CN1429271A - 具有增强的分泌活性的谷氨酸棒杆菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌菌株，其新分离和鉴定的secD和/或secF基因被遗传修饰而使得该菌株分泌增强。本发明还这些基因的蛋白质和多核苷酸序列，含有至少一个这些基因的质粒以及所述细菌菌株在生产期望物质或在一个报道系统中的应用。

Description

具有增强的分泌活性的谷氨酸棒杆菌菌株

本发明涉及一个谷氨酸棒杆菌菌株，其天然基因secD和secF被首次鉴定、分离并且测序，还涉及这些新基因在基因表达及基因序列方面的遗传修饰，以及这些遗传修饰菌株产生期望的物质的用途及在蛋白质转运的报道系统中的用途。

穿越细菌细胞质膜的蛋白质输出主要遵循普遍存在的分泌途径(GSP)。蛋白质转运被一系列跨膜的异三聚体催化，其由蛋白质SecY，SecE和SecG组成，其组成方式是三个SecYE二聚体装配在推定的孔周围。与对细胞存活必不可少的SecY和SecE相反，SecG对于SecYE环结构的形成显然不是必要的(Economou，A.(1999)，微生物趋势.7，315-319)。但它有助于SecA的功能，从而促进蛋白质的分泌(Economou，A，Pogliano，J.A.，Beckwith，J.Oliver，D.B.和Wickner，W.，(1995)，细胞83，1171-1181)。必需的膜外蛋白质SecA是转运的机械推动者，其以二聚体分子存在，其羧基末端结合SecYEG复合物(Economou，A.(1999)，微生物学趋势.7，315-319)。ATP水解时SecA通过环状插入和解插入驱动前蛋白转运(Lill，R.Dowhan，W.and Wickner，W.，(1990)，细胞60，259-269)且这种作用受跨越膜的质子动力的强烈促进(Shiozuka，K，Mitzushima，S.和Tokuda，H.(1990)，J.Biol.Chem.264，18843-18847)。辅助性移位酶亚基SecD和SecF促进了蛋白质以不同的方式输出：(i)它们调节SecA的膜环化(Duong，F and Wickner，W.(1997)，EMBO J.16，4871-4879)，(ii)它们促进带有缺陷信号序列蛋白质的输出(Pogliano，J.A.和Beckwith，J.，(1994a)，EMBO J.13，554-561)，(iii)它们刺激质子动力驱动的蛋白质转运(Wickner，W.和Arkowitz，R.A.(1994)，EMBO J.13，954-953)并且(iv)它们在膜上释放成熟蛋白(Gardel，C.，Johnson，K.，Jacq A.和Beckwith，J.，(1990)，EMBO J.16，3209-3216)。迄今为止仅在革兰氏阴性菌发现过分子伴侣SecB(Fekkes，P.和Driessen，A.，(1999)，微生物学分子生物学回顾.63，161-173)。

革兰氏阳性，不形成孢子的土壤细菌谷氨酸棒杆菌对生产精细化工产品具有特别重要的意义(Wohlleben，W.，Muth，G.和kalinowski，J.(1993)，微生物遗传工程，pp.83-133，A.Puhler编辑，纽约，Weinheim)，其细胞壁蛋白质是主要的分泌产物(Joliff，G.，Mathieu，L.，Hahn，V.，Bayan，N.，Duchiron，F.，Renaud，M.，Chechter，E.和Leblon，G.(1992)，分子微生物学，6；2349-2362)。由于缺乏胞外蛋白酶活性同时具有大量分泌蛋白质的能力，谷氨酸棒杆菌是生产异源胞外蛋白质的理想宿主，如生产来自粪肥纤维单孢菌的纤维素酶(Paradis，F.W.，Warren，R.A.J.，Kilburn，D.G.和Miller Jr.，R.C.，(1987)，基因61，199-206)，羊γ干扰素(Billman-Jacobe，H.，Hodgson，A.L.M.，Lightowlers，M.，Wood，P.R.和Radford，A.J.(1994)，环境微生物学的应用60，1641-1645)和来自S hyicus的脂肪酶以及来自金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(Liebel和Sinskey，美国专利4,965,197)。

迄今为止只有通过优化异源蛋白质的表达来促进谷氨酸棒杆菌对异源蛋白质的分泌。因此将异源蛋白质与谷氨酸棒杆菌的信号序列融合(Liebel和Sinskey，美国专利4,965,197；Joliff等，专利号.FR 2,679,922)。

对谷氨酸棒杆菌的几个GSP基因已经进行了克隆和测序，其中包括secY和secA基因(Kobayashi，M.，Fugono，N.，Asai，Y.，Inui，M.，Vertes，A.A.，Kurusu，Y.和Yukawa，H.(1994)，基因139，99-103；基因分析和生物分子工程15：-13)，secG(GenBank D14162)和secE(GenBank AF130462)。然而谷氨酸棒杆菌的编码辅助蛋白secD和secF的基因尚未确定。

本发明的目的是提供一种能够大量生产容易与生产源分离的期望物质的一种手段，同时也提供一种能够检测所生产蛋白质转运的系统。

通过一种遗传修饰的细菌菌株谷氨酸棒杆菌可以满足这一目的，所述遗传修饰至少涉及基因secD和secF之一。

迄今为止在分析的所有细菌物种中，sec基因的染色体排列是非常保守的(Siefert，J.L.，Martin，K.A Abdi，F.，Widger，W.R & Fox，G.E.(1997)，分子进化杂志45：467-472)，特别是secD和secF基因直接相邻，如在大肠杆菌(Pogliano，J.A.和Beckwith，J.，(1994a)，EMBO J.13，554-561)或结核分枝杆菌中(Cole，S.T.，Brosch，R.，Parkhill，J.，Garnier，T.，Churcher，C.，Harris，D.，Gordon，S.v.，Eigelmeier，K.，Gas，S.，Barry，E.E.3^rd，Tekaia，F.Badcock，K.，Basham，D.，Brown，D.，等(1998)，自然6685 537-544)。

谷氨酸棒杆菌的secD大小为1911bp。同源性数据和可能的Shine-Dalgamo序列AAGGA表明该基因起始于罕见的起始密码子TTG，该基因编码计算分子量为67.689，等电点为4.52，由637个氨基酸组成的蛋白质。据HMMTOP分析(Tusnady，G.E.和Simon，I.，(1998)，分子生物学杂志283 489-506)和6个存在于所有已知secD蛋白的保守基序D1-D6(Bolhuis，A.，Broekhuizer，C.P.，Sorokin，A.，vanRoosmalen，M.L.，Venema，G.，Bron，S.，Quax，W.J.和van Dijl，J.M.(1999)，生物的化学杂志273，21217-21224)预测，该蛋白具有不规则的分布的6个推定的跨膜区域，并具有371个残基的细胞质外的环。谷氨酸棒杆菌和结核分枝杆菌secD的推导的氨基酸序列对比(图2a)表明具有41％的同源性，61％的相似性(Myers，G.和Miller，W.，(1988))CABIOS 4，11-17)，但这两个蛋白质并非全长同源。只有具有5个跨膜区域的C末端部分和棒杆菌secD的6个短型D1-D6是高度保守的，细胞质外环和蛋白质C端的延伸部分与分枝杆菌secD蛋白具有较少的保守性。

