KR20020097264A - 분비 활성이 증강된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 - Google Patents

분비 활성이 증강된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 신규하게 분리되고 동정된 secD 및/또는 secF 유전자(들)가 세균성 균주의 분비가 증강되도록 유전적으로 변형된 코리네박테리움 글루타미쿰 세균성 균주, 이들 유전자의 단백질- 및 폴리뉴클레오타이드 서열, 하나 이상의 이들 유전자를 함유하는 플라스미드 및 목적하는 물질의 생성을 위한 또는 리포터 시스템에서 이러한 세균성 균주의 용도에 관한 것이다.

Description

분비 활성이 증강된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주{Corynebacterium glutamicum strain with enhanced secretion activity}
본 발명은, 천연 유전자 secD 및 secF가 최초로 동정, 분리 및 서열 결정된 세균성 균주 코리네박테리움 글루타미쿰, 유전자 서열 뿐만 아니라 유전자 발현과 관련된 이들 신규한 유전자의 유전자 변형물 및 목적하는 물질의 생성 및 단백질 전위를 위한 리포터 시스템에서 이러한 유전적으로 변형된 세균성 균주의 용도에 관한 것이다.
세균성 세포질막을 통과하는 단백질 배출은 주로 편재한 일반 분비 경로(GSP)를 따른다. 단백질 전위는, 3개의 SecYE 이량체가 추정적 세공 둘레로 집합되는 방식으로, 단백질 SecY, SecE 및 SecG로 이루어진 한 셋트의 막 스패닝 이종삼량체로 촉매된다. 세포 생존성에 필수적인 SecY 및 SecE와는 대조적으로, SecG는 SecYE 환구조의 형성에 반드시 필요한 것은 아니지만[참고문헌: Economou, A. (1999), Trends in Microbiol. 7, 315-319], SecA 기능을 지지하여 단백질 분비를 자극한다[참고문헌: Economou, A, Pogliano, J.A., Beckwith, J., Oliver, D.B. and Wickner, W., (1995), Cell 83, 1171-1181]. 필수적인 막주변 단백질 SecA는 전위의 기계적 모터이고, 이의 카복시 말단이 SecYEG 복합체에 결합하는 이량체 분자이다[참고문헌: Economou, A. (1999), Trends in Microbiol. 7, 315-319]. 예비단백질 전위는 ATP 가수분해하에 막내로 SecA의 사이클릭 삽입 및 탈삽입으로 구동되고[참고문헌: Lill, R., Dowhan, W. and Wickner, W., (1990), Cell 60, 259-269], 막을 통과하는 양성자 원동력에 의해 강하게 촉진된다[참고문헌: Shiozuka, K, Mitzushima, S. and Tokuda, H. (1990), J. Biol. Chem. 264, 18843-18847]. 보조 전위효소 소단위 SecD 및 SecF는 상이한 방법으로 단백질 배출을 증강시킨다: (i) 이들은 SecA의 막 사이클링을 조절한다[참고문헌: Duong, F and Wickner, W. (1997), EMBO J. 16, 4871-4879], (ii) 이들은 시그날 서열이 결손된 단백질 배출을 증진시킨다[참고문헌: Pogliano, J.A. and Beckwith, J., (1994a), EMBO J. 13, 554-561], (iii) 이들은 양성자 원동력으로 구동된 단백질 전위를 자극한다[참고문헌: Wickner, W. and Arkowitz, R.A. (1994), EMBO J. 13, 954-953] 및 (iv) 이들은 막으로부터 성숙 단백질을 방출시킨다[참고문헌: Gardel, C., Johnson, K., Jacq A. and Beckwith, J., (1990), EMBO J. 16, 3209-3216]. 샤프론 SecB는 지금까지 그람-음성 세균에서만 발견되었다[참고문헌: Fekkes, P. and Driessen, A., (1999), Microbol. Mol. Biol. Rev. 63, 161-173].
그람-양성에서, 비-포자형성 토양 세균 코리네박테리움 글루타미쿰은 순수 화학제품의 산업적 생산을 위해 특히 흥미롭고[참고문헌: Wohlleben, W., Muth, G. and Kalinowski, J. (1993), Genetic Engineering of Microorganisms, pp. 83-133, edited by A. Puhler, New York, Weinheim], 세포벽 단백질은 주요한 분비 생성물이다[참고문헌: Joliff, G., Mathieu, L., Hahn, V., Bayan, N., Duchiron, F., Renaud, M., Chechter, E. and Leblon, G. (1992), Mol. Microbiol. 6; 2349-2362]. 세포외 프로테아제 활성 및 다량의 단백질을 분비하는 이의 동시 능력의 결핍으로 인하여, 예를 들면, 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)로부터의 셀룰라제[참고문헌: Paradis, F. W., Warren, R.A.J., Kilburn, D.G. and Miller Jr., R.C., (1987), Gene 61, 199-206], 에스. 하이쿠스(S. hyicus)로부터의 양 감마 인터페론[참고문헌: Billman-Jacobe, H., Hodgson, A.L.M., Lightowlers, M., Wood, P.R. and Radford, A.J. (1994), Appl Env. Microbiol 60, 1641-1645] 및 리파아제 및 에스. 아우레우스(S. aureus)로부터의 서모뉴클레아제[참고문헌: Liebel and Sinskey, 미국 특허 제4,965,197호]의 생성에서 나타난 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰은 이종 외부 단백질의 생성을 위한 이상적 숙주이다.
지금까지 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 이종 단백질의 분비를 증강시키는 것은 단지 이종 단백질의 발현을 최적화하는 것에 의해서만 이루어졌다.
따라서 이종 단백질은 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)의 시그날 서열로 융합되었다[참고문헌: Liebel and Sinskey, 미국 특허 제4,965,197호; Joliff et al., Patent Nr. FR 2,679,922호].
GSP의 수개의 유전자는, secY 및 secA 유전자[참고문헌: Kobayashi, M., Fugono, N., Asai, Y., Inui, M., Vertes, A.A., Kurusu, Y. and Yukawa, H. (1994), Gene 139, 99-103; Genetic Analysis and Biomolecular Engineering 15: -13], secG(진뱅크 D14162), 및 secE(진뱅크 AF130462)를 포함하여 코리네박테리움 글루타미쿰에서 클로닝되고, 서열화되었다. 그러나 보조 단백질 SecD 및 SecF를 암호화하는 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 동정되지 않았다.
본 발명의 목적은 생성물 공급원으로부터 용이하게 분리할 수 있는 다량의 목적하는 물질의 제조 수단 뿐만 아니라 생성된 단백질의 전위를 검사할 수 있는 시스템을 제공하는 것이다.
