CN1425023A - 包含trp基因破坏的转基因小鼠 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及转基因动物、与基因功能鉴定相关的组合物和方法。

Description

包含TRP基因破坏的转基因小鼠
本申请要求1999年10月26日提交的美国临时申请60/161,488的权益，所述临时申请的全部内容通过引用结合到本文中。
                      发明领域
本发明涉及转基因动物、与基因功能鉴定相关的组合物和方法。
                      发明背景
在人类基因组中已经鉴定出许多多态三核苷酸重复。这些突变由可遗传的不稳定DNA产生，被称为“动态突变”，因为在世代之间遗传的重复单位的数目是变化的(Koshy等，Brain Pathol，7：927-42(1997))。虽然这些重复是高度多态性的，但其数量在正常个体中通常不超过40个重复(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM(TM).Johns Hopkins University，Baltimore，MD.MIM Number：603279：jlewis：7/14/1999；World Wide Web URL： http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/omim；Koshy等(1997))。
相比之下，已经发现异常扩增的三核苷酸重复引起疾病(OMIM603279)。致病的扩增通常含有超过40个三核苷酸重复，已经报道了200个或更多重复的序列段(OMIM 603279；Slegtenhorst-Eegdeman等，Endocrinology，139：156-62(1998))。已经鉴定出四种类型的三核苷酸重复扩增：(1)两种脆性X染色体综合征(FRAXA和FRAXE)中的长胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤(CGG)重复，(2)肌强直性营养不良中的长胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤(CTG)重复扩增，(3)Friedreich共济失调中的长鸟嘌呤-腺嘌呤-腺嘌呤重复扩增，和(4)涉及神经变性性疾病的短胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤重复扩增(CAG)。(Koshy等(1997))。
分类为1型和2型疾病的至少12种疾病由三核苷酸扩增突变所致，大多数具有神经精神特征(Margolis等，Hum Genet.，100：114-122(1997))。1型疾病由可读框中的(CAG)n扩增引起，产生扩增的谷氨酰胺重复。1型疾病包括1型脊髓小脑性共济失调(SCAl，Orr等，NatGenet，4：221-6(1993))、SCA2(Imbert等，Nat Genet，14：285-91(1996)；Pulst等，Nat Genet，14：269-76(1996)；Sanpei等，Nat Genet，14：277-84(1996))、Machado-Joseph病(MJD或SCA3，Kawaguchi等，Nat Genet，8：221-8(1994))、SCA6(Zhuchenko等，Nat Genet，15：62-9(1997))、dentatutorubral pallidoluysioan atrophy(DRPLA，Koide等，Nat Genet，6：9-13(1994))、亨廷顿舞蹈病(HD，Huntington’s Disease CollaborativeResearch Group，Cell，72：971-83(1993))和脊髓延髓性肌萎缩(SBMA，LaSpada，Nature，352：77-9(1991))。2型疾病可以由5’非翻译区中的扩增(Jacobsen综合征，Jones等，Nature，376：145-9(1995)；脆性X染色体综合征，Fu等，Science，1992 255：1256-8(1992))、3’非翻译区中的扩增(肌强直性营养不良，Brook等，Cell，68：799-808(1992)；Philips等，Science，280：737-41(1998))和内含子区中的扩增(Fredreich共济失调，Campuzano等，Science，271：1423-7(1996))引起。然而，对于扩增事件的机理和发生时间知之甚少(Bates等，Hum Mol Genet.，6：1633-7(1997))。
由三核苷酸重复扩增引起的疾病表现出称为早现遗传的现象，这种现象不能用传统的孟德尔遗传学来解释(Koshy等(1997))。早现遗传的定义是在连续世代中疾病的严重程度增加并且症状出现的年龄更早。早现遗传通常受遗传亲代性别的影响，对于大多数CAG重复性疾病而言，当为母性遗传时这种疾病更为严重。该病的严重程度和发病年龄与重复序列的大小有关(Koshy等(1997))。较大的扩增导致更早发病和临床表现更为严重。早现遗传的现象已经使人们怀疑，所述扩增重复的不稳定性是特定疾病的基础(OMIM 603279)。
带有扩增的三核苷酸重复序列段的蛋白质是不相关的，并且广泛表达，而且表达模式广泛重叠(Bates等(1997))。大多数蛋白是新的，但雄激素受体和电压门控αlA钙通道例外，它们在脊髓延髓性肌萎缩和6型脊髓小脑性共济失调中有突变。有趣的是，CAG重复蛋白在周围神经组织和中枢神经组织中均广泛表达，但在每种神经病中，仅一个选定的神经细胞群体由于所述扩增的重复而成为变性的靶(Koshy等(1997))。
尚不了解扩增导致神经元机能障碍和细胞死亡的机理(Bates等(1997))。目前的看法是，重复序列段的存在使所涉及的基因、信使或蛋白质获得功能。例如，已假定肌强直性营养不良基因(MD)转录物的扩增CUG重复区与CUG结合蛋白的不当相互作用逐渐演变出(titrate-out)通常构成(comprise)不均一核内核糖核蛋白颗粒的蛋白质(Bhagwati等，Biochim Biophys Acta，1317：155-7(1996)；Philips等(1998))。也已经提出，产生新型蛋白质-蛋白质相互作用或异常的蛋白质折叠以及侧翼基因表达和染色质结构的改变是三核苷酸扩增可能致病的机理(Thomton等，Nat.Genet.，16：407-9(1997))。
三核苷酸重复性疾病的小鼠模型对于揭示这些疾病的分子基础和开发治疗干涉而言有很大潜力和前景。转基因小鼠再现了人类疾病的许多特征，因而是研究体内疾病发展的优良模型系统。应用这种小鼠，将有可能在所述小鼠中对致病机理和三核苷酸重复的不稳定性进行建模(Bates等(1997))。
                     发明概要
本发明总的来说涉及转基因动物以及与基因功能鉴定相关的组合物和方法，更具体地讲，本发明涉及编码三核苷酸重复蛋白(TRP)的基因，例如基因T243。
本发明提供在编码TRP的靶DNA序列中包含破坏的细胞，优选干细胞，更优选胚胎干(ES)细胞。最好是，所述靶DNA序列是T243。在一个优选实施方案中，所述干细胞是鼠类ES细胞。按照一个实施方案，通过获得与所述靶DNA序列同源的序列，并将所述序列插入打靶构建体中，产生所述破坏。然后将打靶构建体导入所述干细胞中，构建在所述靶DNA序列中产生破坏的同源重组体。
在一个更优选的实施方案中，采用不依赖连接作用的克隆，将所述同源序列的两种不同片段插入具有第二多核苷酸序列(最好是编码正选择标记的基因)的载体中，使得所述第二多核苷酸序列定位于所述构建体中的所述两种不同的同源序列片段之间，构建所述打靶构建体。在该实施方案的一个方面，所述同源序列可以通过以下方法获得：产生与所述靶互补的两种引物；使所述引物退火到小鼠基因组DNA文库中含有所述靶区域的互补序列上；并且扩增与所述靶区域同源的序列。然后分离出具有由所述引物形成的终点的扩增反应产物。最好是通过PCR进行扩增，更优选通过长距离PCR(long-range PCR)进行扩增。在另一实施方案中，所述载体还包含编码筛选标记的基因。在再一实施方案中，所述载体也包括邻接所述正选择标记的重组酶位点。
本发明还提供在编码TRP的基因中带有破坏的脊椎动物，最好是小鼠。在一个实施方案中，本发明提供一种敲除小鼠，所述小鼠具有正常编码并表达功能性TRP的基因的非功能性等位基因。本发明包括一种敲除小鼠，所述敲除小鼠具有两个正常编码并表达功能性TRP的基因的非功能性等位基因，因而不能产生野生型TRP。最好是，通过将包含本文所述任一种或者本领域可得到的编码TRP的破坏的基因的干细胞，注射或者其它方法导入胚泡中，产生所述小鼠。然后将所得的胚泡注射到假孕小鼠体内，随后让其分娩出在其种系中带有编码所述TRP的受破坏基因的嵌合小鼠。本领域技术人员会认识到，可以繁育所述嵌合小鼠，以产生在编码所述TRP的基因中带有杂合破坏和带有纯合破坏的两种小鼠。
按照一个实施方案，所述破坏改变了TRP基因启动子、增强子或剪接位点中的至少一个，致使所述小鼠不表达功能性TRP蛋白。在另一实施方案中，所述破坏是插入突变、错义突变、移码突变或缺失突变。然后可以观察这类敲除小鼠的表型。
本发明的一个方面是表型包括相对于普通正常野生型成年小鼠体重降低的敲除小鼠。通常，敲除小鼠的体重降低至少约15％。另一方面是表型包括相对于普通正常野生型成年小鼠身长降低的敲除小鼠。通常，身长至少降低约10％。本发明的再一方面是表型包括相对于正常野生型成年小鼠体重与身长之比降低的敲除小鼠。一般而言，观察到至少约20％的降低。
在本发明的另一实施方案中，敲除小鼠的表型包括软骨病。通常存在异常软骨，并且软骨生成减少。
本发明的另一方面是表型包括骨病的小鼠。通常，所述骨病包括骨异常和骨生成减少。在一个实施方案中，敲除小鼠表型的特征是软骨发育不良。
在本发明的再一实施方案中，敲除小鼠的表型包括肾病。通常观察到肾畸形。在一个实施方案中，敲除小鼠的表型包括肾发育不良。
本发明也提供能够影响敲除小鼠表型的因子的鉴定方法。按照该方法，将推定的因子给予敲除小鼠。然后测定敲除小鼠对所述推定因子的反应，并将其与“正常”或野生型小鼠的反应比较。本发明还提供按照这类方法鉴定的因子。
在本发明的又一个实施方案中，提供其中编码TRP的靶DNA序列已被破坏的敲除细胞。按照一个实施方案，所述破坏抑制野生型TRP的产生。可以从敲除干细胞、组织或动物得到细胞或细胞系。在又一实施方案中，所述细胞是稳定的细胞培养物。
本发明也提供包含编码TRP的核酸序列的细胞系。这类细胞系可以借助于与在所述细胞系中有功能的启动子有效连接，能够表达这类序列。最好是，编码所述TRP的序列的表达处于诱导型启动子的控制之下。
本发明还提供新型的先前未鉴定过的编码TRP的核酸序列。也提供鉴定与TRP相互作用的因子的方法，所述方法包括使所述TRP与一种因子接触并且检测因子/TRP复合物的步骤。
本发明也提供治疗骨病的方法，所述方法包括将能够影响敲除小鼠表型的因子给予合适的受治疗者。合适的受治疗者包括但不限于哺乳动物，包括人类。在一个实施方案中，所述骨病是软骨发育不良。本发明也提供缓解骨病症状的方法，所述骨病症状例如骨缩短、生长板异常和椎骨变小。在可以给予的因子中有T243蛋白、其片段以及T243的天然和合成类似物。
也提供用于治疗软骨病的方法，所述方法包括将能够影响敲除小鼠表型的因子给予受治疗者。在一个实施方案中，所述软骨病是软骨发育不良。也提供缓解软骨病症状的方法，所述软骨病症状包括软骨岛大、不规则、软骨细胞柱(chondrocyte column)短以及软骨薄而不规则。
治疗肾病的方法也包括在本发明范围内。按照该方法，将有效量的因子例如T243蛋白、T243蛋白片段或T243的天然或合成类似物给予受治疗者。在一个实施方案中，所述肾病是肾发育不良。本发明也包括缓解与肾病相关的症状的方法，所述症状例如小的异常生成的肾。
本发明也提供确定TRP中三核苷酸重复的扩增是否引起表型改变的方法。按照该方法，使其中正选择标记侧翼为重组酶位点的敲除干细胞与一种合成核酸接触。所述合成核酸包括侧翼为重组酶靶位点的三核苷酸重复。在识别所述重组酶靶位点的重组酶存在下，在所述合成核酸中的重组酶位点与邻接所述正选择标记的重组酶位点之间，通过酶辅助位点专一性发生重组，从而产生转基因干细胞。然后可以将所产生的转基因干细胞的表型与正常的野生型干细胞比较，以确定三核苷酸扩增是否产生表型改变。最好是，所述合成核酸包括至少约20个三核苷酸重复。所述酶辅助位点专一性可以例如是Cre重组酶-lox靶系统、或FLP重组酶-FRT靶系统。
本发明也提供编码TRP的基因有三核苷酸扩增的脊椎动物、最好是小鼠。在一个实施方案中，所述小鼠的产生是通过将含有扩增型TRP基因的转基因干细胞导入胚泡中来进行的。然后将所产生的胚泡植入假孕小鼠中，随后让其分娩出在其种系中含有所述扩增型三核苷酸重复基因的嵌合小鼠。然后可以繁育所述嵌合小鼠，以产生在编码所述TRP的基因中带有或者杂合或者纯合破坏的小鼠。
本发明还提供新的扩增型TRP基因以及由这些基因编码的蛋白质。也提供一种鉴定与扩增型TRP相互作用的因子的方法，所述方法包括以下步骤：使所述扩增型TRP与一种因子接触，并且测定因子/扩增型TRP复合物，从而鉴定与所述扩增型TRP相互作用的因子。
本发明也提供细胞系，所述细胞系包含编码扩增型TRP的核酸序列，能够通过与在所述细胞系中有功能的启动子有效连接而表达这类序列。最好是，编码所述扩增型TRP的序列的表达，处于诱导型启动子的控制之下。
本文所用的“基因打靶”是当将基因组DNA的片段导入哺乳动物细胞中、所述片段定位并且与内源同源序列重组时发生的一种类型的同源重组。
在基因组DNA的片段定位并与内源同源序列重组，致使正常野生型基因产物的产生受到抑制时，发生靶基因的“破坏”。破坏的非限制性实例包括插入突变、错义突变、移码突变和缺失突变。基因打靶也可以改变靶基因的启动子、增强子或剪接位点，而引起破坏，也可以包括启动子被外源启动子例如下述的诱导型启动子取代。
本文所用的“敲除小鼠”是在其基因组中含有已经用基因打靶方法破坏或失活的特定基因的小鼠。敲除小鼠既包括杂合子小鼠(即一个缺陷型等位基因和一个野生型等位基因)，也包括纯合突变体(即两个缺陷型等位基因)。半合子小鼠也包括在本发明范围内。人们会理解，在正常的野生型动物中，某些基因例如雄性中的性连锁基因仅存在一个拷贝(即在正常野生型动物中是半合子)。正常为半合子的基因被破坏的敲除小鼠，将具有一个该基因的缺陷型等位基因。
术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。核苷酸可以具有任何三维结构，可以执行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括单链分子、双链分子和三股螺旋分子。
“寡核苷酸”是指具有5个和约100个核苷酸之间的单链或双链DNA的多核苷酸。寡核苷酸也称为寡聚物或oligo，可以从基因中分离出，或用本领域已知的方法化学合成。“引物”是指通常为单链的寡核苷酸，它为酶介导的核酸合成的起始提供3’-羟基末端。
以下是多核苷酸的非限制性实施方案：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具任何序列的分离的DNA、具任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子也可以包括经修饰的核酸分子，例如甲基化核酸分子和核酸分子类似物。嘌呤和嘧啶的类似物是本领域已知的，包括但不限于氮丙啶基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、5-戊炔基尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。在脱氧核糖核酸中用尿嘧啶作为胸腺嘧啶的取代基，也被认为是嘧啶的类似物形式。
多核苷酸的“片段”是由编码序列或非编码序列的至少9个连续核苷酸组成的多核苷酸，所述至少9个连续核苷酸包括10个、11个、12个、13个或14个连续核苷酸，优选至少15个连续核苷酸，更优选至少45个核苷酸，也包括至少60个核苷酸。
本文使用的“碱基对”也称为“bp”，是指互补的核酸分子。在DNA中有四种“类型”的碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)形成氢键，而嘌呤碱基鸟嘌呤(G)与嘧啶碱基胞嘧啶(C)形成氢键。每个形成氢键的碱基对设置也被称为Watson-Crick碱基对。一千个碱基对通常称为一个千碱基对或kb。“碱基对错配”是指核酸分子中碱基不是互补的Watson-Crick碱基对的位置。短语“在任何位置都不包括至少一种类型的碱基”是指在任何位置都不具有四种碱基中的一种的核苷酸序列。例如，缺乏一种核苷酸(即缺乏一种类型的碱基)的序列可以由A、G、T碱基对组成，而不含C残基。
本文所用的术语“构建体”是指待转移到靶组织、细胞系或动物(包括人类)中的人工装配的DNA区段。通常，所述构建体将包括特定的目的(interest)基因或序列、标记基因和合适的控制序列。术语“质粒”是指自主自我复制型染色体外DNA分子。在一个优选实施方案中，本发明的质粒构建体含有一个位于目的基因两个侧翼区之间的正选择标记。可任选的是，所述构建体也可以含有一种筛选标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。如果存在的话，所述筛选标记位于所述侧翼区之外并与之距一定距离。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”是指用热稳定聚合酶(例如Taq聚合酶)和两种寡核苷酸引物扩增DNA碱基序列的方法；其中一种引物与待扩增序列一个末端的(+)链互补，而另一种引物与另一末端的(-)链互补。因为新合成的DNA链随后可以用作相同引物序列的额外模板，所以连续多轮的引物退火、链延伸和解离，导致所需序列以指数高度特异性地扩增。PCR也可以用来检测DNA样品中特定序列的存在。“长距离”是指允许扩增大的核苷酸序列段(例如大于1kb)的PCR条件。
本文所用的术语“正选择标记”是指这样一种基因，所述基因编码一种致使在某些条件下仅携带该基因的细胞存活和/生长的产物。例如，表达所导入的新霉素抗性(Neor)基因的植物和动物细胞对化合物G418具有抗性。不带有Neor基因标记的细胞被G418杀死。其它正选择标记是本领域技术人员已知的。
“正-负选择”是指选择携带在特定打靶位置整合的DNA插入片段的细胞(正选择)以及选择除去携带在染色体的非打靶位点整合的DNA插入片段的细胞(负选择)的过程。负选择插入片段的非限制性实例包括编码胸苷激酶(tk)的基因。适合于正-负选择的基因是本领域已知的，参见例如美国专利5,464,764。
“筛选标记”或“报道基因”是指所编码的产物可容易地分析的基因。例如，报道基因可以用来确定特定DNA构建体是否已经成功地导入细胞、器官或组织中。筛选标记的非限制性实例包括编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因或者编码经修饰的荧光蛋白的基因。“负筛选标记”不应被解释为负选择标记；负选择标记通常杀死表达该标记的细胞。
