CN1661047A - 成髓细胞性白血病原癌基因与原发性高血压的相关性 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的成髓细胞性白血病原癌基因MYB、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患原发性高血压的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。

Description

成髓细胞性白血病原癌基因与原发性高血压的相关性

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及成髓细胞性白血病原癌基因(myeloblastosis oncogene，MYB)的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)及其与原发性高血压的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。

背景技术

高血压是指收缩压或舒张压升高的一组临床症侯群。血压的升高与冠心病、肾功能障碍、高血压心脏病及高血压并发脑卒中的发生存在明显的因果关系。高血压最新的诊断标准是收缩压≥19kpa(140mmHg)或舒张压≥12kpa(90mmHg)，符合其中一项者可确诊为高血压。

大多数的高血压患者在血压升高早期仅有轻微的自觉症状，如头痛、头晕、失眠、耳鸣、烦燥、工作和学习精力不易集中并容易出现疲劳等。随着病情的发展，特别是出现并发症时，症状逐渐增多并明显，如手指麻木和僵硬、多走路时出现下肢疼痛，或出现颈背部肌肉酸痛紧张感。当出现心慌、气促、胸闷、心前区疼痛时表明心脏已受累，出现夜间尿频、多尿、尿液清淡时表明肾脏受累、肾小动脉发生硬化。如果高血压患者突然出现神志不清、呼吸深沉不规则、大小便失禁等提示可能发生脑出血，如果是逐渐出现一侧肢体活动不便、麻木甚至麻痹，应当怀疑是否有脑血栓的形成。

高血压早期无明显异常体征出现。当脑、心、肾等重要器官出现轻度损害时可有异常的体征出现。常见的心脏异常表现有心尖搏动左移、心前区有抬举样搏动感，听诊心尖区第一心音增强、主动脉瓣区第二心音增强且有收缩期杂音和舒张期杂音，表明已发生动脉硬化和左心室肥厚，如果在心尖区听及奔马样心律可能表明有心力衰竭的出现。另外还常见耳垂出现折痕、毛细血管搏动、桡动脉出现硬脉或无脉及下肢间歇性跛行等。

此外，由于某些诱发因素或高血压本身的发展，可导致一些高血压患者血压显著或急骤升高，同时伴有脑、心、肾、视网膜等重要器官功能损害，严重危及生命，出现一系列临床特殊征象，称为高血压急症。高血压急症的发病率占高血压人群的5％，常见有高血压脑病、脑出血、急性左心衰竭、可乐宁急性停药综合征、急性心肌梗塞、急进型恶性高血压等。

高血压患者中约5％左右无自觉症状，也不知道血压何时升高，更不知道什么时候已产生了血管和器官损害的并发症，有些患者甚至在发生了心血管意外之后才知道自己患有高血压。所以，找出高血压发病的遗传原因，及早的进行预防以及检测，可以有效控制高血压的发病，将疾病对人体的伤害减到最小。

原发性高血压(essential hypertension，EH)也叫高血压病，是一种独立的疾病，有着自己的病因、发生发展转归的规律和临床表现。临床上主要表现为动脉血压的升高。占人群高血压患者的90％以上，目前发病机理尚未完全明了，主要依据排除了其他疾病导致的高血压后才能诊断为原发性高血压(高血压病)。动脉血压的升高主要是因外周小动脉阻力增高所致，同时有不同程度的血容量和心输出量的增加。晚期常导致心、脑、肾等脏器受累发生高血压心脏病、心力衰竭、肾功能障碍、脑出血等严重并发症。原发性高血压的治疗主要是降低血压同时防止并发症的发生。原发性高血压患者致死原因为脑血管意外、心血管意外和肾功能不全，我国以脑血管意外为多见，心力衰竭和尿毒症次之，而欧美国家以心力衰竭多见，脑血管意外和尿毒症次之。

原发性高血压作为最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。

虽然已有许多关于各种基因多态性与原发性高血压的研究，但没有证实MYB基因与原发性高血压相关性的报道，更没有证实MYB基因的SNP与原发性高血压相关性的报道。

综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻找原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)高血压的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗高血压的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗高血压的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的MYB基因、转录本和/或蛋白，并与正常的MYB基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，所述的方法中检测的是MYB的基因或转录本，并与正常MYB核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

24108位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在成髓细胞性白血病原癌基因MYB的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)用MYB基因特异性引物扩增样品的MYB基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

24108位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ IDNO：1中第24108位。

在本发明的第三方面，提供了一种检测高血压的试剂盒，它包括特异性扩增MYB基因或转录本的引物，更佳地，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第24108位的扩增产物。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第24108位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第24108位的突变限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

24108位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的MYB蛋白的抑制剂或拮抗剂以及药学上可接受的载体。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了MYB的基因组序列与高血压密切相关，而且发现了它的新功能：MYB的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在MYB第24108位的SNP(24108位C→T)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，因此可作为检测高血压的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。

MYB基因

成髓细胞性白血病原癌基因(myeloblastosis oncogene，MYB)的详细序列可参见登录号为U22376的核苷酸序列(可参见网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO：1所示。

c-myb基因属于一个结构和功能上已经比较清楚原癌基因，其是一种DNA结合蛋白。c-myb的表达是生长依赖性的，静止细胞表达水平低，当细胞增殖旺盛时，其基因表达迅速增加，G1晚期达到高峰(Bwown KE et al，J Biol Chem.1992 Mar 5；267(7)：4625-30.)。c-myb除了与肿瘤细胞的增殖密切相关，人们发现作为转录因子MYB的表达增强是引起平滑肌细胞(VSMC)增殖的原因之一。

血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和表型改变是动脉粥样硬化及其他闭塞性血管疾病的主要病理基础(Miano JM，et al.Am J Pathol，1990，137：7612765.)。由于MYB与血管的平滑肌细胞增殖存在关系，这提示其可能与血压调节有关。1992年Simons M等人用球囊导管损伤大鼠主动脉，同时用反义和正义myb寡核苷酸(ODNs)分别导入损伤处，发现反义myb寡核苷酸(ODNs)能明显地抑制颈动脉平滑肌细胞(carotid artery smooth muscle cells)的增殖，对正常中膜无明显作用(Simons M，et al.Circ Res.1992 Apr；70(4)：835-43.)。

细胞内的Ca²⁺浓度的变化与细胞周期有关，G1到S期的转变是由细胞内Ca²⁺浓度的上升激活的，而转录因子c-Myb通过与细胞膜Ca²⁺ATPase-1(PMCA1))的启动子区的结合，调节细胞内Ca²⁺水平，导致G1/S的转变。因此针对c-Myb靶点的药物，可以通过抑制MYB的表达，调节动脉平滑肌细胞的增殖，降低血液循环的外周阻力，可能达到治疗动脉粥样硬化和高血压的目的。(Afroze T，et al Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord.2001 Jun；1(1)：23-40)。

本发明人对MYB基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与高血压易感性并不相关，然而关联研究表明24108位C→T却是与高血压易感性关联性非常高的SNP。该SNP位于MYB的第12号内含子中，提示对MYB的转录水平有影响，进而导致影响MYB的表达和平滑肌细胞的增殖，并最终导致携带者的高血压易感性明显高于正常人群。

