CN1467293A - 传染性法氏囊病病毒(ibdv)多聚蛋白基因(vp2/vp4/vp3)、真核表达质粒、dna疫苗 - Google Patents
传染性法氏囊病病毒(ibdv)多聚蛋白基因(vp2/vp4/vp3)、真核表达质粒、dna疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因，它比病毒主要宿主保护性抗原VP2基因更能增强疫苗的免疫原性。本发明还提供了以pCI作为真核表达载体，含有上述编码序列的重组载体，它比其它常规真核表达载体的表达能力强10－40倍，基因表达量高可以增强DNA疫苗的效果。。本发明还提供了一种传染性法氏囊病病毒的DNA疫苗，包括上述真核表达质粒和免疫佐剂，其质量比为1∶1－5，它是一种安全、稳定、有效的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗，制备简单、贮运方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因、真核表达质粒、DNA疫苗。
背景技术
传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)引起的急性接触性传染病，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官—法氏囊，导致雏鸡的免疫抑制，该病的重要性不仅在于暴发本病后带来的直接经济损失，更重要的是造成其它疫苗的免疫接种失败。目前，对IBDV的主要宿主保护性抗原VP2基因有较多研究，但VP2蛋白对IBDV的免疫保护效果不理想。IBD传统的防治方法是接种弱毒苗和灭活苗，但弱毒苗毒力易返强、易受母源抗体干扰，灭活苗效果不够稳定、并且不能有效抵抗IBDV变异株与超强毒株的攻击。为了研制基因工程疫苗防制IBD，VP2基因先后在大肠杆菌、酵母、重组禽痘病毒、重组火鸡疱疹病毒、重组马立克氏病毒、重组杆状病毒等系统中获得了表达。但由于基因工程疫苗的免疫原性依赖于不同的表达系统、诱导产生免疫保护的能力依赖于VP2蛋白的抗原表位的构象、生产成本昂贵、也不能解决抗原变异问题等，基因工程疫苗难以商品化。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因。
本发明另一个所要解决的问题是提供一种能够用于DNA疫苗的真核表达质粒。
本发明再一个所要解决的问题是提供一种安全、稳定、有效的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗。
本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因，其核苷酸序列如说明书附图中的图1，长度为3039个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链。
研究表明，传染性法氏囊病病毒(IBDV)的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因可以形成病毒样颗粒(VLPs)，VLPs可以正确折叠并模拟传染性法氏囊病病毒颗粒的天然构象，比单独表达病毒主要宿主保护性抗原VP2基因更能增强疫苗的免疫原性。
本发明提供的真核表达质粒为以pCI(可购自Promega公司)作为真核表达载体，含有上述多聚蛋白基因(VP2/VP4/VP3)的编码序列的重组载体(pCI-VP2/VP4/VP3)。该重组载体保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC0720，保藏时间2002年3月4日。
pCI载体含有源于β-珠蛋白与IgG内含子组成的序列，该序列的存在可显著增强目的基因表达，比其它常规真核表达载体如pcDNA3表达能力强10-40倍，因此基因表达量高可以增强DNA疫苗的效果。
本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗，它包括真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)和免疫佐剂，pCI-VP2/VP4/VP3∶免疫佐剂＝1∶1-5。
所述的免疫佐剂可以是免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体、细胞因子、弗氏不完全佐剂、蜂胶等。
本发明与现有的IBD疫苗相比具有以下的优点：(1)本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗具有很好的安全性，DNA疫苗不含有任何传染因子，没有弱毒苗引起的法氏囊损伤和毒力返强的危险性。(2)本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗具有很好的稳定性，pCI-VP2/VP4/VP3质粒在-20℃保存1年后，没有出现降解、丢失抗原基因，DNA疫苗在4℃保存2个月或-20℃保存6个月后均没有出现沉淀、异味、变质等现象，仍能保持良好的免疫效力。(3)本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗具有良好的免疫原性，对IBDV标准强毒株BC6/85(购自中国兽医兽药监察所)攻击的保护率达80％以上，可诱导产生高水平的体液免疫应答和细胞免疫应答，而传统的IBD疫苗仅能诱导体液免疫应答。(4)本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗具有良好的免疫效力，可对不同的致病毒株提供良好的交叉保护效果，DNA疫苗对IBDV标准强毒株BC6/85和其它致病毒株的攻击具有良好的免疫保护效果，平均保护率达83.33％。(5)本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗还具有制备简单、贮运方便等优点。
