CN1471587A - 肺癌的基因标记 - Google Patents
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Abstract
披露了一种用于诊断和鉴定新的或残留的肺癌的方法,该方法是用新鉴定的肺癌标记,包括多配体聚糖1、胶原1α2,和两种新的蛋白7013和7018。所述鉴定肺癌标记的方法涉及到来自患者的血液。预计会使用至少一种标记或者使用四种标记的任意组合。该方法可能还包括鉴定细胞角蛋白-19。
Description
发明领域
本发明涉及用于诊断和确定残余肺癌的方法。本发明还涉及将新鉴定的细胞标记用于肺癌诊断。所述标记包括多配体聚糖1、胶原1α2、和两种新的蛋白7013和7018。
发明背景
在工业国家肺癌是最常见的癌症之一,并且具有极高的致死率。目前,还不能进行早期诊断和有效治疗。胸部X光检查通常被用于肺癌筛选,不过,该方法不适用于检测早期阶段的癌症。也可以使用CT扫描,并且能够在较早的时期检测到癌症,不过,这种方法花费时间,并且具有曝光的危险。
在患有黑素瘤、甲状腺癌和前列腺癌的患者血液中,通常能检测到癌细胞或微型转移瘤。现有的基于逆转录的聚合酶链式反应(RT-PCR)是一种有效方法,该方法通过扩增癌专一性基因或标记,能够从数百万个正常血液细胞中检测出一个癌细胞。这种微型转移瘤的RT-PCR检测成为一种用于预测、选择合适的治疗方法、以及监测每一种治疗的效力的有前途的诊断方法。另外,血液检测不会导致任何健康损害,而诸如X光照相或CT扫描的方法则会导致对健康的损害。另外,与内窥镜检查和活组织检查相比,血液检测所导致的身体不适非常小。肺癌通常会导致通过血液的转移,即使是在早期阶段——在出现有症状的病症之前,并且很多肺癌能作为远距离的转移瘤复发,如在大脑、骨髓、肝脏中复发。这是由于肺癌诱导的通过血液的转移。不过,这些知识是可加以利用,因为它表明可以在非常早的阶段,根据血液携带的转移瘤诊断并检测复发。不过,没有好的标记可用于鉴定血液中的转移性肺癌细胞。目前,将诸如细胞角蛋白-19和CEA的肺癌标记用于通过RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)诊断非小细胞肺癌,但缺乏专一性,并且会导致大量的假阳性和假阴性。
然而,微型转移瘤的RT-PCR对于肺癌的检测来说是特别有利的,因为存在庞大的患者群体、通过血液转移的高发病率、不良的愈后结果,以及用于先进的癌症治疗的高昂医疗费用。另外,还没有用于肺癌的专用抗体。
因此,需要通过检测通过血液的转移的肺癌诊断的专一性标记和方法。
发明概述
一种实施方案是用于通过从患者体内分离血液或非肺组织,并鉴定下列至少一种标记的存在来鉴定肺癌的方法:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018。该方法还可以包括鉴定标记细胞角蛋白-19的存在。在另一种实施方案中,鉴定至少两种标记。在另一种实施方案中,鉴定两种以上标记。所述鉴定方法可以是本领域技术人员已知的任何方法,不过,还可以包括RT-PCR和/或抗体结合。所述患者可以是任何生物,不过,在一种实施方案中患者是哺乳动物,特别是人、狗或猫。
另一种实施方案是一种通过用对选自下列一组的至少一种标记专一的抗体治疗癌细胞或含有癌细胞的非肺组织,分离或消除转移性癌细胞的方法:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018。该方法还可以包括对标记细胞角蛋白-18专一的抗体。在一种实施方案中,所述抗体与选自下列一组的成分结合:金属颗粒、荧光颗粒、层析小球、层析凝胶和固体支持物。在另一种实施方案中,使用两种标记。在另一种实施方案中,使用两种以上标记。
另一种实施方案是一种至少包括SEQ ID NO:16(保藏号为ATCC______,2001年6月21日)的17个核苷酸的多核苷酸,在本文中又被确定为标记7013。另一种实施方案是保藏号为ATCC_______,于2001年6月21日保藏的多核苷酸的至少17个核苷酸。
另一种实施方案是一种至少包括SEQ ID NO:17(保藏号为ATCC______,2001年6月21日)的17个核苷酸的多核苷酸,在本文中又被确定为标记7018。
另一种实施方案是一种用于鉴定患者体内的实体肿瘤的转移瘤的方法,包括:
从所述患者体内分离血液或骨髓;鉴定选自下列一组的至少一种标记的存在:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018。该方法还包括鉴定细胞角蛋白-18。在一种实施方案中,所述实体肿瘤选自胆管、结肠、乳腺、子宫、食道和咽喉。
另一种实施方案是一种通过获得癌细胞;并鉴定选自7013、7018和这两者的标记的存在来鉴定癌症的方法。
附图说明
图1是改进的示差展示方法的示意图,它是用于优选实施方案中的选择扩增片段长度多态性方法(s-AFLP)。
图2是表示6种候选标记带的聚丙烯酰胺凝胶,这6条带的含量在肺癌RNA中比在任何正常血液泳道中都丰富:H-健康人体,L-肺癌组织。
图3是表示具有每一种候选标记以及细胞角蛋白-19和肌动蛋白的肺细胞的RT-PCR的凝胶。
图4是表示具有每一种候选标记以及细胞角蛋白-19和肌动蛋白的肺癌细胞的RT-PCR的凝胶。
图5是来自血液RNA的阳性PCR和阴性PCR的例子。
图6是有关多配体聚糖1的序列信息以及探针序列。