术语“载体”是指可以携带所插入DNA并且可以在宿主细胞中保持的DNA分子。载体也被称为克隆载体(cloning vector)、克隆载体(cloning vehicle)或载体(vehicle)。该术语包括主要用来将核酸分子插入细胞的载体、主要用来复制核酸的复制型载体以及用来转录和/或翻译所述DNA或RNA的表达载体。也包括提供不止一种上述功能的载体。在一个优选实施方案中，所述载体含有可用于本文所述方法的位点，例如本文描述的载体“pDG2”或“pDG4”。
“宿主细胞”包括可以成为或已经是载体受体或掺入核酸分子和/或蛋白的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，所述子代由于天然突变、意外突变或有意的突变，可能不一定与原始亲代完全相同(在形态学方面或总DNA互补序列方面)。宿主细胞包括用本发明的构建体转染的细胞。
术语“基因组文库”是指由一组代表一种生物的基因组、随机产生的重叠DNA片段所构成的克隆的集合体。“cDNA文库”(互补DNA文库)是将细胞、组织或生物中存在的mRNA分子用反转录酶转变为cDNA分子、然后插入载体(在加入外源DNA后可以继续复制的其它DNA分子)中得到的集合体。供文库用的示范性载体包括噬菌体(bacteriophage)(也称为“噬菌体(phage))”，它们是感染细菌的病毒，例如λ噬菌体。然后在所述文库中探测所述特定的目的cDNA(以及从而探测mRNA)。在一个实施方案中，将噬菌体载体系统的高效率与质粒系统的便利性相结合的文库系统(例如ZAP系统，得自Stratagene，La，Jolla，CA)用于实施本发明。
术语“同源重组”是指两种DNA分子或染色质之间在具同源核苷酸序列(即优选具有约70％序列同一性、通常至少约85％同一性、优选至少约90％同一性、或者至少约95-98％同一性的那些序列)的位点进行DNA片段的交换。用“BLASTN”算法，例如在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov：80/BLAST/(Basic，Advanced或PSI)可在线得到、并且在以下任一文献中描述的BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))2.0，可以测定同源性和/或同一性百分比，所述文献是：ALtschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.(1990)“基本局部比对搜索工具”J.Mol.Biol.215：403-410.(Medline)；Gish，W.和States，D.J.(1993)“通过数据库相似性搜索鉴定蛋白质编码区”Nature Genet.3：266-272.(Medline)；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.和Zhang，J.(1996)“网络BLAST服务器的应用”Meth.Enzymol.266：131-141.(Medline)；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.(1997)“包括空位的BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序”Nucleic AcidsRes.25：3389-3402.(Medline)；以及Zhang，J.和Madden，T.L.(1997)“PowerBLAST：交互或自动序列分析和注释的一个新的网络BLAST应用”Genome Res.7：649-656.(Medline)。不言而喻，同源序列可以在所述核苷酸序列中包括插入、缺失和取代。因此，即使某些核苷酸残基不完全对应或比对，核苷酸的线性序列也可以是基本上相同的。
本文所用的术语“不依赖连接作用的克隆”以常规含义使用，是指无需激酶或连接酶而将DNA分子掺入到载体或染色体中。例如在Aslanidis和de Jong，Nucleic Acids Res.，18：6069-74和顺序号为07/847,298(1991)的美国专利申请中，描述了不依赖连接作用的克隆技术。
本文所用的术语“靶序列”(或者称为“靶基因序列”或“靶DNA序列”)是指具有在整个群体中其序列与任何疾病或可分辨表型都不相关的任何多核苷酸的核酸分子。注意到，在整个群体中，野生型基因可能包括多种优势形式，所述优势形式相互之间在序列中含有改变，尚不引起可分辨的病理学效应。这些变异被称为“多态性”或“等位基因变异”。
在一个优选实施方案中，所述靶DNA序列包含所述个体基因组DNA中特定基因或基因座的一部分。最好是，所述靶DNA序列编码一种TRP，最好是具有编码亮氨酸的CTG的三核苷酸重复。按照一个实施方案，所述靶DNA包含基因产物功能未知的特定基因或基因座的一部分，所述基因例如为用部分cDNA序列(例如EST)鉴定的基因。在一个优选实施方案中，所述靶TRP基因是T243。最好是，所述靶DNA序列包含SEQ ID NO：47(鼠类)或SEQ ID NO：57(人类)或其天然存在的等位基因变异体。
术语“外切核酸酶”是指从线性核酸底物的游离末端顺序切割核苷酸的酶。外切核酸酶对双链或单链核苷酸是专一性的和/或定向的，例如3’-5’和/或5’-3’。某些外切核酸酶显示出其它酶活性，例如T4DNA聚合酶既是聚合酶，又是活性3’-5’外切核酸酶。其它示范性外切核酸酶包括：外切核酸酶III，该酶从不具有磷酸化3’末端的双链DNA的5’末端一次除去一个核苷酸；外切核酸酶VI，该酶通过切去单链DNA两端的核苷酸而制备寡核苷酸；以及外切核酸酶λ，该酶从连接有5’-磷酸基团的双链DNA的5’末端切除核苷酸。
术语“重组酶”包括：诱导、介导或促进重组的酶；引起、介导或促进核酸序列重排或在第二核酸序列切除或插入第一核酸序列的其它核酸修饰酶。重组酶的“靶位点”是所述重组酶所识别(例如与其特异性地结合)和/或作用(切除、切割或诱导重组)的核酸序列或区域。本文所用的表述“酶指导的位点专一性重组”将包括以下三种事件：
1.缺失重组酶靶位点所邻接的预选定的DNA区段；
2.将重组酶靶位点所邻接的预选定DNA区段的核苷酸序列倒位；
3.将位于不同DNA分子上邻近重组酶靶位点的DNA区段相互交换。
                     附图简述
图1是一幅简图，描述一种构建本发明打靶载体的方法。该质粒PCR法在实施例9和实施例10中有描述。
图2A是一幅简图，描述pDG2载体。该载体含有一个氨苄青霉素抗性基因和一个新霉素(Neor)基因。在Neor基因的两侧有两个供不依赖连接作用的克隆用的位点以及限制性酶切位点。pDG2的序列示于图2B和SEQ ID NO：1中。
图3A是一幅简图，描述pDG4载体。该载体含有一个氨苄青霉素抗性基因、一个新霉素(Neor)基因和一个绿色荧光蛋白(GFP)基因。在Neor基因的两侧有两个供不依赖连接作用的克隆用的位点以及限制性酶识别位点。pDG4的序列示于图3B和SEQ ID NO：2中。
图4(SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：10)显示了经PCR扩增的基因组DNA末端所含有的退火位点1-4在用T4 DNA聚合酶处理之前和之后的核酸序列。
图5(SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：18)显示了pDG2载体中所含有的退火位点1-4在用T4 DNA聚合酶处理之前和之后的核酸序列。
图6显示了在退火反应期间5’和3’侧翼DNA相对于pDG2载体内的退火位点1、2、3和4的重排。
图7显示了在退火反应期间5’和3’侧翼DNA相对于pDG4载体内的退火位点1、2、3和4以及GFP筛选标记的重排。
图8显示了用于实施例4-10中的寡核苷酸引物的序列(SEQ IDNO：19-SEQ ID NO：44)。小写序列是克隆位点(例如不依赖连接作用的克隆序列)。
图9显示了两只杂合T243敲除小鼠之间交配编号1799的子代的身长、体重和体重/身长之比。
图10显示了两只杂合T243敲除小鼠之间交配编号1808的子代的身长、体重和体重/身长之比。
图11显示了编码鼠类TRP(SEQ ID NO：52)(具体地说，是T243的表达产物)的核酸序列(SEQ ID NO：47)；和编码人类TRP(SEQ IDNO：58)的核酸序列(SEQ ID NO：57)。
图12显示了鼠类TRP的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)和人类TRP的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)。
图13显示了用于PCR扩增与靶基因T243同源的序列的寡核苷酸引物的核酸序列(SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：46)。还显示了具有克隆位点的所述引物(SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：49)和用于鉴定靶基因T243中含有的文库部分的引物的核酸序列(SEQ ID NO：55；SEQ IDNO：56)。
图14显示了通过PCR扩增产生的、与靶基因T243同源的序列的核酸序列(SEQ ID NO：50；SEQ ID NO：51)。
图15显示了用包含同源序列(SEQ ID NO：50；SEQ ID NO：51)的构建体产生的靶基因T243的缺失型基因片段的核酸序列(SEQ IDNO：59)。还显示了扩增型T243基因的核酸序列(SEQ ID NO：53)以及相应表达产物的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)。
                      发明详述
本发明部分基于对于基因的表达和作用以及基因表达产物、主要是与三核苷酸重复蛋白相关的那些基因产物的评估。尤其是，这使得可以确定疾病途径(disease pathway)和鉴定该途径中在诊断和治疗方面有用的靶。例如，在病症状况下突变的或被负调节的基因，可能参与引起该病症或使其恶化。目标在于正调节这类基因活性的治疗或涉及替代途径的治疗，可能缓解所述病症。
本文所用的“基因”是指：(a)含有本文所公开的DNA序列中至少一种的基因；(b)编码由本文公开的DNA序列所编码的氨基酸序列的任何DNA序列；和/或(c)与本文公开的编码序列的互补序列杂交的任何DNA序列。最好是，该术语包括编码区和非编码区，最好包括正常基因表达所必需的所有序列，包括启动子、增强子和其它调节序列。
本发明也包括与前一段落中的DNA序列(a)-(c)杂交、并因此是所述DNA序列(a)-(c)的互补序列的核酸分子，最好是DNA分子。这种体外杂交条件可以是高度严格性的，或严格性不太高。高度严格性条件例如包括在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并且在0.1×SSC/0.1％SDS于68℃洗涤(参见Ausubel F.M.等编著，1989，Current Protocols inMolecular Biology，第I卷，Green Publishing Associates，Inc.，和JohnWiley & Sons，Inc.，New York，第2.10.3页；Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第2卷，Cold Springs Harbor Laboratory，Cold Springs，N.Y.，第8.46-8.47页(1995)，这两个参考文献均通过引用结合到本文中)，而严格性不太高的条件诸如中等严格性条件，例如在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗涤(Ausubel等，1989，参见上文；Sambrook等，1989，参见上文)。
在核酸分子是脱氧寡核苷酸(“oligo”)的情况下，高度严格性条件可以是指例如在6×SSC/0.05％焦磷酸钠中于37℃(对于14个碱基的oligo)、48℃(对于17个碱基的oligo)、55℃(对于20个碱基的oligo)和60℃(对于23个碱基的oligos)洗涤。这些核酸分子在体内可以用作在例如靶基因的调节有用的靶基因反义分子和/或用作靶基因核酸序列扩增反应中的反义引物。此外，这类序列可以用作核酶序列和/或三股螺旋序列的一部分，也可用于靶基因的调节。再者，这类分子可以用作诊断方法中的组分，从而可以检测致病等位基因的存在。
本发明也包括：(a)含有任一前述编码序列和/或其互补序列(即反义序列)中的DNA载体；(b)含有与指导任一前述编码序列表达的调节元件有效连接的所述编码序列的DNA表达载体；和(c)含有与指导任一前述编码序列在宿主细胞中表达的调节元件有效连接的所述编码序列的基因工程宿主细胞。本文所用的调节元件包括但不限于诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵基因和本领域技术人员已知的驱动和调节表达的其它元件。本发明包括任一本文公开的DNA序列的片段。
除上述基因序列外，采用本领域众所周知的分子生物学技术，无需过度实验，就可以鉴定这类序列的同源物，例如可能存在于其它物种的同源物，并且可以容易地将其分离出。此外，在基因组中的其它基因座可能存在编码与这类基因产物的一个或多个结构域具有广泛同源性的蛋白质的基因。这些基因也可以用相似的技术来鉴定。
例如，可以对经分离的差异表达的基因序列或其部分进行标记，并用来筛选由得自目的生物的mRNA构建的cDNA文库。当从与所述标记序列所来源的生物类型不同的生物中得到cDNA文库时，杂交条件的严格性要低些。另一方面，采用适宜的严格性条件，又可以用标记片段来筛选由目的生物制备的基因组文库。这种低严格性条件是本领域技术人员众所周知的，可以预测，根据所述文库和标记序列所来源的具体生物，这种低严格性条件会有所改变。有关这类条件的指南，参见例如Sambrook等，1989，Ausubel等，1989。
在所鉴定的基因是正常的或野生型基因的情况下，该基因可以用来分离所述基因的突变型等位基因。就已知有或怀疑有遗传基础的过程和疾病而论，这样一种分离是优选的。可以从或者已知有或怀疑有导致病症的基因型的个体，分离出突变型等位基因。然后可以将突变型等位基因和突变型等位基因产物用于治疗和诊断分析系统中。
可以例如采用本领域技术人员众所周知的技术-PCR，分离突变型基因的cDNA。在这种情况下，通过使寡聚dT寡核苷酸与从组织中分离的并且已知或怀疑在推定携带所述突变型等位基因的个体中表达的mRNA杂交，并且通过用反转录酶延伸所述新链，可以合成第一条cDNA链。然后，用与正常基因5’端特异性杂交的寡核苷酸，合成所述cDNA的第二条链。然后用这两种引物通过PCR扩增所述产物，将所述产物克隆到合适的载体中，用本领域技术人员熟知的方法进行DNA序列分析。通过比较突变型基因和正常基因的DNA序列，可以确定导致所述突变型基因产物功能丧失或改变的突变。
或者，可以构建基因组文库或cDNA文库，并且分别用从已知或怀疑在怀疑或已知携带所述突变型等位基因的个体中表达目的基因的组织中得到的DNA或RNA进行筛选。然后可以标记所述正常基因或其任何合适的片段，将其用作探针，鉴定所述文库中相应的突变型等位基因。可以通过本领域中常规使用的方法，纯化含有该基因的克隆，并且对其进行序列分析。
任何本领域已知的技术都可以用来将靶基因转基因导入动物中，以产生转基因动物的建立者系。这类技术包括但不限于：原核微注射(美国专利第4,873,191号)；反转录病毒介导的基因转移到种系中(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82：6148-6152(1985))；胚胎干细胞中的基因打靶(Thompson等，Cell，56：313-321(1989))；胚胎电穿孔(Lo，Mol Cell.Biol.，3：1803-1814(1983))；和精子介导的基因转移(Lavitrano等，Cell，57：717-723(1989))等。有关这类技术的综述，参见Gordon，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cytol.，115：171-229(1989)，该文献通过引用全部结合到本文中。
在一个优选实施方案中，采用同源重组来产生本发明的敲除小鼠。最好是，以两步产生所述构建体，即(1)扩增(例如使用长距离PCR)与靶序列同源的序列，和(2)将另一种多核苷酸(例如一种选择标记)插入所述PCR产物中，使得其侧翼为所述同源序列。通常，所述载体是来自质粒基因组文库的质粒。构建好的构建体也常常是环状质粒。因此，如图1所示，采用长距离PCR和“向外(outwardly pointing)”寡核苷酸，产生其中可以容易插入选择标记、最好是通过不依赖连接作用的克隆插入选择标记的载体。然后将所述构建体导入ES细胞，在此它可以破坏所述同源靶序列的功能。
同源重组也可以用来敲除干细胞和不是全能胚胎干细胞的其它细胞类型中的基因。作为实例，干细胞可以是骨髓细胞、淋巴样细胞或神经祖细胞或前体细胞。这类敲除细胞可能在研究个体发育途径中靶基因的功能方面特别有用。干细胞可以来源于任何脊椎动物，例如小鼠、大鼠、狗、猫、猪、兔、人类、非人类灵长类等。
在非全能的细胞中，可能最好是用本领域已知的方法敲除所述靶的两个拷贝。例如，对包含靶基因座的同源重组的细胞，根据正选择标记(例如Neor)的表达进行选择，并且根据非随机整合进行筛选，经过选择和筛选的所述细胞可以通过暴露于提高水平的选择剂(例如G418)，进一步选择具有多拷贝所述选择标记的细胞。然后，分析所述细胞在靶基因座的纯合性。或者，可以在所述两个同源序列之间插入一个不同的正选择标记，产生第二构建体。可以将这两种构建体或者顺序导入细胞，或者同时导入细胞，然后根据每种正选择标记基因进行合适的选择。根据所述靶的两种等位基因的同源重组，对最终的细胞进行筛选。
另一方面，扩增目的克隆的两个分开的片段，采用不依赖连接作用的克隆技术将它们插入到含有正选择标记的载体中。在该实施方案中，目的克隆一般来自噬菌体文库，并且用PCR技术鉴定和分离。可以用两个步骤或用一个步骤进行不依赖连接作用的克隆。
按照一个优选方法，使用具有多个可以产生5’-3’单链区的位点的构建体。这些构建体，最好是质粒，包括能够进行定向的四向(four-way)不依赖连接作用的克隆的载体。
所述构建体通常包含：一个编码正选择标记的序列(例如编码新霉素抗性的基因)；在所述正选择标记任一侧的一个限制性酶切位点；和邻接所述限制性酶切位点、不含4个碱基对之一的序列。这种构型使得可以通过用合适的限制性酶消化所述构建体，并且用具有外切核酸酶活性的化合物(例如T4 DNA聚合酶)处理所述片段，在所述序列中产生单链末端。
在一个优选实施方案中，适用于将定向突变导入ES细胞的构建体最好直接由质粒基因组文库制备。采用长距离PCR与特异性引物，以一个步骤从所述质粒文库中鉴定并分离出目的序列。在分离该序列之后，可以容易地把要破坏所述靶序列的第二多核苷酸插入编码所述目的序列的两个区之间。采用这种直接方法，可以在少至72小时内构建定向构建体。在另一实施方案中，如下所述，在噬菌体基因组文库中鉴定目的克隆之后，制备定向构建体。