附图说明
图1：本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因的核苷酸序列。
图2：本发明提供的真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)的构建图。
图3：本发明提供的真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)的酶切鉴定图。
图4：本发明提供的基因真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)在Vero细胞中表达的间接免疫荧光图。
图5：图4的阴性对照图。
图6：本发明提供的真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)在Vero细胞中表达的ELISA试验结果曲线图。
图7：不同免疫剂量的本发明提供的DNA疫苗的中和抗体效价动态变化柱形图。
图8：不同免疫剂量的本发明提供的DNA疫苗的免疫保护效果统计表。
图9：不同途径免疫后，本发明提供的DNA疫苗诱导的中和抗体效价动态变化柱形图。
图10：不同途径免疫后，本发明提供的DNA疫苗免疫保护效果统计表
图11：本发明提供的DNA疫苗的安全性试验结果统计表。
图12：本发明提供的DNA疫苗的免疫效果稳定性试验结果统计表。
图13：本发明提供的DNA疫苗对不同致病毒株的交叉保护效果统计表。
本发明提供的真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC0720，保藏时间2002年3月4日。
具体实施方式
实施例1：
本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因的获得方法，克隆方法为RT-PCR，包括以下步骤：(一) 传染性法氏囊病病毒(IBDV)ZJ2000株的分离及鉴定
从浙江省杭州鸡场暴发疑似IBD的雏鸡中收集法氏囊病料(编号为ZJ2000)，用灭菌生理盐水按1∶3研磨成匀浆，反复冻融3次；15000r/min，40℃离心20min；取上清液加氯仿(5％)作用30min；15000r/min，40℃离心20min；取上清，加青霉素、链霉素(1000IU/ml)，4℃过夜，置-20℃保存备用。
对上述处理物与SPF鸡(即无特定病原鸡)IBD标准阳性血清的琼扩试验表明：病料孔与IBD标准阳性血清孔之间，均出现明显的白色沉淀线，而阴性血清对照组未见沉淀线。ZJ2000接种35日龄敏感鸡后，第2天开始发病，出现IBD的典型临床症状，病鸡精神萎顿，羽毛松乱，饮欲增强，拉白色粪便，第3天开始死亡，至第4天共死亡6只，剖检发现病鸡法氏囊严重水肿，呈胶胨状，个别法氏囊弥漫性出血，法氏囊粘膜普遍有大量针状出血点；肾脏、脾脏肿大；腿鸡、胸肌有出血点。ZJ2000接种9日龄鸡胚后，第2天便开始陆续死亡，死亡高峰为3-4天，致死率高达100％。死胚病变表现为：胚体充血，发育不良，呈侏儒胚，有点状出血，尤以颈、背、趾部为甚；胚体水肿以头部、腹部为甚，肝脏坏死，肾脏郁血。病毒分离物经鸡胚传6代，每代死亡率均可达100％，死胚均表现出IBD的病理变化。病毒样品经磷钨酸负染后透射电镜观察结果表明：病毒粒子呈六边形，无囊膜，直径约55纳米，没有发现其它病毒粒子，这些特征与IBDV的形态特征一致。以上试验证实所分离的ZJ2000株野毒是传染性法氏囊病病毒。(二)RT-PCR扩增ZJ2000株的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因
称取1.0g新鲜的病变法氏囊，加入2ml TEN研磨成匀浆，反复冻融3次，17000g离心15min，取0.5ml上清液加SDS、蛋白酶K至终浓度分别为0.5％、1mg/ml，60℃消化2h，加DEPC至终浓度为0.2％，60℃作用30min，加等体积醋酸钾(终浓度为1M)，乙醇沉淀，4℃，20000g离心30min，沉淀用0.5mlTE重悬，分别用酚、酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次，分离上层水相，加1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜，12000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤，室温干燥，溶于适量的DEPC处理水中，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，-20℃保存备用。
为了获得完整的多聚蛋白基因，设计一对引物，P1(5’CG
GAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAA 3’)；P2(5’TA
GGTACCTCACTCAAGGTCCTCATCAGAGAC3’)。为了便于以后的基因操作，P1和P2中分别引入酶切位点EcoRI(即P1中划线序列)和KpnI(即P2中划线序列)。