谷氨酸棒杆菌的secF由1209bp组成，起始于secD的终止子之后5个碱基，其推定的Shine-Dalgarno序列AGGAG是secD 3’端的一部分。secD的终止密码子TAG和secF的起始密码子ATG之间间隔两个核苷酸。具有403个氨基酸残基的该种蛋白质显示其计算分子量为43.664，理论等电点为5.07。其结构与secD蛋白相似。其具有6个跨膜区和95个残基的细胞质外环，但是它的N端较分枝杆菌的secF(图2b)短。与结核分枝杆菌secF对比，显示出43％的同一性和60％的整体相似性(Myers，G.和Miller，W.，(1988)CABIOS 4，11-17)，但与SecD类似，该蛋白质并不是在其全序列上保守。与SecD类似，仅仅是含有跨膜结构域和在所有SecF蛋白中均存在的4个区域F1-F4(Bolhuis，A.，Broekhuizen，C.P.，Sorokin，A.，van Roosmalen，M.S.，Venema，G.，Bron，S.，Quax，W.J.和van Dijl，J.M.(1999)，生物的化学杂志273，21217-21224)的部分具有高保守性。通过指纹扫描(Attwood，T.K.，Flower，D.R.，Lewis，A.P.，Mabey，J.E.，Morgan，S.R.，Scordis，P.，Selley，J.和Wright，W.(1999)，核酸研究27，220-225)分析SecF的氨基酸序列，发现两个可能与SecY作用的位点(图2b)具高度保守性，它们是跨膜区域I和VI的一部分。

SecD的蛋白序列示于SEQ ID NO.3，由多核苷酸序列SEQ IDNO.1编码。SecF的蛋白序列示于SEQ IN NO.4，由多核苷酸序列SEQID NO.2编码。

本发明内容中的“物质”可以是细菌途径(分解或代谢途径)产生的任何产物，优选地，“物质”选自氨基酸，寡肽，多肽和蛋白质。物质也可是引入的异源基因的产物或者可以由所述异源基因产物产生。

本发明的蛋白质的“同源蛋白质”或“同源氨基酸序列”在本申请中意指一种氨基酸序列，其与本发明的蛋白质之一具有至少70％，优选80％，更优选90％的氨基酸同一性而且其中取代的氨基酸优选为同源氨基酸取代。“同源”氨基酸指具有相似的疏水性，电荷和空间性质等特性。

“功能性突变体”在本发明中的是指具有SEQ ID NO.3或4氨基酸序列的蛋白质，其中一个或几个氨基酸以人工的或自然的方式被具有不同特性的氨基酸所取代，然而，如本发明描述的实施方案中涉及的在三维结构结构域，功能行为或效率方面，蛋白质整体上具相似特征。

在本说明书中“片段”的含义是指包含一种同源蛋白质或这些蛋白质之一的一种功能性突变体的SEQ IN NO.3或4的氨基酸序列部分的多肽。优选的片段是功能性片段，即它们能够有效地参与分泌或本申请所描述的报道系统。蛋白质或整个序列的片段也可是包含其它蛋白序列的融合蛋白的一部分，其加强表达或定向的水平或定位。

为了获得蛋白质产生和/或分泌加强型的谷氨酸棒杆菌菌株，支持生产和分泌的基因可被调节，结果产生了本发明的遗传修饰的菌株。“修饰”包括基因的突变，多核苷酸的缺失和插入，也包括基因彼此间或基因与启动子之间的重排，恰当的启动子的选择，调节蛋白质的表达，优选增强分泌蛋白的表达，复制基因等等。修饰支持蛋白产生和分泌的基因可位于基因中，互相以顺式或反式位置排列，修饰可以整合入染色体中或仅保留在质粒中。

在本发明的一个优选实施方案中，至少一个通常分泌途径的蛋白质较野生菌株的表达是过表达的，导致细菌的蛋白质分泌增加。优选的，至少蛋白SecD和SecF之一是过表达的，更优选是二者同时是过表达的。

蛋白质的过表达可以通过例如至少将基因SecD和/或SecF之一置于强启动子控制之下，优选的是将该基因插入一个表达载体中，所述表达载体转入细胞，或通过基因的复制的方式实现。

优选的，至少一种蛋白SecD和SecF过表达与至少一种必需的Sec蛋白(SecE，SecY，SecA)的过表达相结合。

一种蛋白质的“过表达”意即这种蛋白质较野生型谷氨酸棒杆菌的天然表达具有更高的表达量。优选地，过表达是野生型菌株表达的1.5倍，更优选至少2倍。

用于过表达的含有若干sec基因组合的构建质粒如表1所示，质粒图谱示于图5-8。

   表1：谷氨酸棒杆菌菌株和质粒菌株/质粒             相关基因型                        文献菌株：C.g.                ATCC13032的限制性缺陷突变体         Bielefeld大学RES167              Δ(cglRI-cglRII)C.g.INT-D           RES167 secD∷pCR2.1，Km^R           本研究C.g.INT-F           RES167 secF∷pCR2.1，Km^R           本研究C.g.INT-G           RES167 secG∷cmx.Cm^R               本研究C.g.AMY2            RES167 dciAE∷pIAmy2，Tc^R，        本研究

                淀粉酶排泄试验菌株质粒：pCR2.1              克隆PCR产物的载体，Ap^R，Km^R       InvitrogenpLW60               携带dciAE片段的pK18mob              Wehemier等(1998)pInsD               携带secD片段的pCR2.1                本研究pInsF               携带secF片段的pCR2.1                本研究pK18mobsacB         可移动的克隆载体，sacB衍生物，Km^R  Schafer等(1994)pEC31               含有pTP10的cmx的pSVB31，Cm^R        Bielefeld大学pInsG               携带secG∷cmx的pK18mob-sacB         本研究pXT99A              大肠杆菌表达载体，P_trc，Tc^R       Bielefeld大学pEC-XK99A           大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌

                穿梭表达载体，P_trc，Km^R           Bielefeld大学pEC-XT99A            大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌

                 穿梭表达载，体P_trc，Tc^R         Bielefeld大学pSecD                在P_trc下游携带secD的pEC-XT99A    本研究pSecG                在P_trc下游携带secG的pEC-XT99A    本研究pSecDF               在P_trc下游携带secD secF

                 的pEC-XK99A                        本研究pSecEDF              在P_trc下游携带secE，secD secF

                 的pEC-XK99A                        本研究pSecYDF              在P_trc下游携带secY，secD secF

                 的pEC-XK99A                        本研究pULMJ95              大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭

                 载体，amy，Km^R                    Cadenas等(1996)pAmy                 在P_trc下游携带amy

                 的pEC-XT99A                        本研究pIAmy2               在P_trc下游携带amy dciAE-片段

                 的pXT99A                           本研究

本发明的一个优选实施方案是用质粒pSecD转化的谷氨酸棒杆菌菌株。

本发明的另一个优选实施方案是用质粒pSecDF转化的谷氨酸棒杆菌菌株。

本发明的一个特别优选的实施方案是分别用质粒pSecEDF或pSecYDF转化的谷氨酸棒杆菌菌株。

本发明的细菌菌株除了所描述的sec基因之一的遗传修饰外还包括导致增强蛋白质分泌的另外的修饰。特别的，本发明的细菌菌株包括至少一个另外的异源基因，优选地编码一种蛋白质，所述蛋白应被大量产生。因此，该异源基因导入sec基因已被遗传修饰的本发明的细菌菌株，或含有所需基因的已经构建的细菌菌株如本文所述对sec基因进行遗传修饰。

在基因修饰过程中质粒的引入可以采用本领域熟知的任何方法进行，如转染，注射，ballistic missile，病毒载体，电穿孔法，氯化钙法和热休克法。

本发明的细菌菌株特别适于氨基酸，肽或蛋白质的生产，因为该菌株可以大量分泌这些物质，因此这些物质可以直接从培养基(上清夜)中分离出来而无须损伤细胞。

本发明的细菌菌株可以进一步应用到报道系统。这个报道系统可以报道基因的调节，蛋白质的表达，蛋白质的转运，或者基因表达的可诱导性。优选的，在该报道系统中，产生的蛋白质能够穿过细胞壁转运，凭借这种方式很容易在上清夜中确定它们。

该报道系统的一实施方案中，谷氨酸棒杆菌天然蛋白质的蛋白表达可以通过分泌蛋白质的蛋白质鉴定确定。

报道系统的另一个实施方案中，编码一个标记蛋白的异源标记基因被转入本发明的细菌菌株。

为了检测基因的调节，标记基因被置于一个感兴趣的启动子“之后”，可天然地控制所检测的基因。通过这种构建，可确定所检测基因如何以及在怎样的状况下表达，获得关于此基因的调节结论。

相似的构建包括进一步调节基因元件，从而产生一可确定感兴趣基因的基因表达的可诱导性的系统。

在所有的实施方案中，蛋白质鉴定可以采用本领域熟知的任何方法进行，如测定酶活性，聚丙烯酰胺凝胶电泳，测序，免疫学方法亦即Western印迹法或色谱法。

将一或多个异源基因导入本发明细菌菌株使该细菌细胞的生长加快，从而使应用本发明的细菌菌株生产蛋白质的能力被大大加强了。优选的，异源基因能够使细胞利用通常不被该菌株所能利用的外部能源。所述的外部能源包括几种糖类，氨基酸，肽，碳水化合物，脂肪酸，有机聚合物，无机离子和光能。

一个优选的外部能源是淀粉。可将本发明的细菌菌株例如导入一异源淀粉酶基因以转化使其以淀粉作为唯一能源进行。

本发明的一个特别优选的细菌菌株是谷氨酸棒杆菌RES167菌株，其被转入质粒pSecYDF和pIAmy2。

附图简介

图1

图示结核分枝杆菌SecD/SecF区域(a)的染色体组织，与谷氨酸棒杆菌相同区域(b)比较。图中，拯救载体及用于质粒拯救的限制性酶用括号括起来，克隆所用酶用(*)表示。

图2

谷氨酸棒杆菌与结核分枝杆菌的SecD(a)和SecF(b)的推导的氨基酸序列的比较。相同的氨基酸(*)与保守的替代(：)标记出来。存在于所有已知的SecD和SecF蛋白中的保守区域D1-D6和F1-F4被框起来。通过指纹扫描的氨基酸序列分析发现(Attwood等，1999，如上)两个可能的SecY的与SecF相互作用的位点用黑杠标记。六个推定的SecD和SecF的跨膜区域用灰色阴影表示。所有蛋白质跨膜结构域用网站HMMTOP预测(Tusnady和Simon，1998，如上)。

图3

过表达sec基因不同组合的谷氨酸棒杆菌AMY2的淀粉酶的分泌。将1.3×10⁶的细胞孵育16小时。对上清液的活性测定5次。定义1mU为每分钟每毫升内1nmol的还原糖。如果SecD和SecF过表达(pSecDF)则能检测到淀粉酶分泌的明显增加。在谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecEDF(pSecEDF)和谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecYDF(pSecYDF)中淀粉酶的活性大于谷氨酸棒杆菌AMY2(AMY2)的两倍。

图4

不同的谷氨酸棒杆菌株菌株即谷氨酸棒杆菌AMY2(■)，谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecEDF(/△)和谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecYDF(●)在淀粉作为唯一碳源的基本培养基中的生长。谷氨酸棒杆菌RES167(◆)没有生长迹象。分泌的淀粉酶对不溶性淀粉进行降解，使得光密度曲线在开始略微下降。

图5是pSecD的质粒图

图6为pSecDF的质粒图

图7为pSecEDF的质粒图

图8为pSecYDF的质粒图

图9为pAmy的质粒图

图10为pIAmy2的质粒图

下述实施例将视为在不限制本发明范围的情况下对本发明的解释。

本研究所有相关的细菌菌株和质粒都列在表1。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌通常培养在Luria-Bertani(LB)培养基中(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.(1989)，分子克隆：实验手册，第二版。冷泉港，纽约：冷泉港实验室)，温度分别为37℃和30℃。为了让谷氨酸棒杆菌在作为唯一碳源的淀粉上生长，采用了改良的基本培养基(Katsumata，R，Ozaki，A.，Oka，T.和Puruya，A.(1984)，细菌学杂志159，306-311)，它包括2％的可溶性淀粉(Sigma)取代了葡萄糖和酵母提取物。用于质粒筛选的抗生素为卡那霉素(50μg ml^-1和氯霉素(10μg ml^-1)。

实施例1

表达载体pXT99A和pEC-XK99A的构建

大肠杆菌表达载体pTRC99A(Amann等.，1988，基因69：301-315)用BspHI切割，并用Klenow片段处理。通过T4连接酶的连接，谷氨酸棒杆菌质粒pAG1(GeneBank Acc.No.AF121000)的四环素基因取代了氨苄青霉素基被插入，形成了pXT99A。连接混合物通过电穿孔进入大肠杆菌DH5αMCR。

为构建pEC-XK99A，将大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pTRC99A用BspHI切割，并用Klenow片段进行处理。用大肠杆菌质粒pBSL15(Alexeyev，M.，1995，生物技术18：52-56)卡那霉素抗性基因替代氨苄青霉素基因。如上描述的方式进行连接和电穿孔。于是获得质粒pXK99A。

通过BalI和PstI的限制性酶切，从质粒pGA1(Sonnen等，1991，基因107；69-74)获得一个包含一个谷氨酸棒杆菌复制子的3484bp片段。这个片段插入SmaI/PstI切割的载体pK18mob2(Tauch等，1998，微生物学档案169：303-312)。在再次连接后，所述插入的复制子片段的一893bp的片段用BamHI/XhoI切割删除并用Klenow片段处理载体片段。经过载体再连接，一个2645bp KpnI/PstI切割且Klenow处理的包含谷氨酸棒杆菌最小复制子的片段用NheI和Klenow聚合酶处理后插入质粒pXK99A。按上述描述的方法进行连接。电穿法导入谷氨酸棒杆菌后，分离并鉴定质粒pEC-XK99A。