本文所述的方法消除了杂交分离、限制性作图和多克隆步骤的需要。而且，采用这些方法可以测定任何基因的功能。例如，可以用短序列(例如EST)来设计寡核苷酸探针。这些探针可以用于直接扩增程序中，以构建构建体；或者可以用来筛选基因组文库或cDNA文库中较长的全长基因。因此，考虑了，可以快速有效地制备任何基因，以供用于ES细胞。
在一个优选实施方案中，直接从质粒基因组文库制备构建体。可以采用本领域已知的任何方法制备所述文库。最好是，从小鼠ES细胞分离DNA，用限制性内切核酸酶处理，将所述DNA切割为片段。然后将所述DNA片段插入载体中，例如插入噬菌体或噬菌粒(例如λZAPTM，Stratagene，La Jolla，CA)系统中。当在ZAPTM系统中构建该文库时，所述DNA片段最好在约5千碱基和约20千碱基之间。
最好是，用于制备文库的生物没有可分辨的疾病或表型效应。所述文库最好是小鼠文库。该DNA可以从任何细胞来源或体液获得。可用于临床实践的细胞来源的非限制性实例包括ES细胞、肝细胞、肾细胞、血细胞、口颊细胞(buccal cells)、宫颈阴道细胞、得自尿的上皮细胞、胎儿细胞或在通过活组织检查获得的组织中存在的任何细胞。体液包括尿、血液、脑脊液(CSF)和感染或炎症部位的组织渗出液。用本领域已知的任何方法，从所述细胞或体液提取DNA。最好是，通过将5ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM EDTA(pH8.0)、10mMNaCl、0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K)加入含有汇合的胚胎干细胞的100mm平板中，提取所述DNA。然后将细胞于约60℃孵育数小时或直至完全裂解。通过数轮温和的苯酚：氯仿抽提、然后乙醇沉淀，从裂解的细胞中纯化基因组DNA。为了方便起见，将基因组文库布置成多个库。
在一个优选实施方案中，用寡核苷酸引物和长距离PCR，从所述质粒文库中鉴定目的序列。通常，引物是根据从部分基因序列获得的序列信息(例如cDNA或EST序列)设计的向外引物。例如图1中所示，所述产物将是不包括位于每种引物之间的区域的线性片段。
被认为合适的PCR条件在以下实施例中描述。人们会理解，本领域技术人员可以容易地确定最适PCR条件。(参见例如PCR 2：APractical Approach(1995)M.J.McPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，IRL Press，Oxford；Yu等，Methods Mol.Bio.，58：335-9(1996)；Munroe等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.，USA，92：2209-13(1995))。对文库进行PCR筛选，消除了与常规杂交筛选相关的许多问题和时间的延迟，在所述常规杂交中，必须将文库铺平板、制备滤膜、制备放射性探针和建立杂交条件。PCR筛选仅需要目的序列(基因)的寡核苷酸引物。可以采用几种方法，包括但不限于微量过滤、透析、凝胶电泳等，来纯化PCR产物。可能最好是除去用于PCR中的聚合酶，使得不能够发生新的DNA合成。合适的热稳定DNA聚合酶是可在市场上获得，例如VentTM DNA聚合酶(New England Biolabs)、Deep VentTM DNA聚合酶(New England Biolabs)、HotTubTM DNA聚合酶(Amersham)、ThermoSequenaseTM(Amersham)、rBstTM DNA聚合酶(Epicenter)、PfuTM DNA聚合酶(Stratagene)、Amplitaq GoldTM(Perkin Elmer)和ExpandTM(Boehringer Mannheim)。
为了产生构建好的构建体，把会破坏所述靶序列的序列插入所述PCR扩增的产物中。例如，如本文所述，直接方法包括将长距离PCR产物(即载体)和一种片段(即编码选择标记的基因)连接在一起。如上所论述，所述载体含有与所述靶DNA序列同源的两个不同的序列区。最好是，所述载体也含有编码选择标记(例如氨苄青霉素)的序列。所述载体和片段的设计使得当对其进行处理而形成单链末端时，它们将退火，使得所述片段定位于与所述靶基因基本同源的两个不同区之间。
虽然任何克隆方法都是适用的，但最好是用不依赖连接作用的克隆策略，来装配包含邻接选择标记的两个不同同源区的构建体。不依赖连接作用的克隆(LIC)是一种无需使用激酶或连接酶而定向克隆多核苷酸的策略。(参见例如Aslanidis等，Nucleic Acids Res.，18：6069-74(1990)；Rashtchian，Current Opin.Biotech.，6：30-36(1995))。通常通过用T4 DNA聚合酶在仅存在一种dNTP的情况下处理所述载体(在经消化的限制性酶切位点)，在LIC载体中产生单链尾(也称为克隆位点或退火序列)。T4 DNA聚合酶的3’-5’外切核酸酶活性除去核苷酸，直至它遇到对应于反应混合物中存在的所述单一dNTP的残基。这时，该酶的5’-3’聚合酶活性抵消了外切核酸酶活性，阻止进一步切割。所述载体的设计，使得所产生的单链尾是非互补的。例如，在pDG2载体中，所述4个退火位点的单链尾相互之间都不互补。通过使5’适当地延伸到寡核苷酸引物中，产生PCR产物。纯化PCR产物，以除去dNTP(如果将原始质粒用作模板，也除去原始质粒)，然后用在存在合适的dNTP的情况下用T4 DNA聚合酶处理，产生特异性的载体匹配的突出端。通过使匹配的尾退火而发生克隆。例如用化学法或酶法，在所述克隆片段末端产生单链尾。在所述载体上产生互补尾；然而为了防止无插入片段的载体退火，所述载体尾相互之间不互补。尾的长度至少约5个核苷酸，优选至少约12个核苷酸，甚至更优选至少约20个核苷酸。
在一个实施方案中，将重叠的载体和片段置于同一反应中，足以使其退火。或者，将互补序列混合，加热并让其缓慢冷却。加热步骤优选在约60℃和约100℃之间进行，更优选在约60℃和80℃之间进行，甚至更优选在60℃和70℃之间进行。然后，让加热反应物冷却。一般而言，冷却的发生相当缓慢，例如，在约室温，所述反应一般在约1小时后发生。冷却必须足够缓慢，以便让其退火。退火的片段/载体可以直接使用，或于-20℃冻存待用。
此外，通过调节盐和温度而达到合适的条件，可以进行退火。在范围在约10mM NaCl至约600mM NaCl的溶液中，于范围为约37℃至约65℃的温度下，进行杂交反应。人们会理解，杂交反应的严格性由盐浓度和温度两者决定。例如，在10mM盐中37℃进行杂交，其严格性与在500mM盐中65℃的严格性相似。对于本发明，可以使用在同源互补序列之间形成杂交体的任何杂交条件。
如图1所示，在一个实施方案中，在应用这些退火方法中的任一种后制备构建体，其中所述载体部分含有与靶基因(用长距离PCR从质粒文库中扩增的)基本同源的两个不同区，而所述片段是编码选择标记的基因。
在退火后，用本领域已知的方法，将所述构建体转化到感受态大肠杆菌细胞(例如DH5-α细胞)中，扩增所述构建体。分离的构建体随时可用于导入ES细胞。
在另一实施方案中，在汇集的基因组文库中，用PCR鉴定目的克隆。在一个实施方案中，所述PCR条件使得编码选择标记的基因可以直接插入到鉴定为阳性的克隆中。所述标记定位于与靶DNA具有基本同源性的两个不同序列之间。
可以采用本领域已知的和实施例中描述的任何方法，制备基因组噬菌体文库。最好是，通过将基因组DNA切割成长度约20千碱基的片段，用λ噬菌体制备小鼠胚胎干细胞文库。然后，将所述片段插入到任何合适的λ克隆载体例如λFix II或λDash II(Stratagene，La Jolla，Ca)中。
为了从文库中快速而有效地筛选大量克隆，可以构建具有多个平板接种文库的库。在一个优选实施方案中，一个基因组λ噬菌体文库以每个平板约1,000克隆(噬斑)的密度铺平板。产生足够的平板，以在数次铺平板后可代表所述生物的整个基因组。例如，约1×106克隆(1000个平板)将产生约8个基因组相当物。然后，例如通过用缓冲液覆盖所述平板，将平板保温，再收集缓冲液，来收集噬斑。缓冲液的用量将根据平板大小而变，一般而言，一个100mm直径的平板应用约4ml缓冲液覆盖，然后收集约2ml。
人们会认识到，可以在该程序期间的任何时候将单个平板的裂解液合并，可以将它们以任何组合合并。然而，为了随后易于鉴定单个克隆，最好是分开保持每个平板的裂解液，然后制备一个库。例如，可以将每个2ml的裂解液置于96孔深孔平板中。然后通过从每个孔中取一定量，例如约100μl，并将其在一个新平板的孔中混合，形成一个库。最好是，在一个孔中混合12个100μl的单个平板裂解液，形成一个代表12,000个该文库克隆的1.2ml的库。
然后，用已知扩增所述靶基因的一组PCR引物，对每个库进行PCR扩增。靶基因可以是已知的全长基因，或更优选是从公众可得的核酸序列数据库(例如GenBank或EMBL)获得的部分cDNA序列。这些数据库包括称为已表达序列标志(EST)的部分cDNA序列。可以采用本领域已知的任何方法，从任何生物中分离出寡核苷酸PCR引物，或者最好用化学法合成寡核苷酸PCR引物。
一旦在基因组文库中鉴定出靶基因的阳性克隆，则必须产生编码所述靶基因不同部分的两种片段。换句话说，产生所述靶的小的已知区(例如EST)的侧翼区。虽然，每个侧翼区的大小并不是关键性的，但其范围可以是从小至100个碱基对至多达100kb，最好是每种侧翼片段的长度大于约1kb，更优选在约1kb和约10kb之间，甚至更优选在约1kb和约5kb之间。本领域技术人员会认识到，虽然较大的片段可以增加ES细胞中同源重组事件的次数，但较大的片段也将更加难以克隆。
在一个实施方案中，用来扩增侧翼片段的寡核苷酸PCR引物之一对于文库克隆载体(例如λ噬菌体)是特异性的。因此，如果该文库是λ噬菌体文库，那么对λ噬菌体臂特异性的引物可以与对所述阳性克隆特异性的引物结合使用，以产生长的侧翼片段。可以设置多重PCR反应，以测试不同的引物组合。最好是，所用引物将产生长度约2kb和约6kb之间的侧翼序列。
最好是，根据与所述片段待克隆进的载体互补的5’序列，设计所述寡核苷酸引物。另外，所述引物的设计，也使得当装配所述构建体时，所述侧翼片段将相对于所述载体以及相互之间以适宜的3’-5’定向。当靶基因是T243时，在一个实施方案中，所述引物之一包含SEQID NO：48，而在另一个实施方案中，另一引物包含SEQ ID NO：49。
因此，采用基于PCR的方法，例如，可以根据在电泳凝胶上显现出一条带，鉴定出阳性克隆。
一方面，所述克隆涉及一种载体和两种片段。所述载体含有正选择标记(最好是Neor)和位于所述正选择标记两侧的用于所述靶基因的两种不同区的克隆位点。可任选的是，所述载体也含有编码筛选标记的序列(报道基因)，所述序列最好是与所述正选择标记的定位相反。所述筛选标记将位于同源序列的侧翼区之外。图3A显示了所述载体的一个实施方案，筛选标记GFP位于所述载体的一侧。然而，所述筛选标记可以位于与正选择标记Neor相反一侧的Not I和位点4之间的任何位置。
合适载体的一个实例是图2所示的具有SEQ ID NO：1序列的质粒载体。本文也显示了图1标记为“位点1、2、3或4”的特异性核酸不依赖连接作用的克隆位点(也称为退火位点)。一般而言，所述克隆位点缺乏至少一种类型的碱基，例如胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)。因此，使所述载体与既作为聚合酶又作为外切核酸酶的酶在仅存在所述一种缺少的核苷酸的情况下进行反应，将产生突出端。例如，T4 DNA聚合酶既作为3’-5’外切核酸酶起作用，又作为聚合酶起作用。因此，当聚合酶活性可利用的核苷酸不足时，T4将作为外切核酸酶起作用。因此，通过使pDG2载体与T4 DNA聚合酶在仅存在dTTP的情况下反应，可以产生特异性突出端。可用于实施本发明的其它酶是本领域已知的，例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)(参见例如WO 93/18175)。本文例举的载体具有24个核苷酸的突出端。本领域技术人员会知道，成功的不依赖连接作用的克隆需要少至5个核苷酸。
在另一实施方案中，用两步克隆方案装配构建体。第一步，将每个同源性的克隆区分别克隆到所述载体的两个退火位点中。例如，将同源性的“上游”区克隆到退火位点1和2中，而在一次单独的克隆中，将同源性的“下游”区克隆到退火位点3和4中。一旦鉴定出含有同源性的每个单一区的克隆，则可以通过用多种限制性酶消化每个克隆，其中一种酶在退火位点1之外(例如图2A中的Not I)消化，而另一种酶在正选择标记和退火位点3之间(例如图2A中的Sal I)消化，来构建含有这两个同源性区的打靶构建体。纯化(通过通过凝胶电泳)含有来自每种构建体的侧翼同源性区的片段，用本领域已知的标准连接技术进行将其混合，产生所得的打靶构建体。
在再一实施方案中，按照本发明的一个方面构建体可以用一步四向连接法构成。如上所述处理所述载体和片段。简而言之，处理所述载体，以形成两个片段，每个片段在每一端具有一个特异性序列的单链尾。同样，也处理PCR扩增的侧翼片段，以形成与所述载体片段的单链尾互补的单链尾。如上所述将经处理的载体片段和所述侧翼片段混合，并且让其退火。因为所述单链尾具有特异性，所以最终的构建体将含有被正选择标记分开的正确定向的所述片段。
在细菌中扩增最终的质粒构建体，将其纯化，然后可以将其导入ES细胞中，或于-20℃冻存待用。当需要时，将所述载体导入胚胎干细胞系中(例如通过电穿孔)，选择其中所导入的DNA与所述内源DNA发生了同源重组的细胞(参见例如Li等，Cell，69：91526(1992))。然后将所选细胞注射到动物(例如小鼠)的胚泡(或适用于产生有活力动物的其它发育阶段，例如桑椹胚)中，形成嵌合体(参见例如Bradley，A.Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson编著，IRL，Oxford，第113-152页(1987))。或者，可以让所选ES细胞与分离的小鼠胚胎细胞聚集，形成团聚嵌合体。然后可以将嵌合胚胎植入合适的假孕代母动物体内，让胚胎生长至足月。在其生殖细胞中带有同源重组的DNA的嵌合子代，可以用来繁育出其所有的细胞均含有所述同源重组的DNA的动物。在一个实施方案中，嵌合子代小鼠用来产生在靶基因中带有杂合破坏的小鼠。可以让杂合敲除小鼠交配。本领域众所周知，通常这种交配的1/4子代将在靶基因中具有纯合破坏。
然后将杂合敲除小鼠以及纯合敲除小鼠与正常的野生型小鼠比较，以确定所述靶基因的破坏是否引起表型改变，尤其是病理学改变。在一个实施方案中，所述靶DNA序列是T243，与普通正常野生型成年小鼠相比，纯合敲除小鼠的体重降低。体重通常降低至少约15％，更常见降低约30-90％，甚至更通常较低约40-80％；最常见降低约60-70％。
在另一实施方案中，与普通正常野生型成年小鼠相比，纯合敲除小鼠的身长降低。身长通常降低至少约10％，常常降低15-50％；更常见降低约20-40％，最常见降低约25-35％。
与正常野生型成年小鼠相比，体重与身长之比也可以降低。通常，体重与身长之比降低至少约20％，更常见降低约25-75％，更常见降低约30-65％，最常见降低约40-55％。
也观察到表型包括身长和体重均降低的小鼠。这类小鼠也可以表现出体重与身长之比降低。
在本发明的另一实施方案中，所述敲除小鼠的表型包括软骨病和/或骨病。通常，在该实施方案中，有软骨异常并且骨生成普遍减少。
本文所用的“疾病”是指机体状态或机体某些器官的任何改变，中断或扰乱了生活机能的执行、以及引起疼痛或虚弱或有疼痛或虚弱的危险。疾病也可以被认为包括机体任何部分、器官或系统(或其组合)的正常结构或功能的任何偏差或中断，其表现为特征性的一种或一组症状和/或体征，其病因学、病理学和/或预后可以是已知或未知的。
通常观察到的病理学病症包括中轴骨骼和附肢骨骼都缩短。四肢的近端和远端骨按比例缩短。关节软骨缺乏爱茜蓝染色。该实施方案的其它方面包括股骨远端的生长板薄以及骺软骨薄至缺乏。所述疾病也可能有微小骨折，提示生长板脆性。在该实施方案中，在长骨体生长部内增殖区和肥大区中的软骨细胞柱短。干骺端内软骨性针状体(spicule)短并且间隔宽；偶尔出现的针状体偶然定向。成骨细胞丰富并且常常沿软骨性针状体堆积。骺软骨薄并且常常被纤维性结缔组织所取代。骺表面的爱茜蓝染色也减弱。骨骺/长骨体生长部连接处的软骨略微向外张开，有伸出在长骨体生长部之上的不规则的凸出边缘。该实施方案中也包括胸骨板不规则；生长板或者缺乏或者不连续。大的不规则的软骨岛延伸到胸骨板体中，偶然有第二骨化中心。软骨边缘也可能向外张开。另一方面包括不定骨化的椎体，所述椎体可能小并且主要是软骨性的。这些主要是软骨性的椎体的生长板不规则且薄，侧突渐尖。在本发明的一个方面，所述疾病被鉴定为软骨发育不良。
在本发明的再一方面，所述敲除小鼠的表型包括肾病。通常，所述肾小且缺乏正常的结构。皮质薄，并且某些肾小球可能在被膜下。被膜下的肾小球是小而皱缩的、多细胞的肾小球丛。皮质髓质区可能没有放射状弓形管和独特的管形。皮质髓质连接处内的肾小管上皮细胞随机排列成片、堆和簇。某些肾小管上皮细胞小且嗜碱染色暗，显示有再生。在两个肾中通常存在发育异常性改变，最主要存在于皮质髓质连接处，在皮质较之存在较少。按照本发明的一个方面，所述肾病被鉴定为肾发育不良。
也可以观察到病理学状态的其它病症。
可以加入到本发明所述载体中的额外特征包括应用重组酶靶位点。噬菌体P1 Cre重组酶和来自酵母质粒的flp重组酶是位点专一性DNA重组酶的两个非限制性实例，位点专一性DNA重组酶在特定的靶位点切割DNA(cre重组酶在lox P位点切割，而flp重组酶在frt位点切割)，并且催化该DNA连接至第二切割位点。已经描述了许多合适的可供选择的位点专一性重组酶，其基因可以按照本发明的方法应用。这类重组酶包括：噬菌体λ的Int重组酶(带有或不带有Xis)(Weisberg，R.等，Lambda II，(Hendrix，R.等编著)，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，第211-50页(1983)，通过引用结合到本文中)、TpnI和β-内酰胺酶转座子(Mercier等，J.Bacteriol.，172：3745-57(1990))、Tn3解离酶(Flanagan和Fennewald J.Molec.Biol.，206：295-304(1989)；Stark等，Cell，58：779-90(1989))、酵母重组酶(Matsuzaki等，J.Bacteriol.，172：610-18(1990))、枯草杆菌SpoIVC重组酶(Sato等，J.Bacteriol.，172：1092-98(1990))、Flp重组酶(Schwartz和Sadowski，J.Molec.Biol.，205：647-658(1989)；Parsons等，J.Biol.Chem.，265：4527-33(1990)；Golic和Lindquist，Cell，59：499-509(1989)；Amin等，J.Molec.Biol.，214：55-72(1990))、Hin重组酶(Glasgow等，J.Biol.Chem.，264：10072-82(1989))、免疫球蛋白重组酶(Malynn等，Cell 54：453-460(1988))、和Cin重组酶(Haffter和Bickle，EMBO J.，7：3991-3996(1988)；Hubner等，J.Molec.Biol.，205：493-500(1989))，所有这些文献都通过引用结合到本文中。Echols(J.Biol.Chem.，265：14697-14700(1990))、deVillartay(Nature，335：170-74(1988))、Craig(Ann.Rev.Genet.，22：77-105(1988))、Poyart-Salmeron等(EMBO J.8：2425-33(1989))、Hunger-Bertling等(Mol Cell.Biochem.，92：107-16(1990))以及Cregg和Madden(Mol.Gen.Genet.，219：320-23(1989))讨论了这类系统，所有上述文献通过引用结合到本文中。