图7是有关胶原1Proα2的序列信息以及探针序列。
图8是有关7013基因的序列信息以及探针序列。
图9是有关7018基因的序列信息以及探针序列。
优选实施方案详述
通过示差展示,鉴定由在血液中循环的肺癌细胞专一性表达,而不能由正常血液细胞表达的mRNA。对传统的示差展示方法进行改进,以便能更广泛地代表在细胞中表达的所述基因。
为了鉴定候选基因,目前有三种主要技术可供利用:扣除文库、示差展示和DNA微型芯片阵列。不过,尽管扣除文库有潜在的利用价值,还能够鉴定在基因序列上具有部分相似性的基因,但它是一种非常花费人力的和时间密集型的技术。DNA微型芯片阵列尽管快速并且便于实施,但其灵敏度不足以检测出血液样品中的少量基因。这一点是特别重要的,因为该方法必须能在不表达标记的正常细胞的大的背景(数百万个白血细胞)中,检测出能表达特殊标记的少量微型转移瘤。示差展示(dd-PCR)可以通过使用多种简并引物的组合,扩增所有存在的基因,因此增加了检测出少量标记或基因的可能性。
不过,为了改进示差展示技术,以便代表尽可能多的基因,在例1中使用了选择扩增片段长度多态性方法(s-VFLP)。该方法具有以下优点:1)仅扩增所述基因的3’末端,2)产生可再现性更高的凝胶图案,3)鉴定少量冗余基因,和4)采用更具选择性的PCR条件。该方法导致了四种标记的鉴定:多配体聚糖、胶原、7013和7018。
上述标记可用于在疾病的任何阶段鉴定患者血液中的肺癌细胞。本领域技术人员已知的任何方法,都可用于鉴定血液或任何转移性组织中的所述标记。例如,可以鉴定由所述细胞表达的对所述标记专一的mRNA。
另外,可以用免疫技术鉴定所述蛋白本身,如Western印迹、FACS技术、ELISA和本领域技术人员公知的其他方法。所述抗体或功能性抗体部分可以购买、分离、或用已知方法生产。
在一种实施方案中,鉴定了所述标记的基因表达。可以鉴定与所述标记相关的基因表达的任何方法都可以使用。通常,所述方法扩增由所述基因表达所产生的mRNA。在一种实施方案中,使用对来自血液或组织的mRNA的RT-PCR。在另一种实施方案中,用抗体鉴定含有所述标记的血液中的细胞。例如,可以通过细胞分类鉴定由所述标记的抗体进行过荧光标记的细胞。
在一种实施方案中,用所述方法鉴定血液或骨髓中肺癌细胞的存在。不过,预计可以使用不能正常产生所述标记的任何组织的mRNA。例如,可以使用来自通常是转移瘤部位的器官的mRNA。因此,在另一种实施方案中,用所述方法鉴定诸如肝脏和大脑的器官中的肺癌细胞。
在一种实施方案中,用所述方法在有关疾病的非常早期的阶段鉴定肺癌细胞的存在,在另一种实施方案中,在病情缓解之后鉴定肺癌细胞或者确定疾病的复发。
在另一种实施方案中,用所述标记对体内或体外的肺癌细胞进行定向。在一种实施方案中,通过亲和技术清除体内的癌细胞,这种技术能够寻找癌细胞并且将癌细胞从血液中清除。
在另一种实施方案中,用所述标记鉴定存在于血液或骨髓或转移瘤器官或组织中的转移瘤细胞,所述细胞是由诸如胆管、结肠、乳腺、子宫、食道和咽喉的癌症产生的。还可利用所述标记从血液中清除转移瘤细胞。
在另一种实施方案中,用标记7013和7018鉴定癌细胞或其他细胞是否是来自上皮细胞。例如,如果所述细胞能表达一种或两种标记,它可能是来自上皮细胞的。
所述患者可以是可能患癌症的任何动物。在一种实施方案中,所述患者是哺乳动物。在另一种实施方案中,所述动物是宠物,如狗或猫。在另一种实施方案中,所述患者是人。
现在将结合下面的实施例对本发明进行说明。不过,应当理解的是,这些实施例仅仅是说明性质的,而不是要限制本发明。
在例1和2中,用多种示差展示技术鉴定所述标记。所鉴定的标记在例2中解释。
例1
s-AFLP示差展示
s-AFLP是基于对来自cDNA文库的限制片段的选择性PCR扩增。使用两套选择性引物。第一套是图1所示的选择性引物A,它包括三个部分;一个核心序列,一个酶专一性序列和两个位于3’末端选择性核苷酸。它能因为选择性引物的变化提供42=16种引物。第二套是图1所示的选择性引物B,它也包括三个部分:一个锚定序列,一个polyT序列和位于3’末端的用荧光团标记过的两个选择性核苷酸。它能提供3×4=12种引物,因为在polyT(A、G、和C)之后有三种选择序列。因此,包括polyA片段在内的所有3’末端cDNA限制片段都包括在由这种选择性PCR方法所产生的192(16×12)种类型之内。出现在扩增片段的凝胶展示上的每一个信号都表示所述cDNA文库中的一个非重叠基因。采用这种技术,将从肺癌样品的分离的RNA与来自健康个体血液中的RNA进行比较。在癌症样品中超量表达的差异表达基因,被认为是肿瘤细胞传播的一般遗传标记。
对于成功的sALFP来说,优质RNA是重要的。不过,肺样品是用于制备RNA的最困难的组织之一,因为其中存在来自肺泡巨噬细胞的大量RNases,因此,从NCCRI(Chuou-ku,东京,日本)购买速冻肺癌样品,并通过以前披露的AGPC方法纯化总RNA(Tominaga,K,Miura,Y.Arakawa,T.Koboyashi,K.and Mitsuhashi,M.Clin.Chem.,42,1750-1783,1998)。利用琼脂糖凝胶电泳或微型毛细芯片评估RNA的质量,并验证两条rRNA带的存在。然后将可以接受的样品用于sALFP。使用六种肺癌样品,每一种样品来自不同的患者,其中的四种样品是腺癌,两种是鳞状细胞癌。二十种对照血液来自没有诊断出恶性肿瘤或其他疾病的历史或存在这种疾病的健康志愿者。