实施例2

棒杆菌sec基因的分离和定性

利用大肠杆菌DH5αMCR(Grant，S.G.N.，Jessee，J.，Bloom，F.R.和Hanahan，D.(1990)，美国科学院院报87，4645-4649)作为质粒构建的宿主。以修改的碱裂解法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，分子克隆：实验室手册.第二版。冷泉港，纽约：冷泉港实验室)制备Ecoli的质粒DNA，所述方法为用含20mg的溶菌酶的裂解缓冲液HB1在37℃作用2小时。谷氨酸棒杆菌的染色体DNA按照Tauch，A.，Kirchmer，O.，Wehmeier，L.，Kalinowski，J.和Puhler，A(1994)，FEMSMicrobiol.Lett.123，343-347所描述的那样分离。DNA限制消化，琼脂糖凝胶电泳，Klenow处理以及连接均按标准程序(Sambrook等，1989，如前)进行。用于DNA操作的酶来源于Pharmacia或Boehringer公司并遵循制造者推荐的方法使用。利用Nucleotrap核酸提取试剂盒(Macherey-Nagel)从琼脂糖凝胶上分离DNA限制性片段。

所有用于PCR实验的引物列于表2。为了分离无启动子的SecY，使用合成的寡核苷酸sy1和sy2(表2)进行PCR产生该基因，所述引物根据GenBank entree D14162)推导出序列。小基因SecE(GenBank AF130462)和SecG(231bps，GenBank AJ007732)则通过染色体直接扩增，引物se1和se2用于secE，sg1和sg2用于secG。所有PCR产生的基因首先利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆入pCR2.1，EcoRI消化，在第二步再克隆入trc启动子控制下的IPTG可诱导的大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-XT99A上，最终生成质粒pSecY，pSecE和pSecG。

利用衍生自质粒拯救的序列的推导引物sd1和sd2对无启动子的secD进行PCR扩增，并如上述描述的方法进行克隆。

利用PCT-100热循环器(MJ研究公司)和TaqDNA聚合酶(Gibco-BRL)进行PCR反应。初始变性为94℃，2分钟，接着90秒变性，然后是在-5℃的引物依赖温度Tm(2AT+4GC)(Suggs，S.V.，Hirose，T.，Miyake，T.，Kawahima，E.H.，Johnson，M.L.，Itakura，K.和Wallace，R.B.(1981)，利用纯化基因的发育生物学，学术出版社，纽约，N.Y.PP.683-693)下退火90秒，72℃延伸90秒。循环32次，最后在72℃10分钟的延伸后停止。

采用电穿孔法(Tauch等，1994，FEMS Microbiol.Lett.123，343-347；Haynes和Britz，1989，FEMS Microbiol.Lett.，61 329-334)将质粒转入大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。

DNA测序由Institut fur Innovationstransfer GmbH(Bielefeld)完成。氨基酸相似性的研究由BLAST服务公司(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.(1990)，分子生物学杂志125，403-410)完成。利用CLUSTAL W程序(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.，(1994)，核酸研究22，4673-4680)进行蛋白质的对比。

在分类学上接近谷氨酸棒杆菌的结核分枝杆菌H37Rv菌株中，二肽转运蛋白编码基因dciAE(图1a)在secD和secF的下游。谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032)dciAE同源物在研究rel基因(Wehmeier，L.Schafer，A.，Burkowski，A.，Kramer，R.，Mechold，U.，Malke，H.，Puhler，A.und Kalinowski，J(1998)微生物学144，1853-1862)以利用染色体拯救技术分离基因secD和secF这一研究中已部分地测序，用EcoRI和BamHI消化后衍生自质粒pLW60(Wehmeier等，1998)的dciAE基因的0.8kb的片段克隆入pCR2.1，所得质粒电穿孔后通过同源重组整合到谷氨酸棒杆菌的染色体中。总染色体DNA从所得菌株中分离，用EcoRV和SspI消化，再连接并转移至大肠杆菌DH5αMCR。用EcoRV和SspI对整合载体的拯救产生了含有插入了dciAE和上游染色体区的9751bp片段的质粒pCR2.1(图1)。插入的片段测序通过引物步移(primer walking)进行。通过DNA的测序分析，包括secD和secF的8个完整的和一个不完整的orf(开放阅读框架)被鉴定出来。

SecD和secF的序列分别示于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。表2扩增谷氨酸棒杆菌sec基因的PCR引物

基因	5′-引物	3′-引物
			SecA片段	saf1：5′-CGCGACAAGGACTACATCGT-3′	saf2：5′-GAGATGTCTGCGGATTCGAG-3′
SecY片段	syf1：5′-TGAGGAGGCCAGGAGGCCAG-3′	syf2：5′-AACCACCGTACTGACGACGA-3′
			SecY	sy1：5′-TTAAGTGCTGAGGAGGCCAG-3′	sy2：5′-TTATCAGCACCGGTAGTTCC-3′
SecE	se1：5′-TGGATGAGTAGTGATTTAGA-3′	se2：5′-GATTCTGACTCCGTAGGTAG-3′
			SecE区	ser1：5′-CACCTGGCAGACGCACTCAA-3′	ser2：5′-AGCCGGAGTAGCACTGAATG-3′
SecG	sg1：5′-ACCTGGGTTCTCAAACGGCA-3′	sg2：5′-TTGTCGACCTGTTGTCTCCC-3′
			SecG区	sgr1：5′-TCCAGGCCTTCCTCACGCAA-3′	sgr2：5′-AGCTGCGAGAATCCAGGCTA-3′
SecD	sd1：5′-TTGTCTGGTTGATTGGAATT-3′	sd2：5′-TGAAGTTTCAGTCTGGGAAT-3′
			secD片段	sd1：5′-TGCTGTTGACAGGCGATCGT-3′	sdf2：5′-TCATCAGTGGTGCACTGCAT-3′
seeF片段	sff1：5′-GTACCAAGATGAGCATGCCA-3′	sdff2：5′-ATCGAACGCATGAAGGTCTG-3′

实施例3

质粒pSecDF，pSecEDF，pSecYDF的构建

携带有在一9751bp插入序列上的染色体secD和secF基因的质粒pCR2.1(实施例1)用SalI切割并通过凝胶电泳分离一个3275bp片段。将该片段插入pEC-XK99A，用SalI切割，生成质粒pSecDF。如上所述进行连接和对大肠杆菌DH5αMCR进行电穿孔，在含有50ug/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上进行细菌培养。

为分别构建pSecEDF和pSecYDF，对pSecDF用EcoRI切割，pSecE和pSecY(实施例2)也用EcoRI切割，然后包含secE和secY基因的片段被分离出来。包含secE和secY基因的EcoRI片段分别插入EcoRI切割的pSecDF，连接后分别生成pSecEDF和pSecYDF。