Cre已经被纯化至均质，它与loxP位点的反应已被广泛地表征(Abremski和Hess J.Mol.Biol.259：1509-14(1984)，该文献通过引用结合到本文中)。Cre蛋白的分子量为35,000，在市场上可以从NewEngland Nuclear/Du Pont获得。cre基因(它编码Cre蛋白)已被克隆和表达(Abremski等Cell 32：1301-11(1983)，该文献通过引用结合到本文中)。Cre蛋白介导两个loxP序列之间的重组(Sternberg等Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.45：297-309(1981))，所述loxP序列可以存在于相同或不同的DNA分子上。因为loxP位点的内部间隔序列是不对称的，所以两个loxP位点可以表现出相互之间相对定向(Hoess和Abremski Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：1026-29(1984))。因此，当同一DNA分子上的两个位点为同向重复定向时，Cre将切割所述位点之间的DNA(Abremski等Cell 32：1301-11(1983))。然而，如果所述位点相互之间相对倒位，则所述位点之间的DNA在重组后不被切割，而仅仅是倒位。因此，具有两个同向loxP位点的环状DNA分子将重组产生两个较小的环，而具有反向的两个loxP位点的环状分子仅仅将侧翼为loxP位点的DNA序列倒位。另外，当在不同的DNA分子上存在靶时，重组酶的作用可以导致远离所述靶位点的区域相互交换。
对于在敲除模型中鉴定基因功能而言，重组酶具有重要的应用。当本文所述的构建体用来破坏靶基因时，当所述正选择标记的插入发生在靶基因翻译起始位点下游(3’)时，可以产生融合转录物。所述融合转录物可能产生某一水平的蛋白表达，其后果是未知的。已经提出，正选择标记的插入可以影响附近基因的表达。这些影响可能使得难以确定敲除事件之后的基因功能，因为不可能辨别给定表型是与基因的失活有关，还是与附近基因的转录有关。这两种潜在的问题都可以通过利用重组酶活性来解决。当正选择标记的侧翼为同向的重组酶位点时，添加相应的重组酶将导致除去所述正选择标记。因而避开了由正选择标记或融合转录物表达引起的影响。
对于鉴定与TRP靶基因相关的疾病而言，功能丧失或无效突变模型可能是不合适的。许多已发表的报道提出，TRP中三核苷酸重复区的扩增使得所产生的蛋白质不利地获得功能。这类功能的获得可能涉及新型的或增强的与其它蛋白质的相互作用、增强对蛋白酶降解的抗性、蛋白质折叠异常和/或大的不溶性蛋白形式的毒性积累。因此，模拟TRP中三核苷酸重复的扩增以确定扩增是否引起可能与功能获得相关的表型改变，可能具有很大价值。因此，本发明的一个实施方案将涉及应用重组酶以引起合成的三核苷酸重复在靶基因破坏位点的酶辅助位点专一性整合。该实施方案将涉及重组酶催化远离存在于不同分子上的两个靶位点的DNA交换的重组酶系统的相互交换能力。当用来产生敲除干细胞的打靶构建体包含邻接正选择标记的一个重组酶靶位点时，在重组酶存在下，在该位点和合成核酸上存在的第二位点之间可以发生重组。
本领域技术人员会认识到，会容易地合成所述合成核酸，以使其包含所述重组酶靶位点和任何所需序列重复的三核苷酸。例如，所述合成核酸序列可以包括编码亮氨酸的CTG重复、或编码谷氨酰胺的CAG重复。所述合成核酸优选具有至少约20个三核苷酸重复；更优选具有至少约40个三核苷酸重复；最优选具有至少约100个三核苷酸重复。
技术人员也会认识到，采用用于导入DNA的任何标准实验室方法，包括但不限于转染、脂质体转染或电穿孔，可以使所述合成核酸与已破坏的基因接触。
在一个实施方案中，通过直接微注射，将纯化的重组酶提供给所述细胞。在另一实施方案中，由其中重组酶基因与有功能的启动子有效连接的共转染的构建体或载体，表达所述重组酶。该实施方案的另一方面是应用组织特异性或诱导型重组酶构建体，这使得可以选择何时何地发生重组。用于实施诱导型形式的重组酶介导的重组的一种方法，涉及利用诱导型或组织特异性启动子或其它基因调节元件表达所需重组酶活性的载体的应用。最好将诱导型表达元件有效定位，以允许诱导型地控制或激活所需重组酶活性的表达。这类诱导型启动子或其他基因调节元件的实例包括但不限于四环素效应启动子、金属硫蛋白效应启动子、蜕皮激素效应启动子和其它类固醇效应启动子、雷帕霉素效应启动子等(No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-51(1996)；Furth等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9302-6(1994))。可以使用的其它控制元件包括需要特定转录因子的启动子，例如病毒启动子。加入这类启动子的载体可以仅在表达所需转录因子的细胞中表达重组酶活性。
所述TRP基因序列也可以用来产生TRP基因产物。TRP基因产物可以包括代表功能等同的基因产物的蛋白质。这种等同的基因产物可以在本文所述基因序列所编码的氨基酸序列中含有氨基酸残基缺失、添加或取代，但这些导致沉默改变，因此产生功能等同的TRP基因产物。可以根据所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性来进行氨基酸取代。
例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正电性(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而负电性(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本文所用的“功能等同物”是指能够显示出体内活性与所述TRP基因序列所编码的内源基因产物基本相似的蛋白质。或者，当用作测定的一部分时，“功能等同物”可以指能够以与内源基因产物的相应部分作用方式相似的方式与其它细胞分子或胞外分子相互作用的肽。
按照本发明方法有用的其它TRP蛋白产物是用重组法或合成法产生的由TRP衍生或基于TRP的肽(TRP衍生肽)。
也可以产生其中例如通过定点诱变有意扩增所述三核苷酸区的突变型TRP蛋白。也可以使用在干细胞中通过酶辅助位点专一性整合扩增的TRP。
可以采用本领域众所周知的技术，通过重组DNA技术产生TRP和扩增型TRP基因产物。因此，本文描述了通过表达编码基因序列的核酸制备本发明的基因多肽和肽的方法。可以用本领域技术人员熟知的方法，构建含有基因蛋白编码序列和合适转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组(参见例如Sambrook等，1989，参见上文，和Ausubel等，1989，参见上文)。或者，使用例如自动合成仪，可以化学合成能够编码基因的蛋白序列的RNA(参见例如Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach，Gait，M.J.编著，IRL Press，Oxford(1984))。
可以利用各种各样的宿主-表达载体系统，来表达本发明的基因编码序列。这类宿主-表达系统代表可以用来产生目的编码序列并且随后进行纯化的载体、但也代表当用所述合适的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表现出本发明的基因蛋白的细胞。这些包括但不限于：用含有基因蛋白编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌)；用含有所述基因蛋白编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有所述基因蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有基因蛋白编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有基因蛋白编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或带有含得自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)。
在细菌系统中，最好可以根据待表达基因蛋白的计划的应用，对多种表达载体进行选择。例如，当要产生大量的这种蛋白质以产生抗体或筛选肽文库时，可能最好是例如指导高水平容易纯化的融合蛋白产物表达的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther和Muller-Hill，EMBO J.，2：1791-94(1983))，其中所述基因蛋白编码序列可以单独地与lac Z编码区符合读框地连接到所述载体中，使得产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.，13：3101-09(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.，264：5503-9(1989))等。也可以用pGEX载体来表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的融合蛋白的外源多肽。一般而言，这类融合蛋白是可溶性的，通过吸附至谷胱甘肽-琼脂糖微珠、然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱，可以容易地从裂解细胞中纯化。设计pGEX载体，使其包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得所克隆的靶基因蛋白可以从GST部分释放出来。
在一个优选实施方案中，采用标准PCR法(Innis等(编著)PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press，SanDiego(1990))，在氨基末端与Bam HI位点以及在羧基末端与Eco RI位点符合读框地加入全长cDNA序列，并且连接到pGEX-2TK载体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)中。所得的cDNA构建体在氨基末端含有一个用于放射性标记的激酶识别位点以及在羧基末端含有用于亲和纯化的谷胱甘肽S-转移酶序列(Nilsson等，EMBO J.，4：1075-80(1985)；Zabeau和Stanley，EMBO J.，1：1217-24(1982))。
在昆虫系统中，用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可以将所述基因编码序列单独克隆到该病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下。成功插入基因编码序列，将导致多角体蛋白基因失活，并产生非包含体型重组病毒(即缺乏多角体蛋白基因编码的蛋白性外壳)。然后，用这些重组病毒感染草地贪夜蛾细胞，在此表达所插入的基因(参见例如Smith等，J.Virol.46：584-93(1983)；Smith，美国专利第4,745,051号)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用多种基于病毒的表达系统。在用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将目的基因编码序列连接于腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三联前导序列。然后通过体外或体内重组，将这种嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如E1区或E3区)中，将产生有活力并且能够在受感染宿主中表达基因蛋白的重组病毒(参见例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3655-59(1984))。所插入的基因编码序列的有效翻译，也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。在将包括自身起始密码子和邻近序列的完整基因插入合适表达载体的情况下，可能不需要额外的翻译控制信号。然而，在仅插入所述基因编码序列的一部分的情况下，必须提供外源翻译控制信号，也许包括ATG起始密码子。此外，起始密码子必须与所需编码序列符合读框，以确保翻译完整的插入片段。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以具有多种来源，可以是天然的和合成的。通过包括合适的转录增强子元件、转录终止子等，可以增强表达效率(参见Bitter等，Methods in Enzymol.，153：516-44(1987))。
另外，可以选择调节所插入序列的表达、或以特定所需方式修饰和加工所述基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于所述蛋白的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白的翻译后加工和修饰的特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保正确的修饰和加工所表达的外源蛋白。为此，可以使用具有初级转录物的正确加工、所述基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等。
对于重组蛋白的长期高产的生产，最好是稳定的表达。例如，对稳定表达所述基因蛋白的细胞系进行工程改造。不用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由合适表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的DNA和选择标记转化宿主细胞。在导入外源DNA后，可以让工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择培养基中。重组质粒中的选择标记提供对所述选择的抗性，使得在染色体中稳定整合所述质粒的细胞可以生长，形成转化灶，进而将所述转化灶克隆并发展为细胞系。这种方法可以有利地用来工程改变表达所述基因蛋白的细胞系。这类工程细胞系在影响所述基因蛋白内源活性的化合物的筛选和评估方面尤其有用。
在一个优选实施方案中，所述重组蛋白的表达时间和/或表达量的控制可以采用诱导型表达构建体来控制。诱导型构建体和用于诱导型表达重组蛋白的系统是本领域技术人员众所周知的。这类诱导型启动子或其它基因调节元件的实例包括但不限于四环素效应启动子、金属硫蛋白效应启动子、蜕皮激素效应启动子和其它类固醇效应启动子、雷帕霉素效应启动子等(No等，Proc.Natl.Acad Sci.USA，93：3346-51(1996)；Furth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：9302-6(1994))。可以使用的其它控制元件包括需要特定转录因子的启动子，例如病毒启动子，特别是HIV启动子。在一个实施方案中，利用Tet诱导型基因表达系统。(Gossen和Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-51(1992)；Gossen等，Science，268：1766-69(1995))。Tet表达系统基于得自大肠杆菌Tn10转座子的四环素抗性操纵子的两个调节元件-四环素阻抑蛋白(TetR)和TetR结合的四环素操纵基因序列(tetO)。使用这种系统，可以将所述重组蛋白的表达置于tetO操纵基因序列的控制之下，将该系统转染或转化到宿主细胞中。在共转染到宿主细胞中的TetR存在下，由于TetR蛋白与tetO调节元件结合，因此所述重组蛋白的表达受到阻抑。然后，对不同浓度的与tetO元件竞争与TetR结合的四环素(Tc)或Tc衍生物(例如强力霉素(Dox))应答，可以诱导出高水平的受调节的基因表达。用于tet诱导型基因表达的构建体和材料在市场上可得自CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo，Alto，CA。
当用作测定系统的组分时，可以将所述基因蛋白或者直接或者间接地标记，以便于检测所述基因蛋白和试验物质之间形成的复合物。可以使用多种合适标记系统中的任一种，包括但不限于放射性同位素例如125I；当暴露于底物时产生可检测比色(calorimetric)信号或光的酶标记系统；和荧光标记。
在使用重组DNA技术产生用于这类测定系统的基因蛋白的情况下，可能最好是对融合蛋白进行工程改造，这可以便于标记、固定化和/或检测。
间接标记涉及应用与任一基因产物特异性结合的蛋白质，例如标记的抗体。这类抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和由Fab表达文库产生的片段。
本文描述了用于生产能够特异性地识别一种或多种基因表位的抗体的方法。这类抗体可能包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体和任一种上述抗体的表位结合片段。这类抗体可以用来例如检测生物样品中的靶TRP基因，或者用作抑制异常靶基因活性的方法。因此，这类抗体可以用作疾病治疗方法的一部分，和/或可以用作检验患者异常靶TRP基因蛋白水平或异常形式的这类蛋白存在的诊断技术的一部分。
关于针对基因的抗体的生产，可以通过注射TRP蛋白或其部分，免疫各种宿主动物。这类宿主动物可以包括但不限于兔、小鼠和大鼠，这仅例举了几个实例。根据宿主的物种，可以使用各种佐剂来增强免疫应答，所述佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性剂例如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽类、油乳液、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人用佐剂，例如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)。
