CN1442188A - 猫人参注射液及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是用猫人参提取液作为君药制备的注射液及其用作抗癌药物的用途。其制备方法为：(1)采用水提取法或醇提取法制备猫人参提取液；(2)用醇沉淀法纯化水提取液或用水沉淀法纯化乙醇提取液；(3)用注射用水配制成注射液，灌封、灭菌即可。本发明制备工艺简单，成本低廉，抗癌效果确切，副作用小。

Description

猫人参注射液及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及医药技术领域，是用猫人参提取物为君药制备的注射液及其抗癌用途。

背景技术：

猫人参又名猫气藤、痈草、沙梨藤，是猕猴桃科植物镊合猕猴桃的根，民间常用草药，具有清热解毒、消肿散疖的功效。通常与其它中草药配伍煎煮制成汤剂口服，治疗痈疖、及消化系统肿瘤。至今未见用猫人参提取物制成注射液并用其作为抗癌药物的报道。

发明内容：

本发明以猫人参为原料，提取有效成分制备成注射液，用作抗癌药物。

本发明的制备方法可有两种，一是用水煎煮提取，再用乙醇沉淀纯化，简称水提醇沉法；二是用乙醇浸渍提取，再用水沉淀纯化，简称醇提水沉法。

方法一、水提醇沉法制备猫人参注射液，包括如下步骤：

1、制备猫人参提取液

将中草药猫人参按常规用水煎煮60-180分钟，煎煮三次，合并滤液后浓缩，得猫人参提取液。

2、纯化猫人参提取液

在猫人参提取液中加乙醇使含醇量为45-85％，置0-12℃冰库(下同)冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，再加乙醇使含醇量为55-90％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，再加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。

3、制备猫人参注射液

将上述纯化的猫人参提取液按所需浓度加入注射用水，用10％氢氧化钠调pH4-10，冷藏12-48小时，滤去沉淀，加活性炭适量，搅拌，加热，放置30分钟，滤去沉淀、分装灌封，灭菌，即为猫人参注射液。

方法二、醇提水沉法制备猫人参注射液，包括如下步骤：

1、制备猫人参提取液

猫人参用45-95％乙醇适量浸渍72小时，滤过，滤液备用。药渣用适量乙醇，置水浴上回流提取两次，每次1-3小时，滤过药渣用60-95％乙醇分次洗涤，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏静置数小时，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味。

2、纯化猫人参提取液

在上述提取液中加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，加适量注射用水，用10％氢氧化钠溶液调pH6-8，冷藏24小时以上，滤过得纯化的猫人参提取液。

3、制备猫人参注射液

将上述纯化的猫人参提取液按所需浓度加注射用水，用10％氢氧化钠溶液调pH4-10，加活性炭适量，搅拌，加热，放置30分钟，滤去沉淀，分装灌封，灭菌，即为猫人参注射液。

经体外细胞实验和动物试验，本发明猫人参注射液具有良好的抗肿瘤作用，而对细胞免疫无明显抑制作用。

本发明猫人参注射液制备工艺简单，成本低廉，抗癌效果确切，副作用小，可用作抗癌药物。

具体实施方式：

实施例1：制备猫人参注射液(5g/ml生药，表示每毫升注射液含5克生药的提取液，下同)

1、制备猫人参提取液

取猫人参5000g用水浸泡，充分润湿后，加水过药面，煎煮三次，每次煮沸90分钟，滤去沉淀、合并三次滤液并浓缩，得提取液约5000ml。

2、纯化猫人参提取液

在上述提取液中加95％乙醇使含醇量达65％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为80％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为90％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。

3、制备猫人参注射液

上述纯化的猫人参提取液中加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调pH为6.8，冷藏48小时，滤去沉淀，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，分装灌封(10ml/支，下同)，流通蒸汽灭菌，即为猫人参注射液。

实施例2、制备猫人参注射液(5g/ml生药)