实施例4

谷氨酸棒杆菌RES167染色体sec基因的定向诱变

通过同源重组的基因破坏作用，构建一个限定的secD突变体。因此，利用推导的引物sdf1和sdf2(表2)对secD的一个609bp的内部片段(nt1200-1809)进行PCR扩增并且克隆入pCR2.1。所得质粒pInsD通过电穿孔转入谷氨酸棒杆菌并且只有通过同源重组进入染色体才能存在。基因的破坏经Southern杂交法证实。用一个内部的603bp(nt 346-949)的片段的引物sff1和sff2，以同样的方式构建一个secF突变菌株谷氨酸棒杆菌INT-F，生成质粒pInsF。关于secA和secY的突变，用引物saf1，saf2，syf1和syf2分别通过PCR扩增基因的内部片段并克隆进pCR2.1，但最终不能整合进染色体。

由于secG和secE较小，利用sacB系统，通过插入失活建立secG突变体，所述sacB系统通过同源重组(Schafer，A.，Tauch，A.，Jager，W.，Kalinowski，J.，Thierbach，G.和Puhler，A.，(1994)，基因145，69-73)能够实现等位基因交换的阳性选择。为此，用合成寡核苷酸sgr1和sgr2通过PCR产生具有中心secG的1.3kb的DNA片段，之后用SalI和XbaI通过pCR2.1克隆入质粒pXT99A。为了分离氯霉素抗性基因盒cmx，用SalI和HindIII消化载体pEC31，从0.8％的琼脂糖凝胶中分离出含cmx的2.0kb的片段。通过连接用Klenow处理的cmx和BspHI消化的质粒，将cmx整合入secG。所构建的质粒再次从大肠杆菌分离，含有secG∷cmx的3.3kb的片段用SalI和HindIII克隆入pK18mobsacB(Schafer等，1994)。这一pInsG载体整合到谷氨酸棒杆菌染色体中，所得菌株携带了修饰的secG区域和被载体序列分隔的野生型基因。质粒的切除可通过在含10％蔗糖的LB琼脂培养基上培养细胞进行选择(Schafer等，1994)。由于第二次交换事件，即恢复野生型基因排列或者引起仅携带破坏的secG等位基因的选择性氯霉素抗性菌株谷氨酸棒杆菌INT-G，使能生长在上述培养基上的细胞丢失了质粒。SecG的破坏通过Southern杂交法证实。

为了使secE被破坏，利用衍生自secE侧翼区域的引物ser1和ser2(Wehmeier，1999)对1.6kb DNA片段进行PCR扩增，在酶XbaI和HindIII作用下经pCR2.1克隆入pK18mobsacB。所得载体在secE基因内的BssHII单一位点被切割。Klenow处理，与pEC31的cmx片段连接，整合入谷氨酸棒杆菌的染色体。接下来的步骤按上述描述的方法进行，但没有发现双交换事件。

创建的突变菌株谷氨酸棒杆菌INT-D和谷氨酸棒杆菌INT-F(表1)在尺寸上增加了，示出了明显延长的滞后期并且没有达到液体培养基中野生型菌株的光密度。突变体的表型可通过质粒编码的完整sec基因互补(没有示出)。

实施例5

淀粉酶分泌报道系统的构建

构建产生淀粉酶的谷氨酸棒杆菌菌株，将载体pULMI95(Cadenas，R.F.，Fernandez-Gonzales，C.，Martin，J.F.和Fil，J.A.(1996)，FEMSMicrobiol.Lett.137，63-68)用EcoRI和Ecl136II进行消化，携带有灰色链霉菌IMRU3570的amy基因的一个2.1kb的片段克隆入IPTG诱导的trc启动子(Amman，E.，Ochs，B.和Abel，K.-J.(1988)，基因69：301-315)控制下的EcoRI和Ecl136II切割的大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-XT99A中。具有IPTG可诱导的淀粉酶表达的新的构建载体pAmy通过电穿孔转入谷氨酸棒杆菌。

对携带有淀粉酶基因一个染色体拷贝的谷氨酸棒杆菌，按照上述描述的步骤将amy克隆入大肠杆菌表达载体pXT99A。第二个步骤中，来自pLW60(Wehmeier等，1998)的dciAE的XbaI和HindIII基因片段克隆入所得amy载体的下游。新的非复制质粒pIAmy2通过电穿孔和随后的同源重组整合入谷氨酸棒杆菌的染色体中，产生谷氨酸棒杆菌AMY2菌株。

实施例6

淀粉酶的活性测定

为进行淀粉酶分析，谷氨酸棒杆菌被培养在含有1％酵母提取物(Difco)，1％肽胨和2％的可溶性淀粉(Sigma)的固体和液体TYPS培养基上。加入50nM的IPTG到TYPS培养基中诱导淀粉酶的产生。为了测定胞内淀粉酶的活性，用10mM的磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤生长在液体培养基的谷氨酸棒杆菌两次。为使细胞破裂，以速度为6使用Ribolyser(Hybaid)两次30秒。

用二硝基水杨酸溶解法(Miller，G.L.，1959，Anal.Chem.31，426-428)的改进法测定谷氨酸棒杆菌株上清的淀粉酶活性。在含有2％可溶性淀粉的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)中37℃测定30分钟。体积活性(mU)定义为每分钟每毫升内的还原糖nmol数。淀粉降解在琼脂板上用Lugol溶液染色确定。淀粉酶的活性可以通过菌落周围透明带观测到。

孵育3天后，谷氨酸棒杆菌AMY2琼脂板上的淀粉降解可观察到，同时培养上清的淀粉酶活性是45mU。谷氨酸棒杆菌AMY2，携带一个amy染色体拷贝，仅分泌相当于谷氨酸棒杆菌RES1167/pAmy产生的淀粉酶的12％。因此得出结论，每个谷氨酸棒杆菌细胞具有约8个拷贝的pAmy质粒。相对于野生菌株，所有产生淀粉酶的谷氨酸棒杆菌菌株都可以在以淀粉为唯一碳源的基本培养基中生长。因此淀粉酶的产生易于从谷氨酸棒杆菌的复制和整合系统两方面分析，所述系统是一个蛋白质分泌的充足的报道系统。

实施例7

GSP内的突变减少或者消除淀粉酶分泌

为了量化突变对蛋白质输出的影响，用复制型质粒pAmy转化谷氨酸棒杆菌INT-D和谷氨酸棒杆菌INT-F菌株。在固体培养基和液体培养基上测试淀粉的降解。在谷氨酸棒杆菌INT-D/pAmy和谷氨酸棒杆菌INT-F/pAmy菌株上未发现分泌。体积活性的测定类似于同样的表型，两个菌株均没有发现淀粉的降解。

由于另人惊奇的事实即分泌异源淀粉酶能力的完全消失，对谷氨酸棒杆菌的其他的sec基因进行突变。但如上述指出的，维持细胞活性必需的secA，secY和secE未能产生突变体。为了使secG突变，用氯霉素抗性盒cmx，经过sacB系统的两次交换使secG破坏，破坏的secG置换野生基因。所得突变菌株谷氨酸棒杆菌INT-G(表1)在允许的温度正常生长，但其细胞壁对SDS敏感(未示出数据)。所有的突变已被Southern杂交法证实。