基于本发明的新发现，MYB蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进MYB蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人MYB蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制人MYB蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人MYB DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MYB基因产物或片段。较佳地，指那些能与人MYB基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人MYB蛋白的分子，也包括那些并不影响人MYB蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人MYB基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人MYB蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人MYB蛋白功能的抗体以及不影响人MYB蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人MYB基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人MYB基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人MYB蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人MYB蛋白的多少和/或突变与否。一种优选的抗MYB抗体是不识别正常MYB但识别突变MYB的抗体，或者识别正常MYB但不识别突变MYB的抗体。利用这些抗体，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。

利用本发明MYB蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与MYB蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明MYB蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明MYB蛋白的抑制剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的MYB蛋白的拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人MYB蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于MYB蛋白的无表达或异常/无活性的MYB蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带MYB基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人MYB基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还涉及定量和定位检测人MYB蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括ELISA等。

一种检测检测样品中是否存在MYB蛋白的方法是利用MYB蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与MYB蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在MYB蛋白。

MYB蛋白的多聚核苷酸可用于MYB蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，MYB蛋白的多聚核苷酸可用于检测MYB蛋白的表达与否或在疾病状态下MYB蛋白的异常表达。如MYB DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断MYB蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用MYB蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测MYB蛋白的转录产物。

检测MYB基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。MYB蛋白突变的形式包括与正常野生型MYB DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用MYB基因特异性引物扩增样品的MYB基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：24108位C→T，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

应理解，在本发明首次揭示了MYB基因的SNP与高血压的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在24108位C→T。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：2和3的序列。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO：1中第24108位。

由于本发明的SNP与高血压具有非常高的关联性，因此不仅可用于早期较准确地诊断原发性高血压，而且可以未雨绸缪地使携带者在未发病前就采取合理的预防措施(如在饮食上采取相应控制)，从而提高携带者的生存期和生存质量，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.1研究对象

由于血压是多基因参与的受多种环境因素影响的数量性状，必然在分析相关基因时要考虑遗传异质性的问题。选择遗传背景相对比较单一的隔离人群作为研究多基因疾病的材料将有助于降低遗传异质性的影响，同时由于这些群体具有比较固定的生活环境和较为一致的生活习惯使得环境因素的影响大大降低。选择这样的群体，不论是用于连锁不平衡分析，还是从中选取家系进行家系分析，都有助于提高高血压易感基因位点的检测灵敏度。因此在本实施例中选定隔离群体作为研究对象(隔离群体具有遗传背景的相对一致性，奠基者数目比较少的优点)。

在知情同意的基础上随机收集了324个年龄在50岁以上的汉族个体，均来自于安徽省岳西县大别山响肠镇。80％的个体只有6个姓，奠基者数目应该比较少，并且同一性别的个体来自于同一个奠基者。选用的高血压样本要求收缩压不低于140mmHg，舒张压不低于90mmHg，测量血压两次取平均值。

挑选其中的11％位于血压分布的最顶端(37例个体；SBP＞178mmHg)和有7％位于血压分布的最底端的(22个个体；SBP＜104mmHg)共59个个体，通过直接测序的方法进行SNP的检测。

1.2实验方法和结果

1.2.1 DNA提取

用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。

1.2.2 PCR及测序引物的设计

根据GenBank中MYB的基因组序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。

                      表1引物序列表

引物名称	序列(5′-3′)	SEQ ID NO：
			有义引物	gcaccagcatcagaagatga	2
反义引物	catttgagggcagaagaaga	3

1.2.3 MYB基因的PCR扩增

以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。

结果，获得402bp的扩增产物。

1.2.4 SNP的发现和检测

PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRIS^TM 377 DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http：//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。

结果，发现存在以下SNP：24108位C→T。

1.2.5 SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型。即在高血压病人和正常血压对照组中进行分型和关联分析。

等位基因的频率统计出来以后进行卡方检验，通过对血压最高的11％和最低的7％个体数据进行比较，初步确定是否等位基因的频率和血压水平连锁。

结果发现SEQ ID NO：1中24108位的T型SNP在高血压个体中的频率为42.1％，而在低血压人群中的频率为17.6％。两者之间的频率差为24.5％，证实了SEQ IDNO：1中24108位的C/T型SNP与高血压的发生存在着相关性。

实施例2

原发性高血压易感性检测试剂盒

如实施例1所述，SEQ ID NO：1中24108位C→T的突变与高血压疾病密切相关。因此，可基于这个突变设计MYB基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

名称	序列	浓度
			有义引物	SEQ ID NO：2	100pmol
反义引物	SEQ ID NO：3	100pmol
			PCR反应液	含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液

抽取待检测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出24108位C→T。

检测结果，含24108位C→T的检测对象的高血压易感性高于正常人群。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                          序列表

<110>复旦大学

     上海人类基因组研究中心

<120>成髓细胞性白血病原癌基因与原发性高血压的相关性

<130>040145

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>40433

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gaattcttta ttggactatg catattccca aacatattat tgtcatacaa ctgagggaaa     60

aatgtaaaac tatatctggg aaatgaaaaa ttataaattc tcaaaatgat acataggaaa    120

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gcgccatggc ccgaagaccc cggcacaggt aacggggagc cgggcgggcg gccgagggcg   2280

ggggcggggg tcgcggggcg ccaggctccc gggagcaggt gggaattcgt tccgggatca   2340

tctgaggggc tgtcagaccc tccgaggacc tggagcccct gcctcggcag cagaagccgc   2400

tccagagact gatgaatgga agagtctttg cgggaaatgt atccggacgt tgggaagcac    2460

gccctgcggc tcattttgca agttgcatgg ggatacattt ttctttaggg ggaaaaagaa    2520

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tatgtttgga cttggaagtg cagagcatat ggcagataca gggaaaatgc tggattgttt    2700

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attgtcttaa gacctggttt tggaggttcg aatcattttt ctctgaaagg cttttacttc    2880

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ggctcgccgg gaagatgggt gcagtccctt cacatttttg gccggacaga tgggaagagg    3000

gagaggagga ggaggaggga aatcctcgtc cgaactgtca gttgctcgtt ccccagtctc    3060

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ggagttctaa ggcgaagtcc atggaggcaa agcaaatcca ttcgcctttc cttagattgt    3420

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ttttcttttt cgtttctttg cacggtttgt ttccttgaca gaatgtaaca ttcatagttg    4140

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atcgcatgca aagttcaaag gcgagcctgg gtggccagcc tggcagggaa actcaggagc    4380

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gcttttaaga ggcacggaag gacatggcat ggtcatgtat tagcgctgga aagtacctta    4560

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tattacagat tataaatata tatttcctgg gattttattt ggtggtggtg gtattttaaa    5220

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ctttaaatta tgagaacccc caattcagga tttttggtaa gcacttcagc ttcacttgta    5340

gggggctggt aatatgcata ccagtgagtt agtttgggaa gacaaaacct gtaatgaata    5400

taacttttct ttttaaaaac aatgatttac attatgatat ggctttatat cattgttttt    5460

attggtctta gtttaatggg tttcccaaca ttgcaatgac aaattttagt gaagtttcta    5520

agatagtatt tttcctattt taagttttat aagaaaaact ataaaataaa ccgtgtctgt    5580

aaaattattg tcatctgatc agttgattag attaacaaac attatgatta tgattaacaa    5640

acagtaagca tatagttact tcttcaaaag tcataaaatt tcctaggtta ggttaactaa    5700

ataaaagaaa aagctttcga aaatagtaat gggttctttt aaatccatgg cttttttctg    5760

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gtgagcaatt tggtattaat tttatttaca aaacattaaa gcttgatcac tcaatgttct    6000

tatctttgct ttggttttaa aatcctttcc tcttagattc tcctaatcct ctagacttta    6060

tgggatcact ataatcctgt tttgcgctgt actacttctt gatttttttc ttcttttaat    6120

aaaacaaaaa ccccattgga atagcatagt tgaattgttt attatgtttg agaaatatta    6180

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tcattttatc aagacgcaga aaatagatag agtgtataat ttataaaaaa caaaatttca    6780