1、制备猫人参提取液

猫人参5000g用水浸泡，充分润湿后，加水过药面，煎煮三次，每次煮沸60分钟，滤去沉淀、合并三次滤液并浓缩，得提取液约5000ml。

2、纯化猫人参提取液

在上述提取液中加95％乙醇使含醇量达60％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为75％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味(约剩2500ml)，再加95％乙醇使含醇量为85％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。

3、制备猫人参注射液

上述纯化的猫人参提取液中加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠调pH为7.0，冷藏48小时，滤去沉淀，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，灌封，流通蒸汽灭菌。

实施例3、制备猫人参注射液(5g/ml生药)

1、制备猫人参提取液

猫人参5000g用95％乙醇浸泡，充分润湿后加95％乙醇过药面浸渍72小时，滤过，滤液备用。药渣用95％乙醇过药面，置水浴上回流提取两次，每次2小时，滤过药渣用95％乙醇1000ml分次洗涤，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏，静置12小时，滤去沉淀，滤液减压回收乙醇至无醇味。

2、纯化猫人参提取液

在上述提取液中加注射用水至约1000ml，加热煮沸30分钟，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.3，冷藏48小时以上，滤过得纯化的猫人参提取液。

3、制备猫人参注射液

将以上猫人参提取液加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.1，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，灌封，流通蒸汽灭菌。

实施例4、制备猫人参注射液(5g/ml生药)

1、制备猫人参提取液

猫人参5000g加65％乙醇过药面浸渍72小时，滤过，滤液备用。药渣用65％乙醇过药面，置水浴上回流提取两次，每次2小时，滤过药渣用65％乙醇1000ml分次洗涤，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味。

2、纯化猫人参提取液

在上述提取液中再加乙醇使含醇量为85％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，加水至1000ml，加热煮沸30分钟，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.5，冷藏48小时，滤过得纯化的猫人参提取液。

3、制备猫人参注射液

将以上猫人参提取液加入注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调pH为7.6，加活性炭5g搅匀，加热至75℃，保温放置30分钟，滤去沉淀，灌封(10ml/支)，流通蒸汽灭菌，即为猫人参注射液。

猫人参注射液抗肝癌作用动物实验

一、猫人参注射液对小鼠肝癌体内抑瘤实验

1、猫人参注射液对小鼠实体型肝癌H₂₂和HepS的作用

1.1小鼠移植性肝癌造模

用小鼠肝癌细胞株H₂₂和HepS分别进行小鼠肝癌移植瘤造模，是常规的成熟技术。选取已腹腔接种小鼠肝癌细胞后8日健康状况较好的小鼠，颈椎脱臼处死，抽取腹腔积液(乳白色腹水)，细胞分类计数，根据活细胞计数，用生理盐水稀释成含细胞数为2×10⁷/ml备用，每只小鼠于右腋皮下接种0.2ml细胞。凡腋下接种了H₂₂或HepS细胞的小鼠致病率达100％。

1.2抑瘤实验

抑瘤实验按常规进行，分别将上述接种H₂₂和HepS细胞的小鼠于接种后次日随机分为五组，每组10只，尾静脉注射给药，每次给药体积为0.2ml/10g，(10克体重注射0.2ml)。

(1)阴性对照组：尾静脉注射等容积生理盐水注射液，每天两次，间隔7小时，连续10天；

(2)阳性对照组：尾静脉注射环磷酰胺(CTX)，剂量为30mg/kg/次，隔日一次，共注射3次；

(3)猫人参注射液高剂量组，简称高剂量组：每天剂量为每公斤体重200g生药提取液(用200g/kg表示，下同)，尾静脉注射猫人参注射液100g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天；

(4)猫人参注射液中剂量组，简称中剂量组：每天剂量为100g/kg，尾静脉注射猫人参注射液50g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天；

(5)猫人参注射液小剂量组，简称小剂量组：每天剂量为50g/kg，尾静脉注射猫人参注射液25g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天。