이러한 목적은, 유전자 변형이 유전자 secD 및 secF 중 하나 이상과 관련되는, 유전적으로 변형된 세균성 균주 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 이루어진다.
지금까지 분석된 모든 세균성 종에서, sec 유전자는 이들 염색체 배열내에서 매우 보존적이고[참고문헌: Siefert, J.L., Martin, K. A., Abdi, F., Widger, W. R. & Fox, G. E. (1997), J. Mol. Evol. 45: 467-472], 특히 secD 및 secF 유전자는 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)[참고문헌: Pogliano, J.A. and Beckwith, J., (1994a), EMBO J. 13, 554-561] 또는 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)[참고문헌: Cole, S.T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon, S.V., Eigelmeier, K., Gas, S., Barry, E.E.3rd, Tekaia, F. Badcock, K., Basham, D., Brown, D., et al. (1998), Nature 6685, 537-544]에서 바로 인접하여 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰 secD는 1911bp의 크기이다. 상동성 데이타 및 가능한 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열 AAGGA는 당해 유전자가 드물게 개시 코돈 TTG로 개시함을 나타낸다. 당해 유전자는 67,689의 계산된 분자량 및 4.52의 이론상 pI를 갖는 637개 아미노산의 단백질을 지정한다. 단백질은 HMMTOP 분석으로 예측시, 371개 잔기의 세포질외 루프를 갖는 불규칙하게 분포된 6개 추정적 트랜스막 스패닝 영역[참고문헌: Tusnady, G.E. and Simon, I., (1998), J. Mol. Biol. 283, 489-506] 및 공지된 모든 SecD 단백질내 존재하는 6개 보존된 모티프 D1-D6[참고문헌: Bolhuis, A., Broekhuizen, C.P., Sorokin, A., van Roosmalen, M.L., Venema, G., Bron, S., Quax, W.J. and van Dijl, J. M. (1999), J. Biol. Chem. 273, 21217-21224]을 갖는다. 코리네박테리움 글루타미쿰 및 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) SecD의 추정된 아미노 서열의 정렬(도 2a)은 41%의 동일성 및 61%의 전반적인 유사성으로 나타났지만[참고문헌: Myers, G. and Miller, W., (1988) CABIOS 4, 11-17], 단백질은 이들 총길이에 걸쳐 상동성은 아니다. 오직 5개 트랜스막 영역을 갖는 C-말단 부분 및 코리네박테리움 SecD의 6개 짧은 패턴 D1-D6만이 고도로 보존되고, 단백질의 C-말단의 신장부 및 세포질외 루프는 미코박테리움 SecD 단백질보다 보다 덜 보존적인 것으로 나타난다.
코리네박테리움 글루타미쿰 secF는 1209bp로 이루어지고, secD 종결 코돈이후 5개 염기로 개시하며, 이의 추정 샤인-달가노 서열 AGGAG는 secD 3'말단 부분이다. secD 종결 코돈 TAG와 secF 개시 ATG사이의 간격은 2개 뉴클레오타이드이다. 403개 아미노산 잔기로 당해 단백질은 43,664의 계산된 분자량 및 5.07의 이론상 pI를 나타낸다. 이의 구조는 SecD 단백질과 유사하다. 또한 이는 6개 트랜스막 스패닝 영역 및 95개 잔기의 세포질외 루프를 갖지만, 이의 N-말단은 미코박테리움 SecF와 비교하여 보다 짧다(도 2b). 엠. 투베르쿨로시스 SecF와 함께 정렬되는 경우, 이는 43%의 동일성 및 전반적으로 60%의 유사성을 나타내지만[참고문헌:Myers, G. and Miller, W., (1988) CABIOS 4, 11-17], SecD의 경우에서와 같이, 단백질은 또한 전체 서열에 걸쳐 보존되지 않는다. SecD와 같이, 트랜스막 도메인 및 4개의 영역 F1-F4를 함유하는 부분만이 모든 SecF 단백질내에서 나타나고[참고문헌: Bolhuis, A., Broekhuizen, C.P., Sorokin, A., van Roosmalen, M.L., Venema, G., Bron, S., Quax, W.J. and van Dijl, J.M. (1999), J. Biol. Chem. 273, 21217-21224], 잘 보존된다. FingerPRINTscan을 사용한 SecF 아미노산 서열의 분석[참고문헌: Attwood, T.K., Flower, D.R., Lewis, A.P., Mabey, J.E., Morgan, S.R., Scordis, P., Selley, J. and Wright, W. (1999), Nucleic Acid Res. 27, 220-225]은 2개의 고도로 보존된 가능한 SecY 상호작용 부위를 나타내었고(도 2b), 이는 트랜스막 도메인 I 및 Ⅵ의 부분이다.
SecD의 단백질 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화되는 서열번호 3으로서 나타내고, SecF의 단백질 서열은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열로 암호화되는 서열번호 4로서 나타낸다.
본 발명의 내용에서 "물질"은 세균의 이화경로 및 대사경로 모두의 임의의 생성물일 수 있고, 바람직하게는, "물질"은 아미노산, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 그룹으로부터 선택된다. 추가로, 물질은 도입된 이종 유전자의 생성물일 수 있거나, 이러한 이종 유전자 생성물에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 단백질중 하나에 대한 내용에서, "상동 단백질" 또는 "상동 아미노산 서열"은 본원에서, 70% 이상, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%의 아미노산이 본 발명의 단백질중 하나와 동일하고, 여기서, 대체된 아미노산이 바람직하게는 상동 아미노산으로 대체되는 아미노산 서열을 의미한다. "상동" 아미노산으로 명명된 경우, 이는 소수성, 전하, 입체 특성등에 관해서 유사한 특성을 갖는다.
본 발명의 의미에서 "기능성 돌연변이체"는 하나 또는 수개의 아미노산이 상이한 성질을 갖는 아미노산으로 인위적 또는 천연으로 대체된, 서열번호 3 또는 4에 따르는 아미노산 서열을 갖는 단백질이지만, 대체로 단백질은, 본 명세서에 기재된 양태 중 하나에서 예를 들면, 3차원 구조의 도메인, 기능성 거동 또는 유효성에 관해서 유사한 특성을 나타낸다.