采用Gibco BRL公司的SuperscriptTM Preamplification System试剂盒进行病毒基因组dsRNA的反转录。将IBDV的dsRNA和引物P2混合物，于100℃沸水中煮5min，迅速冰浴淬灭1min。加入反转录反应液(含10×PCR buffer2μl，25mM MgCl2 2μl，10mM dNTP 1μl，0.1M DTT 2μl)，50℃保温5min，加1μl反转录酶，50℃反应50min，后于70℃ 15min终止反应。反应产物经1μl RNaseH于37℃消化20min，立即进行PCR反应。按ExpandHigh Fidelity PCR System的操作指南进行PCR反应，以反转录合成的第一链cDNA为模板，以P1和P2为引物扩增多聚蛋白基因，经优化后的循环反应参数为94℃预变性2min，94℃变性15sec，59℃退火30sec，68℃延伸3min；最后72℃保温3min，共35个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果得到3.0kb左右的特异性片段。(三)ZJ2000株的多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因的克隆和序列获得
低熔点胶回收3.0kb左右的特异性片段，溶于10μl TE，克隆于T载体(购自Promega公司)，连接反应按Promega公司提供的pGEM-T Easy Vector克隆kit说明书进行，在一1.5ml的Eppendorf管中依次加入以下试剂：2×Rapid Ligation Buffer 5μl，pGEM-T Easy Vector 1μl，纯化的PCR产物2μl，T4 DNA lignase(3 wess unit/μl)，ddH2O 1μl。共10μl反应体系，PCR产物与载体的摩尔比约为3∶1，混匀后，室温连接1h，直接转化感受态细胞，涂布含氨苄青霉素、X-gal、IPTG的LB平板，37℃培养24h，挑取单菌落，接种含有氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养24h，碱裂解法提取质粒DNA。
为保证序列的正确性，上述质粒DNA重复3个阳性克隆进行测序。采用渐进法(prime walking)ABI PRISM 377DNA Sequencer自动测序仪进行测序反应，即5’和3’端先用通用引物进行反应，后根据两端测出的序列，设计中间段测序引物，再进行往后的反应，分别进行了7个测序反应得到多聚蛋白基因的完整序列。测序结果表明，ZJ2000株的多聚蛋白基因全长3039个核苷酸，编码共有1013个氨基酸组成的完整的多聚蛋白(图1所示)。
实施例2
本实施例描述了本发明提供的真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)的构建过程及在哺乳动物细胞中的表达，并包括以下步骤：(一)真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)的构建过程
真核表达质粒pCI-VP2/VP4/VP3的构建过程见图2：低熔点胶回收3.0kb的多聚蛋白基因片段，用EcoRI和KpnI双酶切；酚氯仿抽提后，溶于适量的TE溶液中。真核表达载体pCI经EcoRI和KpnI双酶切，酚氯仿抽提后，溶于适量的TE溶液中。目的基因与载体以3∶1的摩尔比进入连接体系，转化感受态细胞，LB培养基振荡培养1h，涂布含有氨苄青霉素的LB平板。挑取单菌落振荡培养过夜，碱裂解法抽提质粒，电泳鉴定，将重组质粒命名为pCI-VP2/VP4/VP3。采用EcoRI、XhoI和ApaI单酶切，EcoRI+KpnI、EcoRI+XbaI、EcoRI+AccI、EcoRI+HindIII、EcoRI+BamHI双酶切，进一步鉴定ZJ2000株重组质粒pCI-VP2/VP4/VP3；以重组质粒pCI-VP2/VP4/VP3为模板，实施例1中的P1和P2为引物，按上述条件进行PCR鉴定，同时设pCI空白质粒对照。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切鉴定结果见图3(1表示分子量标记λDNA/HindIII；2表示EcoRI单酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒；3表示EcoRI和KpnI双酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒；4表示XhoI单酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒；5表示EcoRI和XbaI双酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒；6表示EcoRI和AccI双酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒；7表示EcoRI和HindIII双酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒；8表示EcoRI和BamHI双酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒；9表示ApaI单酶切pCI-VP2/VP4/VP3重组质粒)，多聚蛋白基因以按正确的方向插入pCI的CMV启动子的下游。(二)转染级超纯度真核表达质粒的制备