末次给药后次日处死动物，解剖并完整分离肿瘤，称瘤重量，计算肿瘤抑制率(IR)。剥取小鼠胸腺、脾脏并称重，计算脾脏和胸腺指数。以上实验重复三次。

2、对小鼠腹水型肝癌H₂₂的生存期的影响

2.1腹水型肝癌H₂₂造模

选取已腹腔接种小鼠H₂₂肝癌细胞后8日健康状况较好的小鼠，颈椎脱臼处死，抽取腹腔积液(乳白色腹水)，生理盐水洗涤，稀释成含细胞数为2×10⁷/ml备用，每只小鼠于腹腔内注射0.2ml。凡腹腔接种了H₂₂细胞的小鼠均会得腹水型肝癌。

2.2抑瘤试验：

接种后次日将小鼠随机分为五组：分组与给药方法同实体型肝癌模型实验，逐日观察并记录小鼠的死亡情况，观察小鼠生存期，计算生命延长率(％)。以上实验重复三次。

3、疗效评价

实体瘤疗效以肿瘤生长抑制率(抑瘤率)表示，按下列公式计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率(IR)＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

免疫器官指数：脾脏(胸腺)指数＝脾脏(胸腺)重(g)/体重(g)；

腹水型疗效评价以生命延长率表示，按下列公式计算生命延长率。

生命延长率＝(实验组平均存活天数/对照组平均存活天数-1)×100％

4、结果(各项指标取三次重复实验的平均值)：(1)猫人参注射液对小鼠实体型肝癌的抑制作用(见表1)

表1：猫人参注射液对小鼠实体型肝癌的抑制作用(n＝30， x±s)肿瘤类型         组别           平均瘤重(g)         平均抑瘤率(％)

         1、阴性对照组       2.37±0.97               0

         2、阳性对照组       0.79±0.88               64.73HepS         3、高剂量组         0.92±0.51               57.69

         4、中剂量组         1.63±0.10               44.24

         5、小剂量组         1.96±0.04               33.11

         1、阴性对照组       2.01±0.85               0

         2、阳性对照组       0.79±0.36               54.86H₂₂         3、高剂量组         0.80±.24                57.62

         4、中剂量组         1.3±0.48                41.42

         5、小剂量组         1.47±0.33               34.15

由表1看出，不同剂量的猫人参注射液对小鼠肝癌HepS、H₂₂均有一定的抑制作用，抑瘤率达30％以上，且有较明显的剂量依赖性，随着剂量的增加，作用增强，猫人参注射高剂量组抑瘤率达到50％以上，与阳性对照组比较接近。

2.猫人参注射液对腹水型肝癌H₂₂小鼠生存期的影响(见表2)

表2：猫人参注射液对腹水型肝癌H₂₂小鼠生存期的影响(n＝30， x±s)肿瘤       分组             平均生存期(天)          平均生命延长率(％)H₂₂   1、阴性对照组         11.2±0.35

   2、阳性对照组         13.50±1.61                 20.53

   3、高剂量组           13.43±0.67                 19.90

   4、中剂量组           12.8±0.28                  13.40

   5、小剂量组           11.55±0.64                 2.18

表2表明，猫人参注射液高剂量治疗组腹水型肝癌H₂₂小鼠的生存期明显提高，生命延长率为19.90％，与阳性对照组比较接近，提示高剂量的猫人参注射液可延长腹水型肝癌H₂₂小鼠的生存期。

(3)猫人参注射液对小鼠免疫器官的影响(见表3)。

表3：猫人参注射液对小鼠脾和胸腺指数(n＝30， x±s)肿瘤类型     组别           脾指数(g/100g)            胸腺指数(g/100g)

       1、阴性对照组    0.838±0.325              0.274±0.087

       2、阳性对照组    0.587±0.706              0.222±0.267H₂₂      3、高剂量组      0.961±0.114              0.294±0.107

       4、中剂量组      0.984±0.192              0.339±0.070

       5、小剂量组      1.079±0.302              0.319±0.266

       1、阴性对照组    0.702±0.193              0.317±0.104

       2、阳性对照组    0.751±0.147              0.277±0.113HepS       3、高剂量组      0.613±0.240              0.264±0.086

