CN1441841B - 对内耳的细胞再生和分化的刺激 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于刺激内耳细胞(包括内耳感觉毛细胞和内耳支持细胞)形成的方法。本发明的方法破坏和/或杀死内耳细胞，并刺激新内耳细胞的形成。

Description

对内耳的细胞再生和分化的刺激

发明领域

本发明涉及用于刺激内耳细胞(包括内耳感觉毛细胞和内耳支持细胞)形成的方法和组合物。

发明背景

感觉神经性听力丧失(SNHL)，也称为“神经性耳聋”，是严重的通讯问题，仅在美国就影响数以千万计的人。检测声音的内耳感觉毛细胞的丧失被认为是导致这种缺陷的主要原因。内耳解剖学对于本领域普通技术人员而言是众所周知的(参阅例如《Gray’s Anatomy》，美国修订版，1977年，第859-867页，收入本文作为参考)。简而言之，内耳包括三个感觉部分：耳蜗，感觉声音；半规管，感觉角加速度；和耳石器，感觉线加速度。在每一个感觉部分中，特化的感觉毛细胞排列在一层或多层内耳支持细胞之上。在内耳中，支持细胞位于感觉毛细胞的下面，至少部分包围感觉毛细胞，并在物理上支持感觉毛细胞。在运作时，感觉毛细胞应答声音或运动而发生物理偏转，这种偏转被传送至神经，后者向大脑发出神经冲动，以进行加工和解释。

在哺乳动物中，内耳通常不能再生受损或死亡的内耳感觉毛细胞。因此，源于感觉毛细胞死亡或恶化的听觉障碍通常导致永久性听力损伤。感觉神经性听力丧失可能是由多种事件引起的，包括年龄相关性丧失(老年性耳聋)、噪声接触、药物接触(如抗生素和抗癌治疗)、感染、遗传突变(综合症或非综合症)和自身免疫疾病。

目前，获得性感觉神经性听力丧失的治疗包括使用外用助听器和耳蜗移植。这两种策略都只具有相当有限的治疗潜力，更重要的是，它们未能解决恢复听觉上皮的结构或功能的问题。

关于内耳感觉毛细胞再生的更新方法公开于已发表的国际申请系列号PCT/US99/24829，其中公开了用于刺激内耳细胞(包括感觉毛细胞)再生的方法，包括向内耳细胞中导入编码能够刺激内耳细胞再生的转录因子的核酸分子。

本发明人发现，破坏现有的内耳感觉毛细胞能够促进通常静止的内耳支持细胞(在其中一种或多种细胞周期抑制蛋白的表达水平降低，或者细胞周期蛋白质的活性降低)重新进入细胞周期而产生经诱导能够形成内耳感觉毛细胞的后代细胞，正如本文所公开的。在有些情况中，破坏现有的内耳感觉毛细胞足以刺激下面和/或周围的内耳支持细胞发展成为感觉毛细胞。在其它情况中，由支持细胞有效再生感觉毛细胞需要将破坏现有的内耳感觉毛细胞联合至少一种其它刺激，正如本文所公开的。另外，本发明人还发现，刺激内耳支持细胞增殖(同时刺激或不刺激内耳感觉毛细胞再生)能够改进内耳的听觉功能。

发明概述

本发明提供了用于刺激内耳细胞(包括内耳感觉毛细胞和内耳支持细胞)形成的方法。本发明方法基于以下意外发现：破坏和/或杀死内耳细胞能够刺激新的内耳细胞的形成。

一方面，本发明提供了用于刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的方法。本发明这个方面的方法包括步骤(a)在促进由与下述受损的感觉毛细胞接触的一个或多个支持细胞形成一个或多个新的感觉毛细胞的条件下，破坏一个或多个内耳感觉毛细胞。优选的是，由多个内耳支持细胞形成多个内耳感觉毛细胞。本发明这个方面的方法任选包括步骤(b)进一步刺激由与受损的内耳感觉毛细胞接触的内耳支持细胞形成一个或多个内耳感觉毛细胞。步骤(b)可以发生在步骤(a)之前、之中、之后或两步骤交叠。在一个实施方案中，刺激与受损的内耳感觉毛细胞接触的一个或多个内耳支持细胞形成一个或多个新的内耳感觉毛细胞的步骤包括刺激内耳支持细胞进入细胞周期、然后刺激至少一些内耳支持细胞后代分化而形成内耳感觉毛细胞的步骤。

可以通过例如接触有效破坏内耳感觉毛细胞的数量的耳毒性试剂来破坏内耳感觉毛细胞，诸如抗生素，优选氨基糖苷类抗生素。可以通过任何本领域公认的手段将耳毒性试剂导入内耳，例如通过注射(诸如使用针头和注射器)，或者通过插管。在本发明这个方面的一个实施方案中，内耳感觉毛细胞受到的损伤足以引起它们的死亡。

在本发明的有些实施方案中，施加于内耳感觉毛细胞的损伤能够刺激与受损的内耳感觉毛细胞接触的内耳支持细胞形成一个或多个新的内耳感觉毛细胞。然而，在其它实施方案中，施加于内耳感觉毛细胞的损伤自身不足以有效刺激与受损的内耳感觉毛细胞接触的内耳支持细胞形成一个或多个新的内耳感觉毛细胞。因此，在本发明这个方面的方法的一个实施方案中，通过破坏内耳感觉毛细胞并(在破坏感觉毛细胞的步骤之前、之中和/或之后)在内耳支持细胞内表达能够刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的转录因子来刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞。例如，在本发明的一个实施方案中，在能够表达下述转录因子的条件下向内耳支持细胞中导入编码能够刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的转录因子的核酸分子。能够刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的转录因子的代表性范例包括POU4F1、POU4F2、POU4F3、Brn3a、Brn3b和Brn3c。

在本发明这个方面的方法的另一个实施方案中，通过破坏内耳感觉毛细胞，并在破坏感觉毛细胞的步骤之前、之中和/或之后抑制一种或多种在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂的表达，来刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞。细胞周期抑制剂的抑制剂可以是在细胞内直接或间接作用于细胞周期抑制剂的物质，如蛋白质。作为代表性范例，在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂包括周期蛋白依赖性激酶抑制剂，诸如所谓的CIP/KIP家族的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，包括p21^Cip1、p27^Kip1和p57^Kip2。例如，可以通过向内耳支持细胞中导入表达特定核酸分子的表达载体来抑制在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂的表达，所述特定核酸分子能够在严谨条件下(诸如高于2X SSC、55℃的严谨度)与编码在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂的核酸分子(诸如mRNA分子)发生杂交。

另外，各种重组生长因子诸如TGF-α、胰岛素和IGF-1也可用于刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞。在本发明的实践中，体外使用重组生长因子的代表性有效浓度范围是1-1000ng/ml。更具体的说，优选以1-100ng/ml的有效浓度使用TGF-α，优选以100-1000ng/ml的有效浓度使用胰岛素，而优选以10-1000ng/ml的有效浓度使用IGF-1。对于体内应用，将施用有效量的重组生长因子，从而在体内产生上述浓度。

在本发明这个方面的优选实施方案中，由内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞导致接受治疗的内耳获得听觉功能的改进。因此，一方面，本发明提供了用于改进内耳听觉功能的方法，包括：(a)在促进与下述受损的第一个感觉毛细胞接触的支持细胞形成一个或多个新的内耳感觉毛细胞的条件下，破坏第一个内耳感觉毛细胞；(b)对依照步骤(a)治疗的内耳测量听觉功能的改进。

另一方面，本发明提供了用于刺激内耳支持细胞形成的方法。本发明这个方面的方法包括在促进新的内耳支持细胞形成(例如通过与受损的内耳支持细胞接触的内耳支持细胞的细胞分裂)的条件下破坏内耳支持细胞的步骤。在本发明的这个方面中，使用本文关于刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的本发明方法而描述的相同技术来破坏内耳支持细胞并刺激新的内耳支持细胞的形成。因此，可以通过例如接触有效破坏内耳支持细胞的数量的耳毒性试剂来破坏内耳支持细胞，诸如氨基糖苷类抗生素。同样，作为范例，可以通过破坏内耳支持细胞，并在破坏内耳支持细胞之前、之中和/或之后在内耳支持细胞内表达能够刺激内耳支持细胞分裂，形成新的内耳支持细胞的转录因子(诸如POU4F1、POU4F2、POU4F3、Brn3a、Brn3b和Brn3c)，来进一步刺激新的内耳支持细胞的形成。在本发明这个方面的优选实施方案中，内耳支持细胞的增殖导致接受治疗的内耳获得听觉功能的改进。

本发明的方法可用于刺激内耳细胞(诸如感觉毛细胞和支持细胞)的形成。此外，本发明的方法可用于在哺乳动物诸如人中改善由内耳细胞死亡或受损引起的听觉障碍的症状。另外，本发明的方法可用于鉴定能够刺激由内耳支持细胞形成内耳支持细胞和/或内耳感觉毛细胞的基因和/或蛋白质。

附图简述

通过参照下文详述并联系附图，将能够更容易的领会及更好的理解本发明的上述方面和许多伴随优势。

图1显示了科尔蒂器的横截面。

图2显示了血清剥夺24小时并在该24小时的最后4小时BrdU脉冲后的BrdU标记的豚鼠JH4细胞的数目。在荧光显微镜下进行细胞计数。脂质与p27^Kip1AS的联合将生长停止逆转至在10％FBS刺激中看到的40％(p<.0001)。(+)FBS；(-)无FBS；(AS)反义寡核苷酸；(脂质)脂转染。

图3显示了用硫酸阿米卡星治疗小鼠内耳两周后小鼠右耳的ABR阈值。缩写：ABR，听性脑干反应；dB，分贝；SPL，声压级；Wt，野生型；Het，p27杂合子；Ko，p27敲除；kHz，千赫。

图4显示了用硫酸阿米卡星治疗小鼠内耳两周后小鼠左耳的ABR阈值。缩写与图3描述中所列相同。

图5显示了用硫酸阿米卡星治疗小鼠内耳四周后小鼠右耳的ABR阈值。缩写与图3描述中所列相同。

图6显示了用硫酸阿米卡星治疗小鼠内耳四周后小鼠左耳的ABR阈值。缩写与图3描述中所列相同。

优选实施方案详述

在用于本文时，缩写“SSC”指用于核酸杂交液的缓冲液。一升20X(20倍浓度)SSC缓冲液储液(pH7.0)含有175.3克氯化钠和88.2克柠檬酸钠。

在用于本文时，短语“破坏一个或多个内耳感觉毛细胞”或“破坏第一个内耳感觉毛细胞”或其文法等同语指与在基本相同条件下培养但未受损的内耳感觉毛细胞相比，在受损的感觉毛细胞中引起结构、生化和/或生理学的有害变化(包括杀死受损细胞)。