制备肿瘤和血液样品的总RNA
在液氮中将新鲜冷冻的肿瘤样品粉碎成小片。通过胍方法从100毫克样品中提取总RNA(Chomzynski,P.and Sacchi,N.1987,Single-step method of RNA isolation by acid guanidinethiocyanate phenol-chloroform extfaction,Anal.Biochem.16:156-159)。从患者和健康志愿者的静脉内采集外周血样,放入装有肝素抗凝固剂的试管中。从每一个对象体内采集两份样品,在第一个试管中装1-2毫升外周血液,在第二个试管中装10毫升。丢弃第一个试管,因为它可能受到了在针头刺穿皮肤时挑取的上皮细胞的污染。仅对第二个试管进行分析。按照生产商的说明用RiboCapTM(RNature,Irvine,CA)从外周血液样品中提取总RNA。通过具有18s和28s核糖体带的琼脂糖凝胶电泳检验纯化的总RNA的质量,并且通过UV分光计测定其数量。
示差展示s-AFLP分析
用选择性引物技术实施改进过的示差展示“s-AFLP”。
将六种肺癌样品(肺癌组织)和两种各自包括五个健康个体的合并的健康血液样品用于s-AFLP分析。用于整个分析中的所有寡聚物都是从Sawady Technology(东京,日本)获得的。由30微克总RNA合成双链cDNA。在65℃下变性5分钟之后,在50微升反应混合物中,在37℃下对RNA进行逆转录90分钟。所述反应混合物含有以下成分:5O微克/毫升寡聚(dT)12-18引物(Life Technologies,USA),500μM每一种脱氧核苷三磷酸(dNTP)(Life Technologies),50mM Tris-HCl(pH8.3),75mM氯化钾,3mM氯化镁,10mM二硫苏糖醇(DTT),20单位的RNAsin(Life Technologies),以及100单位/毫升MMLV逆转录酶(Life Technologies)。第二条链反应是通过添加以下最终浓度的各种成分在16℃下进行120分钟而完成的:25mM Tris-HCl(pH8.3),100M氯化钾,10mM硫酸铵,5mM氯化镁,250μM每一种dNTP,0.15mM NAD,5mM DTT,250单位/毫升DNA聚合酶(LifeTechnologies),和30单位/毫升DNA连接酶(Life Technologies)。在所述反应之后,将试管放置在冰上,并且添加12.5微升的0.25M乙二胺四乙酸(EDTA;pH7.5),以便使酶失活。用苯酚/氯仿提取所述产物1次,并且用乙醇沉淀。在37℃下用X单位的4-碱基识别限制酶MboI(↓GATC;New England Biolabs,USA)消化双链cDNA 60分钟。用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP;Takara,日本)除去消化片段5’末端的磷酸残基,以免在连接过程中发生自我连接。添加20单位的CIAP和10微升10×碱性磷酸缓冲液(500mM Tris-HCl,pH7.9,5mM氯化镁),并且在37℃下培养30分钟。用苯酚/氯仿提取所述产物2次,并且用乙醇沉淀。将片段连接在所述寡聚物上,以便引入启动位点。将以下寡聚物用于连接:(P1)5’-P-GATCCCCTATAGTGAGTC-3’(接头寡聚物)[SEQ ID NO:1];(P2)5’-GACTCACTATAGGG-P-3’(辅助寡聚物)[SEQID NO:2]。辅助寡聚物的3’末端被磷酸化,以避免产生寡聚物二聚体。连接反应是以1∶100∶200摩尔比的消化过的片段∶辅助寡聚物∶接头寡聚物进行的。
所述反应是通过在45微升反应物中添加15微升Ligation High(Toyobo),在16℃下进行一夜。在通过快速核苷酸清除试剂盒(Qiagen,德国)清除未连接的寡聚物之后,扩增其3’末端包括PolyA尾巴的片段,并用两种类型的选择引物检测。一种类型的引物(P3)包括三个部分:锚定寡聚物的互补序列,MboI识别序列(GATC)和位于3’末端的两个简并核苷酸(5’-GACTCACTATAGGGATCNN-3’)[SEQ ID NO:3]。因为选择序列的变化(NN),P3具有42=16种类型。第二种选择引物P4也包括三个部分:一个锚定序列,一个PolyT序列和位于3’末端的由磺基罗丹明101标记过的两种简并核苷酸(5’-TCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’)[SEQ ID NO:4]。P4具有3×4=12种类型,因为选择性序列“V”是除了T以外的任何核苷酸。因此,包括PolyA片段的所有3’末端cDNA限制片段可以划分成192(=16×12)种类型,这些片段是分别通过192种PCR反应产生的。PCR是用Ex TaqDNA聚合酶(Takara,日本)进行的,循环参数为94℃30秒,56℃1分钟,72℃1分钟(30次循环)。通过聚丙烯酰胺凝胶(4%T,5%C)电泳分离扩增的产物,电泳是在装有1×TBE(0.09M Tris-硼酸和0.02MEDTA)和7M尿素的Hitachi SQ-3000荧光DNA测序仪上进行的。