       4、中剂量组      0.709±0.242              0.275±0.059

       5、小剂量组      0.713±0.326              0.280±0.176

由表3显示：猫人参注射液对荷瘤小鼠脾脏或胸腺指数均无明显的增强作用，接近于阴性对照组。阳性对照组脾脏或胸腺指数均下降，但无显著性。

二.高剂量猫人参注射液对小鼠免疫功能的影响

1、脾淋巴细胞的制备：

将荷瘤小鼠30只，按常规抑瘤实验进行，实体型肝癌H₂₂造模同前。接种后次日将H₂₂实体型肝癌小鼠随机分为三组，每组10只，次日起给药，给药体积为0.2ml/10g。

阴性对照组：尾静脉注射等容积生理盐水注射液，每天两次，间隔7小时，连续10天；

阳性对照组：尾静脉注射环磷酰胺(CTX)30mg/kg/次，隔日一次，共3次；

猫人参注射液高剂量组(200g生药/kg/天)：尾静脉注射猫人参注射液100g/kg/次，每天两次，间隔7小时，连续10天；

停药后次日，颈椎脱臼处死，在无菌条件下取脾。尼龙网捻碎，加Hanks液2ml冲洗细胞，用淋巴细胞分离液分离出脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。

2、小鼠脾T淋巴细胞转化功能测定：(采用ConA诱导³H-TdR掺入法检测cpm值)

常规用10％NBS-RPMI-1640培养液制备4×10⁶/ml脾淋巴细胞悬液，每组随机取4个脾细胞标本，每个标本设三个复孔，小鼠脾淋巴细胞悬液接种96孔板，每孔加入100μl小鼠脾淋巴细胞悬液(细胞的终浓度为5×10⁵/孔)，加入55μg/mlConA20μl/孔(终浓度为5 mg/L)，设空白对照(不加ConA)，置37℃，5％CO₂培养箱内培养48小时后加³H-TdR0.5uCi/孔，继续培养6小时，收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，烤干，加入液闪液，液闪烁仪检测cpm，计算刺激指数(Stimulation Index，SI)。刺激指数(SI)＝ConA刺激管cpm均值/对照管cpm均值。

3、小鼠T细胞亚群检测：流式细胞术分析

每组随机取4个脾细胞标本，取小鼠脾淋巴细胞悬液约1×10⁶/ml，分别加入荧光标记的CD3⁺，CD4⁺，CD8⁺单抗各100μl。用流式细胞仪检测：在荧光直方图上分别计算出CD3⁺，CD4⁺，CD8⁺的阳性峰的百分率

4、自然杀伤细胞(NK)活性的检测

用同位素³H-TdR标记YAC-1(人白血病细胞)靶细胞，配成2×10⁵/ml细胞悬液，每组随机取4个脾细胞标本，取小鼠脾淋巴细胞悬液约1×10⁶/ml。脾淋巴细胞与靶细胞之比为50∶1。两种细胞悬液分别取100μl加到96孔板中，同时设对照孔(只加YAC-1靶细胞)，在37℃，5％CO₂培养箱内培养24小时，收集细胞，加入液闪液，液闪烁仪检测cpm。NK活性用特异性抑制率Pi表示。Pi(％)＝(1-实验组cpm值/靶细胞自然掺入cpm)×100％

5、结果各免疫指标如下：(1)猫人参注射液对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响(见表4)

表4：猫人参注射液对小鼠淋巴细胞转化功能的影响(n＝4， x±s)

       组别                          刺激指数(SI)

    阴性对照组                       0.98±0.59

    阳性对照组                       0.76±0.45

    高剂量组                         1.21±0.92由表4看出，高剂量猫人参注射液有轻度促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化作用，但与生理盐水组无明显的差异，而CTX阳性对照组有抑制作用。

(2)猫人参注射液对荷瘤小鼠T细胞亚群的影响(见表5)

表5：猫人参注射液对T细胞亚群的影响(n＝4， x±s)