在用于本文时，短语“改进听觉功能”或“听觉功能的改进”或其文法等同语指通过依照本发明方法治疗内耳，将内耳对声音的敏感性改进至少10％，或者在内耳对声音的敏感性中实现任何可测量的改进，而在依照本发明的治疗之前，内耳对声音完全没有应答。通过任何本领域公认的手段(诸如听性脑干反应)来测量治疗后内耳对声音的敏感性，并与未依照本发明治疗且在与治疗的内耳基本相同条件下培养的对照内耳对声音的敏感性进行比较。

在用于本文的核酸序列比较或氨基酸序列比较时，术语“序列同源性”(也称为“序列同一性”)定义为在比对序列并导入缺口(如果需要的话)以实现最大同源性(同一性)百分比后，受试氨基酸序列或核酸序列中与部分或所有候选氨基酸序列或核酸序列相同的氨基酸残基或核酸残基所占的百分比，此时不考虑将任何保守替代作为序列同源性的一部分。不应当将N或C端延伸和插入看作是降低同源性。为了获得最大同源性(同一性)百分比，对导入的缺口(如果需要的话)的数目或长度不赋予权重。

一方面，本发明提供了用于刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的方法。本发明这个方面的方法包括步骤(a)在促进与下述受损的感觉毛细胞接触的一个或多个支持细胞形成一个或多个新的感觉毛细胞的条件下，破坏一个或多个内耳感觉毛细胞。优选的是，由多个内耳支持细胞形成多个内耳感觉毛细胞。本发明这个方面的方法任选包括步骤(b)进一步刺激与受损的内耳感觉毛细胞接触的内耳支持细胞形成一个或多个内耳感觉毛细胞。步骤(b)可以发生在步骤(a)之前、之中、之后或两步骤交叠。本发明这个方面的方法可用于体内和体外。

内耳解剖学对于本领域普通技术人员而言是众所周知的(参阅例如《Gray’s Anatomy》，美国修订版，1977年，第859-867页，收入本文作为参考)。具体而言，耳蜗包括主要负责感觉声音的科尔蒂器。如图1所示，科尔蒂器10包括基底膜12，上面是多种支持细胞14，包括边缘细胞16、内柱细胞18、外柱细胞20、内指细胞22、Dieter氏细胞24和Hensen氏细胞26。支持细胞14支持内毛细胞28和外毛细胞30。覆膜32位于内毛细胞28和外毛细胞30的上面。一方面，本发明适用于刺激由下面的支持细胞14再生感觉毛细胞28和30。另一方面，本发明适用于刺激支持细胞14的形成。

本发明人发现，破坏现有的内耳感觉毛细胞能够促进通常静止的内耳支持细胞重新进入细胞周期而产生经诱导能够形成内耳感觉毛细胞的后代细胞，正如本文所公开的。在有些情况中，破坏现有的内耳感觉毛细胞足以刺激下面和/或周围的内耳支持细胞发展成为感觉毛细胞。在其它情况中，由支持细胞有效再生感觉毛细胞需要将破坏现有的内耳感觉毛细胞联合另一种刺激，正如本文所公开的。

在本发明一个方面的实践中，通过例如接触有效破坏内耳感觉毛细胞的数量的耳毒性试剂来破坏内耳感觉毛细胞。可用于破坏内耳感觉毛细胞的耳毒性试剂的代表性范例包括氨基糖苷类抗生素，诸如新霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、阿米卡星和妥布霉素。在本发明的实践中，上述氨基糖苷类抗生素通常以大约0.01mM-10mM的有效浓度在体外使用，而以大约100毫克/千克/天-大约1000毫克/千克/天的有效浓度在体内使用。另外，可用于破坏内耳感觉毛细胞的化学试剂的代表性范例包括下列抗癌剂：顺铂、卡铂和氨甲蝶呤，通常以大约0.01mM-大约0.1mM的有效浓度在体外使用，而以大约5毫克/千克/天-大约10毫克/千克/天的有效浓度在体内使用。其它有用的化学试剂包括聚L-赖氨酸，体外有效浓度大约0.1-1.0mM；和氯化镁，体外有效浓度大约5-100mM。

可以通过任何本领域公认的手段，例如通过注射(使用针头和注射器)或通过耳蜗造瘘术(cochleostomy)，将试剂或耳毒性试剂导入内耳。耳蜗造瘘术包括刺破耳蜗并插入导管，通过导管将化学试剂导入耳蜗。耳蜗造瘘术公开于例如Lalwani，A.K.等人，HearingResearch，114：139-147，1997，将此发表物收入本文作为参考。

在本发明方法的一个实施方案中，通过破坏内耳感觉毛细胞并(在破坏内耳感觉毛细胞之前、之中和/或之后)在至少一些内耳支持细胞内表达能够刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的转录因子，来刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞。例如，在一个实施方案中，在能够表达下述转录因子的条件下向内耳支持细胞中导入编码能够刺激内耳感觉毛细胞形成的转录因子的核酸分子。

可用于本发明这个方面的转录因子能够在用于本发明方法的实践时刺激内耳支持细胞再生内耳感觉毛细胞。可用于本发明这个方面的有些转录因子是内耳感觉毛细胞的正常发育和/或正常机能所需要的。

可用于本发明这个方面的转录因子的代表性范例包括POU4F1(Collum，R.G.等人，Nucleic Acids Research，20(18)：4919-4925，1992)、POU4F2(Xiang等人，Neuron，11：689-701，1993)、POU4F3(Vahava，O.，Science，279(5358)：1950-1954，1998)、Brn3a(也称为Brn3.0)、Brn3b(也称为Brn3.2)和Brn3c(也称为Brn3.1)，正如下列参考文献所公开的：Gerrero等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，90(22)：10841-10845，1993；Xiang，M.等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，93(21)：11950-11955，1996；Xiang，M.等人，J.Neurosci.，15(7部分1)：4762-4785，1995；Erkman，L.等人，Nature，381(6583)：603-606，1996；Xiang，M.等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，94(17)：9445-9450，1997；将这些发表物收入本文作为参考。可用于本发明这个方面的一些转录因子具有至少一个同源域和/或至少一个POU特异域，而且具有大约33kDa-大约37kDa的分子量。

在用于本文时，术语“同源域”指与SEQ ID NO：1所列同源域氨基酸序列至少50％同源(诸如至少75％同源，或至少90％同源)的氨基酸序列。

在用于本文时，术语“POU特异域”指与SEQ ID NO：2所列POU特异域氨基酸序列至少50％同源(诸如至少75％同源，或至少90％同源)的氨基酸序列。

可用于测定两种蛋白质序列之间或两种核酸序列之间的同源性百分比的算法的范例是Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268，1990)，并经过Karlin和Altschul的修正(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993)。将这种算法整合入Altschul等人(J.Mol.Biol.，215：403-410，1990)的NBLEST和XBLEST程序。

目前更优选的、可用于本发明实践的内耳细胞转录因子是POU4F3转录因子同系物(本文称为POU4F3同系物)。可用于本发明实践的POU4F3同系物能够刺激由支持细胞再生内耳感觉毛细胞，而且与具有SEQ ID NO：4所列氨基酸序列且由SEQ ID NO：3核酸分子编码的POU4F3转录因子至少25％同源(诸如至少50％同源或至少75％同源或至少90％同源)。在用于本文时，术语“POU4F3同系物”包括具有SEQ ID NO：4所列氨基酸的POU4F3蛋白质，这是目前最优选的、可用于本发明实践的内耳细胞转录因子。可用于本发明实践的其它POU4F3同系物的代表性范例列于Xiang，M.等人，J.Neuroscience，15(7)：4762-4785，1995，将此发表物收入本文作为参考。

可以使用本领域普通技术人员知道的多种克隆技术来分离编码可用于本发明实践的转录因子的其它核酸分子。例如，采用例如将放射性标记核酸探针与固定在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的核酸杂交的技术，可以将克隆的POU4F3同系物cDNA或基因或其片段作为杂交探针，正如《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》(第2版)第9.52-9.55页所述，J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis编，将引用页收入本文作为参考。目前优选的、用于鉴定编码POU4F3同系物的其它核酸分子的杂交探针是具有SEQ ID NO：3所列核酸序列的cDNA分子(或其互补序列)的长度为至少15个核苷酸的片段，尽管具有SEQ IDNO：3所列核酸序列的完整cDNA分子也可作为杂交探针用于鉴定编码POU4F3同系物的其它核酸分子。目前最优选的、用于鉴定编码POU4F3同系物的其它核酸分子的杂交探针是具有核酸序列5’-TAG AAG TGC AGGGCA CGC TGC TCA TGG TAT G-3’(SEQ ID NO：5)的寡核苷酸。

可用于鉴定(通过Southern印迹)编码POU4F3同系物的其它核酸分子的例示性高严谨度杂交和清洗条件是：于68℃在含1mM Na₂EDTA、20％十二烷基硫酸钠的0.25MNa₂HPO₄缓冲液(pH7.2)中进行杂交；于65℃在含1mM Na₂EDTA、1％(w/v)十二烷基硫酸钠的20mM Na₂HPO₄缓冲液(pH7.2)中进行清洗(3次，每次20分钟)。

可用于鉴定(通过Southern印迹)编码POU4F3同系物的其它核酸分子的例示性中严谨度杂交和清洗条件是：于45℃在含1mM Na₂EDTA、20％十二烷基硫酸钠的0.25M Na₂HPO₄缓冲液(pH7.2)中进行杂交；于55℃-65℃在含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的5X SSC中进行清洗。

同样，作为范例，可以通过聚合酶链式反应(PCR)来分离编码可用于本发明的转录因子的核酸分子，正如《The Polymerase ChainReaction》所述，K.B.Mullis、F.Ferre和R.A.Gibbs编，BirkhauserBoston，1994，收入本文作为参考。因此，例如，可以使用寡聚(dT)引物来引发第一条DNA链的合成，可以使用对应于与靶DNA分子同源的cDNA分子5’-非翻译区部分的寡核苷酸引物来引发第二条cDNA链的合成。可以使用第二条cDNA链合成引物和对应于与靶DNA分子同源的cDNA分子3’-非翻译区部分的引物来引发后续数轮PCR。

作为非限制性范例，用于扩增编码可用于本发明的转录因子的核酸分子的代表性PCR反应条件如下。在管中(在冰上)混合下列试剂以形成PCR反应混合液：DNA模板(如可多达1μg基因组DNA或可多达0.1μg cDNA)、0.1-0.3mM dNTPs、10μl 10X PCR缓冲液(10X PCR缓冲液含有500m MKCl、15mM MgCl₂、100mM Tris-HCl，pH8.3)、50pmol每种PCR引物(PCR引物的长度应当优选超过20bp且简并性达到10²-10³)、2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT)和去离子水至终体积50μl。将装有反应混合液的管置于热循环仪中，并如下运行热循环仪程序。于94℃变性2分钟，然后是30个循环：94℃ 30秒钟、47℃-55℃ 30秒钟、和72℃ 30秒钟-2.5分钟。