按Gibco公司提供的ConcertTM High purity Plasmid Purification System Kit说明书进行。收集3ml含有ZJ2000株pCI-VP2/VP4/VP3质粒的大肠杆菌过夜培养物；加2ml Equilibration Buffer到滤柱中重力作用自然干燥；加0.4ml细胞上清缓冲液(含有Rnase A)悬浮细胞沉淀物；加0.4ml细胞裂解液，上下颠倒5次，室温静置5min，千万勿震荡；加0.4ml中和缓冲液，立即上下颠倒5次，室温下12000g离心10min，千万不能在4℃离心；吸取上清液到平衡柱中，重力作用下自然过柱，弃过柱液；用2.5ml清洗液洗柱2次，重力作用下自然过柱，弃过柱液；加0.9ml洗脱液溶解DNA，重力作用下自然过柱，收集洗脱液；加0.63ml的异丙醇到洗脱液中，混匀，4℃，12000g离心30min，小心弃上清；用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g离心5min，小心弃上清，室温干燥10min；用适量灭菌ddH2O溶解沉淀，注意最好不用TE溶解以避免转染细胞时出现毒性反应；用灭菌ddH2O稀释DNA，使DNA的浓度维持在1μg/μl。(三)脂质体介导pCI-VP2/VP4/VP3转染Vero细胞
在6孔细胞培养板上接种2×105个细胞数于2ml含有胎牛血清的培养基；37℃ 5％CO2培养箱培养18-24h至40-60％的细胞汇片；在Eppendorf管中准备以下液体：Solution A：将8μgDNA稀释到100μl不含血清的OPTI-MEM IReduced Serum Medium培养基中；Solution B：稀释10μl Lipofectin Reagent(Life Technology)到100μl不含血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基中。为了达到最佳的转染效果，DNA不能超过20μg/ml和LipofectinReagent不能超过200μg/ml；将Solution A和Solution B轻轻混匀，室温放置10-15min，溶液可能会出现浑浊，但不会影响随后的转染效果；用2ml不含血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基洗涤培养的Vero细胞；加0.8ml不含血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基到DNA-Lipofectin混合物中，混匀后，将混合物轻轻铺在Vero细胞上，在整个过程都不能加抗生素；37℃ 5％CO2培养箱培养6h；倾去DNA-Lipofectin混合物，加2ml含5％胎牛血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基继续培养48-72h，检测活性。(四)间接免疫荧光抗体法检测多聚蛋白的表达
图4表示：pCI-VP2/VP4/VP3转染Vero细胞后60h，用FITC标记的二抗进行间接免疫荧光抗体检测，荧光显微镜观察结果发现有大量黄绿色荧光，而图5中pCI阴性对照组没有特异性的荧光。(五)ELISA检测多聚蛋白的表达
图6表示：ELISA检测pCI-VP2/VP4/VP3在Vero细胞中的表达动力学表明，转染Vero细胞36h之前均没有检测到蛋白的表达，48h后即为阳性，P/N值达到2.56±0.40，72h达到高峰，P/N值达到2.92±0.27，随后又有所下降，说明表达的蛋白具有免疫反应性；而pCI对照组和正常对照组的P/N值均在1.5以下，结果均为阴性。
实施例3
本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因DNA疫苗，它包括真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)和免疫佐剂，pCI-VP2/VP4/VP3∶免疫佐剂＝1∶1-5(质量比)。所述的免疫佐剂可以是免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体、细胞因子、弗氏不完全佐剂、蜂胶等。其生产方法包括：(一)真核表达质粒的大量制备
将含ZJ2000株的pCI-VP2/VP4/VP3单个菌落划线于含氨苄青霉素的LB平板上培养过夜；挑取单个菌落于10ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养过夜；按1％的比例加入100ml含氨苄青霉素的LB培养液扩大培养6h至λ＝600nm处的OD值为0.7-0.8；800g离心20min，收集菌体，加3.2ml溶液I及1ml新配制的溶菌酶(5mg/ml)，混匀，冰浴30min；加入6.4ml溶液II，冰浴5min；加入4.8ml的溶液III，冰浴60min。溶液I、II、III的配方见《分子克隆实验指南》1989年第一版，科学出版社出版。然后1500g离心15min，上清加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜；12000g离心20min，沉淀以1mlTE悬浮，加0.192g醋酸铵(终浓度为2.5M)，混匀，冰浴30min；12000g离心20min，上清加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜；12000g离心20min，沉淀抽干，用0.4含RNA酶(20μg/ml)的TE悬浮，37℃作用30 min；等体积饱和酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇各抽提一次，收集水相，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAc(3M，pH4.8)，混匀，-20℃沉淀2h，12000g离心20min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，真空抽干，TE溶解。(二)质粒pCI-VP2/VP4/VP3的纯化、鉴定和定量
