CN1491720A - 血管新生诱导剂 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供对生物体安全的血管新生诱导剂。通过向生物体内给药，本发明提供的血管新生诱导剂可以安全诱导血管新生，实现功能障碍和功能不全的生物体组织及脏器的功能再生。

Description

血管新生诱导剂

技术领域

本发明涉及可以作为药物组合物使用的血管新生诱导剂。

背景技术

血管新生，是指从现有的血管形成小血管的现象，至今有很多研究者正在对血管新生的机理进行研究。血管新生，涉及到癌的增大及转移、糖尿病性视网膜症和炎症性疾病(慢性风湿性关节炎)的发展，尤其出现了很多以治疗癌症为目的抑制血管新生的研究。另一方面，近年来出现了对于被称为“血管新生疗法”的新的治疗方法的研究，该疗法通过利用并促进血管新生作用，积极向缺血组织周边供给充足的血液而保护缺血组织，从而治疗患处。

对于缺血性疾病的药物疗法，缺血的改善效果并不明显，对于这样的药物治疗不应性的缺血性病例，需要实施旁通手术等血行再建术。但是，也有不少因为脑血管障碍或肾功能障碍等并发症而不能实施血行再建术的病例。而且，循环系统疾病，例如，以闭塞性动脉硬化症或伯格氏病为代表的末梢血管疾病没有有效的治疗方法，在难以进行血管扩张术及外科血行再建术时，不得不截断下肢。作为这样严重的缺血性病例及循环系统疾病的新的治疗方法，促进血管新生，形成新的血管的血管新生疗法是很有效的。但是，这些技术还没有达到实用化，急需开发一种有效且安全地诱导血管新生的优良药剂。

在血管新生疗法中作为具体开发的一例，可以例举利用胚胎干细胞(ES细胞)等的血管形成技术的研究(例如非专利文献1)，但是其培养法、分化诱导法及分化细胞的取得方法等应具备的技术还不完善，没有达到实用化。

另外如同上面所述，也进行了将从人类骨髓液中分离的骨髓单核细胞直接导入治疗部位，形成血管新生的自体骨髓细胞移植法(例如非专利文献2)的研究。但是，在该方法中，需要对患者实施全身麻醉而收取大量的骨髓液，因此不能避免对患者身体的负担及危险。进而存在极其难以控制导入的细胞分化的问题。

根据本发明，通过在生物体中导入在外科手术等中可以用作止血剂等对生物体安全的纤维蛋白，可以在体内诱导血管新生的技术至今没有出现过。而且，本发明为充分明确其机理，没有必要必须使用可能因给药产生副作用的生长因子，而且不会对患者造成采取骨髓液等外科负担，从而更加安全。另外，纤维蛋白在生物体内具有优良的附着性，在生物体内施用时，在患处等目的部位可以容易达到固定化。

因此，通过利用本发明的血管新生诱导，可以实现在患处周边形成血管而供给充足的血液，治疗患处的在临床及成本方面都非常实用的血管新生疗法。

[非专利文献1]

平岛、片冈等(Hiarshima M.，Kataoka H.等)，“体外脉管形成模式中胚胎干细胞向血管内皮细胞的成熟(Maturation of embryonic stemcells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis.)”，血液(Blood)，美国血液学会(American Society of Hematology)，(美国)，1999年2月15日，93卷，4号，1253-1263页。

[非专利文献2]

嶋田寿文、室原丰明，“利用自体骨髓细胞移植的血管再生治疗”，再生医学再生治疗现代化学增刊，(株)东京化学同人，2002年7月1日，41卷，102-108页。

发明内容

本发明的目的在于，提供对生物体安全的血管新生诱导剂。具体来说，本发明提供的由纤维蛋白构成的血管新生诱导剂，通过在脏器或组织内施用对生物体安全且具有优良的生物体附着性的纤维蛋白，形成血管新生。进而本发明的目的是提供用于再生治疗的血管新生诱导剂。

本发明者在潜心研究中，意外发现通过在生物体内给药纤维蛋白，可以诱导血管新生的新方法。而且，本发明者发现，通过在生物体内给药纤维蛋白，可以利用其血管新生诱导作用供给细胞的增殖、维持所必需的氧及营养成分，而且可以使功能障碍或功能不全的生物体组织或脏器的功能再生。

本发明者以上述发现为基础进一步进行研究，结果完成了本发明。

即，本发明涉及

(1)血管新生诱导剂，其特征在于，含有纤维蛋白；

(2)根据前述(1)所述的血管新生诱导剂，其特征在于，进一步含有生物体内分解性高分子；

(3)根据前述(1)所述的血管新生诱导剂，进一步含有选白骨髓单核细胞、骨髓间质细胞、干细胞、角质化细胞、成纤维细胞、心肌细胞、神经干细胞、血管内皮细胞、内皮前体细胞、血管上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、胰脏细胞、肾脏细胞、肠细胞及胃细胞的细胞和/或由所选细胞构成的组织；