优选的是，针对在一些或所有已知靶蛋白序列中找到的保守氨基酸序列基序来设计PCR引物。可用于设计用于克隆其它POU4F3同系物的PCR引物的保守氨基酸序列基序的范例是具有SEQ ID NO：2所列氨基酸序列的POU特异域和具有SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的同源域。

此外，还可以通过例如使用识别转录因子蛋白质的抗体来分离编码可用于本发明实践的转录因子的其它核酸分子。用于制备单克隆和多克隆抗体的方法对于本领域普通技术人员而言是众所周知的，列于例如《Antibodies，A Laboratory Manual》第5和6章，E.Harlow和D.Lane，冷泉港实验室，1988，将引用章收入本文作为参考。作为非限制性范例，成功的制备了针对由Brn3 C末端构建的融合蛋白的抗体，正如Xiang，M.等人，J.Neuroscience，15(7)：4762-4785，1995和Xiang，M.等人，P.N.A.S.(U.S.A)，94：9445-9450，1997所述，将这些发表物收入本文作为参考。

可以通过例如筛选表达库来分离编码可用于本发明实践的转录因子的核酸分子。作为非限制性范例，可以使用抗POU4F3同系物抗体来筛选cDNA表达库，以鉴定一个或多个编码POU4F3同源蛋白的克隆。DNA表达库技术对于本领域普通技术人员而言是众所周知的。筛选cDNA表达库充分论述于《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》第12章，Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，1989，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，NY，将引用章收入本文作为参考。

作为代表性范例，可以如下方式制备抗原，用它制备的抗体可用于筛选表达库。可以将编码转录因子诸如POU4F3同系物的全长cDNA分子(或并非全长但包含所有编码区的cDNA分子)克隆到质粒载体中，诸如Bluescript质粒(购自Stratagene公司，La Jolla，California)。然后将重组载体导入大肠杆菌菌株(诸如大肠杆菌XL1-Blue，也购自Stratagene公司)，并在大肠杆菌中表达然后纯化由cDNA编码的蛋白质。例如，可以将携带包含目的cDNA分子的Bluescript载体的大肠杆菌XLl-Blue在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养过夜。可以将50μl过夜培养物用于接种5ml含氨苄青霉素的新鲜LB培养基，并将培养物于37℃剧烈摇动培养至A₆₀₀达到0.5，然后用1mM IPTG进行诱导。继续培养2小时后，将悬浮液离心(1000xg，15分钟，4℃)，除去培养基，并将沉淀的细胞重悬于1ml冷的缓冲液，该缓冲液优选含有1mM EDTA和一种或多种蛋白酶抑制剂。可以通过使用微探针的声处理来破碎细胞。通过离心使冷却后的声处理物澄清，并通过本领域公认的蛋白质纯化技术由上清液纯化表达的重组蛋白，诸如《Methods inEnzymology》第182卷《Guide to Protein Purification》所述，MurrayP.Deutscher编，1990，将此发表物收入本文作为参考。

用于制备单克隆和多克隆抗体的方法对于本领域普通技术人员而言是众所周知的，列于例如《Antibodies，A Laboratory Manual》第5和6章，E.Harlow和D.Lane，冷泉港实验室，1988，将引用章收入本文作为参考。在一个代表性范例中，可以在植入了塑料空心球(whiffle ball)的新西兰兔中制备对纯化蛋白特异的多克隆抗体。间歇的将1μg蛋白质直接注入塑料空心球肉芽肿。代表性注射方案是第1天、第14天和第35天进行注射，每次1μg蛋白质。第一次注射前一周(免疫前血清)和最后一次注射后40天(免疫后血清)吸取肉芽肿流体。

通过删除、替代、突变和/或插入产生的可用于本发明实践的转录因子的序列变体也可用于本发明的方法。可以通过突变编码野生型转录因子蛋白质的DNA序列来构建可用于本发明实践的转录因子的氨基酸序列变体，诸如使用通常称为定点诱变的技术。可以通过本领域普通技术人员众所周知的多种PCR技术来突变编码可用于本发明实践的转录因子的核酸分子(参阅例如下列发表物，将引用部分收入本文作为参考：《PCR Strategies》，M.A.Innis、D.H.Gelfand和J.J.Sninsky编，1995，Academic出版社，San Diego，CA，第14章；《PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications》M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White编，Academic出版社，纽约，1990)。

作为非限制性范例，Clontech公司的Transformer Site-DirectedMutagenesis kit(即转化剂定点诱变试剂盒)中采用的双引物系统可用于将定点突变导入编码可用于本发明实践的转录因子的核酸分子。将该系统的靶质粒变性后，将两种引物同时与质粒退火；这两种引物中的一种包含期望的定点突变，另一种包含质粒中另一位点的突变(能导致限制性位点的消除)。然后进行第二条链的合成，紧密联结这两种突变，并将产生的质粒转化到大肠杆菌mutS菌株中。由转化后的细菌分离质粒DNA，用相应的限制酶进行消化(由此将未突变的质粒线性化)，然后再次转化到大肠杆菌中。该系统能够直接在表达质粒中产生突变，而无需亚克隆或生成单链噬菌粒。两种突变的紧密联结和随后未突变质粒的线性化导致高突变效率并且允许最少的筛选。合成初始限制性位点引物后，对于每个突变位点，该方法只需要使用一种新引物。不是分开制备每种定位突变体，而是可以合成一组“设计的、简并的”寡核苷酸引物，从而在指定位点同时导入所有的期望突变。可以通过对贯穿诱变区的质粒DNA测序来筛选转化体，以鉴定并分选突变体克隆。然后可以将每一种突变体DNA完整测序，或者进行限制性消化并通过Mutation Detection Enhancement gel(即突变检测增强凝胶)(J.T.Baker)上的电泳进行分析，以确认序列中没有发生其它变化(通过与未诱变对照的条带移位比较)。

同样，作为非限制性范例，Stratagene公司(LaJolla，California)的QuickChange^TMSite-Directed Mutagenesiskit(即快速变化定点诱变试剂盒)中采用的双引物系统也可用于将定点突变导入编码可用于本发明实践的转录因子的核酸分子。将包含携有靶突变位点的插入片段的双链质粒DNA变性，并与在靶突变位点与质粒DNA的每一条链互补的两种寡核苷酸混合。使用pfu DNA聚合酶延伸退火后的寡核苷酸引物，由此产生包含交错切口的突变质粒。温度循环后，用切割甲基化或半甲基化DNA但不切割未甲基化DNA的限制酶Dpn I消化未突变的亲本DNA模板。亲本模板DNA几乎总是甲基化或半甲基化的，因为用于获得模板DNA的大多数大肠杆菌菌株包含需要的甲基化酶活性。将掺入期望突变的剩余的退火后载体DNA转化到大肠杆菌中。

在设计具体的定点诱变实验时，通常希望首先进行非保守性替代(如用Ala替代Cys、His或Glu)并测定这样做的结果是否大大削弱活性。若通过这种手段即通过活性削弱或通过敲除证明残基是重要的，则可以进行保守性替代，诸如用Asp替代Glu以改变侧链长度、用Ser替代Cys、或用Arg替代His。对于疏水性片段，有用的主要是改变大小，尽管也可以用芳香族替代烷基侧链。

其它定点诱变技术也可用于编码可用于本发明实践的转录因子的核酸分子。例如，DNA的限制性内切核酸酶消化及随后的连接可用于生成可用于本发明实践的转录因子的删除突变体，正如《MolecularCloning：A Laboratory Manual》第15.3节所述，Sambrook等人，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约，NY，1989，收入本文作为参考。相似策略可用于构建插入变体，正如同上第15.3节所述，Sambrook等人。

由寡核苷酸指导的诱变可用于制备可用于本发明实践的转录因子的替代变体。它还可用于方便地制备可用于本发明实践的转录因子的删除和插入变体。这种技术在本领域是众所周知的，描述于Adelman等人，DNA，2：183，1983；Sambrook等人，同上；《Current Protocolsin Molecular Biology》，1991，Wiley，NY，F.T.Ausubel、R.Brent、R.E.Kingston、D.D.Moore、J.D.Seidman、J.A.Smith和K.Struhl编，收入本文作为参考。

通常，将长度为至少25个核苷酸的寡核苷酸用于插入、删除或替代编码可用于本发明实践的转录因子的核酸分子中的两个或多个核苷酸。最佳寡核苷酸将在编码突变的核苷酸两侧具有12-15个完全匹配的核苷酸。为了诱变可用于本发明实践的野生型转录因子蛋白质，将寡核苷酸与单链DNA模板分子在合适杂交条件下退火。然后加入DNA聚合酶，通常是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。该酶使用寡核苷酸作为引物以完成携带突变的DNA链的合成。由此形成异源双链分子，其中一条编码野生型蛋白质的DNA链插入载体，而第二条编码突变型蛋白质的DNA链插入相同载体。然后将该异源双链分子转化到合适的宿主细胞中。

可以通过几种方式中的一种生成具有超过一处氨基酸替代的突变体。若氨基酸在多肽链中的位置相距较近，则可以使用编码所有期望氨基酸替代的一种寡核苷酸同时进行突变。然而，若氨基酸彼此相距较远(例如被超过十个氨基酸分开)，则要生成编码所有期望变化的寡核苷酸更加困难。改而可以采用两种候选方法之一。在第一种方法中，为将被替代的每一种氨基酸生成分开的寡核苷酸。然后同时将寡核苷酸与单链模板DNA退火，由模板合成的第二条DNA链将编码所有的期望氨基酸替代。候选方法包括两轮或多轮诱变以生成期望的突变体。第一轮与对单一突变体所描述的方法相同：使用野生型蛋白质DNA作为模板，将编码第一期望氨基酸替代的寡核苷酸与该模板退火，从而生成异源双链DNA。第二轮诱变采用第一轮诱变中生成的突变DNA作为模板。因此，该模板早就包含一处或多处突变。然后将编码其它期望氨基酸替代的寡核苷酸与该模板退火，生成的DNA链现在编码来自第一轮和第二轮诱变的突变。生成的这种DNA可以用作第三轮诱变的模板，等等。

可以使用原核生物作为可用于本发明实践的转录因子的初始克隆步骤的宿主细胞。它们对于快速生成大量DNA、生成用于定点诱变的单链DNA模板、同时筛选许多突变体和/或推定的内耳细胞转录因子、和生成的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94(ATCC编号31，446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC编号27，325)、大肠杆菌X1776(ATCC编号31，537)和大肠杆菌B；然而，大肠杆菌的许多其它菌株诸如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539，和原核生物的许多其它物种和属，包括杆菌诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、其它肠细菌诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或Serratia marcesans、和多种假单胞菌属物种也都可以用作宿主。优选使用氯化钙法转化具有坚硬细胞壁的原核宿主细胞或其它宿主细胞，正如Sambrook等人在第1.82节所述(同上)。或者，可以将电穿孔用于这些细胞的转化。原核生物转化技术列于Dower，W.J.，《Genetic Engineering，Principles and Methods》，12：275-296，Plenum出版公司，1990；Hanahan等人，Meth.EnzyMol.，204：63，1991。