将Sepharose 2B凝胶用TE缓冲液(pH8.0)平衡；将Sepharose 2B凝胶悬浮，装入直径为1cm的层析柱；用20倍柱体积的TE缓冲夜平衡Sepharose2B柱，同时打开紫外检测仪和记录仪；吸去胶面上多余的TE缓冲夜，剩余1cm高度的溶液，让其自然流下，当胶面刚刚露出时，将pCI-VP2/VP4/VP3溶液沿柱内壁缓缓加到胶面，待pCI-VP2/VP4/VP3溶液全部进入凝胶时，用少量TE洗涤柱内壁，待所有液体全部进入凝胶后，连上TE缓冲液储液瓶，开始洗脱；收集第一峰洗脱液；Pharmacia Biotech微型分光光度计测定λ＝260nm和λ＝280nm处的OD值，衡量pCI-VP2/VP4/VP3的纯度和质量。质粒的OD260nm/OD280nm比值应在1.9-2.0，质粒浓度维持在1μg/μl左右。(三)酶切分析鉴定重组质粒
重组质粒经多种限制性内切酶酶切鉴定表明多聚蛋白已以正确的方向插入pCI的CMV早期立即启动子的下游；以重组质粒为模板PCR均能扩增出3.0kb的特异性条带。(四)以ISCOM作为佐剂的本发明提供的DNA疫苗的制备
(1)脂混合物的制备。将磷脂酰胆碱溶液1ml(100mg)与胆固醇/氯仿溶液1ml(100mg)混合，终浓度各为50mg/ml，充分混匀，分装，-40℃保存备用；
(2)乳化。将1ml纯化后的重组质粒pCI-VP2/VP4/VP3与100μl脂混合物混合，加温45℃以去除氯仿，反复混合使溶液完全清晰，即以充分乳化；
(3)透析。加入Quil A使其终浓度为1mg/ml，充分混合。将混合物装入透析袋，以0.001％的thiomersal透析，20℃透析3天，每12h换液一次。透析内液呈微絮状提示已形成完全ISCOM；
(4)检验。用大量的PBS 4℃透析20h，除去thiomersal，进行无菌检验和物理性状检验。所制得的DNA疫苗应匀质、无沉淀，接种LB平板培养至24h无细菌生长。
根据以上方法制备的DNA疫苗，pCI-VP2/VP4/VP3与免疫刺激复合物(ISCOM)的质量比在1∶1-5之间。当然，可以调节脂混合物和Quil A的浓度和体积，使DNA疫苗中pCI-VP2/VP4/VP3与免疫刺激复合物(ISCOM)的质量比在1∶1-5中取于与上述比例不同的数值。
上述纯化后的的重组质粒pCI-VP2/VP4/VP3可以1∶1-5的质量比与脂质体、细胞因子、弗氏不完全佐剂、蜂胶等免疫佐剂乳化混合，从而制得DNA疫苗。
实施例4
本实施例提供了本发明研制的传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因DNA疫苗的性能指标，包括最佳的免疫方案、良好的安全性、稳定性、免疫原性和对不同致病毒株攻击的保护效果。(1)DNA疫苗的免疫剂量筛选
将实施例3制得的DNA疫苗共分10μg(质粒pCI-VP2/VP4/VP3的质量，下同)、50μg、100μg、200μg、500μg等五个不同剂量免疫组，同时设有pCI空白质粒对照组、ISCOM对照组、正常对照组及攻毒对照组，每组15只鸡，所有免疫组在14日龄首次免疫，接种途径均为肌肉注射法，14天后，以各自相应的剂量进行二次免疫，二次免疫后14天，攻击IBDV中国标准强毒株BC6/85，攻毒后3天，人工扑杀，称取鸡体重、法氏囊重和脾重，计算平均囊体比和脾体比，检查鸡的法氏囊、脾脏等器官的眼观病变。所有试验组雏鸡的法氏囊用10％甲醛固定48h，自来水洗24h，60％、70％、80％、90％、95％、100％逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规法切片，苏木精-伊红染色，奥林巴斯显微镜下观察法氏囊组织的病理学变化。所有免疫组于首免后3、7、10、14天，二免后3、7、10、14、17、24天，随机翅静脉采血5只鸡，室温静置，收集血清，56℃灭活，固定病毒稀释血清法测定病毒血清中和抗体效价和动态变化规律。结果如图8【A表示法氏囊损伤评估数：0＝无损伤；1＝细胞轻微损伤，有少量滤泡；2＝法氏囊中度萎缩或细胞含1/3到1/2滤泡；3＝法氏囊严重萎缩坏死，细胞被滤泡完全充满；B表示11只鸡的平均值。平均器官重/体重＝平均器官重(克)×1000/体重(克)；a表示根据Fisher’s t-test无显著统计学差异(P＞0.05)；b表示根据Fisher’s t-test有显著统计学差异(P＜0.05)】所示，低剂量DNA疫苗10μg组和50μg组几乎不产生保护，100μg组的攻击保护率达66.67％，200μg组和500μg组的保护效果最好，同为73.33％，说明免疫剂量是影响DNA疫苗免疫效果的重要因素。pCI对照组、ISCOM对照组、攻毒对照组均出现IBD典型的临床症状、病理变化和组织学病变。病鸡主要表现为精神萎顿、羽毛蓬松、拉白色粪便，并出现鸡只的死亡，剖检发现法氏囊水肿(P＜0.05)、内有大量干酪样物质、法氏囊粘膜有点状出血，脾脏肿大(P＜0.05)。组织病理学变化表现为法氏囊淋巴细胞减少、萎缩、坏死，淋巴滤泡消失，呈空泡状，结缔组织大量增生。按生物统计学上的方差分析法进行平均囊体比、平均脾体比和中和抗体效价的统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如图7所示，不同的剂量DNA疫苗接种非免疫来杭鸡后，以200μg和500μg剂量组诱导的中和抗体水平最高，但二者无统计学差异(P＜0.05)，二免2周的中和抗体GMT值分别达4077.6和4199.5；100μg剂量组也能诱导较高的中和抗体，但水平低于200μg组和500μg组，二免2周的中和抗体GMT值达2358.3；10μg剂量组和50μg剂量组仅诱导很低水平的中和抗体。(2)DNA疫苗的免疫途径筛选