본원의 의미에서 "단편"은 서열번호 3 또는 4에 따르는 아미노산 서열 또는 상동 단백질 또는 이들 단백질 중 하나의 기능성 돌연변이체의 부분을 포함하는 폴리펩타이드이다. 바람직하게는 단편은 기능적 단편으로, 이들이 분비 또는 본원에 기재된 리포터 시스템에 효과적으로 관련됨을 의미한다. 단백질 단편 및 전체 서열은 추가로 기타 단백질 서열을 함유하는 융합 단백질의 부분일 수 있고, 이는 발현 또는 표적화의 수준 또는 위치를 촉진한다.
단백질 생성 및/또는 분비가 증강된 세균성 균주 코리네박테리움 글루타미쿰을 수득하기 위해서, 생성 및 분비를 지지하는 유전자가 조절될 수 있고, 본 발명에 따르는 유전적으로 변형된 세균성 균주를 수득한다. "변형"은 유전자내 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이, 결실 및 삽입 뿐만 아니라 유전자 상호간 또는 이들 프로모터의 재배열, 적절한 프로모터의 선택, 단백질 발현의 조절, 바람직하게는 분비 단백질 발현의 증강, 유전자의 증식 및 추가의 것을 포함한다. 단백질의 생성및 분비를 지지하는 유전자의 변형(들)은 서로에 대해 시스 또는 트랜스 위치에 놓인 유전자에 위치될 수 있고, 변형은 염색체내로 삽입되거나, 플라스미드상에 남아있을 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 일반 분비 경로의 하나 이상의 단백질이 야생형 발현과 비교하여 과발현되어, 세균에 의한 단백질 분비가 증강된다. 바람직하게는, 단백질 SecD 및 SecF 중 하나 이상이 과발현되고, 보다 바람직하게는, 이들 2개가 동시에 과발현된다.
단백질의 과발현은 예를 들면, 강한 프로모터의 조절하에 유전자 secD 및/또는 secF 중 하나 이상의 셋팅, 바람직하게는 세포내로 전달되는 발현 벡터에 유전자를 삽입하거나 유전자의 증식에 의해 수득될 수 있다.
바람직하게는, 단백질 SecD 및 SecF 중 하나 이상의 과발현은 필수 Sec 단백질(SecE, SecY, SecA) 하나 이상의 과발현과 결합된다.
단백질의 "과발현"은 이러한 단백질이 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 천연으로 발현되는 것보다 보다 다량으로 발현되는 것을 의미한다. 바람직하게는 과발현은 야생형 발현과 비교하여 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상이다.
sec 유전자 수개의 조합을 함유하는 과발현을 위한 작제된 플라스미드를 표 1에 나타내고, 플라스미드 지도는 도 5 내지 8에 나타낸다.
코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 플라스미드
균주/플라스미드 관련된 유전자형 참고
균주:C.g. RES167 제한-결실 돌연변이체 ATCC 13032, Δ(cglRI-cglRII) UniversitatBielefeld
C.g. INT-D RES167 secD :: pCR2.1, KmR 당해 연구
C.g. INT-F RES167 secF :: pCR2.1, KmR 당해 연구
C.g. INT-G RES167 secG :: cmx. CmR 당해 연구
C.g. AMY2 RES167 dciAE :: pIAmy2, TcR,아밀라제 분비를 위한 시험균주 당해 연구
플라스미드:pCR2.1 PCR 생성물 ApR, KmR의 클로닝을 위한 벡터 Invitrogen
pLW60 dciAE 단편을 함유하는 pK18mob Wehmeier et al.,(1998)
pInsD secD 단편을 함유하는 pCR2.1 당해 연구
pInsF secF 단편을 함유하는 pCR2.1 당해 연구
pK18mobsacB 기동가능한 클로닝 벡터, sacB-유도체, KmR Schafer et al.(1994)
pEC31 pTP10의 cmx를 함유하는 pSVB31, CmR UniversitatBielefeld
pInsG secG :: cmx를 함유하는 pK18mob-sacB 당해 연구
pXT99A 이. 콜라이 발현 벡터, Ptrc, TcR UniversitatBielefeld
pEC-XK99A 이. 콜라이/씨. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터, Ptrc, KmR UniversitatBielefeld
pEC-XT99A 이. 콜라이/씨. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터, Ptrc, TcR UniversitatBielefeld
pSecD secD 하류 Ptrc를 함유하는 pEC-XT99A 당해 연구
pSecG secG 하류 Ptrc를 함유하는 pEC-XT99A 당해 연구
pSecDF secD secF 하류 Ptrc를 함유하는 pEC-XK99A 당해 연구
pSecEDF secE, secD secF 하류 Ptrc를 함유하는 pEC-XK99A 당해 연구
pSecYDF secY, secD secF 하류 Ptrc를 함유하는 pEC-XT99A 당해 연구
pULMJ95 이. 콜라이/씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터, amy, KmR Cadenas et al.(1996)
pAmy amy 하류 Ptrc를 함유하는 pEC-XT99A 당해 연구
pIAmy2 amy dciAE-단편 하류 Ptrc를 함유하는 pXT99A 당해 연구
본 발명의 하나의 바람직한 양태는 플라스미드 pSecD로 형질전환되는 코리네박테리움 글루타미쿰 세균성 균주이다.
본 발명의 또다른 바람직한 양태는 플라스미드 pSecDF로 형질전환되는 코리네박테리움 글루타미쿰 세균성 균주이다.
본 발명의 특히 바람직한 양태는 각각 플라스미드 pSecEDF 또는 pSecYDF로 형질전환되는 코리네박테리움 글루타미쿰 세균성 균주이다.
본 발명에 따른 세균성 균주는 기재된 sec 유전자중 하나의 유전적 변형 이외의 증강된 단백질 분비를 가져오는 추가의 변형을 함유할 수 있다. 특히, 당해 발명에 따른 세균성 균주는 바람직하게는 다량으로 생성될 단백질을 암호화하는 하나 이상의 추가의 이종 유전자를 함유한다. 따라서, 이종 유전자는 당해 발명에 따라 세균성 균주내에 도입-sec 유전자의 유전적 변형후-되거나, 목적하는 유전자를 함유하는 이미 작제된 세균성 균주는 본원에 기재된 바와 같이 sec 유전자에 관하여 유전적으로 변형된다.
유전적 변형 단계에서 사용된 플라스미드의 도입은 기술분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 형질 감염, 주입, 탄도 미사일, 바이러스 벡터, 전기천공, CaCl2방법 또는 열 쇼크에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 세균성 균주는 생성된 물질이 다량으로 세균으로부터 분비될 수 있으므로, 특히 아미노산, 펩타이드 또는 단백질 생성에 적절하고, 이는 물질이 세포 손상없이 배지(상청액)로부터 직접 분리될 수 있기때문이다.