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cttctgtgaa gccatccctg gcttcgccgg acaaggattg gatgcatcct cctgtgatcc    7080

catgcatggg tgcatgttct actttattgt tgctgggaca tatatacctc ctccagctga    7140

ctgcaagtct gttgagggca gggctcttgt ctattcatct ttgtgtttcc tgaattcaca    7200

aatgcttgga cccaaaatag gatattaata aatgttctct caataagtga atgacttgct    7260

actcccaaaa acaaaacaaa caaaagaata aaacaaaaca ctcagagaac  tcatcttttt   7320

acagtgtatt gatttaatat ccttgatata cttaacagag ccatctatat gaaggtatgt    7380

tttaaaatca tccgataatg gatggagaca catctgcttc tcctgtttct ttttcggctg    7440

gcttatcaaa agtttgattt tgtaggaatg gaaaaatatt ttagaagcaa aattattaat    7500

atgtggagaa aagtttctct aatgttctta aaatttttgc aactaatttt agatgattca    7560

tgttacaata aatggtattg gctcttcttc agtttcactg ttctctgctt catttaaacc    7620

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acctattaag attatccact tggataatcc ttatgatacg gaaattctgt tgtcaacatt    7740

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tttgcagaaa cataagaagg aatgcattta tatacttatg aactggtagg attgtgaaca    7860

gcatataaac taaaagaact gattagctgg aaatgtttaa tgtcttttat gttctaacac    7920

atctggccta tctaaatcta actgattttc ttatatagct ttcaaattta attttaaaaa    7980

tggtctttat ttcttttata aaaagttaaa ctaactggaa atattctatt tcttgctcaa    8040

gatcctattt attaccatag gtaaatgtgt actgaatcta gcactggaat gcattttttc    8100

ctaacagagt aaagcagtta tttataataa acactcaata tatgccaggc attatgataa    8160

atgttttgca aaattgcctc atgtaatccc caaataaccc tgttaatatc agcctcatgt    8220

taataaattg ccccatgtaa tccccaaata accctgttaa tttccatttt atagatggca    8280

atactaaggc ccagaaaggt aaaatggtat acccgcttta cacaattaat agttgagtca    8340

agatgccaac tctggtctga ttctaaataa atctatactc ccaagtccgt atattacatt    8400

aatatctcct gtattcggat actttagaga gactttttat tctagattcg ttccctcatt    8460

cactttaact tgaacagagt tatatagtaa ataactgata tcctaggatt acctttaaat    8520

gtcttaggat gaaaaactga agaagctggt ggaacagaat ggaacagatg actggaaagt    8580

tattgccaat tatctcccgg taagttagta agtttttctt ataacgaaag gaaagcttct    8640

cccaaagatt tctataaaat attctaggag gagttattaa gatagtgtat aatttactca    8700

catttaagaa gtgggagaaa tgccctaccc ataacttata ttttatatta taatgcatat    8760

aattaaatta ttagaattta gattattaga atcgattatt ataatttaga ttatcaaatt    8820

ttaaaaacag ttgcttcttg ttttatcttt tcatttatag gataattagt attttgatga    8880

tttgttacat ggtagttgat taaacttgat atttcctcca agtcagtttt tcctgaattc    8940

cctatttttg tcaatagcaa tacttttggc accaaggttt aaaattctga agacctttct    9000

tgacttatca cattccccca acccctacat ctaagcagtt actaaggacc ctggaattcc    9060

tttatagtca gtcccgtcct tttcattctc atggctgtgc tgaaggttgg gctcctgcct    9120

ctcatttgga ctatcatata acttcctaac tggcttcccc acttgtagtt ttccattttt    9180

ctttcttttt tttttttttg ttttttgttt tttttttttt gagatggaat ctagctttgt    9240

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cctggctaat ttttgtattt ttagtagaga caaggtttca ccatattgat caggctggtc    9420

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aggtggaact tcctaaaatg cagctgtacc ttatcttttc aaaaccaacc acagtgacag   9600

aatctcacaa attaagtaaa ctgccttgac ttggcacaca gaggccctcc tctattgccc   9660

caacttacag ctccagttct gtttcctgct tcctctctct aagcaggttt gcttgaattt   9720

atttctgctt tacctcctct gggcttttgc tcctggtctt cccacctcct agaatattct   9780

ccctttatgt caccaattaa agttctgtcc atccttcaaa gtccttatga agagctcttc   9840

aagactcctc ccaaggaaac catttctcct cctaagaaga tgcttctctc ctcacttcag   9900

tatcattttg ctttggtctt ttcttccaag tgaatcaaat tcagcatctg tgatagtcag   9960

tcatctactt gtcttttcct tcttataagt ttacaaactc ctgtaacata ggacctatct  10020

tttatgcatc ttttttcttt ctgcaatata aatactttgg tcctggattg aagcacatct  10080

cttgtctgaa tgggaagcaa actttagtct tttagggtgg tttccatgaa agcctgacaa  10140

catagaatct ctatcaagcc tcaggctatg tagatactct gcaaaagtat ctgaggttaa  10200

ggttaacttg gcaggcacat gtgtagtatg atggtccttt agatcatgtg gcaggaatgt  10260

ttccctcagg aggcagagtg tctaatttta gatgcaactt tgatatatta cttgcatgtt  10320

ctgtagcctg taagtaatga gggatagatg ggctctaaac atgctctaaa atgttcttaa  10380

atattttcac tgcatatggt ctatgtgtga ttcctattac aacaaaaaat tcacgtgctt  10440

atcacatcat atctttatgg tggtgcatac tttatttgtc tagaatcgaa cagatgtgca  10500

gtgccagcac cgatggcaga aagtactaaa ccctgagctc atcaagggtc cttggaccaa  10560

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tcccaaaatg ctaatatttt cctatttgag gaagcaggta aattgggcaa acaggaagta  10680

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cttgtaacac tgaagaatga ttatactgac tcattacata actttaaaac ataggttatt  10800

tttgtgtgtt tatctgaagg tgatagagct tgtacagaaa tacggtccga aacgttggtc  10860

tgttattgcc aagcacttaa aggggagaat tggaaaacaa tgtagggaga ggtggcataa  10920

ccacttgaat ccagaagtta agaaaacctc ctggacagaa gaggaagaca gaattattta  10980

ccaggcacac aagagactgg ggaacagatg ggcagaaatc gcaaagctac tgcctggacg  11040

gtaataatat gtcaaaaaat atattgatcg ggaagaatga gggagtgggt attgaacatt  11100

ctgctttaaa tgtatggtga gtaaattata tttcatcagt cgtaagtgtt ttattagata  11160

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ctggcagttc acgtagctgg ttaagttact caaaggaact cagctaccat tttcctgata  11460

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cactacaccc agctgatttt aaaatatttt ttgtagagat ggaatcctgc tatgttaccc  11700