将感兴趣的cDNA从凝胶上切除,并且通过粉碎和浸泡方法纯化。图2表示产生六种候选标记的样品凝胶。代表一种具体片段的带,在肺癌RNA中的含量高于正常血液中的含量。分离在六种肺癌组织泳道中的至少两种中存在的带,而在任意一种正常血液泳道中出现的带都不分离。由于示差展示通常会产生很多假阳性,选择标准是很重要的。用pGEM-Teasy Vector Systems(Promega,美国)亚克隆分离的带。使用T7引物(5’-TAATACGACTCACTATAG-3’)[SEQ ID NO:15],用Big Dye终止循环测序试剂盒(应用生物系统,CA,美国)和ABI Brism377DAN测序装置(应用生物系统)对通过微量制备方法纯化的产物进行测序。
Northern印迹分析
通过甲醛凝胶电泳分离总RNA,并且转移到尼龙膜(+)上(AmershamPharmacia,英格兰)。用pCR2-1克隆候选产物。通过序列分析证实克隆。用合适的酶限制质粒DNA,并用于体外转录。
筛选方法
首先,鉴定在健康血液中为阴性,而在肺癌中为阳性的121种候选标记。在对这121种候选标记进行测序之后,分析这些序列与GenBank以及表达序列标记(EST)数据库中的已知序列的同源性。
筛选真实信号和假信号的方法如下:将感兴趣的带从展示凝胶上切除,并且对有关的DNA进行克隆。然后对感兴趣的分离物进行测序。如果序列资料证实该基因是正常存在于血细胞中的话,就将它放弃。然后设计专一性引物,并对每一个克隆进行PCR。首先,通过PCR扩增正常血液RNA,并且,如果产生了PCR产物,就将该候选标记放弃。其余的21种候选标记针对来自肺癌患者的血液进行检测,如果在任何患者体内都没有发现信号的话,就将该候选标记放弃。该方法导致分离了四种候选标记(参见例2)。
表1:用于肺癌血液检测的的候选标记
候选标记 | 数据库 | 说明 |
Synd | nr | 多配体聚糖-1基因(外显子2-5) |
Col | nr | 原-2(1)胶原Col1A2基因(外显子1) |
7013 | EST | 基因组克隆位置1q32.2 |
7018 | EST | 无 |
例2
候选基因
候选标记如表1所示。所发现的第一种候选标记是作为多配体聚糖1基因鉴定的(核苷酸序列PubMed保藏号BC008765,蛋白序列保藏号AAH08765)(SEQ ID NO:18和19)。图6提供了由s-AFLP产生的片段的序列(SEQ ID NO:22)。对该序列进行的blast检索,产生了多配体聚糖1基因的外显子2-6的配对片段(GenBank保藏号Z48199)。多配体聚糖1是来自蛋白聚糖家族的细胞表面跨膜硫酸乙腺肝素蛋白聚糖,它能结合细胞外基质和生长因子。在若干种癌症中业已鉴定了该基因调控的丧失。
另一个候选标记是作为胶原1α2鉴定的(核苷酸序列PubMed保藏号J00114,蛋白序列保藏号AAA51996)(SEQ ID NO:20和21)。图7提供了由s-AFLP产生的老片段(SEQ ID NO:24)和新片段(SEQ IDNO:23)的序列。对该序列进行blast检索,提供了胶原原-α2(1)基因的外显子1的配对片段(GenBank保藏号J03464)。这是一种广泛表达的基因,尤其是在肺器官中表达。令人感兴趣的是,该基因是以与PLAG1(多态性腺瘤基因1)融合的融合蛋白形式参与成脂细胞瘤中的。
第三种候选标记被称为7013(SEQ ID NO:6),并且在对EST数据库进行检索时确定它是一种新的基因。图8提供了通过s-AFLP获得的片段的序列(SEQ ID NO:25)。将该片段用于通过引物延伸鉴定较大的片段(SEQ ID NO:16)。将该较大的片段克隆到pCRII上,所得到的质粒p7013业已按照布达佩斯条约规定于2001年6月21日交由设在美国马里兰州Bethesda的美国典型培养物保藏中心保藏,FEDEX货运标记为No.822080437778,所确定的ATCC保藏号为№______。较大的克隆是从cDNA文库中分离的,业已按照布达佩斯条约规定于2001年6月21日将p7013/12交由设在美国马里兰州Bethesda的美国典型培养物保藏中心保藏,FEDEX货运标记为No.822080437778,所确定的ATCC保藏号为№________。该质粒具有一个插入pCMV6-XL4中的大约2200碱基的插入片段。在进行BLAST检索时,鉴定了一种具有同源性的EST(GenBank保藏号AK002208),和一种基因组克隆(GenBank保藏号AL035408)。该序列与已知任何基因没有任何的同源性,不过业已定位于1号染色体的q32区,业已报导过该区在若干种上皮癌中进行扩增。
另一种优选物被称为7018(SEQ ID NO:17),并且也是一种新的基因。图9提供了通过s-AFLP获得的片段的序列(SEQ ID NO:26)。将该序列用于引物延伸形成cDNA,以便得到较大的片段(SEQ ID NO:16)。将该较大的片段克隆到质粒pCRII上,所得到的质粒p7018业已按照布达佩斯条约规定于2001年6月21日交由设在美国马里兰州Bethesda的美国典型培养物保藏中心保藏,FEDEX货运标记为No.822080437778,所确定的ATCC保藏号为№_______。在进行BLAST检索时,鉴定了具有最高同源性的两种ESTs(GenBank保藏号AW956727和AW452795),但是与已知基因没有任何同源性。另外,到目前为止还没有将它定位在任何染色体区上。
例3和4鉴定了所述标记是否是由正常肺细胞和肺癌细胞系表达的。
例3
所述标记在正常肺细胞和肺细胞系中的表达
为了确定所述标记是否在正常人肺细胞中表达,对正常人肺RNA进行RT-PCR,使用来自人肺小通气孔上皮细胞、来自肺的小血管上皮细胞、支气管上皮细胞和正常人肺成纤维细胞的等量RNA。