추가로, 본 발명의 세균성 균주는 리포터 시스템에서 사용될 수 있다. 리포터 시스템은 유전자 조절, 단백질 발현, 단백질 전위, 또는 유전자 발현의 유도능력에 대해 리포팅할 수 있다. 바람직하게는 리포터 시스템에서 생성된 단백질은세포벽을 통해 전위되므로, 이들은 상청액에서 용이하게 측정된다.
이러한 리포터 시스템의 한가지 양태에서, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 천연적으로 발생하는 단백질의 발현은 분비된 단백질의 단백질 특성 결정에 의해 측정될 수 있다.
리포터 시스템의 또다른 양태에서, 본 발명의 세균성 균주는 마커 단백질을 암호화하는 이종 마커 유전자를 세포내로 도입하여 형질전환된다.
유전자 조절을 조사하기 위해서, 조사하고자 하는 유전자를 천연으로 조절하는 관심대상인 프로모터 "뒤에" 마커 유전자를 위치시킨다. 이러한 작제에 의해서, 어떻게 및 어떤 조건하에서 조사되는 유전자가 발현되는지를 결정할 수 있고, 이러한 유전자의 조절에 대해 결론을 얻는다.
유사한 작제는 추가로 유전자 요소를 조절하는 것을 포함하고, 이로써 관심대상인 유전자의 유전자 발현의 유도능력을 결정하기 위한 시스템을 수득한다.
모든 양태에서, 단백질 특성부여는 기술분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 효소 활성 측정, SDS-PAGE, 서열화, 면역학적 방법, 즉, 웨스턴 블롯팅 또는 크로마토그래피 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 세균성 균주의 사용에 의한 단백질 생성은 특히, 이종 유전자(들)를 세균성 세포내로 도입하여 세포가 보다 빠르게 증식되도록 함으로써 증강될 수 있다. 바람직하게는 이러한 이종 유전자는 당해 세균성 균주에 의해 일반적으로 사용되지 않는 외부 에너지를 세포가 사용할 수 있도록 한다. 이러한 외부 에너지는 여러가지 당, 아미노산, 펩타이드, 탄수화물, 지방산, 유기 중합체, 무기 이온및 빛을 포함한다.
하나의 바람직한 외부 에너지원은 전분이다. 본 발명의 세균성 균주는 전분을 단일 에너지원으로서 사용할 수 있는 방식으로, 예를 들면, 이종 아밀라제 유전자를 도입하는 것에 의해 형질전환될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 세균성 균주는 플라스미드 pSecYDF 및 pIAmy2에 의해 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 RES167 균주이다.
도 1
엠. 투베르쿨로시스의 secD/secF 영역(a)의 염색체 구성을 코리네박테리움 글루타미쿰(b)에서의 동일한 영역과 비교한 도식표. 구조된 벡터(b)의 도식에서, 플라스미드 구조를 위해 사용된 제한 효소는 괄호로, 클로닝을 위해 사용된 효소는 (*)로 표시된다.
도 2
코리네박테리움 글루타미쿰 및 엠. 투베르쿨로시스의 SecD(a) 및 SecF(b)의 추정된 아미노산 서열의 비교. 동일한 아미노산(*) 및 보존적 대체물(:)로 표시된다. 모든 공지된 SecD 및 SecF 단백질에 존재하는 보존된 영역 D1-D6 및 F1-F4를 박스로 표시한다. 2개의 가능한 SecY와 SecF의 상호작용 부위가 FingerPRINTscan을 사용한 아미노산 서열의 분석으로 발견되었고[참고문헌: Attwood et al.,1999], 검정바로 표시된다. SecD 및 SecF의 6개 추정 트랜스막 영역은 회색으로 나타낸다. 모든 단백질의 막 스패닝 도메인은 HMMTOP 웹 사이트를 사용하여 예측되었다[참고문헌: Tusnady and Simon, 1998].
도 3
sec 유전자의 상이한 조합을 과발현시키는 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2의 아밀라제 분비. 1.3 ×106세포를 16시간 배양하였다. 상청액내 활성을 5회 측정하였다. 1mU는 환원당 1nmol/㎖/min로서 정의하였다. 아밀라제 분비에서 유의적인 증가가 secD 및 secF가 과발현된 경우(pSecDF), 검출될 수 있었다. 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecEDF(pSecEDF) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecYDF(pSecYDF)에서 아밀라제 활성은 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2(AMY2)와 비교하여 2배 이상이다.
도 4
단독 탄소원으로서 전분을 갖는 최소 배지에서 상이한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2(■), 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecEDF(△) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecYDF()의 증식. 어떠한 증식도 코리네박테리움 글루타미쿰 RES167(◆)에 대해 검출되지 않았다. 초기 커브에서 광학 밀도의 경미한 감소는 분비된 아밀라제에 의해서 전분의 불용성 부분의 분해로 인한 것이다.
도 5는pSecD의 플라스미드 지도이다.
도 6은 pSecDF의 플라스미드 지도이다.
도 7은 pSecEDF의 플라스미드 지도이다.
도 8은 pSecYDF의 플라스미드 지도이다.
도 9는 pAmy의 플라스미드 지도이다.
도 10은 pIAmy2의 플라스미드 지도이다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한함이 없이 본 발명을 상세히 설명하는 것으로서 간주될 것이다.
당해 연구와 관련한 모든 세균성 균주 및 플라스미드를 표 1에 나열한다. 이. 콜라이(E. coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 일반적으로 Luria-Bertani(LB) 배지[참고문헌: Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ndedn. Cold Spring Harbour, NY: Cold Spring Harbour Laboratory]에서 각각 37℃ 및 30℃로 배양하였다. 단일 탄소원으로서 전분상에서 코리네박테리움 글루타미쿰의 증식을 위해서, 글루코스 및 효모 추출물 대신 2% 가용성 전분(시그마)을 함유하는 변형된 최소 배지[참고문헌: Katsumata, R, Ozaki, A., Oka, T. and Puruya, A. (1984), J. Bact. 159, 306-311]를 사용하였다. 플라스미드 선택을 위해 사용된 항생물질은 카나마이신(50㎍㎖-1) 및 클로람페니콜(10㎍㎖-1)이었다.