本领域技术人员将领会，包含衍生自宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的任何质粒载体也可用于克隆、表达和/或操作编码可用于本发明实践的转录因子的核酸分子。载体通常具有复制起点、在转化细胞中提供表型选择的标记基因、一个或多个启动子、和包含用于插入外源DNA的数个限制性位点的多接头区。通常用于转化大肠杆菌的质粒包括pBR322、pUC18、pUC19、pUCI18、pUC119和Bluescript M13，所有这些载体都描述于Sambrook等人的第1.12-1.20节(同上)。然而，还可以获得许多其它合适载体。这些载体包含编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，这些基因使得用这些载体转化的细胞在存在这些抗生素时能够生长。

最常用于原核载体的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等人，Nature，375：615，1978；Itakura等人，Science，198：1056，1977；Goeddel等人，Nature，281：544，1979)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucl.AcidsRes.，8：4057，1980；EPO申请公布号36,776)、和碱性磷酸酶系统。虽然这些是最常用的，但是还可采用其它微生物启动子，而且已经发表了关于它们核苷酸序列的详情，使得熟练工作人员能够将它们功能性连接到质粒载体中(参阅Siebenlist等人，Cell，20：269，1980)。

使用标准重组DNA技术来制备包含编码复制序列、调控序列、表型选择基因的DNA的合适载体和编码可用于本发明实践的转录因子的DNA。将分离的质粒和DNA片段进行切割、剪裁、并以特定顺序连接到一起，产生期望载体，正如本领域众所周知的(参阅例如Sambrook等人，同上)。

在本发明方法的另一个实施方案中，通过破坏内耳感觉毛细胞并(在破坏内耳感觉毛细胞之前、之中和/或之后)抑制一种或多种在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂的表达来刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞。由此，可以刺激与受损的感觉毛细胞接触的内耳支持细胞分裂，而且至少一些产生的后代形成内耳感觉毛细胞。作为代表性范例，在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，诸如所谓的CIP/KIP家族的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，包括p21^Cip1、p27^Kip1和p57^Kip2。

在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂的具体范例包括：p57^Kip2(Lee等人，Genes Dev.，9(6)：639-649，1995；SEQ ID NO：6)、p27^Kip1(Cell，78(1)：59-66，1994；SEQ ID NOS：8和9)、p21^Cip1(El-Diery等人，Cell，75(4)：817-825，1993；SEQ ID NOS：10和11)、p19 Ink 4d(Chan等人，Mol.Cell.Biol.，15(5)：2682-2688，1995；SEQ ID NOS：12和13)、p18 Ink 4c(Guan等人，Genes Dev.，8(24)：2939-2952，1994；SEQ ID NOS：14和15)、p15 Ink 4b(Hannon和Beach，371(6494)：257-261，1994；SEQ IDNOS：16和17)、和p16 Ink 4a(Serrano，M.等人，Nature，366(6456)：704-707，1993；SEQ ID NOS：18和19)。编码可用于本发明实践的细胞周期抑制剂的核酸分子能够与SEQ ID NOS：6、8、10、12、14、16和18所列核酸分子之中任一的反义链在高于2X SSC、55℃的至少一种杂交严谨度下发生杂交，诸如1X SSC、60℃或0.2X SSC、60℃。

细胞周期抑制剂的抑制剂可以是在细胞内以直接或间接方式作用于细胞周期抑制剂的物质，如蛋白质。另外，细胞周期抑制剂的抑制剂可以是与编码细胞周期抑制蛋白的核酸分子(诸如mRNA分子)的整个或部分互补且能够与编码细胞周期抑制蛋白的核酸分子在严谨条件下(诸如高于2X SSC、55℃的严谨度，如1X SSC、60℃或0.2X SSC、60℃)发生杂交的反义核酸分子。

任何本领域公认的方法都可用于抑制细胞周期抑制剂基因在内耳支持细胞中的表达。例如，可以通过将包含相对于启动子序列反义取向并且编码在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂的核酸分子的部分(或整个)的载体导入内耳支持细胞，来抑制在内耳支持细胞中有活性的细胞周期抑制剂的表达。

一般而言，反义技术采用相对于其用于转录的正常取向而言颠倒的DNA序列，因而表达的RNA转录本与宿主细胞内表达的靶mRNA分子互补(即反义基因的RNA转录本能够与靶mRNA分子通过Watson-Crick碱基配对发生杂交)。可以多种不同方式来构建反义基因，只要它能够干预靶基因的表达，诸如编码细胞周期抑制剂的基因。可以通过相对于其用于转录的正常取向颠倒靶基因的编码区(或其部分)从而能够转录其互补链来构建反义基因，因此由反义和有义基因编码的RNA是互补的。

反义基因通常与靶基因的至少一部分基本上相同。然而，为了抑制表达，序列不必完全相同。通常，较高同源性可用于补偿较短反义基因的使用。最小同一性通常高于大约65％，但是更高同一性可能对内源序列发挥更有效的表达抑制。优选超过大约80％的基本上更高同一性，尽管最优选大约95％的同一性至绝对同一性。

此外，反义基因不必具有与靶基因相同的内含子或外显子模式，而且靶基因的非编码区段在实现靶基因表达的反义抑制时可能与编码区段同等有效。通常，应当使用至少大约30或40个核苷酸的DNA序列作为反义基因，尽管优选更长的序列。然后将构建物导入一个或多个内耳支持细胞，并生成RNA的反义链。

催化性RNA分子或核酶也可用于抑制靶基因的表达。有可能设计编码RNA核酶的核酶转基因，所述RNA核酶与靶RNA特异配对，且在特异位置切割磷酸二酯主链，从而在功能上灭活靶RNA。在进行这种切割时，核酶自身不发生改变，从而能够反复利用并切割其它分子。在反义RNA中包含核酶序列赋予它们RNA切割活性，从而提高反义构建物的活性。Tabler等人(Gene，108：175，1991)通过在单一构建物中联合反义RNA与核酶技术的优点而极大简化了催化性RNA的构建。核酶催化需要更小同源区，因此，如果切割位点是保守的话，这能够促进对大型基因家族不同成员的抑制。

依照生成显性失活突变的一般标准(Herskowitz I，Nature，329：219-222，1987)，适用于抑制靶基因活性的另一种策略需要由靶基因编码的蛋白质的突变型或部分删除型的有义表达。

任何本领域公认的基因传送方法都可用于将编码转录因子的核酸分子(或包含反义DNA分子的载体)导入内耳细胞从而在其中进行表达，包括：直接注射、电穿孔、由病毒介导的基因传送、由氨基酸介导的基因传送、生物弹式(biolistic)基因传递、脂转染和热休克。将基因传递到内耳细胞中的非病毒方法公开于Huang，L.、Hung，M-C.和Wagner，E.，《Non-Viral Vectors for Gene Therapy》，Academic出版社，San Diego，California，1999，收入本文作为参考)。

例如，可以通过病毒载体的手段将基因原位导入细胞，或者在由体内取出细胞之后。例如，逆转录病毒是能够在感染后将它们的基因插入宿主细胞染色体的RNA病毒。已经开发了逆转录病毒载体，它们缺乏编码病毒蛋白质的基因，但是保留了感染细胞和将它们的基因插入靶细胞染色体的能力(A.D.Miller，Hum.Gen.Ther.，1：5-14，1990)。

设计了可以直接施用于患者的腺病毒载体。与逆转录病毒不同，腺病毒载体不整合到宿主细胞染色体中。相反，使用腺病毒载体导入细胞的基因作为染色体外因子(游离基因)维持在细胞核中并持续有限时间。腺病毒载体将在体内感染许多不同组织中的分裂和不分裂细胞，包括呼吸道上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和多种肿瘤(B.C.Trapnell，Adv Drug Del Rev，12：185-199，1993)。

另一种病毒载体是单纯疱疹病毒，一种大型双链DNA病毒，它已经用于将治疗基因传送至神经元的一些初步应用，而且能够潜在地用于将治疗基因传送至一些形式的脑癌(D.S.Latchman，Mol.Biotechnol.，2：179-195，1994)。重组形式的牛痘病毒能够容纳大型插入片段，而且是通过同源重组而生成的。迄今为止，这种载体已经用于传递白介素(ILs)诸如人IL-1β和共刺激分子B7-1和B7-2(G.R.Peplinski等人，Ann.Surg.Oncol.，2：151-159，1995；J.W.Hodge等人，Cancer Res.，54：5552-5555，1994)。

另一种基因治疗方法包括将DNA质粒直接导入患者(F.D.Ledley，Hum.Gene Ther.，6：1129-1144，1995)。质粒DNA在体内被细胞摄取，而且能够指导重组蛋白的表达。通常，以脂质体的形式将质粒DNA传送至细胞，在脂质体中DNA与一种或多种脂质相联系，诸如DOTMA(1，2-二油酰氧基丙基-3-溴化三甲铵)和DOPE(二油酰基磷脂酰基乙醇胺)。含DOTMA的配方已经在动物模型中显示在肺上皮细胞中提供表达(K.L.Brigham等人，Am.J.Med.Sci.，298：278-281，1989；A.B.Canonico等人，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，10：24-29，1994)。另外，研究证明肌肉内注射含5％PVP(50,000kDa)的质粒DNA配方能够将肌肉中报道基因的表达水平比只在盐水中注射DNA时发现的水平提高多达200倍(R.J.Mumper等人，Pharm.Res.，13：701-709，1996；R.J.Mumper等人，Proc.Intern.Symp.Cont.Rol.Bioac.Mater.，22：325-326，1995)。肌肉内施用质粒DNA导致基因表达持续数月(J.A.Wolff等人，Hum.Mol.Genet.，1：363-369，1992；M.Manthorpe等人，Hum.Gene Ther.，4：419-431，1993；G.Ascadi等人，New Biol.，3：71-81，1991；D.Gal等人，Lab.Invest.，68：18-25，1993)。

另外，在将质粒直接注射到甲状腺(M.Sikes等人，Hum.GeneTher.，5：837-844，1994)和滑膜(J.Yovandich等人，Hum.GeneTher.，6：603-610，1995)中后也观察到DNA的摄取和表达。注射到肝间质中和(M.A.Hickman等人，Hum.Gene Ther.，5：1477-1483，1994)皮肤间质中(E.Raz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：9519-9523，1994)、滴注到呼吸道中(K.B.Meyer等人，Gene Therapy，2：450-460，1995)、应用于内皮(G.D.Chapman等人，CirculationRes.，71：27-33，1992；R.Riessen等人，Human Gene Therapy，4：749-758，1993)、和静脉内施用后(R.M.Conry等人，Cancer Res.，54：1164-1168，1994)观察到较低水平的基因表达。

已经开发了多种装置用于增强DNA对靶细胞的有效性。一种简单方法是使靶细胞在物理上接触装有DNA的导管或可植入材料(G.D.Chapman等人，Circulation Res.，71：27-33，1992)。另一种方法采用无针头喷射装置，它们在高压下将一筒液体直接注射到靶组织中(P.A.Furth等人，Anal.Biochem.，20：365-368，1992；H.L.Vahlsing等人，J.Immunol.Meth.，175：11-22，1994；F.D.Ledley等人，Cell Bochem.，18A：226，1994)。