(4)根据前述(1)所述的血管新生诱导剂，其特征在于，进一步含有生长因子；

(5)血管新生诱导方法，其特征在于，用纤维蛋白处理生物体；

(6)粒状制剂，通过冷冻干燥酶分解纤维蛋白原所得的纤维蛋白而得到；

(7)粒状制剂，通过冷冻干燥酶分解纤维蛋白原所得的纤维蛋白与钙的混合物而得到；

(8)皮肤移植方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(9)皮肤疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(10)末梢血管疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(11)心脏疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(12)脑疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(13)骨疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(14)人工脏器皮下移植方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(15)呼吸器官疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(16)消化器官疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(17)  内分泌、代谢疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(18)自体免疫疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白；

(19)纤维蛋白在血管新生诱导中的应用。

附图说明

图1为在实施例1制备的纤维蛋白的给药组及对照组中，皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣生存状态的照片。

图2是表示在实施例1中制备的纤维蛋白的给药组及对照组中，皮瓣形成后第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的皮瓣生存率(％)的图。

图3表示在实施例1中制备的纤维蛋白的给药组(a)及对照组(b)中，皮瓣形成后第7天收取各皮瓣，将该组织进行了HE染色。(c)表示在实施例1中制备的纤维蛋白的给药组中，皮瓣形成后第50天收取皮瓣，将该组织进行了HE染色。

图4表示在实施例1中制备的纤维蛋白的给药组及对照组中，随时间变化测定皮瓣形成后第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的各个皮下组织的血流量(ml/100g组织/分)。

图5表示在实施例1中制备的纤维蛋白的给药组及对照组中，在皮瓣形成后第1天、第3天及第7天，皮瓣上的0.5cm(a)位置及1.5cm(b)位置的各皮下组织血流量的恢复率(％)。

图6表示在实施例1中制备的纤维蛋白的给药组及对照组中，皮瓣形成后第3天及第7天的各皮瓣表皮温度的恢复率(％)。

图7表示在切断了大腿动脉的大鼠缺血模型的缺血部位给药实施例1中制备的纤维蛋白，给药后第5天测定该部位血流量(ml/100g组织/分)的随时间变化的结果。

具体实施方式

本发明所使用的纤维蛋白没有特别的限定，可以为市售的纤维蛋白粉、从市售的纤维蛋白原制成的物质、由人或动物的血浆精制的纤维蛋白原制成的物质。另外，也可以从利用DNA重组技术得到的纤维蛋白原的生成中所得到的含纤维蛋白原的细胞培养液制备纤维蛋白。而且这些纤维蛋白，优选细粒状冷冻干燥品，且在生理食盐水或磷酸缓冲溶液等溶液中容易悬浮的形状。作为市售的纤维蛋白，可以例举根据厚生省药务局监修的生物学制剂标准(1979年第201～203页)制备的医疗用干燥纤维蛋白，但优选作为止血剂等达到临床实用化的、除去了病毒的物质。

作为将本发明的血管新生诱导剂进行给药的对象，包括人及其他哺乳动物。

从人或动物的血浆分离纤维蛋白原时，从生物体适合性的角度考虑，以人为对象时优选从人的血浆分离，或以动物为对象时优选从这种动物的血浆分离。纤维蛋白原的分离方法没有特别的限定，可以通过公知的血浆分离法进行。通过血浆分离法得到的纤维蛋白原沉淀物的进一步精制，可以使用本领域技术人员公知的技术，例如，在盐和/或氨基酸存在的条件下，利用蛋白质沉淀物使纤维蛋白再沉淀的技术，或色谱技术(例如离子交换、亲和层析、疏水性或凝胶过滤层析法)中使用任一技术，或两种技术组合使用。优选除去混入的血浆污染物质，例如纤连蛋白和纤溶酶原分别利用被固定的明胶和被固定的赖氨酸吸收、除去。通过实施了这种操作的纤维蛋白原形成的纤维蛋白的自体溶解被抑制，从而可以长时间保持稳定。

另外，从人或动物的血浆制备的纤维蛋白原，优选实施热处理、化学处理，从而除去对生物体有害的病毒。

分离的纤维蛋白原可以悬浮在适当的水性溶剂等中形成纤维蛋白原溶液。而且也可以将该纤维蛋白原溶液冷冻干燥而制成纤维蛋白原冷冻干燥品。冷冻干燥法可以根据公知的技术进行。

从市售的纤维蛋白原，或从人或动物的血浆中分离的纤维蛋白原制备纤维蛋白时，优选使用除去了病毒的高纯度凝血酶制备。作为高纯度的凝血酶，优选用作脏器止血剂等的口服用凝血酶细粒剂等市售的药典记载品，但是通常也可以使用具有作为凝血酶的生物活性或生理活性的物质，例如可以使用将血浆蛋白分离而得到的物质等。也就是说，例如，也可以精制使用，在Ca²⁺存在的条件下将组织促凝血酶原激酶或蛇毒作用于人或牛的血浆精制的凝血酶原而制备的物质。凝血酶的精制，优选单独使用疏水作用色谱(HIC)或配合阳离子交换色谱(CEC)进行。