실시예 1
발현 벡터 pXT99A 및 pEC-XK99A의 작제
이. 콜라이 발현 벡터 pTRC99A[참고문헌: Amann et al., 1988, Gene 69: 301-315]를 BspHI로 절단하고, Klenow 단편으로 처리하였다. 씨. 글루타미쿰 플라스미드 pAG1[참고문헌: 진뱅크 Acc. 제AF121000호]로부터의 테트라사이클린 유전자를 T4 리가아제로 연결하여 암피실린 유전자 대신 삽입하여, pXT99A를 수득했다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 DH5αMCR내로 전기천공시켰다.
pEC-XK99A의 작제를 위해서, 이. 콜라이- 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pTRC99A를 BspHI로 절단하고, Klenow 단편으로 처리하였다. 암피실린 유전자를 이. 콜라이 플라스미드 pBSL15[참고문헌: Alexeyev, M., 1995, Biotechniques 18: 52-56]의 카나마이신 내성 유전자로 대체하였다. 연결 및 전기천공을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 따라서 플라스미드 pXK99A를 수득하였다.
플라스미드 pGA1[참고문헌: Sonnen et al., 1991, Gene 107; 69-74]로부터 씨. 글루타미쿰의 레플리콘을 함유하는 3484bp 단편을 BalI 및 PstI로 제한하여 수득하였다. 이러한 단편을 SmaI/PstI 절단된 벡터 pK18mob2[참고문헌: Tauch etal., 1998, Archives of microbiology 169: 303-312]내로 삽입하였다. 재연결후, 삽입된 레플리콘 단편의 839bp 단편을 BamHI/XhoI로 절단하여 결실시켰고, 벡터 단편을 Klenow 단편으로 처리하였다. 벡터의 재연결후, 씨. 글루타미쿰 최소 레플리콘을 함유하는 Klenow 처리된 2645bp KpnI/PstI 단편을 NheI로 절단하여 Klenow-폴리머라제로 처리된 플라스미드 pXK99A내로 삽입하였다. 연결을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 씨. 글루타미쿰내로의 전기천공후, 플라스미드 pEC-XK99A를 분리하고 확인하였다.
실시예 2
코리네박테리움 sec 유전자의 분리 및 특징부여:
이. 콜라이 DH5αMCR[참고문헌: Grant, S.G.N., Jessee, J., Bloom, F. R. and Hanahan, D. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4645-4649]을 플라스미드 작제를 위한 숙주로서 사용하였다. 이. 콜라이로부터의 플라스미드 DNA를 37℃에서 2시간 동안 용해 완충제 HB1의 20㎎/㎖의 리소자임을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 변형된, 알칼리성 용해 방법[참고문헌: Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), Moleculare Cloning: a Laboratory Manual. 2ndedn. Cold Spring Harbour, NY: Cold Spring Harbour Laboratory]으로 제조하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 DNA를 문헌[참고문헌: Tauch, A., Kirchner, O., Wehmeier, L., Kalinowski, J. and Puhler, A (1994), FEMSMicrobiol. Lett. 123, 343-347]에 기재된 바와 같이 분리하였다. DNA 제한, 아가로스 겔 전기천공, Klenow 처리 및 연결을 표준 방법에 따라 수행하였다[참고문헌: Sambrook et al., 1989]. DNA 조작을 위한 효소를 Pharmacia사 또는 Boehringer사로부터 수득하였고, 제조자가 제시하는 바와 같이 사용하였다. 아가로스 겔로부터 DNA 제한 단편의 분리를 핵산에 대한 Nucleotrap Extraction Kit(Macherey-Nagel)을 사용하여 수행하였다.
PCR 실험을 위해 사용된 모든 프라이머 셋트를 표 2에 나열한다. 프로모터가 없는 secY를 분리하기 위해서, 유전자를 진뱅크 엔트리 D14162로부터 추정된 합성 올리고뉴클레오타이드 sy1 및 sy2를 사용하여 PCR로 생성시켰다(표 2). 소유전자 secE(진뱅크 AF130462) 및 secG(231bps, 진뱅크 AJ007732)를 secE를 수득하기 위한 se1 및 se2, 및 secG를 수득하기 위한 sg1 및 sg2 프라이머를 사용하여 염색체로부터 직접 증폭시켰다. 모든 PCR 생성된 유전자를 먼저 TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 pCR2.1내로 클로닝시켰고, EcoRI로 분해하고 2단계에서 trc 프로모터의 조절하에 IPTG 유도가능한 이. 콜라이/코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pEC-XT99A내로 클로닝시켜 플라스미드 pSecY, pSecE 및 pSecG를 수득하였다.
프로모터가 없는 secD를 플라스미드 구조의 서열로부터 유도되고, 상기 기재된 바와 같이 클로닝된, 추정된 프라이머 sd1 및 sd2를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
PCR을 Taq DNA 폴리머라제(Gibco-BRL)를 사용하여 PCT-100 서모사이클러(MJResearch, Inc.)로 수행하였다. 94℃에서 2분동안의 초기 변성후 90초간 변성, 프라이머 의존 온도 T'm(2AT+4GC)[참고문헌: Suggs, S.V., Hirose, T., Miyake, T., Kawahima, E.H., Johnson, M.L., Itakura, K. and Wallace, R.B. (1981), Developmental biology using purified genes. Academic Press, Inc., New York, N.Y., pp. 683-693] -5℃에서 90초간 어닐링, 및 72℃에서 90초간 연장시켰다. 이러한 사이클을 32회 반복하였고, 72℃에서 10분 동안 연장 단계에 의해 완성하였다.
플라스미드를 전기천공에 의해 이. 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰내로 도입하였다[참고문헌: Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol. Lett. 123, 343-347; Haynes and Britz, 1989, FEMS Microbiol. Lett. 61 329-334].
DNA 서열화를 Institut fur Innovationstransfer GmbH(Bielefeld)에 의해 수행하였다. 아미노산 유사성에 대한 연구를 BLAST 서비스[참고문헌: Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J. (1990), J. Mol. Biol. 125, 403-410]로 수행하였고, 단백질 정렬을 CLUSTAL W 프로그램[참고문헌:Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., (1994), Nucleic Acid Res. 22, 4673-4680]으로 평가하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰과 분류학적으로 밀접하게 관련되어 있는 미코박테리움 투베르쿨로시스 H37Rv 균주에서, 디펩타이드 수송체 암호화 유전자 dciAE(도 1a)를 secD 및 secF의 하류에 위치시킨다. 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC13032)의 dciAE 상동체는, 염색체 구조 기술에 의한 유전자 secD 및 secF를 분리하기 위해, rel 유전자에 대한 연구에서 부분적으로 서열화되었고[참고문헌: Wehmeier, L. Schafer, A., Burkowski, A., Kramer, R., Mechold, U., Malke, H., Puhler, A. und Kalinowski, J. (1998), Microbiology 144, 1853-1862], EcoRI 및 BamHI로 분해하여 플라스미드 pLW60으로부터 유도된 0.8kb 단편의 dciAE 유전자[참고문헌: Wehmeier et al., 1998]를 pCR2.1내로 클로닝하였고, 수득한 플라스미드를 상동 재조합을 통하여 전기천공후 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체내로 삽입하였다. 총 염색체 DNA를 수득한 균주로부터 분리하였고, EcoRV 및 SspI로 분해하여 재연결 후 이. 콜라이DH5αMCR로 전달하였다. EcoRV 및 SspI를 사용하여 삽입된 벡터를 구조하여 dciAE 및 상류 염색체 영역을 포함하는 9751bp 삽입체를 갖는 플라스미드 pCR2.1을 수득하였다(도 1). 삽입체를 프라이머 워킹(walking)으로 서열화하였다. DNA 서열 분석에 의해서, secD 및 secF를 포함하는 8개의 완전하고 1개의 부분적인 orfs(개방판독프레임)를 단편상에서 확인할 수 있다.