由正常肺或肺癌细胞系制备总RNA
使用TRI REAGENT方法(Molecular Research Center,Inc.,Cincinnati,OH,美国),通过酸-硫氰酸胍/苯酚/氯仿提取从细胞中分离总RNA。没有必要对RNA进行彻底纯化,实际上,某些DNA污染是可以接受的,如果引物是在跨越内含子的部分设计的话。
RT-PCR
在进行逆转录之前,用DNaseI处理所有RNA样品,以确保没有基因组DNA污染。每1微克总RNA使用1单位的DnaseI(LifeTechnologies)。用苯酚/氯仿提取该产物2次,并且用乙醇沉淀。来自细胞系的每0.5微克RNA使用200单位的MMLV转录酶进行cDNA合成(42℃50分钟),而每1微克来自血液的总RNA使用100单位的转录酶ReverTraAceTM进行cDNA合成(37℃60分钟)。
首先,将100单位的逆转录酶ReverTraAceTM(TOYOBO,日本)用于每1微克总RNA,50微克/毫升寡聚(dT)12-18引物(LifeTechnologies),500微克/毫升每一种脱氧核苷三磷酸(dNTP)(LifeTechnologies)进行cDNA合成,在37℃下进行60分钟。在每一种PCR来说,在25微升的总反应体积中使用50纳克总RNA,10皮摩尔引物对,和0.125单位EX Taq DNA聚合酶。每一种遗传标记的引物对和循环条件如下:SYND标记是用引物rP5(5’-TCATGTGTGCAACAGGGTAT-3’)[SEQID NO:5]和引物P6(5’-AATATTCCTGATTCCAGCCC-3’)[SEQ ID NO:6]。循环条件为94℃30秒,65℃1分钟,72℃1分钟(30次循环)。COL是用引物P7(5’-CAGAGCATTGTGCAATACAGTTTCATTAACTCCT-3’)[SEQ IDNO:7]和引物P8(5’-GGTTTTCTTACAAAGGTTGACATTTTCCTAACAG-3’)[SEQID NO:8]扩增的。循环参数为94℃30秒,58℃1分钟,72℃1分钟(20次循环)。对于第2轮PCR反应来说,反应混合物含有1微克第1轮PCR产物作为模板和引物对P3和P4。PCR的第2个步骤是在94℃下循环30秒,在60℃下循环1分钟,在72℃下循环1分钟,共20轮。7013是用引物P9(5’-AATAAAGGAGACATCTGGAGTGTGCG-3’)[SEQ ID NO:9]和P10(5’-AGAAAAGAAAGATTAAGGTTCCCATCTGCG-3’)[SEQ ID NO:10]扩增的。循环条件为94℃30秒,63℃1分钟,72℃1分钟(38次循环)。7018是用引物P11(5’-ATCCATGCAGGTCACTTTCCTTTCC-3’)[SEQ ID NO:11]和P12(5’-TCAAGTAGGCACAACCCAGTCCT-3’)[SEQ ID NO:12]扩增的。循环条件为94℃30秒,63℃1分钟,72℃1分钟(38次循环)。CK-19是用引物P13(5’-CAAGATCCTGAGTGACATGCGAAG-3’)[SEQ ID NO:13]和引物P14(5’-CGCTGATCAGCGCCTGGATATG-3’)[SEQ ID NO:14]扩增的。循环参数为94℃30秒,60℃1分钟和72℃1分钟(20次循环)。对于第2轮PCR反应来说,将1微克第1轮PCR产物作为模板,并使用相同的引物对P13和P14,以及相同的循环参数。在PCR之后,通过在4%NuSieve GTG琼脂糖凝胶(Takara,日本)上电泳,对1微升PCR产物进行分析。
作为正对照,所有样品都进行β-肌动蛋白的PCR。将四种候选标记7018、7013、多配体聚糖1(Synd)、胶原1A2(Col)和阳性对照细胞角蛋白-19(Ck-19)的引物用于RT-PCR。细胞角蛋白-19是众所周知的上皮细胞标记。使用以上5个引物对对所述标记进行PCR扩增。对于细胞系来说,在50微升的总反应体积中使用0.1体积的RT反应物,10μM每一种引物和1.24单位Taq DNA聚合酶。对于全血来说,在25微升的总反应体积中使用0.1体积的RT反应物,10μM每一种引物和0.125单位的EXTaq DNA聚合酶。每一种引物的PCR条件如表2所示。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,并通过测序证实某些产物。表2:每一种引物对的PCR条件
PGR循环标记 起始变性 变性 退火 延伸 最后延伸7018 94℃ 1min. (94℃ 30sec. 53℃ 30sec. 72℃ 1min)x35 72℃ 5min.7913 94℃ 1min. (94℃ 30sec. 60℃ 30sec. 72℃ 1min)x35 72℃ 5min.Synd 94℃ 1min. (94℃ 30sec. 55℃ 30sec. 72℃ 1min)x35 72℃ 5min.Col 94℃ 1min. (94℃ 30sec. 52℃ 30sec. 72℃ 1min)x35 72℃ 5min.Ck-19 94℃ 1min. (94℃ 30sec. 65℃ 30sec. 72℃ 1min)x35 72℃ 5min.β-肌动蛋白94℃ 1min. (94℃ 30sec. 53℃ 30sec. 72℃ 1min)x35 72℃ 5min.