DNA疫苗共分肌肉注射、皮内注射、肌肉皮内联合免疫、静脉注射、腹腔注射、口服免疫和点眼免疫等七种途径免疫组，同时设有pCI空白质粒对照组、ISCOM对照组、正常对照组及攻毒对照组，每组15只鸡，所有免疫组在14日龄首次免疫，接种剂量均为200μg/羽，其中肌肉皮内联合免疫时，肌肉途径和皮内途径各用100μg。14天后，以各自相应的途径进行二次免疫，二次免疫后14天，攻击IBDV中国标准强毒株BC6/85，以下步骤同(1)。
结果如图10【A表示法氏囊损伤评估数：0＝无损伤；1＝细胞轻微损伤，有少量滤泡；2＝法氏囊中度萎缩或细胞含1/3到1/2滤泡；3＝法氏囊严重萎缩坏死，细胞被滤泡完全充满；B表示11只鸡的平均值。平均器官重/体重＝平均器官重(克)×1000/体重(克)；a表示根据Fisher’s t-test无显著统计学差异(P＞0.05)；b表示根据Fisher’s t-test有显著统计学差异(P＜0.05)】所示：肌肉和皮内联合免疫途径的保护效果最好，可达80.0％，其次是肌肉注射和皮内注射，分别达73.33％、66.67％，腹腔注射和静脉注射也有一定的效果，分别达60％和53.33％，平均囊体比和脾体比与正常对照组相比无统计学差异(P＞0.05)。而口服免疫组和点眼免疫组的保护率仅达13.33％和6.67％，病变的法氏囊明显水肿、脾脏肿大(P＜0.05)。pCI对照组、ISCOM对照组、攻毒对照组均出现IBD典型的临床症状、病理组织学变化。
结果如图9(A表示肌肉内；B表示皮内；C表示肌肉内和皮内联合；D表示静脉；F表示口服；G表示点眼)所示：200μg剂量的DNA疫苗经7种不同途径接种非免疫来杭鸡后，以肌肉皮内联合免疫诱导的抗体水平最高，肌肉注射和皮内注射次之，但三者差异不显著(P＞0.05)；静脉注射和腹腔注射也能刺激产生较高的抗体；口服免疫和点眼免疫仅能检测到很低的抗体；pCI对照组、ISCOM对照组和正常对照均没有检测到特异性的中和抗体。(3)DNA疫苗安全性
试验共分4组，即DNA疫苗组，B87组，D78组和正常对照组，B87及D78均为商品化的IBDV弱毒疫苗株，每组15只鸡，DNA疫苗组以200μg剂量经肌肉皮内注射联合免疫法，B87和D78按推荐剂量免疫，所有免疫组在14日龄首次免疫，14天后二次免疫。每天观察免疫鸡的反应，并于首次免疫后3天、二次免疫后3天、二免后10天，分别扑杀5只，全身、内脏器官检查后，剖取法氏囊，用10％甲醛固定，进行病理组织学检查。
结果如图11(*表示有法氏囊损伤的鸡数量)所示：DNA疫苗和两种弱毒疫苗(B87和D78)免疫后，连续观察3周，3种疫苗免疫后雏鸡临床上均未出现任何不良反应。首次免疫后3天扑杀，经检查，法氏囊、脾脏等均无眼观变化，病理组织学观察表明：DNA免疫组的所有法氏囊均正常，B87免疫组有2只鸡的法氏囊(2/5)出现轻微的损伤，D78免疫组有1只鸡法氏囊(1/5)出现轻微的损伤。二次免疫后3天扑杀，结果表明所有免疫组的法氏囊、脾脏等也均无眼观变化，病理组织学观察表明：DNA免疫组和B87免疫组均正常，而D78免疫组有1只鸡(1/5)出现轻微的损伤。二免后10天扑杀，三种疫苗均无病理变化。上述结果说明，DNA疫苗免疫对雏鸡是安全的，而B87和D78弱毒苗对雏鸡还具有一定的毒力。(4)免疫效果稳定性试验 ISCOM-pCI-VP2/VP4/VP3在4℃保存2个月或-20℃保存6个月后，检查疫苗的物理性状，并进行免疫效果稳定性试验。试验共分5组，即ISCOM-pCI-VP2/VP4/VP3保存2个月(4℃)组、ISCOM-pCI-VP2/VP4/VP3保存6个月(-20℃)组、ISCOM-pCI-VP2/VP4/VP3新制备组、pCI质粒对照组和非免疫攻毒对照组和健康对照组，每组10只鸡，ISCOM-pCI-VP2/VP4/VP3以200μg的免疫剂量经肌肉皮内注射联合法接种14日龄非免疫来杭鸡，首次免疫后14天，以相同的剂量、途径进行二免，二免后14天，攻击IBDV中国标准强毒株IBDV-BC6/85株，攻毒剂量为100BLD50，攻毒后3天，人工扑杀，称取鸡体重、法氏囊重和脾重，计算平均囊体比和脾体比，检查鸡的法氏囊、脾脏等器官的眼观病变，所有法氏囊用10％甲醛固定。
结果如图12(组1使用在4℃储存2个月后的DNA疫苗，组2使用在-20℃储存6个月后的DNA疫苗，组3使用新鲜制备的DNA疫苗)所示：制备的DNA疫苗在4℃保存2个月或-20℃保存6个月后均没有出现沉淀、异味、变质等现象，接种来杭鸡后，仍能保持良好的免疫效力。(5)DNA疫苗对不同致病毒株的交叉保护效果 试验共分4个大组，即DNA疫苗免疫组、弱毒苗B87免疫组、pCI空白质粒免疫组和正常对照组。DNA疫苗免疫组和弱毒苗B87免疫组组内又分为BC6/85株攻毒组、ZJ2000株攻毒组、ZJ991株攻毒组(浙江大学动物科学学院提供，IBDV变异株，临床表型与一般强毒株有差别)，每组共10只鸡。DNA疫苗组、弱毒苗B87组和pCI空白质粒免疫组均于14日龄首免，28日龄二免，DNA疫苗的免疫剂量均为200μg/羽，免疫途径均为肌肉和皮内联合注射法，B87弱毒苗按使用说明书进行免疫，二免后14天分别攻击BC6/85株、ZJ2000株、ZJ991株等3株毒株，每组均隔离饲养。攻毒后3天，人工扑杀，称取鸡体重、法氏囊重和脾重，计算平均囊体比和脾体比，检查鸡的法氏囊、脾脏等器官的眼观病变，所有法氏囊用10％甲醛固定。