secD 및 secF의 서열을 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로서 나타낸다.
코리네박테리움 sec 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머
유전자 5'-프라이머 3'-프라이머
secA 단편 saf1: 5'-CGCGACAAGGACTACATCGT-3' saf2: 5'-GAGATGTCTGCGGATTCGAG-3'
secY 단편 syf1: 5'-TGAGGAGGCCAGGAGGCCAG-3' syf2: 5'-AACCACCGTACTGACGACGA-3'
secY sy1: 5'-TTAAGTGCTGAGGAGGCCAG-3' sy2: 5'-TTATCAGCACCGGTAGTTCC-3'
secE se1: 5'-TGGATGAGTAGTGATTTAGA-3' se2: 5'-GATTCTGACTCCGTAGGTAG-3'
secE 영역 ser1: 5'-CACCTGGCAGACGCACTCAA-3' ser2: 5'-AGCCGGAGTAGCACTGAATG-3'
secG sg1: 5'-ACCTGGGTTCTCAAACGGCA-3' sg2: 5'-TTGTCGACCTGTTGTCTCCC-3'
secG 영역 sgr1: 5'-TCCAGGCCTTCCTCACGCAA-3' sgr2: 5'-AGCTGCGAGAATCCAGGCTA-3'
secD sd1: 5'-TTGTCTGGTTGATTGGAATT-3' sd2: 5'-TGAAGTTTCAGTCTGGGAAT-3'
secD 단편 sdf1: 5'-TGCTGTTGACAGGCGATCGT-3' sdf2: 5'-TCATCAGTGGTGCACTGCAT-3'
secF 단편 sff1: 5'-GTACCAAGATGAGCATGCCA-3' sff2: 5'-ATCGAACGCATGAAGGTCTG-3'
실시예 3
플라스미드 pSecDF, pSecEDF 및 pSecYDF의 작제
9751bp 삽입체(실시예 1)상에 염색체 secD 및 secF 유전자를 갖는 플라스미드 pCR2.1을 SalI로 절단하였고, 3275bp 단편을 겔 전기영동으로 분리하였다. 이러한 단편을 pEC-XK99A내로 삽입하고, SalI로 절단하여 플라스미드 pSecDF를 수득하였다. 연결 및 이. 콜라이 DH5αMCR내로의 전기천공을 상기 기재된 바와 같이 수행하였고, 세균을 50㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 배양하였다.
각각 pSecEDF 및 pSecYDF의 작제를 위해서, pSecDF를 EcoRI로 절단하였다. 또한, pSecE 및 pSecY(실시예 2)를 각각 EcoRI로 절단하여 secE 및 secY 유전자를 함유하는 단편을 분리할 수 있다. secE 및 secY 유전자를 함유하는 EcoRI-단편을 EcoRI-절단된 pSecDF내로 삽입하여 연결후 pSecEDF 및 pSecYDF를 각각 수득한다.
실시예 4
코리네박테리움 글루타미쿰 RES167의 염색체에서 sec 유전자의 지시된 돌연변이유발
정의되어진 secD 돌연변이체를 상동 재조합을 통하여 유전자 분해로 작제하였다. 따라서, secD의 609bp 내부 단편(nt 1200-1809)을 추정된 프라이머 sdf1 및 sdf2(표 2)를 사용하여 PCR로 증폭시켰고, pCR2.1내로 클로닝하였다. 수득한 플라스미드 pInsD를 코리네박테리움 글루타미쿰내로 전기천공시켰고, 상동 재조합에 의해 염색체내로 그 자체만을 정착시켰다. 유전자 분해를 서던 하이브리드화에 의해 확인하였다. secF 돌연변이체 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-F를 603bp의 내부 단편(nt 346-949)을 나타내기 위해 프라이머 sff1 및 sff2를 사용하여 동일한 방법으로 제조하였고, 플라스미드 pInsF를 수득하였다. secA 및 secY 돌연변이를 위해서, 각각 프라이머 saf1, saf2, syf1 및 syf2를 사용하여 PCR로 유도된 유전자의 내부 단편을 pCR2.1내로 클로닝하였지만, 염색체내로의 삽입은 실패하였다.
secG 및 secE의 작은 크기로 인하여, secG 돌연변이체를 상동 재조합에 의한 대립 유전자 교환의 양성 선택을 가능하게 하는 sacB 시스템을 사용하여 삽입의 불활성화에 의해 작제하였다[참고문헌: Schafer, A., Tauch, A., Jager, W., Kalinowski, J., Thierbach, G. and Puhler, A. (1994), Gene 145, 69-73]. 이러한 목적으로, 중심 secG를 갖는 1.3kb DNA 단편을 합성 올리고뉴클레오타이드 sgr1 및 sgr2를 사용하여 PCR로 제조하였고, 이어서 SalI 및 XbaI를 사용하여 플라스미드 pXT99A내로 pCR2.1을 통하여 클로닝하였다. 클로람페니콜 내성 유전자 카셋트cmx를 분리하기 위해서, 벡터 pEC31을 SalI 및 HindIII으로 분해하였고, cmx를 함유하는 2.0kb 단편을 0.8% 아가로스 겔로부터 분리하였다. secG내로의 cmx 삽입은 BspHI로 분해된 플라스미드 및 cmx 카셋트를 단편 모두 Klenow 처리후 연결하여 이루어졌다. 작제된 플라스미드를 이. 콜라이로부터 재분리하였고, secG::cmx를 함유하는 3.3kb 단편을 SalI 및 HindIII를 사용하여 pK18mobsacB[참고문헌: Schafer et al., 1994]내로 클로닝하였다. 벡터 pInsG를, 수득된 균주가 벡터 서열에 의해 분리된 야생형 유전자 및 변형된 secG 영역을 갖도록하는 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체내로 삽입하였다. 플라스미드의 제거를 10% 수크로스를 함유하는 LB 아가상에서 세포를 증식시켜 선택할 수 있다[참고문헌: Schafer et al., 1994]. 이러한 배지상에서 증식할 수 있는 세포는, 야생형 유전자 배열을 회복시키거나, secG의 파괴된 대립유전자만을 갖는 선택가능한 클로람페니콜 내성 균주 코리네박테리움 굴루타미쿰 INT-G를 유도하는 2차 교차 이벤트로 인하여 플라스미드를 상실한다. secG 파괴를 서던 하이브리드화로 확인하였다.