另一种用于传送基因的装置是“基因枪”或“Biolistic^TM”，在体内将DNA包被的颗粒直接发射到细胞细胞核中的弹果装置。一旦到达细胞核内，DNA由金或钨微粒上解离下来，并能够由靶细胞进行表达。这种方法已经有效用于直接将基因转移到皮肤、肝和肌肉中(N.S.Yang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：9568-9572，1990；L.Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：4455-4459，1993；R.S.Williams等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，88：2726-2730，1991)。

耳蜗造瘘术包括刺破耳蜗并插入导管，通过导管将化学试剂诸如核酸分子导入耳蜗。耳蜗造瘘术公开于例如Lalwani，A.K.等人，Hearing Research，114：139-147，1997，将此发表物收入本文作为参考。

另一种靶向基因传送方法使用由用于将核酸特异靶向细胞的蛋白质或合成配体(在它上面附着了核酸或DNA结合剂)构成的分子缀合物(R.J.Cristiano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11548-11552，1993；B.A.Bunnell等人，Somat.Call Mol.Genet.，18：559-569，1992；M.Cotten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6094-6098，1992)。一旦将DNA偶联到分子缀合物，就产生了蛋白质-DNA复合物。这种基因传送系统已经显示通过使用不同配体能够靶向传送至许多细胞类型(R.J.Cristiano等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：11548-11552，1993)。例如，维生素叶酸已经作为配体用于促进质粒DNA传送至过度表达叶酸受体的细胞(如卵巢癌细胞)(S.Gottschalk等人，Gene Ther.，1：185-191，1994)。疟原虫环子孢子蛋白已经用于肝细胞ASOR受体表达较低条件下(诸如在肝硬化、糖尿病和肝细胞癌中)的肝特异性基因传送(Z.Ding等人，J.Biol.Chem.，270：3667-3676，1995)。表皮生长因子(EGF)受体在癌细胞上的过度表达能够允许肺癌细胞对EGF/DNA复合物的特异摄取(R.Cristiano等人，Cancer Gene Ther.，3：4-10，1996)。目前优选的基因传送方法是脂转染。

在体外使用本发明的方法时，优选切下整个内耳(包括科尔蒂器)，并在培养容器中进行培养和操作。目前优选的、可用于在体外培养内耳的设备公开于美国专利系列号5,437,998、美国专利系列号5,702,941和美国专利系列号5,763,279，都收入本文作为参考。

一般而言，目前优选的、可用于培养内耳的装置包括透气性生物反应器，包含带壁的管状容器，其中管状容器的壁至少部分是由透气材料(诸如硅氧烷橡胶)构成的。在一个优选实施方案中，容器的一半包含透气材料，剩余部分是由不透气材料制成的。通常可获得的透气材料是不透明的。因此，将不透材料用于至少部分反应器可以在容许目视检查管状容器室方面提供优势。

管状容器具有封闭的末端、基本上水平的纵向中心轴、和一个或多个容器入口。容器入口提供了向反应器中输入培养基和细胞、由管状容器除去老培养基的通路。这可以通过容器入口容易地进行，该容器入口也称为阀门或注射口。在优选实施方案中，容器入口是由带注射口的阀门构成的。

优选的是，容器可以围绕其水平的纵向中心轴进行旋转。用于旋转的优选手段是固定在安装底座上且具有连接管状容器的手段的发动机装置。可以调整旋转速度使得管状容器中的内耳持续运动，但是管状容器的旋转速度不应快得足以在管状容器内的水相培养基中引起显著湍流。

如果希望如此，使用透气材料构建至少部分管状容器壁以容许O₂扩散穿过器壁而进入容器腔中的细胞培养基。相应的，CO₂扩散穿过器壁而离开容器。因此，使用透气材料构建至少部分管状容器壁通常克服了向生物反应器容器中注入空气的需要。然而，如果需要额外氧气来培养内耳，可以将空气注入生物反应器容器中的水相培养基。在使用气泵将空气注入水相培养基时，还使用空气滤器来保护气泵阀门免于灰尘污染。

可用于本发明实践的生物反应器的候选实施方案是器壁至少部分由透气材料构成的环状容器。环状在本文中定义为包括环状、环形和其它基本上对称的环样形状的管状容器。环状容器具有封闭末端和基本上水平的纵向中心轴。

在另一个实施方案中，可用于本发明实践的生物反应器包含至少部分由透气材料构成的管状容器。容器具有封闭末端和基本上水平的纵向中心轴，围绕该轴能够进行旋转。容器还具有两个可滑动式互连构件，其中第一个构件可滑动的安装在第二个构件中，在它们之间形成流体密封，并提供可变体积的管状容器。生物反应器具有使管状容器围绕其基本水平的纵向中心轴旋转的手段。提供一个或多个容器入口，用于将材料输入和输出容器。

在必须将污染降至最低的情况中(如AIDS或人组织研究)，可用于本发明实践的生物反应器的一次性能力是一个特殊优势。此外，可以调整具有可滑动式互连构件的生物反应器的实施方案以提供所需要的精确尺寸的生物反应器。

目前优选的、可用于在本发明实践中培养充满流体的感觉器官的商品化生物反应器已知是由Synthecon公司(8054 El Rio，HoustonTexas)制造的High Aspect Ratio Vessel(HARV^TM)和Cylindrical CellCulture Vessel(CCCV^TM)。

购自Gibco BRL的Neuralbasal^TM培养基(Gibco BRL培养基是由Life Technologies生产的，公司总部，Gaithersburg，MD)是目前优选的、用于在体外培养内耳的培养基，它需要添加B27或N2培养基补料。然而，也可以成功使用其它培养基，在本发明的实践中培养充满流体的感觉器官。其它合适的培养基包括含胎牛血清或马血清的DME、BME和M-199。所有上述培养基都是由Gibco-BRL销售的。在使用Neuralbasal^TM培养基且试图延长培养期(>96小时)时，N2或B27补料发挥更加重要的作用。

另一方面，本发明提供了用于刺激内耳支持细胞形成的方法。本发明这个方面的方法包括在促进新的内耳支持细胞形成(例如通过与受损的内耳支持细胞接触的内耳支持细胞的细胞分裂)的条件下破坏内耳支持细胞。在本发明的这个方面中，使用本文关于刺激内耳支持细胞形成内耳感觉毛细胞的本发明方法而描述的相同技术来破坏内耳支持细胞并刺激新的内耳支持细胞的形成。因此，例如，可以通过接触有效破坏内耳支持细胞的数量的耳毒性试剂来破坏内耳支持细胞，诸如氨基糖苷类抗生素。同样，作为范例，可以通过破坏内耳支持细胞并(在破坏内耳支持细胞之前、之中和/或之后)在内耳支持细胞内表达能够刺激内耳支持细胞分裂并形成新的内耳支持细胞的转录因子(诸如POU4F1、POU4F2、POU4F3、Brn3a、Brn3b和Brn3c)来进一步刺激新的内耳支持细胞的形成。在本发明这个方面的优选实施方案中，内耳支持细胞的增殖导致接受治疗的内耳获得听觉功能的改进。

实施例

下列实施例仅仅例示目前试图实践本发明的最好模型，而不应当解释为限制本发明。

实施例1：在体外在永生化支持细胞系中过度表达POU4F3

POU4F3是在内耳中对毛细胞展示显著特异性的DNA结合转录因子。已知POU4F3的突变在小鼠中引起发育失败，在小鼠和人中引起听力丧失。通过用POU4F3转染内耳支持细胞来调查POU4F3在指导毛细胞前体发育中的作用。

为了检测POU4F3在活培养物中的表达，监测由包含POU4F3和GFP编码区的双顺反子mRNA翻译的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。具体而言，将编码POU4F3的1250bp cDNA(包含70bp5’UTR和73bp 3’UTR)定向克隆到pIRES2-EGFP载体(Clonetech)的唯一EcoRV限制性位点中，直接位于人CMV主要立即早期启动子/增强子的下游。将间插合成内含子克隆到POU4F3基因的下游，以增强mRNA的稳定性。将来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)克隆到POU4F3基因与GFP基因之间，从而能够由相同mRNA翻译GFP和POU4F3蛋白质。紧挨着GFP编码区的是来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化信号。设计的这种表达盒利用双顺反子启动子，从而能够通过在荧光显微镜下显现表达的GFP来追踪POU4F3和GFP的转染和表达。这种第二代GFP载体具有为了获得更亮荧光而优化野生型GFP得到的红移变体(最大激发＝488nm；最大发射＝507nm)。为了优化表达高水平POU4F3蛋白质的细胞的鉴定，pIRES2载体利用部分失效的IRES序列(Rees，S.等人，BioTechniques，20：102110，1996)。这种削弱的IRES导致GFP起始密码子处的翻译起始速率相对于POU4F3基因而降低。

由112k^b-tsA 58转基因小鼠(Immortamouse)的内耳前庭感觉上皮建立支持细胞系(UCL)。切开出生后一天小鼠的椭圆囊，并于37℃简短嗜热菌蛋白酶处理后分离感觉上皮(毛细胞和支持细胞)。在刺激快速细胞增殖的允许条件下(33℃和γINF)数次传代后衍生得到支持细胞系。3-4天内达到汇合。根据ICC和电子显微镜(EM)的测定，该方法导致所有毛细胞死亡。通过称为ZO-1的抗体(它标记支持细胞中存在的紧密连接)和EM(它显示紧密连接复合体、分泌小泡和腔表面微绒毛，支持细胞的所有特征)进一步表征UCL。

用于UCL细胞系的培养基由DMEM/F12(Gibco)、胎牛血清(10％)和γINF(20u/ml)组成。根据细胞的生长速率，每周更换2-3次培养基。使用特殊的接种方法来建立单细胞克隆，该方法能够使单细胞在3-4周内汇合且可以传代。在非允许条件下(37℃或39℃、无γINF、以及低或无FBS)细胞生长停滞。

考虑到早已在UCL中观察到高转染效率，将这些细胞在不含血清的合成培养基中进行培养和传代。一旦建立，用IRES-GFP-POU4F3编码质粒脂转染这些细胞。在1-6DIV中对培养物监测GFP表达。当在活培养物中观察到高GFP荧光时，将培养物进行固定，并为POU4F3和钙结合蛋白ICC做好准备。

实施例2：POU4F3在受损科尔蒂器培养物中的过度表达

由P7-P14小鼠建立培养物，并用1mM新霉素损害2DIV。除去培养基，用pIRES2-GFP-POU4F3脂转染培养物达6小时，并在新鲜培养基中恢复1-6DIV。将培养物进行醛固定，并对POU4F3和钙结合蛋白进行免疫细胞化学。将仅用pIRES2-GFP脂转染的培养物作为对照。三重标记细胞(GFP、POU4F3和钙结合蛋白免疫反应性呈阳性)的存在指示POU4F3能够促进受损科尔蒂器采取毛细胞表型。通过针对其它毛细胞选择性标记诸如肌球蛋白6和肌球蛋白7a的抗体，使用针对这些蛋白质而衍生的多克隆抗体，进一步确证了这种表型。