结果如图13【A表示法氏囊损伤评估数：0＝无损伤；1＝细胞轻微损伤，有少量滤泡；2＝法氏囊中度萎缩或细胞含1/3到1/2滤泡；3＝法氏囊严重萎缩坏死，细胞被滤泡完全充满；B表示11只鸡的平均值。平均器官重/体重＝平均器官重(克)×1000/体重(克)；a表示根据Fisher’s t-test无显著统计学差异(P＞0.05)；b表示根据Fisher’s t-test有显著统计学差异(P＜0.05)】所示：DNA疫苗免疫组对3株强毒株都能提供良好的保护效果，对3株强毒株的平均保护率达83.33％，囊体比与正常对照组无统计学差异(P＞0.05)；弱毒苗B87对3株强毒株的平均保护率仅达60％，虽然对BC6/86株具有良好的保护效果，但不能对ZJ2000株和ZJ991株提供理想的保护，特别是攻击ZJ991株后，囊体比均有不同程度的下降(P＜0.05)；pCI对照组攻击ZJ2000株、ISCOM对照组攻击BC6/85株后，所有法氏囊呈严重水肿，平均囊体比显著增大(P＜0.05)；对照攻毒组攻击ZJ991株后，所有法氏囊严重萎缩，平均囊体比显著下降(P＜0.05)。这些结果提示DNA疫苗对3个毒株的交叉保护效果明显优于弱毒苗B87。
Claims (8)
1.具有下列核苷酸序列的传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/VP4/VP3)基因：1 atgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaaccggaccggcgtc81 cattccgggcgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggt161 cagggctaattgtctttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactac241 aagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagttacaactactgcaggctagtgagtcggagtctcac321 agtgaggtcaagcacacttcctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctga401 gtgaactgacagatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaacgtcctagta481 ggggaaggggtcaccgtcctcagcttacccacatcatatgatcttgggtatgtgaggcttggtgaccccattcccgcaat561 agggcttgacccaaaaatggtagccacatgtgacagcagtgacaggcccagagtctacaccataactgcagccgatgatt641 accaattctcatcacagtaccaaccaggtggggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgccatcacaagcctc721 agcgttgggggagagctcgtgtttcaaacaagcgtccatggccttgtactgggcgccaccatctacctcataggctttga801 tgggacagcggtaatcaccagggctgtggccgcaaacagtgggctgacgaccggcaccgacaaccttttgccattcaatc881 ttgtgattccaacaaacgagataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaaaagtggtggtcag961 gcaggggatcagatgtcatggtccgcaagagggagcctagcagtgacgatccatggtggcaactatccaggggccctccg1041 tcccgtcacgctagtggcctacgaaagagtggcaacaggatccgtcgttacggtcgctggggtgagcaacttcgagctga1121 tcccaaatcctgaactagcaaagaacctggttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattg1201 atactgagtgagagggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgactttcgtgaatacttcat1281 ggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcattcggcttcaaagacataatccgggccataaggagga1361 tagctgtgccggtggtctccacattgttcccacctgccgctcccctagcccatgcaattggggaaggtgtagactacctg1441 ctgggcgatgaggcacaggctgcttcaggaactgctcgagccgcgtcaggaaaagcaagagctgcctcaggccgcataag1521 