上述纤维蛋白的制备中，纤维蛋白原溶解时的浓度为4～12w/v％，优选6～10w/v％。因为在该浓度范围中，所制备的纤维蛋白的粘着强度增大。作为溶解纤维蛋白原的溶剂，可以使用注射用蒸馏水、注射用生理食盐水、pH为5～8的缓冲液(磷酸系、柠檬酸系等)等水性溶剂。

关于在上述纤维蛋白原溶液中添加的凝血酶的混合量，为了不降低纤维蛋白的交联度(聚合度)而形成稳定的凝血酶，在每1mg纤维蛋白原中优选添加0.07至0.36单位的凝血酶，更加优选添加0.07至0.25单位。关于凝血酶的单位，通常将1ml的0.1％精制纤维蛋白原溶液凝固15秒的量设定为1单位(NIH(美国全国卫生研究所)单位：[Minimum Requirements for Dried Thorombin](干燥凝血酶的最低要求)(1946))。

在本发明中，将市售的纤维蛋白原，或从人或动物(例如牛)的血浆中制备的纤维蛋白原在上述溶剂中悬浮之后，优选添加适量的凝血酶，在搅拌条件下以37℃左右温度温育一夜而使其进行酶反应，生成纤维蛋白。利用上述方法生成的纤维状纤维蛋白，优选通过滤纸等从反应溶液分离，并通过冷冻干燥而形成粒状。生成的纤维蛋白的分离及冷冻干燥的方法，可以按照公知的方法进行。

利用上述方法得到的纤维蛋白冷冻干燥品，可以含有钙。钙的添加，优选在纤维蛋白原中添加凝血酶而进行酶反应时进行。通过钙的添加，纤维蛋白与Ca²⁺进行聚合、交联反应从而可以提高纤维蛋白的稳定性。添加的Ca²⁺优选2mM以上，优选以CaCl₂等钙盐的形式添加。而且，虽然纤维蛋白具有生物体内分解性，但是通过添加钙，可以调整在生物体内纤维蛋白的分解时间，并且根据疾病的程度等，可以使诱导血管新生的时间延长。

另外，利用上述方法得到的纤维蛋白冷冻干燥品，根据使用目的、使用场所、纤维蛋白在生物体内的滞留时间等，也可以进一步含有其他生物体内分解性高分子。其他生物体内分解性高分子，可以在冷冻干燥纤维蛋白而形成粒状品时，或将纤维蛋白粒状品悬浮在适当的水性溶剂时，与纤维蛋白混合。作为生物体内分解性高分子，已知有天然高分子及合成高分子。作为天然高分子，可以例举葡聚糖、透明质酸、壳多糖、壳聚糖、脱乙酰壳多糖、藻酸、硫酸软骨素、淀粉、普鲁兰多糖(プルラン)等多糖或这些多糖的衍生物，或白蛋白、胶原蛋白、明胶等蛋白质。在本发明中，优选天然物质，特别优选来自天然植物的高分子，例如明胶等。作为合成高分子，可以例举聚乙醇酸、聚乳酸、聚氰基丙烯酸酯等。这些材料任何一个都在体内被吸收而消失，所以没有必要考虑生物体内适合性，而且因为没有细胞毒性，所以不存在有关生物体安全性的问题。

含有利用上述方法得到的纤维蛋白的血管新生诱导剂的生物体给药形式，因为根据给药患者等的疾病种类、疾病部位、疾病程度等各不相同，故不能一概而论，通常根据医生的判断确定，但优选给药形式如下面所述。

本发明的血管新生诱导剂，可以以粉体形式直接给药至生物体内的目标部位，或在注射用蒸馏水、注射用生理食盐水、pH为5～8的缓冲液(磷酸系、柠檬酸系等)等水性溶剂的液状赋形剂中悬浮，例如可以通过注射、涂布等方式给药。另外，也可以与适当的赋形剂混合，形成软膏状、凝胶状、奶油状等，例如可以作为纤维蛋白凝胶等进行涂布。进而，在上述水性溶剂等中，悬浮含有纤维蛋白的本发明的血管新生诱导剂，之后通过除去溶剂而形成例如片状、块状、球状等适当形状，例如作成纤维蛋白片，将其给药至生物体的目标部位。这些制剂中使用的赋形剂，只要是可以添加到药品的则没有特别的限定，但是优选具有生物体内分解性的那些，另外制剂化方法可以采用该领域中公知的方法。

关于对生物体的纤维蛋白给药量，相对于给药生物体的表面积1cm²，优选为1～10mg，更优选1～5mg，特别优选2～3mg。但是，该给药量并没有限定于此，从而不能一概而论，所以如上所述，根据给药部位的疾病等状况或纤维蛋白在生物体内的滞留处置时间等，根据医生的判断确定，而且可以变更。另外，本发明的血管新生诱导剂的剂型为水溶液或软膏时，赋形剂与纤维蛋白的配比相对于纤维蛋白4mg，赋形剂优选为100～500μl。