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aaataactca tcagtcagca tccactctag cctgagattt cacatcactc ccttaagtct    14880

gaaataacat tcacaaagat ttctgcagga gccaaatttg gttggtggtg ttgtcacagt    14940

gaggctcttt gggctgtgcg gcacctcatg accatattgg ctacacccat tgtatttgca    15000

gcttccaatc agacctttgt ctttatttcc cttactttgt aatttcagag acactataat    15060

gatgaagacc ctgagaagga aaagcgaata aaggaattag aattgctcct aatgtcaacc    15120

gagaatgagc taaaaggaca gcaggtgcta ccagtaagac tgtcatcatg tgcttgaatg    15180

aggggatagc agctttgcct cagtttacct aagcgctctt ctcttctaaa tattacactt    15240

agcaaggctc catatatcca ttcagaatgt ctcaacacaa gaagttgctt gtagtaaaat    15300

gtagttggta tcagattata tgctgattaa attggaagca gtctttttgt aattgcaata    15360

aaaatgcaat atccacttat gattgttatc atcaattttt ttcttcagaa ggactataat    15420

cagtttaaag actagcaaag ataaaatgaa tgaaaatctg cattttctac agagctatgt    15480

atctatatgg taccattttg gtttttttct attattttgt taacctatat tttcatattt    15540

tataatttca gacatgattt gatgcatgtt cagtatatac atgtaaaagg ttatatataa    15600

aacctcttca taaataacat tagctgctct cttttatttg catgtgtgaa agttatgtgg    15660

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ctttgcaaca tacatagtta accaacaaag acaataaaag agaagtgatg cccagtaggt    15780

attcctaggg gtaaatttat tttttgttaa ataataagat gtttatgtgc acatgctagt    15840

tcgaccactt tttaacttta gttaatgttt tgcaatttct cctgttgtgt ggtcatactg    15900

taaggagact tctgttaatt tgctcttctg ctttcctaac cacgttgatt tggcagtgct    15960

tcactgcatc agtgcaatct gtagcattag aaagggatag aagcaacaag aatatgtgta    16020

gatcaaagca actctaactc ctgagtcctc tagctttttt gtggttagaa tgcaaatagg    16080

acagttcttc agttcttcac tcacagcaag catttatgga cctttggcaa attatattaa    16140

agtggaattt taagacaata tgataattat acttcgaaat atagacctat gatttgacat    16200

ttttacaaaa tgataacaag gtaatcatat aggtacaacc tctagcacta ttaaaaacag    16260

ggtcttgcat tgataaaagg aaacatcttg acaactgttt cataggcgta agtttgggat    16320

gatgcaacta ctcttatctt tcctccaaca gcatctgata ccttgtgcaa cttcattgct    16380

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acacagaacc acacatgcag ctaccccggg tggcacagca ccaccattgc cgaccacacc    16500

agacctcatg gagacagtgc acctgtttcc tgtttgggag aacaccactc cactccatct    16560

ctgccagcgg atcctggctc cctacctgaa gaaagcgcct cgccagcaag gtgcatgatc    16620

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caatttatag attctgtaag tagaattgtg aagggaagtt aacgattctg gaagataaat    16740

tagaaaaccc atttcttaaa tcattgccat tttctatagc caagctgtta ttagcatata    16800

ttaatgtaaa ggtagaagta tgattttcat cttcatgaat atgttttttc aaagatctga    16860

tttcatagcc taccgagaga gacaaaagta tttataaata cttacaaaat aggacttttg    16920

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agtcagattg atgacttata aagcagagct tggattatgg gaacggaatg gtgtttgagt    17040

tacttttaac tttttttttt ctttgcttac ttcatggtgc ttctctagaa ttttgtcttg    17100

cttttgaaca gcacattaat gatttggctt actcagagct gaaagcaatc ttttagtgta    17160

tttgaagtaa taatcagctc cttggtcata cctggctctt tccacaaaat ggtgattatt    17220

gattactggt cccattgctt cactgagatg aatcatcttt cgtgaaacaa atttgtattc    17280

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gggcaatggg actaaacctg caggagaacc tagcccaagg gtgaacaaac gtatgttgag    17820

tgagagttca cttgacccac ccaaggtctt acctcctgca aggcacagca caattccact    17880

ggtcatcctt cgaaaaaaac ggggccaggc cagcccctta gccactggag actgtagctc    17940

cttcatattt gctgacgtca gcagttcaac tcccaagcgt tcccctgtca aaagcctacc    18000

cttctctccc tcgcaggtag aacacaattt ctgcacagct gttactcatt ttcaacagac    18060

acctgagcct taataatcta gaaactaata cttcggaaca aatgactaat tactgctgcc    18120

tttgctgatt tcattctgtc gttgaatcta gctgttgcta agttatactg cctcccaaag    18180

tttaggctgt ctgcaggcta actgttgatt ttggcatcat tctctctctt ttacttttgg    18240

gtggttttga aagatagttg catgaaacgt acttttattt ccttcaacac tagagtttaa    18300

catttctgtc cctttctttt tctcccatct gatccctccc tttaaaattg ttaacatcat    18360

ttcttcctcg ttgttcattt attcttatgc gattcactga cccaggggag gagggaacca    18420

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aaaagaacat atttttaatt tcagtttctc aacattggct cttttgagtt gtgccatact    18600

attttactag tgcagttttt gccaaggaat atttttattt catacagctt ttttaaggca    18660

tgaaaatcac aattcttatc agagatttgt gttcctaaat tatttaaata attaaattaa    18720

tagataattt ggcactttaa aacatttttc caattgtatc tgttgaattt gttttaagaa    18780

cagatttagg tatgatatag gtatatacat ttgggaaaca ctgaatcaaa caaagttaca    18840

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aaggcaagag gattgcttaa gcacaggagt tcaagttcag cctggtgaac atagcgagat    18960

cccatttctt taaaaacttt ctttttttta actgcaggcc ttctcagagt tattaatatg    19020

ccgttgtgcc ttgtgaattt ccaggaggag attatgatat gttgtgtttc ccaaatttat    19080

tttaccttgg aattgtttaa ggaacaccta gttttttccc agaactttag tgttctgaga    19140

gacacagttt attattcaag aattttccat ataatgtaaa ccttctgtaa tactaatttt    19200

ggttcataga ttattaaaga gaaaaaacaa agtatgaaag gaaactatta attattaact    19260

attattttcc ccaaaatcac taaagccttt taaatgttaa taaagaacac atctcattct    19320

ctttaatgac aagtgtcatt tattgagagt attttctcac agttttgcaa gtttttcagc    19380

aatgacccta aattttattt cttggaaacc acacccaaat cctgggtgct caattgaaat    19440

aaaacaatac cctagtcaat ataacatgct tgttagcatc tttattattt aatatagtgg    19500

gtcaggaaaa cattcttgtt atctaggtgt gatttttaaa ttggggagaa taaagaatta    19560

ccatctaatc taagtatttt ttctttctct ccatatttag ttcttaaaca cttccagtaa    19620

ccatgaaaac tcagacttgg aaatgccttc tttaacttcc acccccctca ttggtcacaa    19680

attgactgtt acaacaccat ttcatagaga ccagactgtg aaaactcaaa aggaaaatac    19740

tgtgtaagtc tttggttcag gaataaaatg atttatctta tttacttata tttaattaat    19800

ggaatatagt tcccagatgt ctgatccact tgtatgtgca taattttact gaccatttat    19860

atataatcat gtctattccc acattgaata tatctgtcct gggcatatta caactaccta    19920

caggtagaag atgggaagat aaactagatt ccttttgtaa cttactccaa aatttcctat    19980

atatgcacaa gtagttttca taaaactttt ccattcggtt tgtttgttcc ctccataagg    20040

ccttcttatg aaagccagat tttcaacctc ctttcctctc taattgtaag cttcagaata    20100

agaacgagta tggtttctta cctagtttgt atttttattt aattttattt gtttattatt    20160

tatttatttt tagtttgtat tttttaatct tattttttct ttttgaattt atgtgtagat    20220

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aggagttctc tctgatgcaa aaatacccac tcttccgttt agcctcagac accctctcat    21000