Brn3.1转录因子在E13.5开始表达后2-3天，在E16胎鼠科尔蒂器中观察到毛细胞特异标记诸如肌球蛋白6和7a的表达。

实施例3：p27^Kip1-/-小鼠中的内耳毛细胞再生

先前关于p27^Kip1-/-和+/-小鼠的报告显示了内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)区存在额外毛细胞(HCs)的定性证据(Chen，P.和Segil，N.，Development，126：1581-1590，1999；Lowenheim，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：4084-4088，1999)。不幸的是，周围支持细胞的显著发育异常能够很好的说明这些观察结果中的有些，如果不是全部的话。因此，测量了p27^Kip1-/-、+/-和+/+小鼠中的IHC和OHC数目。为了更精确的评估HC数目是否真正增加，分析了相同耳蜗的数个区域。使用HC特异标记即肌球蛋白VIIa抗体观察到，p27^Kip1-/-耳蜗中的IHC数目与p27^Kip1+/-和+/+耳蜗相比增加了20％。然而，p27^Kip1-/-、+/-和+/+耳蜗之间的OHC总数没有统计学显著差异，只是在一个分析区中OHC数目增加了10％(表1)。表1显示了四周龄p27^Kip1+/+、+/-和-/-小鼠中的毛细胞数目(n)。在沿科尔蒂器纵轴的三个不同位置，对100μm长度的感觉上皮进行计数。距离对应于离耳蜗顶端的远近程度(±s.d.)。在+/+、+/-和-/-之间对相同毛细胞区域进行比较。使用ANOVA测定统计学显著性。

表1

基因型  距离  n   IHC         OHC

+/+     90    6   13.0±0.0   42.8±2.5

+/-     90    16  13.1±0.7   44.1±2.9

-/-     90    11  16.0±1.9*  43.5±2.3

+/+     180   6   13.3±0.8   40.5±5.2

+/-     180   16  13.2±0.8   43.1±2.2

-/-     180   11  17.0±1.3*  45.9±3.3*

+/+     360   6   13.7±0.8   41.7±5.1

+/-     360   16  13.4±0.5   43.1±2.8

-/-     360   11  16.2±1.8*  41.0±4.6

*p值<0.001

为了测定出生后10天听力初起后是否生成听觉毛细胞，让两周龄p27^Kip1-/-、+/-和+/+小鼠(P10-12)接受3次每日全身注射溴脱氧尿苷(BrdU；30mg/kg/皮下)，即在S期掺入增殖细胞的核苷酸类似物。然后让小鼠恢复2天或2周而无更多注射。使用可见光和荧光显微镜通过免疫细胞化学来鉴定BrdU阳性HC细胞。还用针对肌球蛋白VI和VIIa的抗体来标记耳蜗。在最后一次注射后恢复2天的两周龄p27^Kip1-/-耳蜗中，在BrdU阳性细胞中没有观察到BrdU/肌球蛋白VIIa阳性细胞。然而，在最后一次注射后恢复14天的四周龄p27^Kip1-/-耳蜗中，观察到BrdU/肌球蛋白VIIa阳性HC。这些双重标记的大多数是IHC。这个定性发现与我们对IHC和OHC数目的定量评估相似。p27^Kip1+/-和+/+小鼠在恢复的第2天和第14天完全不含BrdU阳性细胞。这些数据概述于表2。表2显示了在注射BrdU或BrdU/阿米卡星并恢复2天或14天的两周龄和四周龄p27^Kip1+/+、+/-和-/-小鼠科尔蒂器中BrdU标记细胞的数目(n)。对耳蜗顶半部1000μm长度的感觉上皮进行计数(±s.d.)。在+/+、+/-和-/-之间比较BrdU的增殖。将BrdU/阿米卡星组的增殖与相同基因型的只用BrdU组进行比较。使用ANOVA测定统计学显著性。

表2

基因型    n    BrdU+2天         n  BrdU/阿米卡星+2天

+/+       10   0.0±0.0            0.0±0.0

+/-       12   0.0±0.0            4.7±7.6

-/-       4    82.3±11.0*         96.3±9.5

基因型  n   BrdU+14天      n     BrdU/阿米卡星+14天

+/+     10  0.0±0.0       10    0.0±0.0

+/-     18  0.0±0.0       10    10.5±12.0*

-/-     6   82.2±22.5*    12    137.4±17.0*

*p值<0.001

为了确认能否再生听觉HC，通过全身注射硫酸阿米卡星(P7-P12)来损害HC，然后注射BrdU(P10-12)。最后一次注射后2天或14天处死小鼠。阿米卡星损害的作用是至少2倍。首先，在p27^Kip1-/-和+/-小鼠中，BrdU阳性细胞的数目在阿米卡星/BrdU处理后相对于只用BrdU处理而增加。在p27^Kip1+/-耳蜗中，BrdU标记细胞的数目在检验的大多数样品中增加，然而，不是所有的p27^Kip1+/-耳蜗都展示BrdU阳性细胞。通过标记耳蜗的切片确认了HC再生的证据。其次，在p27^Kip1-/-耳蜗中在阿米卡星损害后观察到更大数目的BrdU阳性HC。大多数BrdU阳性HC出现在耳蜗中硫酸阿米卡星损伤或杀死HC的区域(耳蜗基部)。在野生型耳蜗中在阿米卡星/BrdU或只用BrdU处理后没有观察到BrdU阳性细胞。这些数据概述于表2。

为了测量特异蛋白质水平，将单个耳蜗裂解物系列稀释，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。Western印迹显示，肌球蛋白VI和VIIa水平在p27^Kip1-/-、+/-和+/+耳蜗之间大致相等，尽管在p27^Kip1-/-耳蜗中观察到更强的肌球蛋白VIIa条带。p27^Kip1+/-耳蜗包含在野生型耳蜗中发现的p27^Kip1蛋白质水平的大约50％，指示p27^Kip1降至正常的50％能够在硫酸阿米卡星处理后刺激支持细胞增殖并使得一些毛细胞再生。

用于测量耳蜗中的蛋白质水平的方案如下。将耳蜗转移至装有10μl提取缓冲液的管中，所述提取缓冲液含有：HEPES(25mM)、NP-40(0.7％)、抑酶肽(1mM)、亮抑酶肽(1μg/ml)、抑胃酶肽(10μM)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(1mM)、二硫苏糖醇(DTT)(1mM)、和乙二胺四乙酸(EDTA)(2mM)。立即将耳蜗匀浆，并将管在冰上放置大约30分钟。加入5μl 4X加样缓冲液，并将盐浓度调至0.5M。将样品加热至90-100℃达5分钟，然后以13,000rpm离心10分钟，并收集上清液。取一部分上清液中的蛋白质进行15％SDS-PAGE凝胶电泳(200V50分钟)，并将蛋白质转移到PVDF膜上(100V 1小时)。用10％ Amersham封闭缓冲液将膜封闭1小时或过夜。在封闭缓冲液中向膜提供一抗达1小时，然后用PBS/吐温将膜清洗5次，每次5分钟。用山羊抗小鼠或山羊抗兔-碱性磷酸酶和抗生物素-AP对膜探查1小时，并用PBS/吐温将膜清洗5次，每次5分钟。

为了测定p27^Kip1在外周前庭系统中是否发挥相似作用，检验了p27^Kip1+/-和+/+小鼠椭圆囊、球状囊和嵴的增殖能力。让小鼠(P7-P12)连续六天接受全身注射硫酸阿米卡星(500毫克/千克/天/皮下)，并在P10-P12之间联合注射复制标记溴脱氧尿苷(BrdU；30毫克/千克/天/皮下)。还以相似方式只用BrdU给小鼠进行注射。然后在14天后处死小鼠，将前庭感觉器官固定、切开、并进行BrdU免疫细胞化学处理。使用可见光显微镜和Nomarski光学，对整个标本的BrdU阳性细胞核进行计数。对选定的器官进一步进行截面切片分析。

在只接受BrdU的p27^Kip1-/-小鼠中，在球状囊和椭圆囊中观察到很低水平的BrdU标记细胞。然而，在联合阿米卡星/BrdU处理后，在两种器官中都观察到BrdU阳性细胞数目增加了40倍。大约一半标记细胞表现为双联体(doublets)，说明最近或正在进行细胞分裂。塑料截面切片显示大多数BrdU标记细胞沿着基底膜位于感觉上皮的基层。在耳石器中也观察到BrdU阳性HC。这些再生HC的大多数表现为I型HC，因为它们接触蕈体冠。在只接受BrdU的p27^Kip1+/-小鼠中，在球状囊或椭圆囊中都没有观察到增殖。在联合阿米卡星/BrdU处理后，诱导了很低水平的增殖。在p27^Kip1+/+小鼠中，在阿米卡星/BrdU或只用BrdU处理后，在球状囊或椭圆囊中都没有观察到BrdU阳性细胞核。令人感兴趣的是，在阿米卡星/BrdU或只用BrdU处理后，在任何基因型的嵴中都没有观察到BrdU阳性细胞。这些数据指示删除p27^Kip1在各种前庭感觉器官中和在前庭感觉器官与科尔蒂器之间的显著不同影响。这些数据概述于表3。表3显示了注射BrdU或BrdU/阿米卡星且恢复14天后四周龄p27^Kip1+/+、+/-和-/-小鼠的前庭器官中BrdU标记细胞的数目。对整个椭圆囊、球状囊和嵴感觉上皮进行计数(±s.d.)。在BrdU组中，通过比较+/+、+/-和-/-之间相同感觉器官的增殖水平来测定统计学显著性。在BrdU/阿米卡星组中，通过比较相同基因型的相同感觉器官的增殖水平来测定统计学显著性。使用ANOVA来测定统计学显著性。