本发明的含有纤维蛋白的血管新生诱导剂的血管新生诱导效果的确认方法，没有特别的限定，可以将本发明的血管新生诱导剂向实验动物(例如兔子、大鼠或小鼠等动物)给药，通过确认给药部的细动脉的增加而进行。作为确认给药部的细动脉新生的方法，例如，向实验动物将本发明的血管新生诱导剂给药之后，用肉眼确认给药部中细动脉的新生状况，或收取给药部的组织并用福尔马林固定之后，将该部位实施HE(苏木精-曙红)染色而进行调查。进而也可以通过测定给药部位的血流量、表皮温度等进行。

在本发明中，进行了使用裸小鼠的皮瓣生存率的研究。本发明的血管新生诱导剂涂布在剥离皮瓣后的皮下组织上，可以确认血管新生诱导效果。具体来说，血管新生的诱导效果的确认通过如下方法实施：切开小鼠皮肤，在产生的皮瓣与剥离皮瓣后的皮下组织之间涂布该血管新生诱导剂，之后测定皮下组织的血流量、皮肤表面温度等。另外，也可以通过如下方法实施：通过切断小鼠的动脉等人为制作生物体内的缺血部位，向缺血部位将该血管新生诱导剂给药之后，测定该部位的血流量。血流量、皮肤温度等的测定方法，可以为公知的方法，例如对于血流量的测定，可以例举通过利用激光散射的实时血流测定装置，例如使用激光多普勒装置(型号ALF2100，Advance Co.Ltd.制备)的方法；关于皮肤温度的测定，可以例举拍摄温度记录图象，通过电子计算机分析温度分布，例如使用温度描记器(サ一モトレ一サ)(TH3100ME、NEC.公司制备)的方法。

在本发明中，通过向生物体给药纤维蛋白，可以诱导血管新生，可以达到功能障碍或功能不全的生物体内组织及脏器的功能再生，而且通过将细胞或组织等与纤维蛋白一同向生物体内给药，可以进一步促进其效果。

再生治疗的实施，通常需要移植细胞、血管生长、细胞增殖因子等，成为组织再生立足点的生物体内适合材料，进而需要用于维持移植细胞的生物体功能的氧及营养成分的供给源。这些因子被导入生物体内，且在生物体内形成网络，可以实现功能障碍或功能不全的生物体内组织及脏器的功能再生。

使用本发明的含有纤维蛋白的血管新生诱导剂时，纤维蛋白不仅具有作为生物体内适合材料的功能，而且也具有作为氧、营养成分的供给源的作用。即，作为生物体内分解性高分子的纤维蛋白，具有作为促进移植细胞的粘着、分化、形态形成的立足点的功能，而且通过诱导血管新生发挥作为移植细胞的氧、营养成分的供给源的作用。进而为增进血管新生而在本发明的血管新生诱导剂中含有bFGF、VEGF、HGF等生长因子时，纤维蛋白可以取得在组织再生的地方持续放出生长因子的缓释效果。

作为在本发明中使用的生长因子，可以例举成纤维细胞生长因子(FGF)[包括碱性FGF及酸性FGF]、血管内皮细胞生长因子(VEGF)[优选来自血小板]、肝细胞生长因子(HGF)、血管生成素(包括血管生成素-1和血管生成素-2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、胎儿型平滑肌肌球蛋白重链(SMemb)、生长激素(GH)或其类似物质、其他细胞增殖促进因子等。这些生长因子可以单独使用一种，也可以组合两种以上使用。这些物质的用法、用量只要在公知的范围，则没有特别的限定，需要根据将本发明的血管新生诱导剂给药的患者等的疾病、该血管新生诱导剂的给药形式及处置时间等因素而确定，所以不能一概而论。因此，生长因子的用法、用量，优选根据医生等的判断确定，通常相对于每4mg纤维蛋白，生长因子的混合量约为1ng～100μg，特别优选1ng～50μg。

作为本发明的纤维蛋白构成的血管新生诱导剂中使用的移植细胞或移植组织，可以例举骨髓单核细胞、骨髓间质细胞、胚胎干细胞(ES细胞)等未分化细胞，角质化细胞或成纤维细胞、血管内皮细胞、血管上皮细胞、内皮前体细胞等分化细胞以及这些分化细胞构成的组织。

作为再生治疗的代表性领域，可以例举皮肤再生治疗。因火灼伤、或进行皮肤癌手术时，在患者的皮肤上会残留疤痕。为治愈这些创伤部位，生物体内的自体皮肤再生功能是必不可少的。通过在创伤部位涂布或注入由本发明的纤维蛋白构成的血管新生诱导剂，角质化细胞或成纤维细胞从该周边的皮肤组织进入纤维蛋白内，并诱导血管新生，从而促进细胞的增殖，表皮、真皮组织得到再生。表皮组织难以进行自体再生时，通过将患者的其他部分表皮移植到再生的真皮上，在再生真皮与移植表皮之间涂布本发明的纤维蛋白构成的血管新生诱导剂，进一步诱导血管新生而可以提高表皮的粘着性。难以进行自体皮肤再生时，以覆盖保护为目的实施皮肤移植等，但是用于移植的皮肤即使是从患者本人剥离的自体皮肤，或在生物体外培养的培养皮肤，通过在创伤部与皮肤之间通过给药本发明的血管新生诱导剂，可以提高与移植皮肤的覆盖部位的粘着性。另外，通过在本发明的血管新生诱导剂内预先含有角质化细胞或成纤维细胞等和/或生长因子等，可以提高自体组织的再生及移植皮肤的粘着性。