多克隆抗体是从用抗原(例如靶基因产物)或其抗原性功能衍生物免疫的动物血清获得的不均一的抗体分子群体。对于多克隆抗体的生产，可以通过注射补充有如上所述的佐剂的基因产物免疫宿主动物，例如如上所述的动物。
作为抗特定抗原的均一抗体群体的单克隆抗体，可以采用用于在培养物中由连续细胞系生产抗体分子的任何技术获得。这些技术包括但不限于Khler和Milstein(Nature，256：495-7(1975)和美国专利第4,376,110号)的杂交瘤技术；人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today，4：72(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：2026-30(1983))；和EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclohal AntibodiesAnd Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，New York，第77-96页(1985))。这类抗体可以属于任何类别的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。生产本发明mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。在体内产生高效价的mAb构成了本发明优选的生产方法。
另外，可以使用开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-6855(1984)；Tekeda等，Nature，314：452-54(1985))，该技术通过将来自具合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具合适生物活性的人类抗体分子的基因剪接在一起，产生“嵌合抗体”。嵌合抗体是其中不同的部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源于鼠类mAb的可变区和人类免疫球蛋白的恒定区的分子。
或者，可以采用描述的产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号；Bird，Science 242：423-36(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-83(1988)；和Ward等，Nature，334：544-46(1989))，来生产基因-单链抗体。单链抗体是通过将Fv区的重链和轻链片段通过氨基酸桥连接产生单链多肽而形成的。
识别特定表位的抗体片段可以采用已知的技术产生。例如，这类片段包括但不限于：F(ab’)2片段，它通过用胃蛋白酶消化所述抗体分子而产生的；和Fab片段，它通过还原F(ab’)2片段的二硫桥而产生。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，Science，246：1275-81(1989))，以便快速容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。
本文描述了可以用作疾病模型的基于细胞和基于动物的系统。包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪(micro-pig)、山羊和非人类灵长类动物(例如狒狒、猴子和黑猩猩)的任何物种的动物，都可以用来产生疾病动物模型。另外，可以使用得自人类的细胞。这些系统可以用于各种各样的应用中。例如，基于细胞和基于动物的模型系统可以用来进一步鉴定TRP基因。这类测定可以用作筛选策略的一部分，其中所述策略设计用来鉴定能够缓解病症的化合物。因此，可以用基于动物和基于细胞的模型，来鉴定在治疗疾病中有效的药物、药剂、疗法和干涉。
含有并表达编码TRP的靶基因序列、以及进一步显示出与疾病相关的细胞表型的细胞，可以用来鉴定显示出抗病活性的化合物。
这类细胞可以包括：非重组单核细胞细胞系，例如U937(ATCC#CRL-1593)、THP-1(ATCC#TIB-202)和P388D1(ATCC#TIB-63)；内皮细胞，例如HUVEC和牛主动脉内皮细胞(BAEC)；以及一般的哺乳动物细胞系，例如HeLa细胞和COS细胞，例如COS-7(ATCC#CRL-1651)。此外，这类细胞可以包括重组、转基因细胞系。例如，本发明的敲除小鼠可以用来产生可以用作疾病的细胞培养物模型的细胞系，包括与疾病相关的一种或多种细胞类型。虽然可以利用来源于本发明的疾病转基因动物的细胞、组织和原代培养物，但最好是产生连续细胞系。关于可以用来从所述转基因动物得到：连续细胞系的技术的实例，参见Small等，Mol.Cell Biol.，5：642-48(1985)。
可以将靶基因序列导入目的细胞的基因组中，或在所述基因组中过量表达，或者如果存在内源靶基因序列，则可以或者使其过量表达，或者将其破坏，以使靶基因的表达表达不足或使其失活。
为了过量表达靶基因序列，可以将靶基因序列的编码部分与能够在目的细胞类型中驱动基因表达的调节序列连接。这类调节区是本领域技术人员众所周知的，可以在不用过多实验的情况下利用。
为了使内源靶基因序列表达不足，可以分离出这种序列并对其进行工程改造，使得当将其再导入目的细胞类型的基因组中时，所述内源靶基因等位基因被失活。最好是，通过基因打靶导入工程靶基因序列，使得将所述工程靶基因序列整合到所述细胞的基因组中时，内源靶基因序列被破坏。
可以检查用靶基因转染的细胞的与疾病相关的表型。
经分析鉴定的化合物可以用以例如详细阐述靶基因产物的生物功能以及缓解疾病。在病症的病因是靶基因表达和/或靶基因产物在细胞或组织中的总体水平较低的情况下，与所述靶基因产物相互作用的化合物可以包括增强或放大结合的靶基因蛋白活性的化合物。这类化合物可能导致有效提高靶基因产物的活性水平，因而缓解症状。
可以设计体外系统，以鉴定能够结合靶TRP基因或扩增型TRP基因的化合物。这类化合物可以包括但不限于由D-和/或L-构型的氨基酸组成的肽(例如随机肽文库的形式；参见例如Lam等，Nature，354：82-4(1991))、磷酸肽(例如为随机或部分简并的定向磷酸肽文库形式；参见例如Songyang等，Cell，72：767-78(1993))、抗体和小的有机或无机分子。经鉴定的化合物可以用于例如调节靶基因蛋白的活性、最好是突变型靶基因蛋白的活性，可以用于详细阐述靶基因蛋白的生物功能，可以用于鉴定破坏正常靶基因相互作用的化合物的筛选中，或其本身可以破坏这类相互作用。
用来鉴定与靶基因蛋白结合的化合物的测定的原理，包括制备靶基因蛋白或扩增型靶基因蛋白和试验化合物在足以允许所述两种组分相互作用和结合的条件和时间下的反应混合物，由此在反应混合物中形成可以被取出和/或检测的复合物。这些测定可以以各种各样的方式进行。例如，进行这种测定的一种方法涉及将所述靶基因蛋白或扩增型靶基因蛋白或所述试验物质锚定在固相上，并且在反应结束时检测锚定在固相上的靶基因蛋白或扩增型靶基因蛋白/试验物质复合物。在这种方法的一个实施方案中，可以将所述靶基因蛋白锚定在固体表面上，而将未锚定的所述试验化合物直接或间接标记。
实际上，可方便地使用微量滴定板。被锚定的组分可以通过非共价或共价连接而被固定化。非共价连接可以简单地通过用所述蛋白溶液包被所述固体表面并干燥来完成。或者，可以用对所述蛋白特异性的固定化抗体、最好是单克隆抗体，将所述蛋白锚定到固体表面。所述表面可以预先制备和贮存。
为了进行所述测定，将非固定化组分加入至含有锚定的组分的包被表面上。在反应完成之后，在使得所形成的任何复合物保持固定化于固体表面的条件下，除去未反应的组分(例如通过洗涤)。锚定于固体表面的复合物的检测可以以多种方式完成。在对先前非固定化组分进行预标记的情况下，检测到固定化于所述表面的标记，指示形成了复合物。在对先前非固化组分不进行预标记的情况下，可以用间接标记来检测锚定于所述表面的复合物；例如采用对先前非固定化组分特异性的标记抗体(可以进而用标记的抗Ig抗体对所述抗体直接或间接标记)。
或者，可以在液相中进行反应，从未反应组分中分离出反应产物，检测复合物；例如采用对靶基因产物或试验化合物特异性的固定化抗体来锚定溶液中形成的任何复合物，和用对可能的复合物的另一组分特异性的标记抗体来检测锚定复合物。
可以对通过上述方法之一显示出与特定靶基因产物结合的化合物，进一步测试其从所述靶基因蛋白引发生化反应的能力。
基于细胞的系统可以用来鉴定可以用来缓解病症的化合物。例如，可以将这类细胞系统暴露于怀疑显示出缓解病症能力的化合物，所述化合物的浓度和暴露时间足以在经暴露的细胞中引发这种病症的缓解。在暴露之后，检查细胞，以确定一种或多种所述疾病的细胞表型是否已经改变为类似更为正常或更接近野生型的非疾病表型。
另外，基于动物的疾病系统，例如本文所述的系统，可以用来鉴定能够缓解病症的化合物。这类动物模型可以用作用于鉴定在治疗所述动物的疾病或其它特征性的表型方面有效的药物、药剂、疗法和干涉的试验作用物。例如，可以将动物模型暴露于怀疑显示出缓解病症能力的化合物或因子，所述化合物或因子的浓度和暴露时间足以在经暴露的动物中引发这种病症的缓解。可以通过评价与该疾病相关的病症的逆转，监测所述动物对该暴露的反应。暴露可以包括在本文所述的模型动物妊娠期间治疗母畜，从而使胚胎或胎儿暴露于可以预防或缓解所述疾病或表型的化合物或因子。也可以对新生动物、幼年动物和成年动物进行暴露。
相似的病症可能由多种病因所致。例如，软骨发育不良包括一组宽范围的骨畸形，其形成原因可能是生成缺陷型胶原蛋白、信号分子[胰岛素样生长因子(IGF)、甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、Indianhedgehog(Ihh)、骨形态发生蛋白(BMP)]被破坏或者构成软骨基质的蛋白聚糖(即聚集蛋白聚糖)异常。已描述的人类原发性骨病包括成骨不全(合成了缺陷型I型胶原蛋白)、粘多糖病(导致基质异常的溶酶体贮积病)、Blomstrand软骨发育不良(缺乏PTH/PTHrP激素和/或受体)、多发性骨骺发育不良(缺陷型IX型胶原蛋白)和Schmid干骺端软骨发育不良(合成缺陷型X型胶原蛋白)。因为有缺陷型软骨和/或软骨基质，所以矿化作用和骨生成减少。术语骨质疏松用来指骨质量的总体减少，包括原发性病症和继发性病症。原发性骨质疏松症包括特发性青少年骨质疏松、特发性中年(middle adulthood)骨质疏松、经绝后骨质疏松和老年骨质疏松。可以导致骨质疏松的继发性病症包括内分泌性疾病(甲状旁腺机能亢进、甲状腺机能亢进、甲状腺机能减退、性腺机能减退、肢端肥大症、库欣病、I型糖尿病和艾迪生病)、胃肠病(吸收障碍、维生素C、D缺乏、营养不良和肝功能不全)、慢性阻塞性肺病、戈谢病、贫血和高胱氨酸尿。除软骨细胞外，成骨细胞在骨生成中也起重要作用。成骨细胞具有激素(PTH、维生素D、雌激素)、细胞因子和生长因子的受体，并且分泌胶原性和非胶原性蛋白。非胶原性蛋白包括细胞粘着蛋白(骨桥蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白)、钙结合蛋白(骨粘连蛋白、骨涎蛋白)、参与矿化的蛋白(骨钙蛋白)、酶(胶原酶和碱性磷酸酶)、生长因子(IGF-1、TGF-B、PDGF)和细胞因子(前列腺素、IL-1、IL-6)。
此外，基质的聚集蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖和短蛋白聚糖)是胞外基质的重要组分。目前已描述的聚集蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖的配体-fibulin-1(Aspberg等，J Biol Chem，274：20444-9(1999))在发育中的软骨和骨中强表达。
另一组症状-肾发育不良和发育不全，占儿童慢性肾衰竭的20％(Cotran等， Robbins Pathologic Basis of Disease，Saunders，Philadelphia(1994))。先天性肾病可以遗传，但最常见的是妊娠期间产生的获得性发育缺陷。在受影响的个体中，在小鼠中在妊娠8.5天至9天(相当于人类的妊娠第22-24天)时尿生殖区别明显。已经假定，在发育期间，发育不良由异常的细胞分化所致，导致持续的细胞增殖和可能导致囊肿生成的跨上皮体液分泌(Grantham等(1993)Adv Intern Med 38：409-20)或进而影响上皮分化的胞外基质缺陷(Calvet等，J Histochem Cytochem，41：1223-31(1993))。骨发育和肾发育共用的生长因子包括胰岛素样生长因子和BMP。然而，因为钙/磷和酸/碱失调，所以慢性肾衰竭也可以影响骨生成。
本领域技术人员会认识到，给定的因子可能有效缓解由不相干的病因引起的相似症状。因此，给定因子可以用于治疗多种疾病。
在可能显示出缓解病症能力的因子中，有反义分子、核酶分子和三股螺旋分子。可以设计这类分子，以降低或抑制突变型靶基因活性。产生和使用这类分子的技术是本领域技术人员众所周知的。
反义RNA和DNA分子的作用是通过与所靶向的mRNA杂交并阻止蛋白翻译，而直接阻断mRNA的翻译。关于反义DNA，最好是源自翻译起始位点即目的靶基因核苷酸序列的-10和+10区之间的寡脱氧核糖核苷酸。
核酶是能够催化RNA特异性切割的酶性RNA分子。核酶的作用机理包括核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，然后进行内切核酸酶酶切。核酶分子的组成必须包括与靶基因mRNA互补的一个或多个序列，并且必须包括负责mRNA切割的众所周知的催化序列。关于这种序列，参见美国专利第5,093,246号，该专利通过引用全部结合到本文中。因此，特异性地有效催化编码靶基因蛋白的RNA序列的内切核酸酶切割的工程锤头基序核酶分子属于本发明的范围。
通过扫描目的分子的核酶切割位点(所述核酶切割位点包括以下序列：GUA、GUU和GUC)，可初步鉴定任何潜在RNA靶内的特异性核酶切割位点。一旦鉴定出，根据可能使得所述寡核苷酸序列不合适的预测的结构特征，例如二级结构，则可以对与含该切割位点的靶基因区相应的15-20个核糖核苷酸的短RNA序列进行评估。也可以通过用核糖核酸酶保护测定，测试其与互补寡核苷酸杂交的可及性，评估候选序列的合适性。
待用于形成三股螺旋以抑制转录的核酸分子应该是单链的，并且由脱氧核糖核苷酸组成。必须对这些寡核苷酸的碱基组成进行设计，以通过Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋的形成，这一般需要在双链体的一条链上存在相当大的或者嘌呤或者嘧啶的序列段。核苷酸序列可以由嘧啶碱基组成的，这将产生跨越所产生的三股螺旋的三条相连链的TAT和CGC三联体。富含嘧啶的分子提供与双链体一条链的富含嘌呤区的平行方向的碱基互补性。另外，可以选择富含嘌呤、例如含有G残基序列段的核酸分子。这些分子将与富含GC对、其中大部分嘌呤残基位于靶向的双链体的一条链上的DNA双链体形成三股螺旋，产生跨越所述三股螺旋的三条链的GGC三联体。
或者，通过产生所谓的“之字形路线(switchback)”核酸分子，可以增加可以靶向形成三股螺旋的潜在序列。以交替的5’-3’、3’-5’方式合成之字形路线分子，使得它们首先与双链体的一条链进行碱基配对，然后与另一条链进行碱基配对，消除了对于在双链体的一条链上存在或者嘌呤或者嘧啶的相当大的序列段的必要性。
本文所述的反义分子、核酶分子和/或三股螺旋分子有可能降低或抑制由正常和突变型两种靶基因等位基因产生的mRNA的转录(三股螺旋)和/或翻译(反义、核酶)。为了确保维持基本正常水平的靶基因活性，可以将编码并表达显示出正常活性的靶基因多肽的核酸分子，导入到不含对所利用的反义、核酶或三股螺旋的任一种处理敏感的序列的细胞中。或者，可能最好是将正常的靶基因蛋白共同给予所述细胞或组织，以维持必需水平的细胞或组织靶基因活性。
本发明的反义RNA和DNA分子、核酶分子和三股螺旋分子可以采用本领域已知用于合成DNA和RNA分子的任何方法来制备。这些包括本领域众所周知的用于化学合成寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术，例如固相亚磷酰胺化学合成。或者，可以通过体外和体内转录编码所述反义RNA分子的DNA序列，产生RNA分子。可以将这类DNA序列加入到各种各样的加入了合适RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子的载体中。或者，可以将根据所用的启动子组成型或诱导型合成反义RNA的反义cDNA构建体，稳定导入到细胞系中。
可以引入对所述DNA分子的各种熟知的修饰，作为增加胞内稳定性和半寿期的手段。可能的修饰包括但不限于将侧翼核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸序列添加到所述分子的5’端和/或3’端，或在寡脱氧核糖核苷酸骨架中应用硫代磷酸酯键合或2’O-甲基键合，而不是磷酸二酯键。
对靶基因蛋白具有特异性并且干扰其活性的抗体，可以用来抑制靶基因功能。对扩增型靶基因蛋白特异性并且干扰该蛋白的特有相互作用(尤其是可归因于新获得与三核苷酸扩增相关功能的功能)的抗体，也可以用来抑制扩增型靶基因功能。尤其感兴趣的是针对TRP的扩增型三核苷酸区的抗体。可以用标准技术，产生针对蛋白质本身或针对对应于所述蛋白部分的肽的这类抗体。这类抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段、单链抗体、嵌合抗体等。
在所述靶基因蛋白是胞内蛋白并且使用完整抗体的情况下，可以最好使用内化抗体。然而，可以用脂质转染脂质体将与靶基因表位结合的抗体或Fab区片段传递到细胞中。当使用抗体片段时，最好使用与所述靶蛋白或扩增型靶蛋白的结合结构域结合的最小的抑制性片段。例如，可以使用其氨基酸序列对应于与靶基因蛋白结合的抗体可变区的结构域的肽。可以化学合成这类肽，或采用本领域众所周知的方法通过重组DNA技术产生这类肽(参见例如Creighton，Proteins：Structures and Molecular Principles(1984)W.H.Freeman，New York 1983，参见上文；和Sambrook等，1989，参见上文)。或者，也可以给予与胞内靶基因表位结合的单链中和抗体。例如，可以采用例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7889-93(1993)中描述的技术，通过在靶细胞群体内表达编码单链抗体的核苷酸序列，给予这类单链抗体。
对所述TRP或扩增型TRP的一个或多个胞外结构域特异性并且干扰其活性的抗体，在治疗疾病方面尤其有用。这类抗体尤其有效，因为它们可以直接从血流接近所述靶结构域。下述的适用于肽给予的任何给药技术，都可以用来有效地将抑制性靶基因抗体给予其作用部位。
可以直接给予表现出病症的患者编码靶基因蛋白的RNA序列，其给药浓度足以产生使得病症得以缓解的靶基因蛋白水平。