表3

椭圆囊(n)         基因型        BrdU              BrdU/阿米卡星

8                 +/+           0.0±0.0          0.0±0.0

20                +/-           0.0±0.0          0.4±0.7

12                -/-           19.7±13.4*       45.5±19.2*

球状囊(n)         基因型        BrdU              BrdU/阿米卡星

6                 +/+           0.0±0.0          0.0±0.0

16                +/-           0.0±0.0          1.6±1.9

9                 -/-           32.7±14.3*       51.8±15.3*

嵴(n)             基因型        BrdU              BrdU/阿米卡星

12                +/+           0.0±0.0          0.0±0.0

12                +/-           0.0±0.0          0.0±0.0

12                -/-           0.0±0.0          0.0±0.0

*p值<0.001

将选择的半薄切片在塑料中再次包埋，切薄片，并在电子显微镜下进行检验。BrdU阳性HC展示立体纤毛束、角皮层、杯状神经分布及突触形成的证据。

实施例4：p27^Kip1表达的反义抑制

为了测试在p27^Kip1+/+耳蜗中抑制p27^Kip1基因产物是否将容许非有丝分裂支持细胞增殖，用反义寡核苷酸(ONs)处理野生型科尔蒂器外植体(P7-P10，处于听力初起年龄)。如下建立外植体培养物：由耳蜗切下科尔蒂器，除去覆膜，并将科尔蒂器粘附在用Cell-tak包被且维持于37℃、5％CO₂环境的载玻片上。然后将外植体暴露于耳毒性抗生素(1mM硫酸新霉素)达48小时，这杀死了超过95％的HC(Kil，J.等人，ARO abs.，21：672，1998)。然后除去含新霉素的培养基，并使用阳离子脂质(脂转染)来施用p27^Kip1反义寡核苷酸(ONs)(40nM)达24-48小时。在荧光下检验这些活培养物中的一些，以检测缀合FITC的反义寡核苷酸的存在。

在18-24小时内检测到FITC阳性支持细胞，而且在24-48小时间数目和荧光强度增加。将培养物醛固定，并进行BrdU免疫细胞化学处理。反义寡核苷酸(ON)处理后24小时，大多数耳蜗培养物中出现了BrdU阳性支持细胞。在经反义寡核苷酸处理且在不含反义寡核苷酸的条件下额外恢复24小时的培养物中出现了BrdU阳性双联体。这指示M期成功完成，而且随后将发生细胞分裂。只用脂转染处理的培养物包含很低水平的BrdU标记支持细胞。

我们观察到施用p27^Kip1反义寡核苷酸能够在野生型耳蜗中诱导支持细胞增殖。这个观察结果是独特的，而且相当重要。证明p27^Kip1反义寡核苷酸诱导增殖的先前工作是在瞬时或可逆阻滞生长的活泼分裂细胞中显示的(Coats，S.等人，Science，272：877-880，1996；Dao，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：13006-13011，1998)。我们的结果首次证明终末分化器官中的终末有丝分裂细胞能够在抑制p27^Kip1基因产物后再次进入细胞周期。

同样，支持细胞增殖通常在小鼠科尔蒂器的E12-14之间停止。该点以后，支持细胞分化经过出生后寿命的第二周而继续进行。处于外植体时，如本文所述处理的培养物早已形成一些成年样形态特征。这些资料进一步支持p27^Kip1反义寡核苷酸作为潜在手段诱导毛细胞再生的作用。在p27^Kip1+/-小鼠中，正常蛋白质水平降低50％容许一些终末分化支持细胞克服p27^Kip1阻碍并再次进入细胞周期和增殖。

加入在其它上皮器官中诱导细胞增殖的生长因子不能在出生后科尔蒂器中促进细胞增殖或毛细胞再生，在体外或在体内皆如此。本文报道的实验鉴定了相当普遍且有效的细胞周期抑制剂，它在删除后容许科尔蒂器自发再生它的一些毛细胞。含有一个拷贝的基因和50％的正常蛋白质水平的小鼠科尔蒂器能够再生听觉毛细胞。

另外，可以在用CellTak(Collaborative Research)包被的载玻片(Nunc)上在100μl含1mM新霉素的Neurobasal培养基(Gibco)中建立器官型培养物。这种处理杀死95％的毛细胞，而且还促进转染水平。使用商品化脂转染试剂(如Perfect Lipofection Kit；InVitrogen公司)，用反义分子脂转染培养物。培养基还含有BrdU(10μM)以鉴定增殖细胞。另外，可以使用各种重组生长因子诸如TGF-α(1-100nM)、胰岛素(10-100μM)和IGF-1(1-100μM)来提高或驱动这种增殖作用。

实施例5：在体外在豚鼠成纤维细胞细胞系中使用p27^Kip1反义寡核苷酸来刺激细胞增殖

建立在停用血清和生长阻滞阶段应答p27^Kip1反义寡核苷酸(ON)的细胞系培养物。这些培养物包括豚鼠成纤维细胞系(JH4)。16聚体(mer)反义寡核苷酸(具有SEQ ID NO：20所列核酸序列)的脂转染将JH4细胞系的生长阻滞逆转至超过正常的40％。

实施例6：在豚鼠耳蜗中使用p27^Kip1反义分子刺激支持细胞增殖

最近的两项独立研究指示能够成功传送反义寡核苷酸穿过外淋巴间隙并在成熟豚鼠科尔蒂器中引发变化(D’Aldin，C.等人，Mol.BrainRes.，55：151-164，1998；Leblanc，C.R.等人，Hear.Res.，135：105-112，1999)。在安装渗透泵后24小时内，在螺旋神经节、支持细胞、及内和外螺旋沟细胞中看到针对GluR2 mRNA特异序列的FITC-反义寡核苷酸的存在。随后还在原位观察到GluR2/3蛋白质的选择性下降(D’Aldin等人，1998，同上)。

发现p27^Kip1在成熟豚鼠科尔蒂器中的表达模式与在发育中和成年小鼠中观察到的相似。如下刺激豚鼠耳蜗中的支持细胞增殖：

通过吸入异氟烷(用5％诱导、用2-3％维持)或通过肌肉内注射氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(9mg/kg)来诱导全身麻醉。在耳廓后局部注射1％利多卡因。将动物置于加热垫上，从而在外科手术过程中维持基础体温恒定。仔细监测呼吸和循环。通过手术植入由盘绕的导管和渗透微泵(Alzet，产品目录编号2002，流速0.5μl/h，可长达14天)组成的输注单位将药物传送到豚鼠内耳中。盘绕导管装有药物，渗透微泵携有染料。可以通过泵入盘绕导管的染料的量来监测泵入内耳的药物的总体积。将药物溶于由下列成分组成的人工外淋巴溶液：137mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl₂、1mM MgCl₂、10mM Hepes、11mM 葡萄糖，pH7.4且重量摩尔渗透压浓度300mOsm/L。

在无菌条件下在解剖显微镜下进行所有外科流程。通过耳后切除来暴露乳突泡(中耳空间)，并使用1mm切割钻打开，从而显现耳蜗的底转。使用0.5mm金刚石研膏钻在圆窗下面进行大约1mm的耳蜗造瘘术。观察到内耳外淋巴液由该位点漏出，确认了耳蜗造瘘术的正确定位。将输注单位的尖端插入耳蜗造瘘处，并使用牙科粘固粉将管固定在中耳壁上。将输注单位贮藏于在颈后产生的皮下囊中。用2-0丝线逐层缝合皮肤切口。对两耳进行该流程以避免任何随后的失衡或旋转行为，并且能减少完成实验所需要的动物数目。对该流程，每侧需要大约30分钟。

植入后一周在全身麻醉下重复手术以更换输注单位。只通过初始耳后皮肤切口进行流程，而不包括再次进入中耳空间。对该流程，每个输注单位需要5-10分钟。通过检查活动、食欲、饮水、粪便和体重，每天监测动物的术后状况。若术后损失超过20％的体重或者展示严重的旋转行为或头歪斜，则处死动物。不应当发生手术不适，该流程只产生轻微的术后不适。

如下文表4所示，对正常对照给予人工外淋巴溶液达1或2周。毛细胞丧失组接受1周的硫酸庆大霉素(以杀死毛细胞并立即处死)和2周的恢复。使用应当提供HC全部丧失及分级丧失的三种浓度。传送5％(w/v)葡萄糖溶液中的阳离子脂质体达1-2周。该组的目的是看脂转染是否引起任何损伤。毛细胞丧失后的脂转染包括用含庆大霉素泵替代含脂质泵。毛细胞丧失后的脂转染加反义包括脂转染FITC-反义另一周。将损伤后的脂转染加反义加生长因子传送一周，随后脂转染反义和生长因子另一周。数组包括联合反义与生长因子，包括TGF-α、胰岛素和IGF-1。在所有动物中，将分开的、装有BrdU的渗透泵植入皮下，从而能够鉴定具有有丝分裂活性的细胞。

表4

动物(n)    药物(顺序)     浓度(范围)      药物的传送时间(天)

                                          其后的恢复时间(天)

12         GM/L           0.1-10mg/ml     7

                                          0、7、14

12         GM/L/FITC-AS   10-20nM         7

                                          7、14

12         GM/L/AS        10-20nM         7

                                          7、14

12         GM/FITC-AS或AS 10-20nM         7

                                          7、14

12         加TGF-α        10-100ng/ml     7

                                          3、7、14

12         加胰岛素       1-10μg/ml       7

                                          3、7、14

12         加IGF-1        10-100ng/ml     7

                                          3、7、14

使用整装染色技术，通过肌球蛋白VIIa免疫细胞化学(毛细胞特异标记)和鬼笔环肽组织化学(F-肌动蛋白标记)检查了由庆大霉素引起的毛细胞损伤。通过在表面荧光下观察FITC标记细胞核的存在来评估脂质体和p27^Kip1反义寡核苷酸的转染效率。使用BrdU免疫组织化学来测定p27^Kip1反义寡核苷酸处理是否诱导增殖。在电子显微镜下分析选择的标本。

有些实验使用BrdU和肌球蛋白VIIa双重标记来评估新的支持细胞的数目和毛细胞总数。

其它实验使用BrdU和波形蛋白的双重标记来评估新的支持细胞的数目。BrdU、波形蛋白和肌球蛋白的双重标记能够辨别新的毛细胞的数目与新的支持细胞的数目。在哺乳动物中，科尔蒂器支持细胞增殖和听觉毛细胞增殖的基线是零，从而更容易使用单向ANOVA由少数观察事件达到统计学显著性

实施例7：豚鼠中耳毒性损伤和/或p27^Kip1反义处理后听觉功能的评估

在豚鼠中在耳毒性损伤和/或p27^Kip1反义处理后测试听性脑干反应(ABR)。在相同动物内随时间比较ABR阈值，并且在来自相同或不同组(手术前和手术后)的动物间进行比较。通过每种刺激频率和强度的变化的单向分析(ANOVA)来测定显著性。对于p值<0.05，认为差异在统计上是显著的。先前的研究显示这种手术不削弱手术后的ABR反应。

为了记录得到的ABR，用阿佛丁(0.2ml/10g体重/肌肉内，使用1.2％储液)麻醉豚鼠。将有效电极置于外耳道附近的皮下(0.1mm银线；Narishige)。将硬脑膜参比电极置于接近前囱点钻的洞中(或将插入耳机放入耳道并用外科带将导声管固定在耳廓上)。将地极(groudelectrode)(Ag/AgCl₂球)固定在背上。声音刺激或是持续100μs的宽带滴答声或是10ms的单音脉冲(1ms升/降时间)。将豚鼠置于声音衰减室内(TDT模型AC-1)。通过Auditory Evoked ResponseWorkstation(SmartEP；Intelligent Hearing System)来测量和记录应答。向豚鼠呈送由20dB增至85dB(步长5dB)的刺激强度系列，滴答声和单音脉冲刺激都是如此。对于单音脉冲，还使用恒定强度50dB的刺激频率系列(1、2、4、8、16、32Hz)。刺激以5次/秒重复，并将512次试验值平均。阈值定义为能够引发可重复的且视觉上可检测的ABR的最低强度。