      分组          CD₄ ⁺        CD₈ ⁺        CD₃ ⁺        CD₄ ⁺/CD₈ ⁺

    阴性对照组

                  21.75±0.92     3.62±1.51    25.37±2.41   6.82±2.60

    阳性对照组

                  17.36±3.41     4.96±1.57    22.31±3.78   3.76±1.27

    高剂量组

                  19.65±3.75     3.58±0.25    22.75±3.74   6.48±1.37

由表5中看出，阳性对照组与高剂量组的小鼠的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺细胞、CD4⁺/CD8⁺的比值与阴性对照组相比略有下降，但未达到显著的水平，其中阳性对照组的CD4⁺/CD8⁺的比值明显的下降，而高剂量组下降不明显，接近于阴性对照组，与阳性对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，说明猫人参注射液对免疫细胞无抑制作用，而CTX则有明显的抑制作用。

(3)猫人参注射液对荷瘤小鼠NK活性的影响(见表6)表6：猫人参注射液对荷瘤小鼠NK活性的影响(n＝4， x±s)

   组别            cpm              特异性抑制率Pi(％)

 阴性对照组    627.20±47.21            20.67

 阳性对照组    775.90±303.65           1.87

 高剂量组      698.46±99.53            11.66

 YAC-1         790.66±99.52

由表6看出，猫人参注射液对荷瘤小鼠NK细胞活性无明显的抑制作用，而阳性对照组小鼠脾NK细胞活性明显地低于阴性对照组。

以上实验结果表明，猫人参注射液具有良好抗肿瘤作用。小、中、高三个剂量组对小鼠肝癌的抑瘤率均达到30％以上，特别是高剂量组达到50％以上，接近阳性对照组CTX。本发明注射液对荷瘤小鼠ConA诱导的脾细胞增殖反应有一定的作用，对T细胞亚群及NK细胞活性均无明显作用。说明猫人参注射液对机体的细胞免疫无明显的抑制作用。因而本发明注射液可用作抗癌药物。

Claims (8)

1、一种猫人参注射液的制备方法，操作步骤包括提取、纯化、分装灭菌，其特征在于具体方法为：(1)采用水提取法或醇提取法制备猫人参提取液；(2)用醇沉淀法纯化水提取液或用水沉淀法纯化乙醇提取液；(3)用注射用水配制成注射液。

2、按权利要求1所述的猫人参注射液的制备方法，其特征在于所说的水提取法制备猫人参提取液是指，将猫人参用水分次煎煮60-180分钟，合并煎煮的滤液浓缩即可；所说的醇沉淀法纯化水提取液是指，将上述猫人参提取液作如下处理：加乙醇使含醇量为45-85％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味；加乙醇使含醇量为55-90％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味；再加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置12-24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，得纯化的猫人参提取液。

3、按权利要求1所述的猫人参注射液的制备方法，其特征在于所说的醇提取法制备猫人参提取液是指，猫人参用45-95％乙醇浸渍72小时，滤液备用，药渣用适量乙醇置水浴上回流提取两次，每次1-3小时，再用60-95％乙醇分次洗涤药渣，合并上述滤液、回流液和洗涤液，冷藏放置12-48小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；所说的水沉淀法纯化乙醇提取液是指：在上述提取液中加乙醇使含醇量为75-95％，冷藏放置24小时，滤去沉淀，减压回收乙醇至无醇味，加适量注射用水，调PH至6-8，冷藏24小时以上，滤过得纯化的猫人参提取液。

4、按权利要求1、2、3所述的猫人参注射液制备方法，其特征在于用注射用水配制成注射液时，用10％NaOH调PH4-10，加活性炭适量，加热、放置30分钟，滤去沉淀，再分装灌封灭菌。

5、权利要求1、2、3所述猫人参注射液制备方法所制得的猫人参注射液。

6、权利要求4所述猫人参注射液制备方法所制得的猫人参注射液。

7、权利要求5所述猫人参注射液用作抗癌药物的用途。

8、权利要求6所述猫人参注射液用作抗癌药物的用途。