secE를 파괴하기 위해서, 1.6kb DNA 단편을 secE 플랭킹 영역으로부터 유도된 프라이머 ser1 및 ser2를 사용하여 PCR로 증폭시켰고[참고문헌: Wehmeier, 1999], 효소 XbaI 및 HindIII를 사용하여 pK18mobsacB내로 pCR2.1을 통하여 클로닝하였다. 수득한 벡터를 secE 유전자내의 단일 BssHII 부위에서 절단하였다. Klenow 처리하고, pEC31로부터의 cmx 유전자 단편으로 연결하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체내로 삽입하였다. 추가의 단계를 상기 기재된 바와 같이 수행하였지만, 어떠한 이중 교차 이벤트도 검출할 수 없었다.
발생된 돌연변이체 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-D 및 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-F(표 1)는 크기가 증가되었고, 현저히 연장된 지체기를 나타냈고, 액체 배지에서 야생형의 광학적 밀도에 이르지 않았다. 돌연변이체 표현형은 플라스미드 암호화된 손상되지 않은 sec 유전자로 보완될 수 있다(나타내지 않는다).
실시예 5
아밀라제 분비 리포터 시스템의 작제
아밀라제 생산 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 작제를 위해, 벡터 pULMI95[참고문헌: Cadenas, R.F., Fernandez-Gonzales, C., Martin, J.F. and Gil, J.A. (1996), FEMS Microbiol. Lett. 137, 63-68]를 EcoRI 및 Ecl136II으로 분해하였고, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) IMRU 3570의 amy 유전자를 함유하는 2.1kb 단편을, IPTG-유도가능한 trc 프로모터의 조절하에 있는 EcoRI 및 Ecl136II로 절단된 이. 콜라이/코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pEC-XT99A내로 클로닝하였다[참고문헌: Amman, E., Ochs, B. and Abel, K.-J. (1988), Gene 69: 301-315]. IPTG 유도가능한 아밀라제 발현을 갖는 신규하게 작제된 벡터 pAmy를 코리네박테리움 글루타미쿰으로 전기천공시켰다.
아밀라제 유전자의 염색체 복사체를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 위하여, amy를 상기 기재된 바와 같이, 이. 콜라이 발현 벡터 pXT99A내로 클로닝하였다. 두번째 단계에서, pLW60으로부터의 dciAE의 XbaI 및 HindIII 유전자단편[참고문헌: Wehmeier, et al., 1998]을 수득한 벡터내 amy의 하류로 클로닝하였다. 신규한 비복제성 플라스미드 pIAmy2를 전기천공으로 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 내로 삽입하여, 상동 재조합을 수행하여 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2를 수득하였다(표 1).
실시예 6
아밀라제 활성 분석
아밀라제를 분석하기 위해서, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 1% 효모 추출물(Difco사), 1% 펩톤(Difco사) 및 2% 가용성 전분(Sigma사)으로 이루어진 TYPS 배지의 고체 및 액체 배양물에서 배양하였다. 아밀라제 생성을 50nM의 IPTG를 TYPS 배지에 부가하여 유도하였다. 세포내 아밀라제 활성의 측정을 위해서, 액체 배양물에서 증식된 코리네박테리움 글루타미쿰을 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.0)에서 2회 세척하였다. 세포를 파괴하기 위해서, Ribolyser(Hybaid사)를 6의 속도로 30초 동안 2회 사용하였다.
아밀라제 활성을 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 상청액에서, 디니트로살리실산 방법[참고문헌: Miller, G. L., 1959, Anal. Chem. 31, 426-428]의 변형으로 측정하였다. 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.0)에서 2% 가용성 전분으로 37℃에서 30분 동안 분석하였다. 용적 활성(mU)을 환원당 nmol/㎖/분으로 정의하였다. 전분 분해를 루골(Lugol) 용액으로 착색시켜 아가 플레이트상에서 분석하였다. 아밀라제 활성을 콜로니 주위의 투명한 영역으로서 검출하였다.
아가 플레이트상의 전분 분해는 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2에 대해서 검출가능하였고, 배양 3일후 배양물 상청액에서 아밀라제 활성은 45mU이었다. amy의 염색체 복사체를 함유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2는 코리네박테리움 글루타미쿰 RES1167/pAmy에 의해 생성되는 아밀라제의 12%만을 분비한다. 이는 플라스미드 pAmy가 코리네박테리움 글루타미쿰에서 세포당 약 8개의 복사체를 갖는다는 결론을 유도한다. 야생형 균주와 대조적으로, 모든 아밀라제 생산 코리네박테리움 글루타미쿰은 단지 탄소원으로서 전분을 갖는 최소 배지상에서 증식할 수 있다. 이로써, 아밀라제 생성은 단백질 분비를 위한 충분한 리포터인 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제성 및 삽입된 시스템 모두에서 분석에 용이하다는 결론을 유도했다.
실시예 7
GSP내 돌연변이는 아밀라제 분비를 감소 또는 파괴한다
단백질 배출에 대한 돌연변이의 효과를 정량화하기 위해서, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-D 및 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-F를 복제 플라스미드 pAmy로 형질전환시켰다. 전분 분해를 고체 배지 및 액체 배양물에서 시험하였다. 어떠한 분비도 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-D/pAmy 및 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-F/pAmy에서 검출할 수 없었다. 용적 활성의 측정은 둘 모두의 균주에 대해서 어떠한 전분 분해도 발견할 수 없었던 동일한 표현형과 유사하다.