gcagctgactcgcgccgccgacaaggggtacgaggtagtcgcgaatctattccaggtgccccagaatcccgtagtcgacg1601 ggattcttgcttcacctcgggtactccgcggtgcacacaacctcgactgcgtgttaagagagggtgccacgctattccct1681 gtggttattacgacagtggaagacgccatgacacccaaagcattgaacagcaaaatgtttgctgtcattgaaggcgtgcg1761 agaagacctccaacctccttctcaaagaggatccttcatacgaactctctctggacacagagtctatggatatgctccag1841 gtggggtacttccactggagactgggagagactacaccgttgtcccaatagatgatgtctgggacgacagcattatgctg1921 tccaaagatcccatacctcccattgtgggaaacagtggaaatctagccatagcttacatggatgtgtttcgacccaaagt2001 cccaatccatgtggctatgacgggagccctcaatgcttgtggcgagattgagaaagtaagctttagaagcaccaagctcg2081 ccactgcacaccgacttggccttaagttggctggtcccggagcattcgatgtaaacaccgggcccaactgggcaacgttc2161 atcaaacgtttccctcacaatccacgcgactgggacaggctcccctacctcaacctaccataccttccacccaatgcagg2241 gcgccagtaccaccttgccatggctgcatcagagttcaaagagacccccgaactcgagagtgccgtcagagcaatggaag2321 cagcagccaacgtggacccactattccaatctgcactcagtgtgttcatgtggctggaagggaatgggattgtgactgac2401 atggccaacttcgcactcagcgacccgaacgcccatcgggtgcgaaattttcttgcaaacgcaccacaagcaggcagcaa2481 gtcgcaaagggccaagtacgggacagcaggctacggagtggaggctcggggccccacaccagaggaagcacagagggaaa2561 aagacacacggatctcaaagaagatggagaccatgggcatctactttgcaacaccagaatgggtagcactcaatgggcac2641 cgagggccaagccccggccagctaaagtactggcagaacacacgagaaataccggacccaaacgaggactatctagacta2721 cgtgcatgcagagaagagccggttggcatcagaagaacaaatccaaagggcagctacgtcgatctacggggctccaggac2801 aggcagagccaccccaagctttcatagacgaagttgccaaagtctatgaaatcgaccatggacgtggcccaaaccaagaa2881 cagatgaaagatctgctcttgactgcgatggagatgaagcatcgcaatcccaggcgggctctaccaaagcccaagccaaa2961 acccaatgctccaacacagagaccccctggtcggctgggccgctggatcagaaccgtctctgatgaggaccttgagtga
长度为3039个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链。
2.真核表达质粒，其特征在于它为以pCI作为真核表达载体，含有权利要求1所述的多聚蛋白基因(VP2/VP4/VP3)的编码序列的重组载体(pCI-VP2/VP4/VP3)，其保存号为CGMCC0720。
3.一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)的DNA疫苗，其特征在于它包括权利要求2中所述的真核表达质粒(pCI-VP2/VP4/VP3)和免疫佐剂，pCI-VP2/VP4/VP3∶免疫佐剂＝1∶1-5(质量比)。
4.如权利要求3所述的一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗，其特征在于所述的免疫佐剂是指免疫刺激复合物(ISCOM)
5.如权利要求3所述的一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗，其特征在于所述的免疫佐剂是指脂质体。
6.如权利要求3所述的一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗，其特征在于所述的免疫佐剂是指细胞因子。
7.如权利要求3所述的一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗，其特征在于所述的免疫佐剂是指弗氏不完全佐剂。
8、如权利要求3所述的一种传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗，其特征在于所述的免疫佐剂是指蜂胶。
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