实施例8：用硫酸阿米卡星治疗的p27杂合子小鼠中听觉功能的改进

与本文表2报道的实验中描述的小鼠相同方式处理实验动物，不同的是在本实施例中阿米卡星治疗四周后有一个额外的恢复时间点。使用置于用异氟烷麻醉的小鼠头上三个点的皮下记录电极，通过听性脑干反应(ABR)来测量听觉功能。通过发送不同声强(强度以分贝计)的单一频率来测量声强阈值。引发ABR需要的声强越高，听觉阈值越高，即听觉功能越差。图3-6所列数据显示了8个p27杂合子中5个的听觉改进(p<0.001)。

在本文表2中，根据BrdU标记和形态学标准的评估，10个p27杂合子中的5个显示内耳细胞繁殖性再生的证据。这些数据显示大多数BrdU标记细胞是支持细胞而非毛细胞。因此，p27杂合子中改进的听觉功能可能要归功于单独的支持细胞再生，或联合毛细胞再生。

实施例9：小鼠科尔蒂器培养系统中基因传送和基因表达的脂转染法

科尔蒂器的脂转染采用由出生后7-14天小鼠获得的、在体外培养总计多达8天(DIV)的耳蜗外植体。在由Neurobasal培养基组成并添加B27补料(Gibco)的合成培养基中培养培养物。将培养物暴露于选择性杀死内耳感觉毛细胞的氨基糖苷类抗生素(1mM硫酸新霉素达48小时)。然后测试Perfect Lipofection Kit(InVitrogen)的八种不同脂质组合。在6小时内传送编码β-半乳糖苷酶报道基因(由CMV立即/早期基因启动子驱动)的细菌质粒(InVitrogen)。将培养物进行醛固定，并使用x-gal组织化学对β-半乳糖苷酶表达进行处理。在支持细胞中发现x-gal标记(在曾经包含毛细胞的感觉上皮区域中每1000μm长度有54.3+/-15.3个标记细胞，而在未受损的组织中每1000μm长度有5-10个标记细胞)。

考虑到检测β-半乳糖苷酶表达的劳动、β-半乳糖苷酶编码构建物的大小(即4.1kbp)和这种技术与其它期望ICC流程的相容性较低，用编码绿色荧光蛋白(GFP；Clonetech)的质粒脂转染培养物。GFP检测需要标准FITC滤镜组(最大激发488nm，最大发射509nm)，而且已经使用AAV载体系统成功地转染到耳蜗毛细胞、支持细胞和神经元中。

使用多种商品化脂转染试剂(即FuGENE Transfection Reagent；Boehringer-Mannheim)脂转染由衍生自我们的繁殖群体的P7-P14瑞士Webster小鼠建立的科尔蒂器培养物。将这些效率与使用InVitrogen试剂盒得到的转染效率进行比较。通过对科尔蒂器内沿外植体中部1000μm长度的GFP阳性细胞进行计数，测定了优良的脂转染试剂和优良的脂质对DNA比率(3∶1、6∶1、9∶1)。使用配备CCD数码相机的Nikon表面荧光显微镜显现细胞，CCD数码相机将图像直接输出到成像软件程序中，并在其中进行细胞计数。

然后将对毛细胞的氨基糖苷类抗生素损害联合随后的脂转染。施用含1mM硫酸新霉素(Sigma)的培养基，在48小时培养期中杀死毛细胞。与衍生自新生小鼠的培养物不同，已经发展了听觉功能的两周龄小鼠更易于受到这种浓度的新霉素的影响，根据钙结合蛋白免疫反应性和塑料切片分析的测定，毛细胞丧失超过95％。用GFP编码质粒脂转染剩余支持细胞达6小时。漂洗培养物，并在新鲜培养基中继续培养1-4DIV，总计3-6DIV。将培养物进行醛固定，并直接在表面荧光下显现GFP。数份报告证明醛固定后GFP荧光的丧失。这可能令使用商品化GFP抗体(Clonetech)来增强脂转染细胞的荧光成为必要。

实施例10：小鼠内耳的切除和体外培养

以如下方式切除小鼠内耳。将出生后7-14天的瑞士Webster小鼠去头，并将它们的头颅在70％乙醇中浸泡5分钟消毒。在无菌条件下，沿中矢轴将头颅切成两半，并置于35mm塑料培养皿(Nalge NuncInternational，2000 North Aurora Road，Naperville，IL 60563)中的3ml培养基(Neuralbasal^TM培养基，pH7.4；Gibco)中。使用外科镊，显现内耳骨迷路，并与颞骨分离。切除上面的结缔组织、镫骨、面神经和镫骨动脉。使用细镊，穿过侧耳蜗壁的顶部转角戳出一个直径大约2mm的小孔。这个手术生成的管道以及耳蜗卵形开口和圆窗容许培养基容易的扩散到充满流体的内耳中。

通常，将以上述方式切除并制备的内耳转移至HARV^TM或CCCV^TM容器，其中装有50或55ml Neuralbasal^TM培养基且添加了N2或B27补料(都是由Gibco BRL销售的，产品目录编号17504-036)、10U/ml青霉素和.25μg/μl两性霉素。B27补料是以50X浓缩液销售的，而使用时的工作浓度是0.5X(如向55ml Neuralbasal^TM培养基中添加550μl 50X B27储液)。N2补料储液是100X，而使用时的工作浓度是1X(如向55mlNeuralbasal^TM培养基中添加550μl 100X N2储液)。然后将容器置于组织培养箱中，设置是37℃和95％空气/5％CO₂环境。然后将容器以39rpm旋转24-168小时。每48小时更换50％培养基。在一个容器中成功培养了少至2个、多至12个内耳。

为了损害内耳感觉毛细胞，将内耳置于含1mM硫酸新霉素(Sigma，P.O.Box14508，St.Louis，MO63178)的Neuralbasal^TM/N2或B27培养基中达24-48小时。该培养期后，用不含新霉素的培养基完全替换上述培养基。

实施例11：培养基

表5显示了由Gibco销售的Neuralbasal^TM培养基(1X)的组成。所有浓度指工作浓度，即用于将充满流体的感觉器官孵育的培养基中各种成分的浓度。

表5：Neuralbasal^TM培养基的组成

可以向Neuralbasal^TM培养基中添加下列抗生素：两性霉素试剂(两性霉素B，0.25μg/ml和脱氧胆酸钠，0.25μg/ml，由GibcoBRL销售，产品目录编号17504-036)、青霉素G(10U/ml，由Sigma销售，产品目录编号P3414)、硫酸新霉素(1mM，由Sigma销售，产品目录编号N6386)。Neuralbasal^TM培养基还可添加L-谷氨酰胺(2mM)。

实施例12：长期培养过程中感觉上皮活力的测定

在本发明一个方面的实践中，通过旋转培养容器而提供的微重力环境容许将内耳感觉上皮维持延长的培养期(>168小时)，而感觉毛细胞或非感觉支持细胞无显著退化或丧失。通过用针对F-肌动蛋白(鬼笔环肽-FITC)的探针(它标记感觉和非感觉细胞的表面)和针对钙结合蛋白(一种钙结合蛋白质)的毛细胞特异抗体标记感觉上皮，获得了证明感觉毛细胞在延长培养过程中持续活力的数据。在表面荧光显微镜下对这两种标记物进行检测和照相。

截面切片资料指示内耳感觉上皮的正常细胞结构得到维持。例如，科尔蒂器具有数个充满流体的空间(称为Corti氏通道)和Nuel氏空间，它们是正常听觉功能所必需的。这些空间出现于毛细胞和支持细胞之间，而且在延长的培养期后得到维持。在正常重力环境中(即内耳漂浮在不旋转的培养容器中)，感觉上皮开始退化。若不进行旋转，则在24小时内毛细胞或是完全缺失或是表现为经历多种细胞死亡末期。48小时后，支持细胞完全缺失，或者存在但完全丧失Corti氏通道和Nuel氏空间。旋转容器能够预防这种退化并维持正常的细胞结构。

虽然已经例示和描述了本发明的优选实施方案，但是可以理解，可以在其中进行多种变化而不违背本发明的精神和范围。

要求独占性所有权或特权的本发明实施方案定义如下：

Claims (14)

1.选自抗生素的化学试剂在制备第一药物中的应用，其中所述第一药物用于破坏内耳感觉毛细胞，从而促进由与所述受损的内耳感觉毛细胞接触的支持细胞形成一个或多个新的内耳感觉毛细胞，并且其中所述第一药物与第二药物联合使用，该第二药物包含至少一种与编码哺乳动物p27Kip1的mRNA分子的部分互补的核酸分子，其中所述第二药物被导入所述内耳支持细胞以进一步刺激新内耳感觉毛细胞的形成；其中所述抗生素是氨基糖苷。

2.权利要求1的应用，其中所述支持细胞选自HenSen氏细胞、Deiter氏细胞、内柱细胞、边缘细胞和外柱细胞。

3.权利要求1的应用，其中当所述第一药物在体外使用时，抗生素的浓度为0.01mM-10mM。

4.权利要求1的应用，其中当所述第一药物在体内使用时，抗生素的浓度为100毫克/千克/天-1000毫克/千克/天。

5.权利要求1的应用，其中所述第一药物适于通过注射递送至内耳。

6.权利要求1的应用，其中所述第一药物适于通过插管递送至内耳。

7.权利要求1的应用，其中所述至少一种核酸分子是至少一种反义核酸分子。

8.权利要求7的应用，其中所述至少一种反义核酸分子能够在严紧条件下与编码哺乳动物p27Kip1的核酸分子杂交。

9.权利要求8的应用，其中所述至少一种反义核酸分子能够在高于2X SSC、55℃的杂交严紧性下与包含SEQ ID NO：8的核酸分子发生杂交。

10.含有抗生素和至少一种与编码哺乳动物p27Kip1的mRNA分子的部分互补的核酸分子的组合物在制备药物中的应用，其中所述药物用于改善内耳听觉功能。

11.含有至少一种与编码哺乳动物p27Kip1的mRNA分子的部分互补的核酸分子的组合物在制备药物中的应用，其中所述药物用于促进从支持细胞形成一个或多个新的内耳感觉毛细胞。

12.权利要求11的应用，其中所述组合物用于制备促进从支持细胞形成一个或多个新的内耳感觉毛细胞的药物，其中所述支持细胞已经被选自抗生素、化疗剂、聚L-赖氨酸和氯化镁的化学试剂损伤。

13.权利要求11的应用，其中所述至少一种核酸分子在严紧条件下与编码哺乳动物p27Kip1的核酸分子杂交。

14.权利要求13的应用，其中所述至少一种核酸分子在高于2XSSC、55℃的杂交严紧性下与包含SEQ ID NO：8的核酸分子杂交。

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