闭塞性动脉硬化、慢性闭塞性动脉硬化、糖尿病、坏疽、雷诺氏病及伯格氏病为代表的末梢性血管疾病没有有效的治疗方法，在难以进行血管扩张术及血管旁通手术等血行再建术时，不得不截断下肢。对于这样严重的末梢性血管疾病的治疗方法，诱导血管新生，形成新血管的本发明的含有纤维蛋白的血管新生诱导剂是有用的。通过在疾患部给药本发明的血管新生诱导剂，因血管新生而形成侧副动脉(旁通)，可以改善缺血部。而且，在本发明的含有纤维蛋白的血管新生诱导剂中，为了进一步促进血管新生，可以预先配合有关血管形成的血管内皮细胞、血管上皮细胞、内皮前体细胞和/或骨髓单核细胞等，也可以进一步配合bFGF、VEGF、HGF等生长因子。

对于心肌梗塞症、扩张型心肌症等心脏疾病，因为心肌没有再生能力，故因心肌坏死而使收缩功能不全时，除了心脏移植方法之外，至今没有其他治疗方法。但是，通过使用本发明的含有纤维蛋白的血管新生诱导剂，可以再生心肌功能。也就是说，在本发明的血管新生诱导剂中含有心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞等，通过将其给药至心脏的坏死区域，可以使坏死区域的心肌组织再生，而且从宿主的健康的周边心肌部诱导血管，与宿主的心肌组织连接的同时可以再生能够收缩的心肌组织。

脑挫伤、帕金森氏病、多发性硬化症或脑梗塞等脑疾病，必须改善受损的脑功能，尝试了神经上皮型干细胞等神经干细胞的脑内移植。在神经细胞的移植治疗中，需要被移植的神经干细胞在宿主的组织内生存，形成突触而再建神经网络。为了再建神经网络，需要在移植细胞周边诱导血管新生，将移植的细胞分化成神经细胞、神经胶星状细胞等各种细胞。此时，通过将含有该移植细胞的本发明的血管新生诱导剂给药至脑内，可以同时诱导血管新生，促进脑内神经网络的再建。

在骨折等的治疗中，将直接固定工具贴在作为损伤部位的骨上进行治疗。此时，通过将固定工具和本发明的血管新生诱导剂结合使用，例如通过在固定工具上负载本发明的血管新生诱导剂，可以促进骨形成，加快治疗速度。另外，在本发明的血管新生诱导剂中含有成骨细胞、软骨细胞等，可以进一步促进骨形成。

另外，作为骨和关节疾病等的治疗方法，尝试了利用人工骨、人工关节的人工骨、关节置换术，但该置换术的课题是如何使人工骨与患者的周围组织融合为一体。作为解决这个课题的方法，需要开发一种与患者自身的周围细胞一体化，可以与周边组织一同生长的人工骨等。为了得到具有上述功能的人工骨，需要开发如下人工骨的基材：具有网孔结构的，可以三维培养骨髓干细胞、成骨细胞、软骨细胞等移植细胞；具有优良的生物体适合性；一定时间内可以在生物体内被吸收。本发明的血管新生诱导剂以纤维蛋白为其构成成分，所以具有优良的生物体适合性及生物体内分解性，而且通过血管新生诱导作用可以促进移植细胞的增殖。从而，通过使用本发明的血管新生诱导剂，可以得到优良的人工关节、人工骨。

作为消化器官疾病所公知的缺血性大肠炎、肠闭塞等，是一伴随由肠的血液循环障碍所导致的肠组织或肠平滑肌细胞坏死的重病。另外，胃溃疡或十二指肠溃疡、溃疡性大肠炎等溃疡性消化器官疾病，也因肠平滑肌细胞坏死而使平滑肌层受到伤害。通过在本发明的含有纤维蛋白的血管新生诱导剂中配合肠细胞、肠平滑肌细胞或胃细胞等并给药至坏死区域，可以从宿主的健康周边组织诱导血管，可以再生坏死区域的肠组织或胃组织。

作为恢复功能不全的脏器功能的方法，有使用人工脏器的方法，于是为了实现该方法，正在开发可以长时间埋入体内，具有半永久性功能的人工脏器。特别是，从长时间维持人工脏器功能的目的出发，进行了以人工脏器为基材，嵌入培养细胞的生物人工脏器的研究开发。生物人工脏器，根据其形状有微胶囊型、大胶囊型等，但任一个都具有在生物体内环境中用于防止生物体的免疫系统袭击的防御手段，例如免疫隔离膜等防御屏障，和可以替代恢复功能的移植细胞及保持移植细胞功能的细胞外基质(培养基)。而且，这些人工脏器中负载的移植细胞，为了维持细胞功能，需要从血液供给氧和营养成分。从而，通过将本发明的由纤维蛋白构成的血管新生诱导剂与该人工脏器复合，可以制作有效增殖、维持人工脏器内移植细胞的生物人工脏器。