与菌株谷氨酸棒杆菌INT-D和谷氨酸棒杆菌INT-F类似，用复制型质粒pAmy转化谷氨酸棒杆菌INT-G以分析基因破坏对于蛋白质输出的作用。淀粉降解的测定在固体和液体培养基上进行。谷氨酸棒杆菌INT-G/pAmy的淀粉酶分泌明显减少，与谷氨酸棒杆菌RES167/pAmy相比，这个突变菌株仅分泌谷氨酸棒杆菌RES167/pAmy输出的淀粉酶的21.5％。

这些菌株的细胞质中没有一个示出具有淀粉酶的活性。由此，我们推论完整的secD和secF是输出异源淀粉酶不可缺少的。SecG本身对蛋白质转运并不是必需条件但却对输出率有很大的影响。

实施例8

组合的sec基因的过表达增加了淀粉酶的分泌

既然secD和secF看起来是淀粉酶分泌的强影响因子，对secD和secF同时过表达对蛋白输出的影响进行检测。如上所述，将组合的secD和secF用SalI克隆入穿梭表达载体pEC-XK99A。用所得质粒pSecDF转化谷氨酸棒杆菌AMY2并且测定淀粉酶活性。如图3所示，secD和secF基因的同时过表达较谷氨酸棒杆菌AMY2增加分泌淀粉酶1.5倍。

为了分析辅助sec基因secD和secF与必需sec基因的平行过表达的效果，将secE和secY EcoRI克隆入pSecDE，产生如实施例3描述的质粒pSecEDF和pSecYDF。SecE和SecY被克隆，是由于已描述了它们在大肠杆菌中与SecD/SecF复合物相互作用(Sagara，K.，Matsujama，S.Mitzushima，S.，1994，细菌学杂志.176，4111-4116)。对淀粉酶分泌的测定揭示与谷氨酸棒杆菌AMY2(图3)相比谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecEDF的分泌增加了2.3倍，谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecYDF的分泌增加了2.5倍。

在固体培养基上测定淀粉酶的活性显示同样的发现。24小时后，谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecEDF的淀粉降解更多，而且谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecYDF的淀粉降解较谷氨酸棒杆菌AMY2具有更高的倍速。

在以淀粉为唯一碳源的基本培养基上生长反映了这些结果：不能将淀粉转换为代谢形式的谷氨酸棒杆菌RES167没有生长迹象。谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecEDF和谷氨酸棒杆菌AMY2/pSecYDF，表现最高的淀粉酶分泌，示出所有测试菌株中最快的生长并达到稍高的OD值。这表明在淀粉上的生长直接与淀粉酶的分泌相关。

                               序列表<110>德古萨股份公司<120>具有增强分泌活性的谷氨酸棒状杆菌菌株<130>000091 BT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1960<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>misc_feature<222>(34)..(1944)<223>secD<400>1ttgtctggtt gattggaatt gaaggagact ttcttggctc ggcaaaaaaa gagtgccgct 60agcgcctggg aacgatggcc aaaacgcgca atagcgttgt ttgtgctcat cgtcgttggt 120gtttatgcgt tggtgctgtt gacaggcgat cgttctgcca caccaaaatt gggtattgat 180ctgcaaggcg gaacccgagt gaccctcgtg ccgcaggggc aggatccaac tcaggaccag 240ctgaatcagg cacgcaccat tctggaaaac cgtgtgaacg gcatgggcgt ttcaggtgca 300agcgtggtcg ctgacggtaa cacgctggtg atcactgttc ccggggaaaa taccgcacag 360gcgcaatccc taggacagac ctcccagctg ctgttccgtc ccgttggtca ggcaggaatg 420cccgatatga ccacgttgat gccagagctg gaagagatgg ccaacaggtg ggttgaatac 480ggcgtcatca ccgaagagca ggcaaatgcc tccttggagg aaatgaacac cgctgttgca 540tcgaccactg cggtggaagg cgaagaagca actgagccag aacccgtcac cgtgtcggcg 600acccctatgg atgagccagc caactccatt gaggcaacac agcgacgcca ggaaatcacg 660gacatgctgc gcaccgaccg ccagtccacc gatcccactg tccagatcgc tgcaagttct 720ttgatgcagt gcaccactga tgagatggat cctttggccg gcaccgatga tccacgcctg 780ccattggtgg catgtgatcc agctgtaggt ggcgtgtatg tacttgatcc tgcacctttg 840ctcaacggcg aaaccgatga ggaaaatggt gcgcgcctaa ccggtaatga gatcgatacc 900aaccgtccca tcaccggtgg attcaacgcc cagtccggcc agatggaaat cagctttgcc 960ttcaaatccg gcgatgggga agaaggctct gcaacttggt cctctctgac cagccagtac 1020ctgcagcagc agatcgccat caccctggac tctcaggtga tttctgcacc cgtgattcag 1080tcagcaaccc ctgtgggttc tgcaacatcc atcaccggtg acttcactca aactgaagcc 1140caagatctgg cgaacaacct gcgctacggt gcattgcccc tgagcttcgc aggtgaaaac 1200ggcgagcgcg gcggaactac caccaccgtt ccgccatcac taggcgcagc atccttgaag 1260gccggactga tcgcaggcat cgtcggcatc gcgctggtcg ccatcttcgt gttcgcctac 1320taccgcgtct tcggattcgt ttccctgttc accctgtttg ccgcaggcgt gttggtctac 1380ggccttctgg tactgctggg acgctggatc ggatattccc tagaccttgc tggtatcgcc 1440ggtttgatca tcggtatcgg taccaccgcc gactccttcg tggtgttcta tgagcgcatc 1500aaggatgaga tccgtgaagg aagatccttt agatctgcag tacctcgtgc atgggaaagc 1560gccaagcgca ccatcgtcac aggcaacatg gtcactttgc tcggcgctat cgtgatttac 1620ttgctcgcgg tcggcgaagt caagggcttt gccttcaccc tgggtctgac caccgtattc 1680gatctcgttg tcaccttcct gatcacggca ccactggtta tcctggcatc acgcaaccca 1740ttctttgcca agtcatcggt caacggcatg ggacgagtga tgaagctcgt tgaagaacgc 1800cgcgccaacg gtgaattgga tgagcctgag tacctgaaaa agatccatgc caagaatgcg 1860gcagctgata aggcttccac tgacaattct tccactgaca attctgaagc acctggcacc 1920gatacgaacc aagaggagga gaagtagcca tgactgattc                       1960<210>2<211>1562<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>misc_feature<222>(22)..(1230)<223>secF<400>2ccaagaggag gagaagtagc catgactgat tcccagactg aatcactgtc aactcagagc 60gtaaaaccag ccaaaaaacg cagttggttc aacagcctct acaccggtga cggcggcatt 120gacttcatcg ccaaaaccaa actgtggtac tggatcaccg gcattttgct ggttatctcg 180atcctgttca tcgccatccg tggcttctcc ctgagcatcg atttccaggg cggtaccaag 240atgagcatgc cagcatcgga ttactccacc gaacaggtgg aggaaacctt tactgaagcc 300accggcatta ctccggaaat cgtgcagatc gtcggttccg gcgacgcccg caccctggag 360atctactccg agcgactcag cgatgaggat gtagaaaaag cccgcctggc gatctacgag 420gaataccaac ccctaaactc tgagggccag ccaagcccag atgccatcgg taattccacg 480gtgtcggaat catggggttc caccatcacc caacgcatgg tgttggctct gattgccttc 540ctggttattg cagcgatcta cattgctttc cgcctcgagc gtgaaatggc catcgccgcc 600atggcagcat tggttgttga cggcatcgtc atcgccggca tctacgccgt catcggcctc 660gaagtatccc cagcaaccgt catcggtctg ctcaccgtgc tgaccttctc catctacgac 720accgtcgtgg tctttgacaa ggtcagagaa aacaccgaag gcttcgaagg cagccgcaga 780cgaacctacg ccgaacaagc caacctggcg gtcaaccaga ccttcatgcg ttcgatctcc 840acgacaatca tctctgcact tccgatcatc gctttgatgg ttgtcgccgt ctggatgatg 900ggtgttggca ccctcaaaga cctcgcactg atccagctga tcggcgtcat cgaaggcacc 960ttctcctccg tcttcctggc aaccccactg ctggtcagcc tgaaaaaccg cctgagcaaa 1020accaaagcgc acaccgcttc cgttatgaag ttgcgcgacg gccaaagcac gcttatcgac 1080gccaccccac acaccaacgc cgacgcctcc gcgcacggca ccgaaagcga cactgacggt 1140gtgacccccg aagcacctgc aaaacgtaca gtaagcaaac ccattgtgga tgatcaccga 1200tcaagcggaa cctggcgacc aggcagaagc taaaccaatt ggagaacgaa gaaaaatccc 1260gcagactcgc gttctgcggg attttttttg tgcgtctatg actcacgatg ttcccaaacg 1320acgacttcac gtggtcgact tcagtcggat ttgccgtttt tatccagtga agtcggctca 1380tgagaagttg agcacgcgaa gtcgtaggtt gaggtctcgt aatctgcggt gtcgtaggtt 1440gagatgtcgc cgccttaagt tcgatttctc accttcgata cctcacgctc aatttcttat 1500gttcgagacc gctaggaaaa gcaccaaaaa ccgactgaaa ttgagtttgg gaaattgagc 1560gc                                                                1562<210>3<211>637<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>PROPEP<222>(1)..(637)<223>secD<400>3Met Ala Arg Gln Lys Lys Ser Ala Ala Ser Ala Trp Glu Arg Trp Pro1               5                  10                  15Lys Arg Ala Ile Ala Leu Phe Val Leu Ile Val Val Gly Val Tyr Ala