正常细胞PCR的结果如表3所示。该结果表明,四种新分离的标记通常能在检验过的正常肺细胞系中表达。另外,新标记7013和7018对肺上皮细胞来说是专一的(表3,还可参见图3)。发现多配体聚糖1能在所有五种RNA中表达。胶原基因也能在所有五种RNA中表达。发现7013基因只能在总肺癌组织和上皮细胞中表达,7018也是这样。发现肺癌标记细胞角蛋白-19也只能在总肺和上皮细胞中表达。
表3:肺RNA和肺细胞系RNA中的mRNA标记的RT-PCR扩增
7018 | 7013 | Synd | Col | Ck-19 | |
总的肺RNA | + | + | + | + | + |
SAEC(小通气孔上皮细胞) | + | + | + | + | + |
NHBE(支气管上皮细胞) | - | + | + | + | + |
HMVECL(肺里的小血管上皮细胞) | - | - | + | + | - |
NHLF(肺成纤维细胞) | - | - | + | + | - |
例4
所述标记在肺癌细胞系中的表达
为了确定上述标记是否在肺癌细胞系中表达,使用相同量的RNA对来自12种肺癌细胞系的RNA进行RT-PCR(参见表4)。通过琼脂糖凝胶电泳对所有PCR产物进行分析,并且通过测序证实某些产物。所有RNA扩增的阳性对照-肌动蛋白都同样好。使用癌细胞系Lu99(Yamada,et al.,Giant cell carcinomas of the lung producingcolony-stimulating factor in vitro and in vivo,Jpn.J.CancerRes.,76:967-976,1985)、PC13(大型细胞癌)、A549(Imanishi,et al.,Hahibition of growth of human lung adenocarcinoma celllines by anti-transforming growth factor-α monoclonalantibody,J.Natl.Cancer Inst.,81:20-23,1989)、PC14、NCI-H441(腺癌)、PC1、和QG56(鳞状细胞癌)。
如图4所示,还通过RT-PCR检验了所述标记在6种肺癌细胞系RNA中的存在。其中4个细胞系是腺癌,而在泳道5和6中的细胞系是鳞状癌。发现多配体聚糖1能在所有6种细胞系中表达。发现胶原基因在6种细胞系中的4种中表达较强,而在2种中表达弱。有趣的是7013和7018表现出不同的表达形式。在6种细胞系的4种中发现了7013,而在6种细胞系的5种中发现了7018。它与细胞角蛋白-19相当,这种标记也出现在6种细胞系的5种中。鳞状细胞系5028不能表达细胞角蛋白-19,但能表达7018。
表4:来自肺癌细胞系的RT-PCR表达标记
细胞系 | 细胞类型 | 7018 | 7013 | synd | Col | Ck-19 |
A549PC14NCl-H23NCl-H358NCl-H441SW1573QG56PC1NCl-H157NCl-H520Lu99PC13 | 腺癌腺癌腺癌腺癌腺癌腺癌鳞状细胞鳞状细胞鳞状细胞鳞状细胞大细胞大细胞 | +--+++++++-+ | +++++-++-+-+ | +-+++++-++-- | +-++-+++++-- | +-++-++--++- |
例5提供了利用所述标记鉴定肺癌细胞的方法。在例5中,利用RT-PCR鉴定所述标记的mRNA在血液样品中的存在。
例5
所述标记在患者血液中的表达
对1998年11月到2000年4月之间在Keio大学医院诊断并治疗过的患有肺癌的68位患者进行研究,同时对同一时期在Keio大学医院的患有转移性肺癌的7位患者进行研究。这些患者的特征如表5所示。
使用4种候选标记7018、7013、多配体聚糖1(synd)、胶原1A2(Col)和一种阳性对照细胞角蛋白-19(Ck-19),通过RT-PCR对来自患者血液样品的RNA进行检测。为了获得有效结果,必须对所述样品进行成功地标记扩增,并且对肌动蛋白进行成功扩增。
来自全血的总RNA制剂
从患者和健康志愿者的肘前静脉中采集外周血液样品,并且收集到装有肝素抗凝固剂的试管中。用标准低渗溶液裂解红血细胞(RBCs),并且将完整的血细胞群体收集到RiboCap注射器滤膜(RNAture,Irvine,CA)上。通过添加胍溶液将RNA从所述注射器滤膜上洗脱,然后用标准AGPC方法处理。通过琼脂糖凝胶电泳,用18s和28s核糖体RNA带分析纯化的总RNA的质量,并通过UV分光计测定其数量。在制备之后,将RNA沉淀重新悬浮在20微升二乙基焦碳酸盐(DEPC)处理过的水中,并且在-80℃下保存。
RT-PCR
在进行逆转录之前,用DNaseI处理所有RNA样品,以便消除任何可能的基因组DNA污染。合成cDNA,来自细胞系的每0.5克RNA使用200单位MMLV转录酶(42℃50分钟),来自总血液RNA的每1微克RNA使用100单位的转录酶ReverTraAceTM(37℃60分钟)。
对所有样品进行PCR,用β-肌动蛋白作阳性对照。图5提供了来自血液RNA的阳性检测的一个例子。将4种候选标记7018、7013、多配体聚糖1(synd)、胶原1A2(Col)的引物以及已知的作为上皮细胞标记的细胞角蛋白-19(Ck-19)的引物用于RT-PCR。对于细胞系的RT-PCR来说,将0.1体积的RT反应物、10微升每一种引物和1.24单位的Taq DNA聚合酶用于50微升的总反应体积中。对于全血的RT-PCR来说,将0.1体积的RT反应物、10微升的每一种引物和1.25单位的EXTaq DNA聚合物用于25微升的总反应体积中。PCR反应条件如表2所示。