ctagtagaag atctgcagga tgtgatcaaa caggaatctg atgaatctgg aattgttgct    21060

gagtttcaag aaaatggacc acccttactg aagaaaatca aacaagaggt aaacacgcaa    21120

ccctttggaa gcaacaagct gagaatcctg ccccctttat tccttgtgtg cagcttgatg    21180

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atctctatct acttcatgtt tggacagaaa acatactaga gagtatcaag aaaagggagg    21360

gaaagaggtt tttaatgtac ttttaaacat tactgattat ataaagttga tatttcattt    21420

ttagatgtga agaattggaa tttaaattaa aataatagta tctttaatta attgtattaa    21480

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atccactaaa aatacaaaaa aattagctgg gtttggtgcg ggcgcctgta gtcccagcta    21660

ctcaggagtc tgaagcagga ttatggtgtg aacccgggag gcagatcttg cagtgagcca    21720

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aattaaaatt aaaaaagaga atctaacctg caaggaacaa agttttagct tgttggcaac    21840

agctgttttc caccaggtta gatacaagtg cttcttgaat ttattttcat gtaaagataa    21900

gtattttttt ttatagctaa aaatctgatt tgattattta gtaatggaga attttaccag    21960

aatgtgatta aaaaccagtc ttttgtcacc aaaagatctt ttatgtcacc aaaataaaat    22020

ccttgacgga tacaacacta ctaggtgtat cattaaaata tattcttaat agaataaaca    22080

cctagaatca gaacattggt tgaaaacgta ggagctttac aggggcagta aatttggagc    22140

tagtcacatt tcaaatttgc catcagtgtt tctttgttga atccagaaga tagagcaaat    22200

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aatatactcc tgactgtaca tgtttcatag gaagttctag aaacaacaaa gcactttcta    22320

tatgctttta ggtggaatct ccaactgata aatcaggaaa cttcttctgc tcacaccact    22380

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ctgtgtgtgg catagggctg ctgcggtttc agcactccct ctttaacaca tcttatttct    22560

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attttttcat gtattagaaa cattgcagac tttttcatta tttgttttct cattatttga    22680

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attgctttgg gttactacca ccatttttaa agtttataat ttgtgaaggg ttgtccttat    22920

gtcttaagga aaatcagagc taataacagc tgctaagatt tatttagtag gtactaagtg    22980

gtaagtactg ctctaggggc tttcgatgaa ttgattcagt taattctcac aattatcctg    23040

taaggttggt attattttta ttaattttta ttttttttga gacggagttt cgctcttgtt    23100

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ccagctaatt ttgaattttt agtagagacg gggtttctcc atgttggtca ggctggtctt    23280

gaactcctga cctcaggtga tctacccgcc tcggcctccc aaagtgctag gattacaggc    23340

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taatttatag ctctaaaata ttgatagttc tgtaccaata tatgaaataa agtgttctct    23580

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atgttttttg agtgcctaac acatgcctag aactctggga tcccaaagga gctttgtgtt    23700

gtggtgatgt ttgccacaat gggattaagg ttcagacata gttgatttct ccttttagct    23760

catagtgggg agaatttatg gcagatgact gcattttttt atgctaatgt gtatcatctc    23820

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taaatttcaa attattctct tccctttaga atattcttac aagctccgtt ttaatggcac    23940

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gctttttttt ttttttttaa ttattcccac ctaagttact tggctcttgg tttctagaga    25980

acagaattca actactgcta ttcgtgtttt aattaagtta gattaagttt tgcatatatt    26040

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tttcaaaaag ccaacacatc aatatacttg gggacaatta ccattacata agttgaaacc    26160

catagttcag tattgagctt tatcagtata tttgtatttt atttaatgga aatattggtt    26220

atctttgaaa ctcaaaatta agttatagct ctattttatt aatctgtatt ctcctgtcta    26280

tcagtgagtc atattggcac tttatgaatt ctaacatctg tacactgaga ttaagttgtg    26340

tatggtgaag gtaatatttg tcaattctat caaactgaat aattgagact tgaaagttaa    26400

ttttagagtc aatactcctg tctaaaccat atagtttact ggtttacact gaccagatat    26460

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gggaagccaa gactggagga tagcttgaga ccaggaattt gagaccagcc tgggcaacat    26580

agtgagactc agtctctatt aaaaaataat tagctgggct gggcgtggtg gctcacgctg    26640

taatcccagc acttttggag gccgaggtgg gcggatcacg aggtcaggag atcgagacca    26700

tcctggctaa cacggtgaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaaaatt agccgggcgt    26760

agtggcgggc acctgtagtc ccagctactt gggaggctga ggcaggagaa tggcatgaac    26820

ccaggaggcg gagcttgcag tgagctgaga tagcgccact acactccggc ctgggtgact    26880

gagcgagact ccatctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aataataata ataataataa    26940

ttagctgggt gtagtggtac atacctgtaa tcctagctac ttgggaggct agggcaggag    27000

gatcccttaa gcccaggagt tcaaggttac agtgagctat gattataccc ctgcactcta    27060

gcctgggaga caagaccaag accttgtctc taaaaaaaat tttttaaggc cagccgtggt    27120

ggctcacacc tgtaatccca gcactttggg aggcagaggc gggtggatca caaggtcagg    27180

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ttgcttgaac ccaggaggtg aaagttgcag tgagcccaga tcgtgccatt gaactccagc    27360