作为上述生物人工脏器内负载的移植细胞，可以例举胰岛细胞、胰内分泌细胞、肾脏细胞、肺上皮细胞等。通过使用这些细胞，可以制作各种生物人工胰脏、生物人工肾脏、生物人工肺等。通过移植这种生物胰脏(胰岛)，可以将作为内分泌、代谢疾病一例的糖尿病引起的高血糖症，调整至生理更正常状态。通过移植生物人工肾脏，可以减少因自体免疫不全疾病而必须定期进行血液透析疗法等的肾功能不全患者的肉体上的负担。另外，通过移植生物人工肺，可以恢复肺组织、细胞的损伤、破坏或肺炎、肺纤维化疾症、肺气肿等呼吸器官疾病导致的障碍、肺功能低下。

进而，通过本发明的血管新生诱导剂的效果，可以在缺血部诱导血管，所以可以进行一直以来难以进行的人工脏器及生物人工脏器的皮下、肌肉内的移植。皮下或肌肉内，可以以比较轻微的侵袭进行移植，并且从该部位移植的人工脏器等的回收也容易，所以被认为是理想的移植部位，但是，在其反面，血管的分布密度稀疏，因而难以用作细胞增殖、生存的场所。也就是说，通过在生物人工脏器内复合本发明的血管新生诱导剂后进行移植，在皮下或肌肉内可以诱导血管新生，可以恢复该部位的缺血状态，所以在皮下或肌肉内生物人工脏器也可以有效发挥其功能。

在本发明的血管新生诱导剂中配合上述细胞等时，所用细胞可以任选自培养细胞及非培养细胞，其培养方法及从生物体的分离方法，可以使用公知的方法。例如，血管内皮细胞，可以为动脉、大动脉、静脉及脐带静脉中的任一血管的内皮细胞。从血管分离内皮细胞时，例如可以收取将血管内壁进行胰蛋白酶等蛋白酶处理而游离的细胞。骨髓单核细胞可以利用常规方法从骨髓液分离，骨髓液可以从胸骨或骨盆收取。而且，分离的细胞，根据需要也可以进行培养后使用。另外，这些血管内皮细胞或骨髓单核细胞等，可以为患者或病畜等的自体来源或具有移植适合性的其他来源，但优选患者等的自体来源。

在本发明的血管新生诱导剂中配合细胞时的状态，没有特别的限定，需要根据将本发明的血管新生诱导剂给药的患者等的疾病、该血管新生诱导剂的给药形式及处置时间等因素而确定，通常相对于每4mg纤维蛋白，细胞数为1×10²～10⁶个，特别优选1×10³～10⁵个。

另外，在本发明的血管新生诱导剂中配合细胞的方法没有特别的限定，例如，可以在纤维蛋白乳浊液中均匀悬浮细胞，得到细胞乳浊液，或按上述作成纤维蛋白凝胶或纤维蛋白片，通过在其中均匀含有细胞而实施。利用这种方法制备的制剂中，形成在制剂内配合的细胞被纤维蛋白均匀覆盖的形态，将该制剂给药到生物体时，可以有效且均匀再生血管。而且，与细胞一同给药的纤维蛋白在生物体内分解、消失，给药的细胞同样通过增殖、粘着，形成具有健全的生物体内网络功能的器官组织。

[实施例]

下面，利用实施例等详细说明本发明，但本发明没有限定于下述各例。

[实施例1]纤维蛋白的制备

将500mg的纤维蛋白原(Sigma公司制备)缓慢添加到500ml的PBS(-)(pH7.2)溶液中，利用搅拌器进行搅拌而使其完全溶解。在得到的纤维蛋白原溶液中，添加125单位的凝血酶(Sigma公司制备)，在室温下搅拌一小时。从溶液中收取析出的纤维蛋白，在500ml的蒸馏水中进行30分钟搅拌。重复3次洗净操作。在洗净之后，用滤纸(ADVANTEC公司制备，5A)除去纤维蛋白的水分，放入500ml离心管中并在-80℃下冷冻保存一夜。将冻结的纤维蛋白干燥，得到了约为280mg的粒状纤维蛋白。冷冻干燥使用东京理科机械公司制备的FDU-830，在温度-40℃条件下进行一夜。

在Eppendorf管内各移入4mg所得的粒状纤维蛋白，通过气体灭菌器(西本产业公司制备、イオジエクトSA-360)实施气体灭菌之后，在室温下保存。

[试验例1]使用裸小鼠的皮瓣生存率的研究

在8～10周龄的裸小鼠(日本SLC株式会社、BALB/C-nu)中，腹腔内给药戊巴比妥钠(50mg/kg)而进行麻醉，在背部正中线部的皮肤中，不切开距离肩胛骨1cm位置的横向1边(基底边：Base of Flap)的状态下，切开、剥离3边成横向1cm、纵向2cm的方形，制作了皮瓣(参照图1)。