         20                  25                  30Leu Val Leu Leu Thr Gly Asp Arg Ser Ala Thr Pro Lys Leu Gly Ile

     35                  40                  45Asp Leu Gln Gly Gly Thr Arg Val Thr Leu Val Pro Gln Gly Gln Asp

 50                  55                  60Pro Thr Gln Asp Gln Leu Asn Gln Ala Arg Thr Ile Leu Glu Asn Arg65                  70                  75                  80Val Asn Gly Met Gly Val Ser Gly Ala Ser Val Val Ala Asp Gly Asn

             85                  90                  95Thr Leu Val Ile Thr Val Pro Gly Glu Asn Thr Ala Gln Ala Gln Ser

        100                 105                 110Leu Gly Gln Thr Ser Gln Leu Leu Phe Arg Pro Val Gly Gln Ala Gly

    115                 120                 125Met Pro Asp Met Thr Thr Leu Met Pro Glu Leu Glu Glu Met Ala Asn

130                 135                 140Arg Trp Val Glu Tyr Gly Val Ile Thr Glu Glu Gln Ala Asn Ala Ser145                 150                 155                 160Leu Glu Glu Met Asn Thr Ala Val Ala Ser Thr Thr Ala Val Glu Gly

            165                 170                 175Glu Glu Ala Thr Glu Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Ala Thr Pro Met

        180                 185                 190Asp Glu Pro Ala Asn Ser Ile Glu Ala Thr Gln Arg Arg Gln Glu Ile

    195                 200                 205Thr Asp Met Leu Arg Thr Asp Arg Gln Ser Thr Asp Pro Thr Val Gln

210                 215                 220Ile Ala Ala Ser Ser Leu Met Gln Cys Thr Thr Asp Glu Met Asp Pro225                 230                 235                 240Leu Ala Gly Thr Asp Asp Pro Arg Leu Pro Leu Val Ala Cys Asp Pro

            245                 250                 255Ala Val Gly Gly Val Tyr Val Leu Asp Pro Ala Pro Leu Leu Asn Gly

        260                 265                 270Glu Thr Asp Glu Glu Asn Gly Ala Arg Leu Thr Gly Asn Glu Ile Asp

    275                 280                 285Thr Asn Arg Pro Ile Thr Gly Gly Phe Asn Ala Gln Ser Gly Gln Met

290                 295                 300Glu Ile Ser Phe Ala Phe Lys Ser Gly Asp Gly Glu Glu Gly Ser Ala305                 310                 315                 320Thr Trp Ser Ser Leu Thr Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Gln Ile Ala Ile

            325                 330                 335Thr Leu Asp Ser Gln Val Ile Ser Ala Pro Val Ile Gln Ser Ala Thr

        340                 345                 350Pro Val Gly Ser Ala Thr Ser Ile Thr Gly Asp Phe Thr Gln Thr Glu

    355                 360                 365Ala Gln Asp Leu Ala Asn Asn Leu Arg Tyr Gly Ala Leu Pro Leu Ser

370                 375                 380Phe Ala Gly Glu Asn Gly Glu Arg Gly Gly Thr Thr Thr Thr Val Pro385                 390                 395                 400Pro Ser Leu Gly Ala Ala Ser Leu Lys Ala Gly Leu Ile Ala Gly Ile

            405                 410                 415Val Gly Ile Ala Leu Val Ala Ile Phe Val Phe Ala Tyr Tyr Arg Val

        420                 425                 430Phe Gly Phe Val Ser Leu Phe Thr Leu Phe Ala Ala Gly Val Leu Val

    435                 440                 445Tyr Gly Leu Leu Val Leu Leu Gly Arg Trp Ile Gly Tyr Ser Leu Asp

450                 455                 460Leu Ala Gly Ile Ala Gly Leu Ile Ile Gly Ile Gly Thr Thr Ala Asp465                 470                 475                 480Ser Phe Val Val Phe Tyr Glu Arg Ile Lys Asp Glu Ile Arg Glu Gly

            485                 490                 495Arg Ser Phe Arg Ser Ala Val Pro Arg Ala Trp Glu Ser Ala Lys Arg