ctaggcaata gagtgagact ctatctcaaa caaacaaaca aaaatttaat ctgctataat    27420

agatactaat ttattttaag aaatacttag tgaatgttgt tctacatact tgccaattgg    27480

gaggaaaaaa gaaatattca ctaaatgaat gaatgttata caccaagtat ctccttcatt    27540

ttatgtcatg gagttctagc ttctgatatc acagaaatat gtgatttcta aaatgtttca    27600

gactattgtg ataagtattg gaaaatgcat caagtgactc taaatattta aacatacatc    27660

acctatattt catataatcc tgattcaata atatttctat agatttttta tgcaatttgg    27720

taattttgtt tgtttgaaac acagtgctat ttcatatatt tctattgata atccaatttg    27780

acctaattag gcatatttct cacacatggt attattgaac atattgcaca tttattaaat    27840

gatatgtatt ttacttaaga gtactttata taatctataa tttttgtaat ttgtacttat    27900

aataaatcaa atattaagtg ggattttagc caaaccatct agacattttt gtcataatgt    27960

ttttattaaa acagcaaaat aggagtttca aaatatttta aaatttgaat acttctaaaa    28020

tgtaaaatgt ttgcaactgg tgtaatgcag ttgattgtct atccctctaa actgtctaaa    28080

taacttaggt tcaagaacag tttattgaag aacataggaa ctgcgcaatt ctgtgtttta    28140

tcatttcagt tttaatcacc ccggcttgat tatggcaaca acattttaga caagcaatta    28200

ttactatttt tgaggcccat atactgggcc attatggttt tgcttctaac gtacatataa    28260

atgcacatgc aatatatata aattatgttt gctgttttaa aattagaaat gccgagaagc    28320

tatgtgtttg acattttatt ataaattttg tacacacata gatgtatgga aaatatacta    28380

tgttctagag tcaacaattg ttatcatttt gccatattta cctcatctct tttttttttt    28440

ttttgagatg aaatctcatt ctgttgccca ggctggggtg cagtgacgca atctcagctc    28500

actgtaacct ctgcctccca ggttcaagca attctcctgc ctcagtcccc tgagtagctg    28560

ggactacaga tatctgcctg gctaattttt gtatttttag tagagatagg gtttctccat    28620

gttggctagg ctggtctcga actgctgacc tcaagtgatc cacctgcctc ggcctcccaa    28680

agtgctggga ttatagatgt gagccaccag cctgggctac ctcatctctt ttttatgaag    28740

tttttatttt tattttttaa tttttttttt aatttttttt tttttttgag acagcgtctt    28800

gttctgtcac ccaggctgga gtgcagtggc atgatctcgg ctcactgcaa cctccacctc    28860

ttgggttcaa gtgattcttc tgccttagcc tctcgagtag ctgggactac aggcgcttgt    28920

caccatgcta gctaattttt ggtattttta gtagggacgg ggtttcaccg tgttagccag    28980

gatggtctca atctcctgac ctcatgatcg gcccgccttg gcctaccaaa gtgctgggat    29040

tacagacatg agccactgca cccggccagt tttttatttt ttattttttt gagacaaggc    29100

cttgctctgt cacccaggct ggagtgcagt ggcaagatca tggctcactg cagcctacct    29160

cctggactca agcaatcctc ctccctcagc ctcctgagta gctgggacta taggcacatg    29220

ccaccatgcc cagctagttt tttttttttt ttttagagat ggggtctccc tgtgttgccc    29280

agcctggcct caaactcctg ggctcaagca atccttctgc cttgacctcc caaagtgctg    29340

ggattacagg caggagccac cctgcccagc ctgaagtatt ttaaagtaaa ttccaactaa    29400

tataacattt tattctcatg tacttccagc atgtgtctct aaaaatagac atttttatat    29460

ataacctaat accatcatta catatttaac aataattctt taatcttctc attctcaggt    29520

atatttaaat tttcccatta atccaaaaaa gaatcaaaat tgaaacaatt tcacacattg    29580

catttggtta agcctcttaa atctctttta ctctctagtc cagtgctgtc taatagaact    29640

tctacagtga tgtgaaggaa atatctaata tgctgctatc cactatgata gccagtggct    29700

tttgagcact tgaaatatgg caagtgctgc tgaggagcag aattttcaat ttgaattaat    29760

ttaagttgct ttaatttaat agccacattt ccttactctc ttactggaat cagccatttc    29820

cccatggtgc tctgaatcct cttagtgaga aatggtacat agacaccaaa atcagggtgc    29880

taagtctgtc cattgttatg tggtttgtca ttgagataca aataattttt tttgttttgt    29940

tttgagacag agtctcactc tgtcacccag gctgcagtgc agtggtacaa tcttggctta    30000

ctgcaacctc cacctccttg gtccaagcta ttctcctgcc tcagtttccc aagtagttgg    30060

gattacaggc acccaccacc acactcagct aattttcgta tttttagtag agacatggtt    30120

tcaccatgtt ggccaggcca ggctcaaact cccaacctca ggtgatctgc ctgtctcagc    30180

ctcccaaagt gctaggatta caggcgtgag ctgccacacc tagccaagac tcagtgaatt    30240

ttaataatcc agagctctcc atgtatcccc taatctataa tctacagtgc ttaaatagag    30300

gcttttataa gccattatgt acactcatgt tatgtttgtt tttttaatta cttagtcttt    30360

ttccaaaagg aatttgcaac agctacataa tcttataatt gttatgtttc ttttatattt    30420

tcacagttgt tttaatttta aattgtaaaa gcaaacagga tattcttata ataaaaatgt    30480

tctgagatgt ttttcatatt tgtgtctttc atgtggctca gaatatatga gattttcatg    30540

tcatatcatt gtcagtattc agccttttct ccacattgtg tggggtagag gatagagtct    30600

agaagcttat aaaatggtca caaatgagga agtagagaaa acattcagcc tagaaagcgt    30660

gcatttgtgg tatgaaaggc actgtggaat gctgctggat tctgcccttc agtagttacc    30720

cgagagagac cgaggcagac gcatagctcc ctcctcagca aggagaaaag agttgcctgc   30780

tttcctcagc gtgctttcca tttcctttgt tttgaaaaaa gcacattatg ctaatcaact   30840

ttccttaagg tagacatttt tattggtaga tcaaaaaccg tgctttaagt tataagcctt   30900

ctgaacttct gtatttttct cttaaattat aatttccttt tattcctatt taaaacccaa   30960

gtgtaaaaga tgtgttcata ggctttctac tcactcactt gcctgttttt cgtaaccaca   31020

gaatgacagc cttaaatttt aatttcctga cttggcttgc ccatggcctg acttttttaa   31080

aacaaggagt ttaagttaaa gaaatttctc cagccattat tatttaaaca catttacaca   31140

gtatcaaaga atttaaaaat gttgctagca gttgatactc ccctcagctt tctgttcagc   31200

gtgttttaga ttgctcctat tttgttattt gtctatgaac ttttatattt ttcaaaaaaa   31260

taaggcaagc cctttttgcc tgataggcac tgctgagcag tataataaac aagcatgggg   31320

gcaacagaac ctgggttcca ggctagactc caccgttttc aaacggcatg actttaattc   31380

atcaagtgaa cacaattaag caaagtataa gtttgggacc atggaatatc cttcactcat   31440

cacacaggtt actgtgaaga tcaaatggat ataatattgc tttcaagatg gcggcacact   31500

tgccactata cacaggtgat attattaggc agagtcgcca catagtccct gtccttgaaa   31560

tgcaggcaag gagccctcac caaaggccag ggtggttttt tgtttttcgg gtttttgttt   31620

gtttttttca ttgtggtata ttatttcctc tggcatgcta ttccctgtcc cactcttaca   31680

