttacac  37980

agctattaag ggatagtcag gattctagct tcagctgttc atctccaaag tccacagttt  38040

gttgaataaa taaatgttga aataatcgag caaatcatct tcttaactaa ccaacacaaa  38100

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

tgtgcagaac actgcagga                                             19

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

tattccgtct gcaaaactgg                                            20

Claims (10)

1.一种体外检测样品是否存在过氧化氢酶基因CAT的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用CAT基因特异性引物扩增样品的CAT基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

36535位T→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQID NO：2和3的序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第36535位。

4.一种检测高血压的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增CAT基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第36535位的扩增产物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第36535位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第36535位的突变限制性内切酶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是以下的单核苷酸多态性：

36535位T→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

8.一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测该个体的CAT基因、转录本和/或蛋白，并与正常的CAT基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，检测的是CAT的基因或转录本，并与正常CAT核苷酸序列比较差异。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

36535位T→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。