可以通过基因取代疗法来治疗患者。除将DNA导入细胞中的其它粒子(例如脂质体)外，可以利用包括但不限于腺病毒、腺相关病毒和反转录病毒的载体，将指导具有靶基因功能的正常靶基因蛋白产生的正常靶基因或所述基因的一个或多个拷贝，插入到细胞中。另外，例如上述的技术可以用来将正常靶基因序列导入人类细胞中。
可以将含有正常靶基因表达基因序列的细胞，最好是自体细胞，在使得可以缓解病症的部位导入或再导入所述患者体内。
可以将已鉴定的抑制靶基因表达或扩增型靶基因表达、合成和/或活性的化合物，以治疗或缓解所述疾病的治疗有效量给予患者。治疗有效量是指足以导致病症缓解的化合物的量。
可以通过标准药学方法，在细胞培养物或实验动物体内，测定这类化合物的毒性和治疗功效，例如测定LD50(使所述群体的50％致死的剂量)和ED50(在所述群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性效应和治疗效应之间的剂量比是治疗指数，它可以以LD50/ED50之比来表示。优选显示出治疗指数大的化合物。虽然可以使用显示出毒性副作用化合物，但应该小心设计将这类化合物靶向受影响组织的部位的传递系统，以便最大限度地减小对未感染细胞的潜在损害，从而降低副作用。
由细胞培养物测定和动物研究获得的数据，可以用来制定用于人类的剂量范围。这类化合物的剂量最好在包括在ED50内的毒性很小或无毒的循环浓度范围。根据所用的剂型和所用的给药途径，该剂量可以在该范围内变动。就用于本发明方法中所用的任何化合物而言，可以根据细胞培养物测定，初步估计治疗有效量。可以在动物模型中确定剂量，以达到包括在细胞培养物中测定的IC50(即达到症状的半最大抑制的试验化合物的浓度)内的循环血浆浓度范围。这种信息可以用来更为精确地确定在人体内的有用剂量。例如可以通过高效液相色谱，测量血浆水平。
可以以常规方式，用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂，配制按照本发明使用的药用组合物。因此，可以配制所述化合物及其生理上可接受的盐和溶剂合物，用于吸入或吹入给药(或者经口或者通过经鼻)或经口、口腔含化、胃肠外、局部、皮下、腹膜内、静脉内、胸膜内、眼内、动脉内或直肠给药。也考虑了药用组合物可以与增强所述化合物活性的其它制品一起给予，所述药用组合物可任选地可以包括其它治疗组分。
就口服而言，所述药用组合物可以采用例如以常规方式用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，所述赋形剂例如为粘合剂(例如预胶凝化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉甘醇酸钠)、或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以用本领域熟知的方法包衣。用于口服的液体制剂可以采用例如溶液剂、糖浆剂或悬浮剂的形式，或它们可以作为在使用之前用水或其它合适的溶媒重建的干制品。可以用常规方法，用药学上可接受的添加剂制备这类液体制剂，所述添加剂例如为悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水溶媒(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分级植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯)。所述制剂合适时也可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
可以适当地配制用于口服的制剂，以提供所述活性化合物的控释。
对于口腔含化给药，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于吸入给药，应用合适的喷射剂，可方便地从加压包装或喷雾器以气雾剂方式传递按照本发明使用的化合物，所述喷射剂例如为二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。就加压气雾剂而论，可以通过提供一个阀以传递一个计量量，测定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的、含有所述化合物的粉末合剂和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的胶囊或药筒。
可以配制所述化合物，用于通过注射(例如大剂量注射或连续输注)胃肠外给药。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如存在于安瓿或多剂量容器中，并加有一种防腐剂。所述组合物可以采用诸如油性或水性溶媒中的悬浮剂、溶液剂或乳剂的形式，可以含有配制用药剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，有效成分可以为在使用之前用合适溶媒(例如无菌无热原水)重建的粉末形式。
所述化合物也可以配制为直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂(retention enemas)，例如含有常规栓剂基质例如可可脂或其它甘油酯。经口摄入可能是摄入任何药物的最容易的方法。这种给药途径一般简单且直接，而且从患者的观点来看，这通常是不便性或令人不愉快的程度最低的给药途径。然而，这涉及到让所述物质通过胃，而胃对于包括蛋白质和其它生物活性组合物在内的许多物质而言是不利的环境。由于胃的酸性、水解和蛋白水解环境已经有效地形成，将蛋白性物质消化为氨基酸和寡肽以用于随后的合成代谢，所以可以意料，非常少的或者各种各样的生物活性蛋白性物质中的任一种如果是单独地经口摄入，则机体将让其通过胃以在小肠吸收。其结果是，许多蛋白性药物必须通过另一种方法摄入，例如通过胃肠外摄入，通常通过皮下、肌内或静脉内注射。
药用组合物也可以包括各种缓冲剂(例如Tris、乙酸盐、磷酸盐)、增溶剂(例如Tween、聚山梨醇酯)、载体(例如人血清白蛋白)、防腐剂(硫柳汞、苯甲醇)和抗氧化剂(例如抗坏血酸)，以便稳定药物活性。稳定剂可以是去垢剂，例如吐温-20、吐温-80、NP-40或Triton X-100。也可以将EBP加入到特定的聚合化合物制剂中，以便在延长的时间内受控制地传递给患者。在 Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编著，Mack Publishing，Easton，Pa.(1990)中，可找到对药用组合物的组分更为广泛的调查。
除前述制剂外，所述化合物也可以配制为缓释型制剂。这类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如，可以将所述化合物与合适的聚合物质或疏水性物质(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或配制为略溶性衍生物，例如配制为略溶性盐。
如有必要，所述组合物可以存在于包装或分配装置(dispenserdevice)中，所述包装或装置可以含有含所述有效成分的一个或多个单位剂型。所述包装可以例如包含金箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包装或分配装置可以伴有给药说明。
可以用多种方法诊断与TRP相关的病症。具体地说，可以使用例如用于检测靶基因突变存在或检测靶基因mRNA或者过量表达或者表达不足的试剂。
可以例如通过利用包含至少一种本文所述的特定基因核酸或抗基因抗体试剂的预包装诊断试剂盒，进行本文所述方法，所述试剂盒可以例如在临床环境中方便地用来诊断显示出病症或有疾病发生危险的患者。
在下述的诊断中，可以利用其中表达所述基因的任何细胞类型或组织，最好是单核细胞、内皮细胞或平滑肌细胞。
得自待分析的细胞类型或组织的DNA或RNA可以用本领域技术人员众所周知的方法，容易地分离出。也可以在从活组织检查或切除术获得的患者组织的组织切片(经固定和/或冷冻的)上，原位直接进行诊断程序，因此不必进行核酸的纯化。核酸试剂可以用作这种原位程序(参见例如Nuovo， PCR In Situ Hybridization：Protocols and Appications，Raven Press，N.Y.(1992))的探针和/或引物。
基因的核苷酸序列，或者RNA或者DNA，可以例如用于生物样品的杂交测定或扩增测定中，以检测疾病相关的基因结构和表达。这类测定可以包括但不限于DNA印迹分析或RNA印迹分析、限制性片段长度多态性分析、单链构象多态性分析、原位杂交测定和聚合酶链式反应分析。这类分析可以揭示出所述基因表达模式的定量方面以及所基因表达和/或基因组成的定性方面。也就是说，这些方面可以包括例如点突变、插入、缺失、染色体重排和/或所述基因表达的激活或失活。
用于检测基因特异性核酸分子的优选诊断方法可以例如包括：使得自所分析细胞类型或组织的核酸与一种或多种标记的核酸试剂在适合于使这些试剂与目的核酸分子内的其互补序列特异性退火的条件下接触和保温。最好是，这些核酸试剂的长度至少为9-30个核苷酸。在保温后，从所述核酸：指纹分子杂交体中除去所有未退火的核酸。然后检测来自所述指纹组织的已经杂交的核酸的存在(如果任何这类分子存在的话)。采用这种检测方案，可以将来自目的组织或细胞类型的核酸固定化至例如固相支持体例如膜或塑料表面，例如固定化至微量滴定板或聚苯乙烯微珠上。在这种情况下，在保温后，可容易地除去非退火的标记核酸试剂。用本领域技术人员熟知的标准技术，完成保留的、退火的、标记的核酸试剂的检测。
用于检测基因特异性核酸分子的可供选择的诊断方法可以包括：其扩增、例如通过PCR扩增(在Mullis的美国专利第4,683,202号(1987)中叙述的实验实施方案)；连接酶链式反应(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-93(1991))；自身支持性序列扩增(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874-78(1990))；转录扩增系统(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：1173-77(1989))、Q-β复制酶(Lizardi，P.M.等，Bio/Technology，6：1197(1988))，或任何其它的核酸扩增法；然后用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果这类分子以非常少的量存在，则这些检测方案对于核酸分子的检测尤其有用。
在这种检测方案的一个实施方案中，从目的RNA分子获得cDNA分子(例如通过将所述RNA分子反转录为cDNA)。从中可以分离出这种RNA的细胞类型或组织，包括其中已知野生型指纹基因表达的任何组织，包括但不限于单核细胞、内皮和/或平滑肌。然后，将所述cDNA内的一段序列用作核酸扩增反应(例如PCR扩增反应等)的模板。在该方法的反转录和核酸扩增步骤中用作合成起始试剂(例如引物)的核酸试剂，可以从本文所述的基因核酸试剂中选择。这类核酸试剂的优选长度至少是15-30个核苷酸。对于所扩增产物的检测，可以用放射性标记或非放射性标记的核苷酸进行核酸扩增。或者，可以制备足够的扩增产物，使得所述产物可以通过标准的溴化乙锭染色或通过利用任何其它合适的核酸染色法来显现。
针对野生型、突变型或扩增型基因肽的抗体，也可以用作疾病诊断剂和预后剂。这类诊断方法可以用来检测基因蛋白表达水平的异常或指纹基因蛋白的结构和/或组织、细胞或亚细胞定位的异常。结构差异可以包括例如相对于正常指纹基因蛋白而言所述突变型指纹基因蛋白大小、电负性或抗原性的差异。
采用本领域技术人员熟知的技术，包括但不限于蛋白质印迹分析，可以容易地检测或分离出来自待分析组织或细胞类型的蛋白质。有关进行蛋白质印迹分析的方法的详细解释，参见Sambrook等(1989)(参见上文)，第18章。本文所用的蛋白质检测和分离方法也可以是例如在例如Harlow和Lane( Antibodies：A LaboratoryManual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1988))中描述的那些方法。
用于检测野生型、突变型或扩增型基因肽分子的优选诊断方法可以包括例如免疫测定，其中通过指纹基因肽与抗指纹基因特异性肽抗体的相互作用，来检测指纹基因肽。
例如，可用于本发明的抗体或抗体片段，可以用来定量或定性检测野生型、突变型或扩增型基因肽的存在。这可以通过例如使用荧光标记抗体(参见下文)与光学显微镜检查、流式细胞术检测或荧光计检测偶联的免疫荧光技术来完成。如果所述指纹基因肽在细胞表面表达，则这类技术尤其有用。
另外，可用于本发明的抗体(或其片段)可以用于组织学检测，如用于免疫荧光或免疫电子显微镜，用于原位检测指纹基因肽。原位检测可以通过从患者体内取出组织学样本、并在样本上应用本发明的标记抗体来完成。所述抗体(或片段)最好是通过将标记抗体(或片段)覆盖在生物样品上来应用。通过采用这种方法，有可能不仅检测所述指纹基因肽的存在，而且有可能检测其在所检查组织中的分布。应用本发明，本领域技术人员将容易地意识到，可以对各种各样的组织学方法中的任一种(例如染色法)进行修改，以便完成这种原位检测。
用于野生型、突变型或扩增型指纹基因肽的免疫测定，通常包括将生物样品(例如生物体液、组织提取物、新收获的细胞或已经在组织培养物中培养的细胞)在能够鉴定指纹基因肽的可检测标记的抗体存在下进行保温，并且通过多种本领域熟知的技术中的任一种检测结合的抗体。
可以使所述生物样品与固相支持体或载体(例如硝酸纤维素)或能够将细胞、细胞粒子或可溶性蛋白固定化的其它固相支持体接触，并固定化至所述固相支持体或载体上。然后，可以用合适的缓冲液洗涤所述支持体，接着用可检测标记的基因特异性抗体处理。然后，可以再次用所述缓冲液洗涤固相支持体，以除去未结合的抗体。然后，用常规方法测定固相支持体上的结合标记的量。
所谓“固相支持体或载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支持体。众所周知的支持体或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。对于本发明的目的而言，载体的性质可以或者在一定程度上是可溶的或是不溶性的。支持体的材料可以实际上具有任何可能的结构构型，只要所偶联的分子能够与抗原或抗体结合即可。因此，所述支持体的结构可以是球形的(就微珠而论)或圆柱形(如就试管的内表面或棒的外表面而论)。或者，所述表面可以是平坦的，例如片或试纸条等。优选的支持体包括聚苯乙烯微珠。本领域技术人员将知道用于结合抗体或抗原的许多其它合适的载体，或者将能够利用常规实验来确定所述载体。
给定的一批抗野生型、抗突变型或抗扩增型指纹基因肽抗体的结合活性，可以按照熟知的方法来测定。本领域技术人员通过使用常规实验，将能够确定操作的最适测定条件。
可以对所述基因肽特异性抗体进行可检测标记的方法之一是将所述抗体与酶连接，并且将其用于酶免疫测定(EIA)(Voller，Ric ClinLab，8：289-98(1978)[“酶联免疫吸附测定(ELISA)”，DiagnosticHorizons 2：1-7，1978，Microbiological Associates Quarterly Publicaiotn，Walkersville，Md.]；Voller等，J.Clin.Pathol.，31：507-20(1978)；Butler，Meth.Enzymol.，73：482-523(1981)；Maggio(编著)， Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.(1980)；Ishikawa等(编著) Enzyme Immunoassay，Igaku-Shoin，Tokyo(1981))。与所述抗体结合的酶将与合适的底物(最好是显色底物)反应，其反应方式使得产生可以例如通过分光光度计、荧光计或肉眼检测法检测的化学部分。可以用来可检测标记所述抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。可以通过利用所述酶的显色底物的比色法，完成所述检测。也可以通过将底物酶反应的程度与同样制备的标准品进行肉眼比较，完成检测。
也可以采用多种其它免疫测定中的任一种来完成检测。例如，通过对所述抗体或抗体片段进行放射性标记，有可能通过利用放射免疫测定(RIA)(参见例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，1986年3月)检测指纹基因的野生型、突变型或扩增型肽。可以采用诸如应用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影之类的方法，检测所述放射性同位素。
也有可能用荧光化合物标记所述抗体。当将所述荧光标记抗体暴露于合适波长的光时，则由于荧光可以检测到其存在。在最常用的荧光标记化合物中，有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
也可以用发射荧光的金属例如152Eu或镧系的其它金属，对所述抗体进行可检测标记。可以用这类金属螯合基团，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，将这些金属与所述抗体连接。
通过将所述抗体与化学发光化合物偶联，也可以将其可检测标记。然后通过检测在化学反应过程中产生的发光，检测所述化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
同样，可以用生物发光化合物来标记本发明的抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种类型的化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在，测定生物发光蛋白的存在。对标记来说，重要的生物发光化合物是荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。
在本申请中，用标记的文献资料出处来表示各种出版物、专利和公布的专利申请。在本申请中提及的这些出版物、专利和公布的专利说明书的公开内容通过引用结合到本说明书中，以更加全面地描述本发明所属技术领域的现有技术。
以下实施例仅用来说明本发明，决不应该解释为限制本发明。
                      实施例
实施例1：从质粒文库直接构建构建体
使用λZAPTM系统，如下制备基因组文库。让胚胎干细胞在100mm组织培养板中生长。通过将5ml裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM EDTA pH8.0、10mM NaCl、0.5％SDS和1mg/ml蛋白酶K)加至100mm平板内汇合的胚胎干细胞中，从这些ES细胞中分离出高分子量基因组DNA。然后将细胞于60℃孵育数小时或直至完全裂解。通过数轮温和的苯酚：氯仿抽提和随后乙醇沉淀，从裂解细胞中纯化基因组DNA。