gaactgtgtc agtgggtcac caaaagagag agctgattca actgattcct tgaaataaag   31740

gtagtcagac ctcgcggtat gatggagatg aagcaactga tttactggtt ttctctattt   31800

ttctgctgtt cgtgttgtca tttaaacaga catggaaacc gtctgcacac gacagagatc   31860

tttccgagcc tttttcatct agtgtgctgt gctgacccgc tcccctggat gcctgcacac   31920

tcatttggtt ctcccttttg gtcacttttt tccacttacc ctggcagaaa ttcacgtggc   31980

tgtcagtagt aattcagtga cctgctttca aaaaatgtta taaattaagc agcttttctg   32040

tgtatagctt ttgggttgaa ctgagaaggg ctaagtgaag ggagaagcta tgttgagctc   32100

agagtcagaa tgccctgccc cagacatttt gagatgtgaa tttttcattt gttttgtttg   32160

gtgacactta gagagaataa acattctgag ataaaaatct tccttgggca ggccagcaaa   32220

gatagaattg ctttagagca atttggcact tggtcttaat cttaatagtt tggaactcat   32280

atgtgactaa ggaaaaggat attgcaaaaa gttgtgccac cctaggctat atgatataaa   32340

cttagaaagt ctatcaacgt gaaaggtgaa gagacctcta gagacatcgg ggacaaactc   32400

caaatttggg aaaggtccat ccacatttgc aattgttagt taggcttggg aagtggagtc   32460

attggtggat gaggcaactt ccaatcacca tctcgatttt tatttcccta acttttaaga   32520

ttattttcta tagaaaatca gtagtgctga agttggagtc atttaattga tttgtgccaa   32580

cctagggaag catttactct cgagaaaagt ttggtaacca ttaatcttac cttagcaaca   32640

tttcagttta agcttatctc tgactttcca aagacaacta aagatttcta cagtctctct   32700

tataactgat ccattttttc aaaagatgtc cctttgggaa ggaattctca tttttagaat   32760

tttagtccag aggaagtatt tttttttcag ataggtgaaa taggataagc agaaaattct   32820

tattttttac tgttttagat accattgatg ccatgcttat tttaaaacaa aacacaataa   32880

aaacatgata ccatctgatg agttgctttg gttttacttt tttttttttt tttttttttt   32940

ttttttttag tttatacaag tttcttatta ggtcagcaaa ttgtaaaaca cataatttgc   33000

caaggctttt gaagccagca gatactgggt gaagttgctg tatgaatata ataataagaa   33060

ccgtttttgt tcagcttgat gaaaaaacta ttcatgttct aaatgaaaat gtgaagatca   33120

tctaattctg acagaaaacc acctgtggac atggtcttgt ttctttttat ttcttctgtt   33180

ttctacaaaa gatggcaata tttatttaaa gtgctttaac aggatatccc agttaaagct   33240

ttgacagact gtttatagtt cacttctgcc caggggcaat taaaggcaca ttacaggata   33300

agcgagatga ctccccggcc acaggaggag gatgtgtggg taggattatt aatgttgaaa   33360

tgaattatga tagagtgaca tgtctgcaag agcaccatgg gttagtaact taacaagaat   33420

tcatatgcag aaacccataa ttctcagcag ttctttaggg taaatgaaac taaagtttag   33480

ggagagagaa caaggagaat ttgcaaagat atgtatgaca gtatttaaaa atgttcttcc   33540

agcacaaaga cattaatctt cctttgtcaa aataattctt tctgcatgaa aagttggcat   33600

ggggctccca ggcttcaggt aagatgggag aaagggagcg tttctttttt tttgtaccaa   33660

agtactcaat cttctgatct tccttgactt tcacgacata ggcatatgtc tactctgacc   33720

agtttgtttc atttattgtg gtaagatgtg cttgtcttgt gctttcctgg tgcagaaaag   33780

gagctgcctc gctcatgctt ggtggccttt ttgttcctac acacagtggt tctcgtacat   33840

ggtggctacc acatcctggt gtttgtctat actgggagaa tcaggcgttc caagtcatct   33900

tggctgccct agctctgagc ttcaggggat atatgactca gaaatgctat gctttctgga   33960

atttggatat ttcattttta tttgtttctt ggtaaattct cttttgactt aggagaagct   34020

aactatttgg aaaggtctct cagaactcta attacaaata tatggtacct tctttatatt   34080

gatctcattt ttaaatacct agtcctggag gaagagctaa atatgaatac agtgatgagc   34140

tgtgtagggg atctcacagg aacacagtca gatttcaagt tgaaaataga ttcagttgat   34200

aatacttagt actagattct cctgaatcga ctttgggaat tctgagtcaa cctaaggact   34260

atattacaaa ggatcagacc ttgactttta ggccaggtgt agtggctcat gcctgtaatc    34320

ccagcacttt aggaagccaa ggcaagtgga tcacttcagt ccaggaggtt gagaccagcc    34380

tgtgcaacac agcgagaccc tgtctctacc aaaaatacaa aaattagcca ggtgtagtgt    34440

agcacctgcc tgtagtctga gctactgagg aggctgaggt tggagaatca actttaaccc    34500

cggatatgga ggctgcagtg agctgtgatc atgccagcct gggcaaggag caagaccctc    34560

tctcaaaaac aaaaacaaaa aagacacaga acttgacttt taacaggagg catagtaata    34620

gcaagcataa gattgtttta acatagcatt taagataatt tacgcattta gaaaattaat    34680

tctggctggt tgtagtagct tatccttaat cctaacccta tgagaggcca aggcaggaag    34740

atcacctgag gccaggagtt tgagaccagc ctaggcaaca tagcgagacc cctgctctct    34800

acaaaaaatt ttttttaaaa aacatagctg ggcatggtga cacactcctg tagtcccagc    34860

tactcaggag gctgaggcgg gaggcttgct tgaggccagg agtttgaggg agctgtgatc    34920

acgcccctgc actccagcct gggcaacaga atgaggccct atatctaaaa aaaagaaaaa    34980

tggacaagaa aattctatac tgattgaagc ccagctaaat agaaaaaaaa aaattctaat    35040

aggccatttt aaagactttg gaaaaattct tagctagagt aaaacagaag caatcctttc    35100

tttcctggtt ctcacatctc cattctcacc ttcattcccc ttcccctcca tttgtttcaa    35160

gtatttttct tttctatgtg tgtctttatg taaatttaaa tttacctaca agatattatg    35220

atattaagat atttcattct gcttcctgtt ttgtcacttg ttctttaaga tccaagtcct    35280

tggctccatg tgcatctaat ccttgccata agccctgcat cgtacttcat attcaccata    35340

ttgaactatt caccctcaag tagtcactat taaatgtcac actgttgtag cgactacaaa    35400

tgcaagctca gtaactgaaa agataacatt aaattttgtt ttttaattgg tttcctgtgt    35460

caatttcatg tttcgggaat ttgtatggac agatagacac cagagagata tgcgtatttc    35520

acctgcatgc ttgaggctag agaaacatga tttattcaga actatttcaa atactgtaac    35580

taacctggta attttgttta ggaaaacatt aaattcggaa tagaaggcaa ttcagaatac    35640

ctgtctgtta tctttgtctt gtcatttttg agatactcag ttcctggaaa atattatgat    35700

aatccatctt gctatgtagt atttcaagtt atatgttgag cctctgagct tgcagagtga    35760

acatttctat tcatagacag tgctgttgac atcagtgggg agatggcaca agctttgtgc    35820

cctaggaaag tttaaaagct agaacattac actgcaaacc ctatgtcagg aaactttgtt    35880

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tttctttgct aagaagtctg gtgactctca caccccatct cagcactttc ctggattcca    36000