이종 아밀라제를 분비하는 능력의 완전한 손실의 놀라운 사실로 인하여, 코리네박테리움 글루타미쿰의 다른 sec 유전자를 돌연변이시켰다. 상기 지적된 바와 같이, 세포 생존율에 필수적인 secA, secY 및 secE의 돌연변이체의 제조는 실패하였다. secG를 돌연변이시키기 위해서, 야생형 유전자를 sacB 시스템을 사용하여 이중 교차를 통한 클로람페니콜 내성 카셋트 cmx로 파괴된 secG로 대체시켰다. 수득한 돌연변이체 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-G(표 1)는 허용되는 온도에서 정상적으로 증식하지만, 이의 세포벽은 SDS에 대해 매우 민감하다(데이타는 나타내지 않음). 모든 돌연변이는 서던 하이브리드화에 의해 확인되었다.
균주 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-D 및 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-F와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-G를 단백질 배출에 대한 유전자 파괴 효과를 분석하기 위해서 복제 플라스미드 pAmy로 형질전환시켰다. 전분 분해를 고체 배지 및 액체 배양물에서 시험하였다. 아밀라제 분비는 코리네박테리움 글루타미쿰 RES167/pAmy와 비교하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 INT-G/pAmy에서 현저히 감소된다: 돌연변이체 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 RES167/pAmy에 의해 배출된 아밀라제의 21.5%만을 분비한다.
어떠한 균주도 세포질에서 어떠한 아밀라제 활성도 나타내지 않았다. 이로 인하여, 손상되지 않은 secD 및 secF가 이종 아밀라제의 배출에 필수적인 것으로 결론짓는다. SecG는 단백질 전위 그 자체에 필수적이 아니며 배출률에 강하게 영향을 미친다.
실시예 8
sec 유전자 조합의 과발현은 아밀라제 분비를 증가시킨다
SecD 및 SecF는 아밀라제 분비에 강한 작동인자인 것 같으므로, 단백질 배출에 대한 secD 및 secF의 조합된 과발현의 결과를 시험하였다. 조합 secD 및 secF를 상기 기재된 바와 같이, SalI를 사용하여 셔틀 발현 벡터 pEC-XK99A내로 클로닝하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2를 수득한 플라스미드 pSecDF로 형질전환시켰고, 아밀라제 활성을 시험하였다. 도 3에서 지적된 바와 같이, secD 및 secF 유전자의 동시 과발현은 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2와 대조적으로 아밀라제 분비를 1.5배 증강시켰다.
필수 sec 유전자 secE 및 secY와 함께 보조 sec 유전자 secD 및 secF의 병행적 과발현의 효과를 분석하기 위해서, EcoRI를 pSecDF내로 클로닝하였고, 실시예 3에 기재된 바와 같이, 플라스미드 pSecEDF 및 pSecYDF를 수득하였다. SecE 및 SecY를, 이. 콜라이에서 SecD/SecF 복합체와 이의 상호작용이 기술되었으므로[참고문헌: Sagara, K., Matsujama, S. and Mitzushima, S., 1994, J. Bact. 176, 4111-4116], 클로닝하였다. 아밀라제 분비에 대한 시험은 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2와 비교하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecEDF에 있어서 2.3배 증가를 나타냈고, 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecYDF에 있어서 2.5배를 얻었다.
고체 배지상의 아밀라제 활성의 검출은 동일한 발견을 나타낸다. 24시간후, 전분 분해는 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecEDF에 있어서 보다 증진되었고, 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecYDF는 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2보다 2배의 높은 속도를 갖는다.
단일 탄소원으로서 전분을 갖는 최소 배지에서의 증식은 이러한 결과를 반영하였다: 코리네박테리움 글루타미쿰 RES167은 전분을 대사가능한 형태로 전환시킬 수 없으므로, 어떠한 증식도 검출할 수 없다. 가장 높은 아밀라제 분비를 나타낸 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecEDF 및 코리네박테리움 글루타미쿰 AMY2/pSecYDF는 모든 시험된 균주에서 가장 빠른 증식을 나타냈고, 경미하게 보다 높은 OD에 이르렀다. 이는 전분상의 증식이 아밀라제 분비에 정비례함을 나타낸다.

Claims (19)

  1. 유전자 변형이 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 유전자 secD 및 secF 중 하나 이상과 관련된 것임을 특징으로 하는, 유전자 변형된 세균성 균주 코리네박테리움 글루타미쿰.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 secD가 천연으로 서열번호 1에 따르는 서열을 갖고, 유전자 secF가 천연으로 서열번호 2에 따르는 서열을 갖거나, 각각 이의 상동 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세균성 균주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 변형이 돌연변이, 결실, 삽입, 유전자 상호간 또는 이의 프로모터(들)의 재배열, 프로모터의 선택에 의한 유전자 발현의 조절 및 유전자 증식으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세균성 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, secD 및/또는 secF가 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰과 비교하여 과발현되는 것을 특징으로 하는 세균성 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 이종 유전자를 추가로 함유하는 세균성 균주.
  6. 제5항에 있어서, 이종 유전자가 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해서는 사용되지 않는 외부 에너지원을 균주가 사용할 수 있도록 하는 세균성 균주.
  7. 제6항에 있어서, 이종 유전자가 아밀라제 유전자인 세균성 균주.
  8. 제5항에 있어서, 이종 유전자가, 이종 유전자의 생성물이거나 이러한 이종 유전자 생성물에 의해 제조되는 것인 목적하는 물질을 균주가 생성시킬 수 있도록 하는 세균성 균주.
  9. 서열번호 3(SecD) 또는 서열번호 4(SecF)의 서열을 갖는 단백질 또는 이의 각각의 상동성 단백질 또는 기능성 돌연변이체 또는 단편.
  10. 제9항에 따르는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호 3에 따르는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1에 상응하고, 서열번호 4에 따르는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 서열번호 2에 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
  12. 서열번호 1의 서열 및 서열번호 2의 서열 중 하나 이상 또는 이의 단편 또는돌연변이체를 함유하는 플라스미드 .
  13. 목적하는 물질의 생성을 위한 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 세균성 균주의 용도.
  14. 제13항에 있어서, 물질이 아미노산, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 그룹으로부터 선택되는 용도.
  15. 제14항에 있어서, 생성된 단백질이 이종 단백질인 용도.
  16. 제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 생성된 물질이 세균성 균주에 의해 분비되는 용도.
  17. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 세균성 균주, 제9항에 따르는 단백질 또는 제10항 또는 제11항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 제12항에 따르는 플라스미드의 리포터 시스템에서의 용도.
  18. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 세균성 균주를 포함하는 리포터 시스템.
  19. 제16항에 있어서, 시스템이 단백질 전위, 단백질 발현, 유전자 조절, 또는 유전자의 유도능력을 리포팅하는 리포터 시스템.
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