基因组DNA用限制性酶Sau 3AI部分消化，产生约5-20kb的片段。通过添加dATP和dGTP，在Klenow DNA聚合酶存在下将这些片段的末端部分补平，在基因组片段上产生不匹配的末端。然后通过琼脂糖凝胶电泳(1xTAE，0.8％凝胶)，纯化5-10kb大小的片段。然后用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，从切下的琼脂糖片中分离出所述DNA。
将基因组片段连接到已经用Xho I切割并且用dTTP、dCTP和Klenow DNA聚合酶部分补平的λZapTM II载体(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)中。在连接之后，所述DNA用λ包装混合物(Gigapack III gold，Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)包装，并测定其滴度。
通过让λ克隆在M13辅助噬菌体ExAssist(Stratagene，Inc.)存在下，在合适的细菌菌株(XL-1 Blue MRF1，Stratagene，Inc.)上生长，从所述λ文库中得到环状噬菌粒DNA。具体地说，将约100,000个λ克隆与全都10-100倍过量的细菌和辅助噬菌体一起于37℃温育20分钟。将1ml LB培养基+10mM MgSO4加入到每种切割反应物中，将其于37℃振荡培养过夜。通常，一次在一个96孔深孔板(block)中建立24-96个这些反应物。第二天早晨，将板加热至65℃达15分钟，以杀死细菌和λ噬菌体。通过以约3000g离心15分钟，除去细菌碎片。保留含有环状噬菌粒DNA的上清液，将其直接用于质粒PCR实验中(关于质粒PCR实验，参见实施例9和10)。
采用长距离PCR和根据已知序列(示于图1中)如上所述选择的“向外”oligo，在上述噬菌粒DNA库中筛选特定的目的基因。所述PCR反应物含有2μl的一个库的噬菌粒DNA样品、3μl 10×PCR缓冲液3(Boehringer Mannheim)、1.1μl 10mM dNTP、50nM引物、0.3μlEXPAND长模板PCR酶混合物(Long Template PCR Enzyme Mix)(Boehringer-Mannheim)和30μl水。循环条件是94℃2分钟(1个循环)；94℃10秒、65℃30秒、68℃15秒(15个循环)；94℃10秒、60℃30秒、68℃15秒以及于68℃每隔一个循环增加20秒(25个循环)；68℃7分钟(1个循环)并且于4℃保持。
通过在含有1X TAE缓冲液的琼脂糖凝胶上电泳，分离所述PCR反应的产物，并且用溴化乙锭和紫外线显现。从凝胶上切下指示成功的长距离PCR的任何大片段，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。
为了免除对所述PCR片段作限制性图谱的需要，使用以下不依赖连接作用的克隆策略。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Inc.，SantaClarita，California)“纯化”目的长距离PCR片段。通过混合0.1-2μg所述片段、2μl NEB(New England BioLabs)缓冲液4、1μl 2mM dTTP、6单位T4 DNA聚合酶(NEB)、水至总体积为20μl，并且于25℃保温30分钟，产生所述PCR片段的单链末端。通过于75℃加热20分钟使所述聚合酶失活。用Sac I和Sac II在单一限制性位点消化质粒载体pDG2(示于图2A中的pDG2)，并且如上所述用T4 DNA聚合酶处理每种反应物，也在Neor选择标记片段上产生单链末端。用与长距离PCR片段末端互补的单链末端，制备图1所示的载体。
然后，用或者两步克隆策略或者四向一步方案，将所述载体和片段装配为构建体。简而言之，将含有10ng T4处理的Neor盒、1μl T4处理的PCR片段、0.2μl 0.5M EDTA、0.3μl 0.5M NaCl和水至4μl的反应物加热至65℃，并且在约45分钟内让其冷却至室温。然后将所述混合物转化到亚克隆效能(subcloning efficiency)DH5-α感受态细胞中。
实施例2：从噬菌体文库产生构建体
如下在λ噬菌体中制备小鼠胚胎干细胞文库。通过在Sau 3AI位点部分切割DNA，产生长度约20kb的基因组片段，从基因组DNA构建基因组文库。用Klenow酶，在dGTP和dATP存在下，将这些DNA片段的末端序列部分补平，用T4 DNA连接酶将所述片段连接到已经用Klenow在dTTP和dCTP存在下部分补平的合适的λ克隆载体例如λFix II(Stratagene，Inc.，La Jolla，California)的Xho I位点中。或者，用蔗糖梯度对所述部分消化的基因组DNA进行大小选择，并且选择约20kb的序列。将经富集的部分克隆到经Bam HI切割的λ载体例如λDatsh II(Stratagene，Inc.，La Jolla，California)中。
将文库平板接种到1,152个平板上，每个平板含有约1,000个克隆。因此，总共平板接种了1.1×106个克隆(相当于8个基因组)。
通过加入4mlλ洗脱缓冲液(10mM MgCl2、10mM Tris-pH8.0)至每个平板，于室温温育3-5小时，从每个平板上洗脱下所述噬菌体。温育后，从每个平板上收集2ml缓冲液，将其置于96深孔板(Costar，In.)的一个孔中。填充12个96孔板，将其称为“亚库文库(sub-poollibrary)”。
使用该亚库文库，通过将100μl的12个不同的亚库孔内容物置于一个新的96孔板的一个孔中，制备“库文库(pool library)。将12个亚库平板混合形成1个库文库平板。
使用已知经PCR扩增所述目的基因的一对寡核苷酸，扩增来自“大库文库”的96个库的上清液。在0.5单位的Amplitaq GoldTM(PerkinElmer)、每种寡核苷酸1μM、200μM dNTP、2μl 1-5倍稀释的所述库(或亚库)上清液、50mM KCl、100mM Tris-HCl(pH8.3)以及或者1.5mM或1.25mM MgCl2存在下，进行PCR。循环条件是95℃8分钟(1个循环)；95℃30秒、60℃30秒、72℃45秒(55个循环)；72℃7分钟(1个循环)，并且于4℃保持。根据所述基因，约3-12个库产生如实施例1中所述在琼脂糖凝胶上鉴定的阳性信号。在需要进一步纯化(即在扩增后没有清晰信号)的情况下，将12个亚库构成的所述库，用相同的引物进行扩增，标识为一个亚库(1000个克隆)。
侧翼片段的产生  如上所述，敲除构建体含有与靶基因同源、邻接正选择标记的两个区段的DNA序列。由如上在实施例2中所述鉴定为阳性的λ克隆的库，进行长距离PCR。用具有缺乏一种类型碱基的预先确定的序列并且与载体上的预先确定的序列互补的一对寡核苷酸，产生每种片段。所获得的片段为1-5kb。也用合适的寡核苷酸产生大于5kb的第三片段。然后用这种第三片段获得待敲除基因附近、但位于所述载体之外的DNA序列。
实施例3：两步克隆法-通用方法
pDG2质粒载体(图2A)含有单一限制性位点Sac II和Sac I。通过用或者限制性酶Sac II或者Sac I消化pDG2载体，并且用T4 DNA聚合酶和dTTP如上所述处理每种反应物，产生合适的单链退火位点。对于每种载体，在微量滴定板中建立4种反应物：所述反应物含有1μl的或者(1)T4 DNA聚合酶处理的片段；(2)110稀释的T4处理的片段反应物；(3)1∶100稀释的T4处理的片段或(4)水(无插入片段对照)。密封所述微量滴定板，将其置于加热至65℃的两个温度块(temperatureblock)之间，让其缓慢冷却至室温达30-45分钟。
然后，将微量滴定板置于冰上，向每孔中加入20-25μl亚克隆效能感受态细胞。将平板于冰上孵育20-30分钟。然后将微量滴定板置于加热至42℃的两个温度块之间达2分钟，然后在冰上放置2分钟。向每孔中加入100μl LB，用parafilm覆盖平板，于37℃温育30-60分钟。将每孔的全部内容物平板接种到一个LB-Amp平板上，并于37℃温育过夜。
从所具有的菌落至少是无插入片段对照的2-4倍的平板上，挑出约12-24个菌落。让所述菌落在深孔板上于37℃生长过夜，然后用Qiagen小量制备试剂盒提取质粒DNA。
用Not I和SalI酶消化质粒DNA。如图2A所示，Not I/SalI消化将产生一个含有克隆位点3和4的大片段和一个含有克隆位点1和2以及Neor基因的较小的片段。在消化后，将反应物在含有0.2μg/ml溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上电泳。对于无插入片段，存在2个条带，一个为1975个碱基对，一个为2793个碱基对。当存在插入片段时，这些条带中的至少一个条带将较大，因为它会在退火位点1/2或退火位点3/4含有一个片段(插入片段1或2)。切下插入片段条带，用QIAquick凝胶提取试剂盒处理。进行第二个连接反应，所述反应物含有1μl 10X连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP、25μg/ml牛血清白蛋白)、1μl T4 DNA连接酶、1-2μl片段(位点3/4条带)、5μl位点1/2条带和水至10μl。也用水或者取代位点3/4片段或者取代位点1/2片段，建立对照。将反应物于室温温育1-2小时，用25μl感受态细胞进行转化。
以下描述适用于下述实施例。许多靶基因的序列是已知的，并且公众可以得到，主要得自EST数据库。根据这些序列制备用于PCR扩增靶基因的寡核苷酸引物。这些实施例正文中的“侧翼DNA”是指邻接靶基因中待缺失或突变区域的基因组序列。“侧翼DNA”在上文中也被描述为与靶基因同源的DNA序列区段。R1基因组文库是指由R1 ES细胞系制备的基因组文库。这种文库例如如实施例1中所述来制备。迄今为止，已经在约200个已知的和新的靶基因中实施了本发明方法。
实施例4：用于靶2(一种金属蛋白酶基因)的打靶构建体的双向克隆
靶2(一种金属蛋白酶基因)侧翼DNA的鉴定。在标准条件下，用Oligo#174(SEQ ID NO：19)和#180(SEQ ID NO：20)，经PCR扩增具有一个R1基因组文库的各个库，以便鉴定根据存在500bp条带指示含有靶#2基因组DNA的各个孔。鉴定出分别含有约12,000个克隆的总共12个库(库A5、A7、C2、D2、E5、E10、F7、G1、G7、H2、H4、H7)。然后用oligo 454(SEQ ID NO：21)和463(SEQ ID NO：22)扩增库C2，产生一个2000bp的条带，用oligo 464(SEQ ID NO：23)和42(SEQID NO：24)扩增库H2，产生一个2700bp的条带。这两个条带含有靶2的侧翼DNA。
打靶构建体的构建。从琼脂糖凝胶中凝胶纯化含有靶2侧翼DNA的每个条带，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分别处理所述末端，以便产生单链突出端。然后将这些条带中的每个条带单独克隆到质粒载体pDG2(示于图2A中)中。通过不依赖连接作用的克隆，将C2条带克隆到Sac II消化的、已经用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2中。在一个单独的反应中，通过不依赖连接作用的克隆，将H2条带克隆到Sac I消化的、已经用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2中。
为了将两个侧翼臂移至一种打靶载体中，用Not I/Sal I消化上述每种载体，凝胶纯化含有C2条带的4kb片段和含有H2条带的5kb片段。采用标准条件，用T4 DNA连接酶将这两种片段连接在一起，鉴定含有这两种侧翼臂的重组体。在所检查的12个菌落中，所有12个菌落都是正确的，即含有正确邻接正选择标记Neor的两个臂。
实施例5：用于靶54(一种丝氨酸蛋白酶基因)的打靶构建体的双向克隆
靶54侧翼DNA的鉴定。在标准条件下，用Oligo #151(SEQ IDNO：25)和#155(SEQ ID NO：26)，经PCR扩增具有一个R1基因组文库的各个库，以便鉴定根据存在179bp条带指示含有靶#54基因组DNA的各个孔。鉴定出分别含有约12,000个克隆的总共12个库(库A4、A10、B2、B9、C9、E1、E6、F8、G4、H6、H7和H9)。然后用oligo454(SEQ ID NO：27)和465(SEQ ID NO：28)扩增库G4，产生一个1400bp的条带，用oligo 466(SEQ ID NO：29)和42(SEQ ID NO：24)扩增库H7，产生一个3000bp的条带。这两个条带含有靶54的侧翼DNA。
打靶构建体的构建。从琼脂糖凝胶中凝胶纯化每个条带，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分别处理所述末端，以便产生单链突出端。然后将这些条带中的每个条带单独克隆到pDG2中。通过不依赖连接作用的克隆，将G4条带克隆到Sac II切割的、已经用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2中。在一个单独的反应中，通过不依赖连接作用的克隆，将H7条带克隆到Sac I切割的、已经用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2中。
为了将两个侧翼臂移至一种打靶载体中，用Not I/SalI消化上述每种载体，凝胶纯化含有G4条带的6kb片段和含有H7条带的8kb片段。采用标准条件，用T4 DNA连接酶将这两种片段连接在一起，鉴定含有这两种侧翼臂的重组体。在所检查的24个菌落中，14个菌落具有正确的插入片段。
实施例6：一步(四向)克隆法-通用方法
因为每种单链退火位点都是独一无二的，所以也使用四向连接策略，用一个步骤产生构建体。如上所述建立退火反应，只是每种反应物含有用Sac I和Sac II两者消化的载体，并且将两种T4处理的片段都加入到这些反应中。
实施例7：用于靶43(一种G蛋白偶联受体基因)的打靶构建体的四向克隆
靶43侧翼DNA的鉴定。在标准条件下，用Oligo#1(SEQ ID NO：30)和#2(SEQ ID NO：31)，经PCR扩增具有一个R1基因组文库的各个库，以便鉴定根据存在414bp条带指示含有靶#43基因组DNA的各个孔。鉴定出分别含有约12,000个克隆的总共11个库(库A32、A5、A9、B4、D4、D10、E1、E9、F9、G7和G8)。然后用oligo 41(SEQ ID NO：32)和38(SEQ ID NO：33)扩增库E1，产生一个1500bp的条带，用oligo 40(SEQ ID NO：34)和37(SEQ ID NO：35)扩增库D10，产生一个3500bp的条带。这两个条带含有靶43的侧翼DNA。
打靶构建体的构建。从琼脂糖凝胶中凝胶纯化每个条带，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分别处理所述末端，以便产生单链突出端。然后将这些插入片段与约50ng的已经用Sac I和Sac II两者消化、随后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2混合。将DNA混合物加热至65℃达2分钟，然后在冰上孵育5分钟。然后将退火的DNA转化到DH5-α感受态细胞中，通过在氨苄青霉素琼脂糖平板上进行选择，获得重组分子。在于37℃温育过夜后，挑出单个菌落，让其生长以用于分析。通过合适的限制性酶消化，鉴定重组分子。在所检查的52个菌落中，35个菌落具有正确的预期产物的限制图谱。
实施例8：用于靶244(一种新基因)的打靶构建体的四向克隆
靶244侧翼DNA的鉴定。在标准条件下，用Oligo#540(SEQ IDNO：36)和#546(SEQ ID NO：37)，经PCR扩增具有一个R1基因组文库的各个库，以便鉴定根据存在246bp条带指示含有靶#244基因组DNA的各个孔。鉴定出分别含有约12,000个克隆的总共16个库(库A1、B1、A3、A5、A6、B6、A8、C9、D10、E1、F2、E5、E6、F10、G9和H8)。然后用oligo 445(SEQ ID NO：38)和667(SEQ ID NO：39)扩增库G9，产生一个1300bp的条带，用oligo 668(SEQ ID NO：40)和42(SEQ ID NO：24)扩增库A6，产生一个1600bp的条带。这两个条带含有靶244的侧翼DNA。
打靶构建体的构建。从琼脂糖凝胶中凝胶纯化每个条带，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分别处理所述末端，以便产生单链突出端。然后将这些插入片段与约50ng的已经用Sac I和Sac II两者消化、随后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2混合。将DNA混合物加热至65℃达2分钟，然后在冰上孵育5分钟。然后将退火的DNA转化到DH5-α感受态细胞中，通过在氨苄青霉素琼脂糖平板上进行选择，获得重组分子。在于37℃温育过夜后，挑出单个菌落，让其生长以用于分析。通过合适的限制性酶消化，鉴定重组分子。在所检查的12个菌落中，2个菌落具有正确的预期产物的限制图谱。
以下的实施例9和10提供质粒PCR法(在图1中图示的)作为上述实施例中所述的双向和四向策略的替代且优选的方法。
实施例9：克隆靶227(一种新基因)的打靶构建体的质粒PCR法
基因组克隆的扩增由R1 ES细胞，制备在λZap II中克隆并且随后用M13辅助噬菌体介导的切除进行切除的、一个质粒PCR基因组文库的各个库，用oligo 907(SEQ ID NO：41)和908(SEQ ID NO：42)扩增。这些oligo从所述文库的库6扩增了一种约9kb的产物。从琼脂糖凝胶中分离出这种含有靶227侧翼臂以及质粒pBluescript骨架的该片段。
打靶构建体的构建  在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶处理所分离的DNA片段，以便产生合适的单链末端。然后将该片段与由已经用Sac I和Sac II两者消化、随后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2获得的Neor基因片段一起退火(不依赖连接作用)。所述消化和聚合酶处理产生了具有特异性退火至靶277片段的末端的Neor基因。基本上如上所述建立退火反应，获得靶227构建体(14个克隆中有13个克隆是正确的)。
实施例10：克隆靶125(一种核激素受体基因)的打靶构建体的质粒PCR法
基因组克隆的扩增  由R1 ES细胞，制备在λZap II中克隆并且随后用M13辅助噬菌体介导的切除进行切除的、一个质粒PCR文库的各个库，用oligo 1157(SEQ ID NO：43)和1158(SEQ ID NO：44)扩增。这些oligo从所述文库的库10扩增了一种约10kb的产物。从琼脂糖凝胶中分离出这种含有靶125侧翼臂以及pBluescript骨架的该片段。