aggccctggt gccctgagca cacaacttcc caggttcctt ttattgttcc tgataagaac    36060

tcgaattaga ggcagcgtct ggtactcacc aggggtgtgg tcccatgggt gacattcttg    36120

ctccatcatt tcttacccgg gtaaccttga gtatggcgcc taaatcctct cttcctttca    36180

aattgcctgg tctgtaaaat ggatgcagtg aatggtagct atgccacagg tgttttgtgt    36240

gagaattaaa tgagaggagt tatatcaata acacttagag gcatgcggtg cctatagtga    36300

gggcttgttt tatgttgtcg tttaaccctt tctttctcag ccctccccca ctccacatcc    36360

cctcccactg gcaatgtaca aattgcagct tcctgcctct ttcctgctat ctcgctccct    36420

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ccctaatctt agctgttttc accctttccc cacagcattg ccttgacagt tcctcagtgt    36540

cccatcccct cttcccatgg acaacaccac aaacctgcgc acacggcctg ttattattcc    36600

tcctgtttca cctgtgtcca ttctgtctca taaaggacac tgtaggctct gaacagctaa    36660

ggcctttctt attcttttgt cccatggaaa ataatccctc cagatagcaa taccaggaat    36720

agtgcctttt ctaacccact ggtttccttt tgagcttaca gccaccaaat cttatatctg    36780

tttgtttctg ttcccctctc tgcattgact gctagagaga tcagagtcaa gcaggaggtt    36840

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tcatgttaca gttgttcctt agtgtccatg ggggatttgt ttcagaaccc gcaaggacac    36960

caaagtccag ggatgctcaa gtccctgata taaaatagca ttgtgtttgc atataatcta    37020

cacacatctt accatataat tttttttatt atttgtatac attcgtgggg tacaagtgta    37080

attttgttac atggatgtat tgcatagtgg tcaaagtcga ggctgtgagt gtatttatcg    37140

ttggaataat gtacattgta cccgttcatt cctgtatact ttaagtcatc tctagattac    37200

ttataatagc taatacaatg taaatgctat ggaaatagtt gttatattgt taggggataa    37260

tgacaaggaa aacacctata catgttcaat acacagcaat tatttttttc tgaatatttt    37320

tgatctgcca ttgattgaat ctatggatgt ggaacccaca gatatgggac ccacagatgc    37380

agagggccaa ctgtgtttat tttttccaaa tttgtttccc tgttatgact cttctttata    37440

cacattttta aactctgttg tcttgtattt gttttctgat catcttacgt ccttttggaa    37500

accaagtggg gcataaatag tacatgtttg catttgaggc aacacagagg catcgcagga    37560

gctggagaca gcaaagttca aagccagtcc accacttacc tacagagtgg ccttgggcaa    37620

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ctggcatgga gatgctgtcc ttagatatta ggtccatctt gtatcttcta gtgtatcttt    37800

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gggtagctga ggtaggagga tcacttgagc ccaggaggct gaggctacag tgagctgtga    38040

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gcactcagca gtttgcttag tgagtagatg gccatagctc actttaggta tctggagaat    38280

aatgctcatt cctgtctcca gctttgtaaa attgcctaat agacggaagg cattaaaata    38340

tgaagatggg attatatctt atgaagctgc ttggaatggg ttttccctct taacaaataa    38400

tttctgatca tccatatccc ttaagaacac cggatttctg ggggccaggg aggtaagatt    38460

ctatctgaca aagccttcct ggtgtcaacc acttgccatc tgttggtcag tgctggccct    38520

gctgggtcta tagaatgagc ttctttgtct gacgctcctg ttgccatccc tttctccatc    38580

agccttgtag cagtacctgg gaacctgcat cctgtggaaa gatggaggag cagatgacat    38640

cttccagtca agctcgtaaa tacgtgaatg cattctcagc ccggacgctg gtcatgtgag    38700

acatttccag aaaagcatta tggttttcag aacacttcaa gttgacttgg gatatatcat    38760

tcctcaacat gaaacttttc atgaatggga gaagaaccta tttttgttgt ggtacaacag    38820

ttgagagcag caccaagtgc atttagttga atgaagtctt cttggatttc acccaactaa    38880

aaggattttt aaaaataaat aacagtctta cctaaattat taggtaatga attgtagcca    38940

gttgttaata tcttaatgca gattttttta aaaaaaaaca taaaatgatt tatctgtatt    39000

ttaaaggatc caacagatca gtattttttc ctgtgatggg ttttttgaaa tttgacacat    39060

taaaaggtac tccagtattt cacttttctc gatcactaaa catatgcata tatttttaaa    39120

aatcagtaaa agcattactc taagtgtaga cttaatacca tgtgacattt aatccagatt    39180

gtaaatgctc atttatggtt aatgacattg aaggtacatt tattgtacca aaccatttta    39240

tgagttttct gttagcttgc tttaaaaatt attactgtaa gaaatagttt tataaaaaat    39300

tatattttta ttcagtaatt taattttgta aatgccaaat gaaaaacgtt ttttgctgct    39360

atggtcttag cctgtagaca tgctgctagt atcagagggg cagtagagct tggacagaaa    39420

gaaaagaaac ttggtgttag gtaattgact atgcactagt atttcagact ttttaatttt    39480

atatatatat acattttttt tccttctgca atacatttga aaacttgttt gggagactct    39540

gcatttttta ttgtggtttt tttgttattg ttggtttata caagcatgcg ttgcacttct    39600

tttttgggag atgtgtgttg ttgatgttct atgttttgtt ttgagtgtag cctgactgtt    39660

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cagaactgtt gcatggatcc tgtgtttgca actggggaga cagaaactgt ggttgatagc    39780

cagtcactgc cttaagaaca tttgatgcaa gatggccagc actgaacttt tgagatatga    39840

cggtgtactt actgccttgt agcaaaataa agatgtgccc ttattttacc tacttttgtt    39900

ttctctctta tttgtcacta tggacaacag ttacacttta aagaaaatgg agcagactca    39960

aagcactttc ctctaataat tgcacaccat atgcacttcg tgtgaagaag ccaggaatca    40020

ttacaatgga gaagaaagaa caagcaaact gagttaaata gttcacaaac aatcacatgg    40080

acaatgggga ggaatcttcc agaatgcatc agtcagggtc tagcggcatt tgagtgcgga    40140

tgctgtaagg ggaattcgtt cacaaatgta ctgataccac agatgtgggc aggggctagg    40200

agagcaacag ggtgcagcct gaaggcacct ggaaggccgc ctggaggggg acagtcagga    40260

aagcaggagc ccttgagagg agcactagcc tttgatgaga ccactgccat cgaaggagac    40320

ctcacaggga gggagccaag ggtaaaccct aactttgttt ccccatttct cctatctctg    40380

cctaggggtc ctcactggca gaaccaacca gaagctggag gacaagggag ctc           40433

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

gcaccagcat cagaagatga                                                   20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

catttgaggg cagaagaaga                                                   20

Claims (10)

1.一种体外检测样品是否存在成髓细胞性白血病原癌基因MYB的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用MYB基因特异性引物扩增样品的MYB基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

24108位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特异性引物具有SEQID NO：2和3的序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第24108位。

4.一种检测高血压的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增MYB基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为100-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第24108位的扩增产物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂：

(a)与SEQ ID NO：1中第24108位的突变结合的探针；

(b)识别SEQ ID NO：1中第24108位的突变限制性内切酶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是以下的单核苷酸多态性：

24108位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO：2和3的序列。

8.一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测该个体的MYB基因、转录本和/或蛋白，并与正常的MYB基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，检测的是MYB的基因或转录本，并与正常MYB核苷酸序列比较差异。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差异是以下的单核苷酸多态性：

24108位C→T；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。