        500                 505                 510Thr Ile Val Thr Gly Asn Met Val Thr Leu Leu Gly Ala Ile Val Ile

    515                 520                 525Tyr Leu Leu Ala Val Gly Glu Val Lys Gly Phe Ala Phe Thr Leu Gly

530                 535                 540Leu Thr Thr Val Phe Asp Leu Val Val Thr Phe Leu Ile Thr Ala Pro545                 550                 555                 560Leu Val Ile Leu Ala Ser Arg Asn Pro Phe Phe Ala Lys Ser Ser Val

            565                 570                 575Asn Gly Met Gly Arg Val Met Lys Leu Val Glu Glu Arg Arg Ala Asn

        580                 585                 590Gly Glu Leu Asp Glu Pro Glu Tyr Leu Lys Lys Ile His Ala Lys Asn

    595                 600                 605Ala Ala Ala Asp Lys Ala Ser Thr Asp Asn Ser Ser Thr Asp Asn Ser

610                 615                 620Glu Ala Pro Gly Thr Asp Thr Asn Gln Glu Glu Glu Lys625                 630                 635<210>4<211>403<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>PROPEP<222>(1)..(403)<223>secF<400>4Met Thr Asp Ser Gln Thr Glu Ser Leu Ser Thr Gln Ser Val Lys Pro1               5                  10                  15Ala Lys Lys Arg Ser Trp Phe Asn Ser Leu Tyr Thr Gly Asp Gly Gly

         20                  25                  30Ile Asp Phe Ile Ala Lys Thr Lys Leu Trp Tyr Trp Ile Thr Gly Ile

     35                  40                  45Leu Leu Val Ile Ser Ile Leu Phe Ile Ala Ile Arg Gly Phe Ser Leu

 50                  55                  60Ser Ile Asp Phe Gln Gly Gly Thr Lys Met Ser Met Pro Ala Ser Asp65                  70                  75                  80Tyr Ser Thr Glu Gln Val Glu Glu Thr Phe Thr Glu Ala Thr Gly Ile

             85                  90                  95Thr Pro Glu Ile Val Gln Ile Val Gly Ser Gly Asp Ala Arg Thr Leu

        100                 105                 110Glu Ile Tyr Ser Glu Arg Leu Ser Asp Glu Asp Val Glu Lys Ala Arg

    115                 120                 125Leu Ala Ile Tyr Glu Glu Tyr Gln Pro Leu Asn Ser Glu Gly Gln Pro

130                 135                 140Ser Pro Asp Ala Ile Gly Asn Ser Thr Val Ser Glu Ser Trp Gly Ser145                 150                 155                 160Thr Ile Thr Gln Arg Met Val Leu Ala Leu Ile Ala Phe Leu Val Ile

            165                 170                 175Ala Ala Ile Tyr Ile Ala Phe Arg Leu Glu Arg Glu Met Ala Ile Ala

        180                 185                 190Ala Met Ala Ala Leu Val Val Asp Gly Ile Val Ile Ala Gly Ile Tyr

    195                 200                 205Ala Val Ile Gly Leu Glu Val Ser Pro Ala Thr Val Ile Gly Leu Leu

210                 215                 220Thr Val Leu Thr Phe Ser Ile Tyr Asp Thr Val Val Val Phe Asp Lys225                 230                 235                 240Val Arg Glu Asn Thr Glu Gly Phe Glu Gly Ser Arg Arg Arg Thr Tyr

            245                 250                 255Ala Glu Gln Ala Asn Leu Ala Val Asn Gln Thr Phe Met Arg Ser Ile

        260                 265                 270Ser Thr Thr Ile Ile Ser Ala Leu Pro Ile Ile Ala Leu Met Val Val

    275                 280                 285Ala Val Trp Met Met Gly Val Gly Thr Leu Lys Asp Leu Ala Leu Ile

290                 295                 300Gln Leu Ile Gly Val Ile Glu Gly Thr Phe Ser Ser Val Phe Leu Ala305                 310                 315                 320Thr Pro Leu Leu Val Ser Leu Lys Asn Arg Leu Ser Lys Thr Lys Ala

            325                 330                 335His Thr Ala Ser Val Met Lys Leu Arg Asp Gly Gln Ser Thr Leu Ile

        340                 345                 350Asp Ala Thr Pro His Thr Asn Ala Asp Ala Ser Ala His Gly Thr Glu

    355                 360                 365Ser Asp Thr Asp Gly Val Thr Pro Glu Ala Pro Ala Lys Arg Thr Val

370                 375                 380Ser Lys Pro Ile Val Asp Asp His Arg Ser Ser Gly Thr Trp Arg Pro385                 390                 395                 400Gly Arg Ser

Claims (19)

1.遗传修饰的细菌菌株谷氨酸棒杆菌，其特征在于所述遗传修饰涉及该菌株secD和secF基因中的至少一种基因。

2.权利要求1的细菌菌株，其特征在于secD基因天然具有SEQID NO.1的序列或其同源序列，secF基因天然具有SEQ ID NO.2的序列或其同源序列。

3.权利要求1或2的细菌菌株，其特征在于遗传修饰选自突变，缺失，插入，基因之间的重排或基因与其启动子间的重排，通过选择启动子和基因复制控制基因的表达。

4.权利要求1至3任一项的细菌菌株，其特征在于与野生型谷氨酸棒杆菌相比，其secD和/或secF是过表达的。

5.权利要求1至4任一项的细菌菌株，进一步包含至少一种异源基因。

6.权利要求5的细菌菌株，其中异源基因使菌株可以利用野生型谷氨酸棒杆菌不能利用的外部能源。

7.权利要求6的细菌菌株，其中异源基因是淀粉酶基因。

8.权利要求5的细菌菌株，其中异源基因使菌株产生期望的物质，所述物质是异源基因的产物或者由这一异源基因的产物产生的物质。

9.具有SEQ ID NO.3(SecD)或SEQ ID NO.4(SecF)序列的蛋白质，或其各自的同源蛋白质或功能性突变体或片段。

10.编码权利要求9的蛋白质的多核苷酸序列。

11.权利要求10的多核苷酸序列，其中编码SEQ ID NO.3的蛋白质的多核苷酸序列相应于SEQ ID NO.1，编码SEQ ID NO.4的蛋白质的多核苷酸序列相应于SEQ ID NO.2。

12.质粒，其含有序列SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2或其片段或突变体中的至少一种。

13.权利要求1-8任一项的细菌菌株生产期望的物质的应用。

14.权利要求13的应用，其中所述物质选自于氨基酸，寡肽，多肽和蛋白质。

15.权利要求14的应用，其中产生的蛋白质是异源蛋白质。

16.权利要求13-15任一项的应用，其中所述产生的物质由细菌菌株分泌。

17.权利要求1-8任一项的细菌菌株、权利要求9的任一种蛋白质或权利要求10或11的任一种多核苷酸或权利要求12的质粒在报道系统中的应用。

18.报道系统，其包含权利要求1-8任一项的细菌菌株。

19.权利要求16的报道系统，其中所述系统报道蛋白质的转运，蛋白质的表达，基因调节或基因的可诱导性。

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