每只小鼠给药4mg实施例1中制备的纤维蛋白。给药方法如下：在Eppendorf管内将4mg纤维蛋白悬浮在20μl的PBS(-)中，用刮铲将该溶液均匀涂布在皮瓣与皮下组织之间。涂布之后立即缝合切开部。重复这个操作，制作了9个实施例1中制备的纤维蛋白的给药模型组。作为对照组，制作了只给药没有添加实施例1中制备的纤维蛋白的20μlPBS(-)的9只(n＝9)小鼠。给药模型组及对照组，在缝合之后回到饲养笼，通常用固体饲料及水来饲养。

[试验例2]皮瓣的生存率测定

在试验例1中制作的给药模型组(n＝9)及对照组(n＝9)中，测定了皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣生存率。

将皮瓣形成后第3天及第7天的两组小鼠固定在实验台上，用数码相机拍摄(图1)背部图象并传送到电子计算机上。利用图象处理软件(Mac Aspect)分析图象，算出了整个皮瓣的生存率。两组的皮瓣生存率通过将整个皮瓣面积设定为100，扣除坏死部面积的比例而求得。在图2中，表示了两组的皮瓣形成后第3天(a)(b)及第7天(c)(d)的皮瓣生存率。其中，进行t检验，求得了两组之间的差异。

在对照组中，皮瓣的生存率在第3天约为44.5±6.07％(平均值±标准误差)，第7天大约下降为32.0±4.38％。与对照组相比，给药模型组中，显示出了第3天及第7天皮瓣的生存率约为72.9±2.54％及73.0±3.89％的高值。这是因为通过在实施例1中制备的纤维蛋白皮瓣缺血部的血管得到新生，促进了剥离的皮瓣与皮下组织的粘着。实际上，收取皮瓣形成后第7天的两组皮瓣组织实施HE染色(图3(a)(b))时，在给药模型组中，与对照组相比发现在肌肉组织内形成了明显的血管网，发生了良好的血管新生。其中，作为参考，收取了在实施例1中制备的纤维蛋白的给药组的皮瓣形成后第50天的皮瓣组织，实施了HE染色，结果如图3(c)所示。根据这个结果，可以确定在皮瓣与皮下组织粘着之后，纤维蛋白完全分解，形成正常的组织。

[试验例3]血流量测定试验

在试验例1中制作的给药模型组(n＝1)及对照组(n＝1)中，测定了皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣中心部的血流量。

将两组小鼠固定在实验台上，将背部已缝合的皮瓣表面的中心部位作为激光多普勒装置(型号ALF2100，Advance Co.Ltd.制备)的激光照射部，测定了一定时间血流量的变化。此时，尽量在照射部与小鼠皮瓣表面密合的状态下测定。在图4(a)(b)(c)(d)中，表示了在得到稳定血流量的时间带中血流量的变化。(a)及(b)表示皮瓣形成后第3天两组的血流量(ml/100g组织/分)，(c)及(d)表示瓣形成后第7天两组的血流量(ml/100g组织/分)。

根据这些结果，可以得到如下结论。皮瓣形成后第3天，给药模型组的血流量大约变化14～16ml/100g组织/分，对照组的血流量大约变化4～5.5ml/100g组织/分。皮瓣形成后第7天，给药模型组的血流量大约变化11～20.5ml/100g组织/分，对照组的血流量大约变化4.5～5.5ml/100g组织/分。因此，不论是第3天还是第7天，给药模型组的血流量与对照组相比均显示出明显的高值，从而可以确定通过给药实施例1中制备的纤维蛋白，可以提高血流量。

[试验例4]血流量恢复试验

在试验例1中制作的给药模型组(n＝5)及对照组(n＝4)中，测定了皮瓣形成后第1天、第3天及第7天的皮瓣血流量的恢复率。

将两组小鼠固定在实验台上，设置了其背部已缝合的皮瓣表面(横向1cm、纵向2cm方形)的纵向4等分线(将纵向2cm以0.5cm间隔分割)，和横向3等分线(将横向1cm大约以0.33cm间隔分割)。将距离基底边0.5cm及1.5cm处的线，与横向3等分线之间的4个交点进行标记，将该4处作为激光多普勒装置(型号ALF2100，Advance Co.Ltd.制备)的激光照射部，测定了血流量(ml/100g组织/分)。此时，尽量在照射部与小鼠皮瓣表面密合的状态下测定。其中，距离基底边0.5cm位置的线上的两点血流量的平均值作为0.5cm位置的血流量，距离基底边1.5cm的线上的两点血流量的平均值作为1.5cm位置的血流量。对进行皮瓣形成前的两组各个小鼠通过测定相同4处的血流量而得到的血流量的平均值设定为100，以相对这100的比例(％)表示血流量的恢复率。其中，进行t检验，求得两组之间的有效差。