表5:肺癌患者的特征
分组 | 特征 | 数量 |
性别 | 男性 | 48 |
女性 | 20 | |
年龄 | -39 | 1 |
40-49 | 14 | |
50-59 | 8 | |
60-69 | 18 | |
70-79 | 25 | |
80- | 2 | |
阶段 | IA | 9 |
IB | 6 | |
IIA | 0 | |
IIB | 2 | |
IIIA | 12 | |
IIIB | 15 | |
IV | 15 | |
复发 | 8 | |
未知 | 1 | |
组织学 | 腺癌 | 35 |
鳞状细胞癌 | 19 | |
大细胞癌 | 3 | |
小细胞癌 | 2 | |
腺鳞状细胞癌 | 1 | |
未知 | 8 |
在表6中,示出了检测所述鉴定标记存在的、来自肺癌患者和对照健康志愿者的血液的RT-PCR结果。检测了I-IV期患者和40位健康志愿者的所述标记的表达。总的来讲,结果表明4种基因:7018、7013、Synd和Col没有在健康的对照血液中表达,而在癌细胞系中表达(参见表6)。
表6:肺肿瘤患者的RT-PCR分析结果
患者 | N | Synd | Col | 7013 | 7018 | % |
I-1V期 | 68 | 13 | 9 | 25 | 3 | 54 |
健康 | 20 | 0 | 0 | 0 | 1 | 5 |
更具体地讲,在表7中,在肺癌患者血液样品中,每一种基因的表达率分别为3%、41%、19%和16%,不过,这4种基因中至少有一种在57%的患者血液样品中表达。另外,在使用细胞角蛋白-19时,这5种基因中至少有一种在71%的患者中表达。上述基因中的一种或多种在80.5%的腺癌中表达,并且在68.4%的鳞状细胞癌中表达。
在13位肺癌患者体内发现了多配体聚糖,但在对照(健康)患者体内没有发现。仅在肺癌患者体内发现了胶原。7013标记能在肺癌患者体内普遍表达,但不能在仅有的1位对照体内表达。只发现了7018既能在对照体内表达,又能在肺癌患者体内表达。
表7:肺癌患者血液中阳性RT-PCR表达标记的比例
细胞类型 患者数量 7018 7013 Synd Col 4项组合 Ck-19 5项组合 | |||
腺细胞 34 2 14 8 5鳞状细胞 21 1 7 3 2大细胞 3 0 1 1 0腺鳞状细胞1 0 0 0 0小细胞 2 0 1 0 1未知 8 0 3 1 1总知 69 3 26 13 9 | 2210201439 | 107001321 | 2713201649 |
因此,有54%的患者表现出上述4种标记中的至少一种或多种。
总之,业已鉴定了存在于肺癌患者血液中,但正常血液中缺乏的4种新的潜在标记。这些标记中的2种是新的基因。在接受检查的54%的肺癌患者血液中观察到了这些新标记的组合(表5),而在接受检查的68%的肺癌患者血液中出现了上述标记与细胞角蛋白-19的组合。因此,将所述组合用于早期诊断肺癌的微型转移或用于诊断复发是理想的。
在例6中,说明了使用5种标记的分子方法在任何类型或阶段的肺癌中鉴定肺癌细胞的能力。
例6
对肺癌类型和阶段的分析
检测患有不同类型和阶段肺癌患者对以上4种标记的表达(表8)。
表8:转移性肺癌患者的特征
来源(细胞类型) | 年龄 | 性别 |
胆管(腺癌) | 59 | 女 |
结肠(腺癌) | 60 | 女 |
乳腺(腺癌) | 68 | 女 |
子宫(鳞状细胞癌) | 68 | 女 |
子宫(鳞状细胞癌) | 55 | 女 |
食道(鳞状细胞癌) | 56 | 男 |
咽喉(鳞状细胞癌) | 59 | 男 |
如例5所述,69位肺癌患者的血样是从Keio大学医院获得的。肿瘤阶段的划分是按照肿瘤-节-转移(TNM)评分进行的(Mountain CE:一种新的肺癌时期国际划分系统。Chest89:225S-233S,1986)。按例5所述方法纯化RNA并进行RT-PCR。分析每一种在血液样品中的表达,结果如表9所示。
从表9中可以看出,尽管所述标记在晚期阶段更有可能表达,但如果使用所有5种标记的组合的话,就可以在这种疾病的所有阶段对它进行鉴定。因此,组合使用这5种基因,至少有一种基因在56%的IA期表达,33%在IB期表达,50%在II期表达,92I在IIIA期表达,60%在IIIB期表达,以及87%在IV期表达。
表9:在各时期的肺癌患者血液中阳性RT-PCR表达的比例
时期 | 7018 7013 Synd Col 4项组合 Ck-19 5项组合 |
IAIBIIIIIAIIIBIVRec. | 1 2 0 3 4(44%) 2 5(56%)0 1 1 1 2(33%) 1 3(50%)0 0 1 0 1(50%) 1 2(100%)0 9 4 0 10(83%) 2 11(92%)2 2 3 3 7(44%) 5 9(56%)0 9 3 2 11(11%) 8 13(81%)0 3 1 0 4(50%) 2 6(76%) |
*四种标记的组合:7013、7018、Synd、和Col
**五种标记的组合:7013、7018、Synd、Col、和Ck-19
在检测来自患有转移性疾病患者的血液时,发现至少有一种标记可以在所有类型的转移性疾病中检测到(参见表10)。这表明可以将所述标记用于检测所有时期的肺癌疾病,并且检测复发性转移瘤。
表10:转移性肺癌患者血液中的标记检测
来源(细胞类型) 7018 7013 Syndd Col Ck-19
胆管(腺) - + - - -
结肠(腺) + - + + -
乳腺(腺) + + - - +
子宫(鳞状) - - - - -
子宫(鳞状) - - - + +
食道(鳞状) - + + - +
咽喉(鳞状) - + - - -
例11
通过来自一种或多种所述鉴定标记的mRNA诊断和分析肺癌的存在
分离来自患者的血液,并且从血液样品中纯化RNA。用至少一种下列标记进行RT-PCR:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018。同样进行诸如肌动蛋白的对照。另外,还通过RT-PCR检测了另一种标记细胞角蛋白-19。合并有关结果,并分析每一种标记的表达。
例12
用所述鉴定标记中的一种或多种的抗体诊断并分析肺癌的存在
购买、制备、或者从患者血液中分离对以下标记专一的单克隆或多克隆抗体:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018、以及细胞角蛋白-19。所述抗体是用本领域技术人员公知的方法制备的,包括杂交瘤技术,将融合蛋白注射到兔子体内,生产人源化抗体,文库技术等。另外,可以使用完整抗体或其功能性部分。分离来自患者的血液,并且用抗所述鉴定标记中的一种或多种的抗体处理所述细胞。对所述抗体进行荧光标记,或者对二级抗体进行荧光标记。通过采用FACS技术,根据所述荧光标记的存在鉴定具有所述标记的细胞。每一种标记是使用不同的荧光标记抗体鉴定的,可以在单一的血液样品中鉴定一种以上标记。
例13
从血液或骨髓中分离癌细胞
通过用对下列一组的至少一种标记专一的抗体处理转移性癌细胞或含有这种细胞的非肺组织,从血液或骨髓中分离转移性癌细胞:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018以及细胞角蛋白-18。
将所述抗体结合在选自下列一组的成分上:金属颗粒、荧光颗粒、层析小球、层析凝胶和固体支持物。
然后将分离的细胞用于鉴定转移所述癌细胞的或产生对所述癌专一的活化免疫细胞的部位。另外,还可将该方法用于从血液中纯化细胞。
例14
分离完整长度的cDNA克隆
将通过s-AFLP技术获得的克隆,用于设计检测完整长度cDNA克隆用的引物。从Stratagene(Torrey Pines,CA)购买人cDNA文库。用对7013(SEQ ID NO:16)和7018(SEQ ID NO:17)专一的探针筛选该文库。在获得阳性克隆之后,通过PCR检测该克隆,并测序。
例15
细胞上皮来源/癌的鉴定
因为标记7013和7018能专一性地识别具有上皮来源的细胞,可以将所述标记用于鉴定细胞是否具有上皮来源,或者对于癌症来说它是否是癌。按例12所述方法处理所述细胞用于FACS分析,只使用标记7013和7018。如果所述细胞由一种或两种标记进行过荧光标记的话,就可以确定该细胞是上皮来源的或者是癌细胞。
Claims (19)
1.一种鉴定肺癌的方法,包括:
从患者体内分离血液或非肺组织,
鉴定下列至少一种标记的存在:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018。
2.如权利要求1的方法,还可以包括鉴定标记细胞角蛋白-19的存在。
3.如权利要求1的方法,其中鉴定至少两种标记。
4.如权利要求2的方法,其中鉴定两种以上标记。
5.如权利要求1的方法,其中所述鉴定通过RT-PCR进行的。
6.如权利要求1的方法,其中所述鉴定通过抗体结合进行的。
7.如权利要求1的方法,其中所述患者是哺乳动物。
8.如权利要求7的方法,其中所述哺乳动物是人、狗或猫。
9.一种分离或消除转移性癌细胞的方法,包括:
用对选自下列一组的至少一种标记专一的抗体治疗癌细胞或含有癌细胞的非肺组织:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018。
10.如权利要求9的方法,还包括对标记细胞角蛋白-18专一的抗体。
11.如权利要求9的方法,其中所述抗体与选自下列一组的成分结合:金属颗粒、荧光颗粒、层析小球、层析凝胶和固体支持物。
12.如权利要求9的方法,其中使用两种标记。
13.如权利要求9的方法,其中使用两种以上标记。
14.一种多核苷酸,至少包括SEQ ID NO:16(p7013,保藏号为ATCC______,2001年6月21日)的17个核苷酸。
15.一种多核苷酸,至少包括SEQ ID NO:17(p7018,保藏号为ATCC______,2001年6月21日)的17个核苷酸。
16.一种多核苷酸,至少包括p7013/12(保藏号为ATCC________,2001年6月21日)的17个核苷酸。
17.一种用于鉴定患者体内的实体肿瘤的转移瘤的方法,包括:
从所述患者体内分离血液或骨髓;
鉴定选自下列一组的至少一种标记的存在:多配体聚糖1、胶原1α2、7013和7018。
18.如权利要求16的方法,其中所述实体肿瘤选自胆管、结肠、乳腺、子宫、食道和咽喉。
19.一种鉴定癌的方法,包括:
获得癌细胞;和
鉴定选自7013、7018和这两者的标记的存在。
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