在图5(a)及(b)中表示了0.5cm及1.5cm位置血流恢复率的结果。在对照组中，在接近基底边的0.5cm位置，第7天的血流量恢复了70.4±13.29％(平均值±标准误差)程度，在1.5cm位置，第7天的血流量只恢复了5.23±8.27％(平均值±标准误差)程度。与此相对，在给药模型组中，在接近基底边的0.5cm位置，第3天的血流量几乎恢复到100％，在1.5cm位置，第7天的血流量只恢复了81.75±16.29％。从而可以确定通过给药实施例1中制备的纤维蛋白，可以得到显著的血流量恢复。

表1表示详细的实验数据。

表1

		皮瓣形成后第3天		皮瓣形成后第7天
						测定位置
		0.5cm	1.5cm	0.5cm	1.5cm
						对照组	血流量	7.38±1.0	1.62±0.82	9.25±0.73	0.62±0.61
恢复率(％)	56.1±7.57	14.4±7.4	70.4±13.29	5.23±8.27
					给药组		血流量	15.16±1.5	8.53±0.9	17.41±1.36	10.2±1.08
恢复率(％)	100.2±8.36	67.95±14.7	117.83±15.17	81.75±16.29

血流量：ml/100g组织/分

[试验例5]皮肤温度恢复试验

在试验例1中制作的给药模型组(n＝5)及对照组(n＝4)中，测定了皮瓣形成后第3天及第7天的皮瓣表面温度。

将两组小鼠固定在实验台上，用温度描记器(TH3100ME、NEC公司制备)拍摄了包括背部已缝合皮瓣的区域的表面温度。拍摄模式设定为：级别(レベル)35℃、灵敏度(センフ)0.7℃、扫描模式SC∑4。在拍摄的图象基础上，进行皮瓣区域的表皮温度分布的分析，求得该区域内的温度平均值。对进行皮瓣形成前的两组各个小鼠通过预先分析相同皮瓣区域的表皮温度分布而得到的平均值设定为100，以相对于该100的比例(％)表示表皮温度的恢复率。

图6表示结果。在给药模型组中，第3天及第7天与对照组相比，得到了显著的皮肤温度恢复。特别是第7天的恢复率几乎达到100％，从而可以确定通过给药实施例1中制备的纤维蛋白，可以显著恢复皮肤温度。

[试验例6]大鼠缺血模型中的血流量测定试验

在8～10周龄的大鼠(清水实验材料(株)、京都)中，腹腔内给药戊巴比妥钠(50mg/kg体重)而进行麻醉。在大鼠的右大腿根部内侧完全切断大腿动脉，在右下肢制作了缺血区域(缺血模型)。在Eppendorf管内，将实施例1中制备的纤维蛋白8mg在400μl的PBS(-)中无菌悬浮，并通过注射将各100μl该溶液各自给药至缺血模型的右下肢缺血区域中的4处(给药模型组，n＝1)。使用激光多普勒装置(型号ALF2100，Advance Co.Ltd.制备)，测定了切开大腿大动脉后第5天右下肢缺血区域的血流量。测定方法如同试验例3，测定了缺血区域内的血流量。在对照组(n＝1)中，只给药不含纤维蛋白的PBS(-)400μl。

给药模型组及对照组的各个结果用图7(a)及(b)表示。给药模型组的血流量大约变化12～13ml/100g组织/分，对照组的血流量大约变化4～4.5ml/100g组织/分。给药模型组的血流量与对照组相比显示出明显的高值，从而可以确定通过给药实施例1中制备的纤维蛋白，可以改善血流量。

发明效果

通过在生物体内给药本发明的含有纤维蛋白的血管新生诱导剂，可以安全且有效诱导血管新生，可以实现功能障碍和功能不全的生物体组织及脏器的功能再生。

Claims (19)

1.一种血管新生诱导剂，其特征在于，含有纤维蛋白。

2.根据权利要求1所述的血管新生诱导剂，其特征在于，进一步含有生物体内分解性高分子。

3.根据权利要求1所述的血管新生诱导剂，其特征在于，进一步含有选白骨髓单核细胞、骨髓间质细胞、干细胞、角质化细胞、成纤维细胞、心肌细胞、神经干细胞、血管内皮细胞、内皮前体细胞、血管上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、胰脏细胞、肾脏细胞、肠细胞及胃细胞的细胞和/或由所选细胞构成的组织。

4.根据权利要求1所述的血管新生诱导剂，其特征在于，进一步含有生长因子。

5.血管新生诱导方法，其特征在于，用纤维蛋白处理生物体。

6.粒状制剂，通过冷冻干燥酶分解纤维蛋白原所得的纤维蛋白而得到。

7.粒状制剂，通过冷冻干燥酶分解纤维蛋白原所得的纤维蛋白与钙的混合物而得到。

8.皮肤移植方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

9.皮肤疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

10.末梢血管疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

11.心脏疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

12.脑疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

13.骨疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

14.人工脏器皮下移植方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

15.呼吸器官疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

16.消化器官疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

17.内分泌、代谢疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

18.自体免疫疾病的预防及治疗方法，其特征在于，使用纤维蛋白。

19.纤维蛋白在血管新生诱导中的应用。

Images