打靶构建体的构建  在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶处理所分离的DNA片段，以便产生合适的单链末端。然后将该片段与由已经用Sac I和Sac II两者消化、随后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2获得的Neor基因片段一起退火。这产生了具有特异性退火至靶125构建体的末端的Neor基因，获得靶125构建体(18个克隆中有12个克隆是正确的)。
实施例11：应用GFP作为筛选标记
将GFP(绿色荧光蛋白)基因加入到与靶基因同源区之外，使得人们可以通过在荧光下筛选ES细胞集落，富集同源重组体(在打靶构建体和ES细胞中的靶基因之间发生重组)。用胰蛋白酶处理快速生长中的ES细胞，以制备单细胞悬浮液。相应的打靶载体用限制性内切核酸酶线性化，将20μg DNA加入到ES培养基{具有1,000单位/ml LIF(白血病抑制因子-Gibco 13275-029“ESGRO”)和12％胎牛血清的高葡萄糖DMEM(无L-谷氨酰胺或丙酮酸钠)}中的10×106 ES细胞中。将细胞置于2mm间距的样品池中，在BTX电穿孔装置上在400μF电阻和200伏下进行电穿孔。在电穿孔后，立即将ES细胞以每个100mm凝胶化组织培养板1×106细胞接种。48小时后，将培养基更换为ES培养基+G418(200μg/ml)。在第4、6和8天，将培养基更换为ES培养基+G418(200μg/ml)。在第10-12天，将平板置于紫外线下，根据它们是否发荧光，对ES细胞集落进行评价。该实验的基础是发荧光的细胞已经随机整合了所述打靶载体，并且GFP基因是完整的。已经经历了同源重组的细胞会缺失GFP基因，并且不发荧光；这些是目的克隆。
实施例12：靶T243的敲除和纯合敲除突变型小鼠的分析
靶T243侧翼DNA的鉴定  在标准条件下，用Oligo#426(SEQ IDNO：55)和#432(SEQ ID NO：56)，经PCR扩增具有一个R1基因组文库的各个库，以鉴定根据存在150bp条带指示含有靶T243基因组DNA的各个孔。鉴定出分别含有约12,000个克隆的总共48个库(库A1、A2、A9、B4、B11、B12、C3、C8、C11、C12、D1、D3、E4、F3、G4、G5、G6、G12、H4、H5和H12)。然后用oligo #488(SEQ ID NO：48)[具有单链尾序列的引物]和#454(参见图8)扩增库H10，产生一个2700bp的条带。然后用oligo#489(SEQ ID NO：49)[具有单链尾序列的引物]和#42(参见图8)扩增库A7，产生一个5200bp的条带。这两个条带含有靶T243的侧翼DNA，(SEQ ID NO：50)和(SEQ ID NO：51)。
打靶构建体的构建  从琼脂糖凝胶中凝胶纯化每个条带，在dTTP存在下用T4 DNA聚合酶分别处理所述末端，以便产生单链突出端。然后将这些插入片段与约50ng的已经用Sac I和Sac II两者消化、随后用T4 DNA聚合酶在dATP存在下处理的pDG2混合。将DNA混合物加热至65℃达2分钟，然后在冰上孵育5分钟。将退火的DNA转化到DH5-α感受态细胞中，通过在氨苄青霉素琼脂糖平板上进行选择，获得重组分子。在于37℃温育过夜后，挑出单个菌落，让其生长以用于分析。通过合适的限制性酶消化，鉴定重组分子。
将打靶构建体导入ES细胞中和同源重组  用胰蛋白酶处理快速生长中的ES细胞，以制备单细胞悬浮液。T243打靶载体用限制性内切核酸酶线性化，将20μg DNA加入到ES培养基{具有1,00单位/mlLIF(白血病抑制因子-Gibco 13275-029“ESGRO”)和12％胎牛血清的高葡萄糖DMEM(无L-谷氨酰胺或丙酮酸钠)}中的10×106ES细胞中。将细胞置于2mm间距的样品池中，在BTX电穿孔装置上在400μF电阻和200伏下进行电穿孔。在电穿孔后，立即将ES细胞以每个100mm凝胶化组织培养板1×106细胞接种。48小时后，将培养基更换为ES培养基+G418(200mg/ml)。在第4、6和8天，将培养基更换为ES培养基+G418(200mg/ml)。
在第10-12天，挑出G418抗性菌落(平均192个菌落)，将其以复份置于96孔板中。在ES培养基中培养2-5天后，将一个平板在50％FBS、40％DMEM和10％DMSO中冷冻。让第二个平板过量生长(overgrow)，再饲养8-10天，然后裂解制备供分析用的DNA(裂解缓冲液：10mM Tris pH7.5、10mM EDTA pH8.0、10mM NaCl、0.5％Sarcosyl和1mg/ml蛋白酶K)。然后用2倍体积的乙醇沉淀DNA，将其重悬于适宜的缓冲液中。
在证实同源重组事件后，将来自复份平板的阳性孔解冻，置于已经接种丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞(24小时之前)的24孔组织培养皿中。让细胞生长至足以供二倍体聚集(CD-1宿主细胞株)和额外的储存小瓶冷冻用的水平。关于处理ES细胞和由ES细胞产生嵌合小鼠的一般方法，参见 Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach(E.J.Robertson编著，IRL Press，Oxford(1987))。将重团聚胚泡植入假孕雌性CD-1小鼠体内。然后繁育高度嵌合的小鼠，以产生突变型243基因的种系传递。
纯合T243敲除小鼠的产生和突变表型的分析  繁育杂合T243敲除小鼠，比较纯合敲除后代与正常及杂合的同窝小鼠明显的表型差异。与正常同窝小鼠相比，纯合子最初机能亢进，并且皮肤非常干燥。到约15-17天时，纯合敲除小鼠开始显得越来越不稳定并且嗜眠；到约19-21天时，纯合子显现出战栗和濒临死亡的体征。在约23-25天，处死未死亡的纯合敲除小鼠供进一步分析(参见下文)。
图9和图10显示了每日测量身长和体重的结果、以及在两只杂合243敲除小鼠之间两次典型交配后代的体重/身长之比的计算结果。在出生时，纯合幼畜的大小与野生型同窝小鼠或杂合同窝小鼠大约相同或略小。然而，随着年龄的增长，在纯合敲除幼畜中体重增加和纵向生长(lengthwise gtowth)均显著降低。到15-17天时，纯合子开始体重减轻，这种体重减轻持续直至约3周时死亡。
对6只纯合突变型小鼠(4只雌性，2只雄性)和3只对照小鼠(2只雌性，1只雄性)进行尸体剖检。在骨和肾组织中观察到可归因于243突变的显著性差异。
骨  突变型小鼠的软骨异常，骨生成普遍减少。具体地说，观察到中轴骨骼和附肢骨骼均缩短。四肢的近端骨和远端骨成比例缩短，关节软骨缺乏爱茜蓝染色。
股骨远端的生长板薄以及骺软骨薄至缺乏。单突变型小鼠有微小骨折，所述微小骨折从皮质通过干骺端斜线延伸到长骨体生长部中(提示生长板脆性)。在所有突变型小鼠的长骨体生长部内，在增殖和肥大区中的软骨细胞柱短。干骺端内软骨性针状体短并且间隔宽。偶尔出现的针状体偶然定向。成骨细胞丰富并且常常沿软骨性针状体堆积。骺软骨薄并且常常被纤维性结缔组织所取代。骺表面的爱茜蓝染色也减弱。骨骺/长骨体生长部连接处的软骨略微向外张开，有伸出在长骨体生长部之上的不规则的凸出边缘。
发现突变体的胸骨板不规则。生长板或者缺乏或者不连续。大的不规则的软骨岛延伸到胸骨板体中，偶然有第二个骨化中心。软骨边缘向外张开。
根据爱茜蓝染色，椎体不定地骨化。某些椎体小并且主要是软骨性的，生长板不规则且薄，显示出侧突渐尖。
肾  所有所述突变型小鼠的两个肾都有发育不良改变，这些在皮质髓质连接处最为显著，而在皮质中程度较低。所述肾小且缺乏正常的结构。皮质薄，并且某些肾小球在被膜下。被膜下的肾小球是小而皱缩、多细胞的肾小球丛，显示发育未全。皮质髓质区没有放射状弓形管和独特的管形。皮质髓质连接处内的肾小管上皮细胞随机排列成片、堆和簇。某些肾小管上皮细胞小且嗜碱染色暗，因而显示有再生。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对上述实施方案作各种修饰。这些修饰和变化在本发明范围内。
                            序列表<110>KLEIN，ROBERT
 MATTHEWS，WILLIAM
 MOORE，MARK
 ALLEN，KEITH<120>含有TRP基因破坏的转基因小鼠<130>3866-5<140>未指定<141>2000-10-26<150>US 60/161,488<151>1999-10-26<160>59<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4768<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：pDG2<400>1gttaactacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 60tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 120ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 180ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 240tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 300gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttctccaatg atgagcactt ttaaagttct 360gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 420acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 480tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 540caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 600gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 660cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 720tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 780agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 840tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 900ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 960acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 1020ctcatatata ctttagattg atttaccccg gttgataatc agaaaagccc caaaaacagg 1080aagattgtat aagcaaatat ttaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 1140aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 1200aaatcaaaag aatagcccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 1260ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc 1320ccactacgtg aaccatcacc caaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta 1380aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcg aacgtggcga 1440gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca 1500cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtaaaagg 1560atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 1620ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 1680ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 1740ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 1800ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 1860ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 1920tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 1980tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 2040tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 2100tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 2160gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 2220tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 2280ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgtaatgtg agttagctca ctcattaggc 2340accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 2400acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctacgta atacgactca 2460ctaggcggcc gcgtttaaac aatgtgctcc tctttggctt gcttccgcgg gccaagccag 2520acaagaacca gttgacgtca agcttcccgg gacgcgtgct agcggcgcgc cgaattcctg 2580caggattcga gggcccctgc aggtcaattc taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg 2640cagtctggag catgcgcttt agcagccccg ctggcacttg gcgctacaca agtggcctct 2700ggcctcgcac acattccaca tccaccggta gcgccaaccg gctccgttct ttggtggccc 2760cttcgcgcca ccttctactc ctcccctagt caggaagttc ccccccgccc cgcagctcgc 2820gtcgtgcagg acgtgacaaa tggaagtagc acgtctcact agtctcgtgc agatggacag 2880caccgctgag caatggaagc gggtaggcct ttggggcagc ggccaatagc agctttgctc 2940cttcgctttc tgggctcaga ggctgggaag gggtgggtcc gggggcgggc tcaggggcgg 3000gctcaggggc ggggcgggcg cgaaggtcct cccgaggccc ggcattctcg cacgcttcaa 3060aagcgcacgt ctgccgcgct gttctcctct tcctcatctc cgggcctttc gacctgcagc 3120caatatggga tcggccattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt 3180ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt 3240gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc 3300cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc 3360ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga 3420agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat 3480ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca 3540agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga 3600tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc 3660gcgcatgccc gacggcgatg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat 3720catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga 3780ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg 3840ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt 3900ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagg ggatcgatcc gtcctgtaag tctgcagaaa 3960ttgatgatct attaaacaat aaagatgtcc actaaaatgg aagtttttcc tgtcatactt 4020tgttaagaag ggtgagaaca gagtacctac attttgaatg gaaggattgg agctacgggg 4080gtgggggtgg ggtgggatta gataaatgcc tgctctttac tgaaggctct ttactattgc 4140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ccttgaaca acagcaagag gtggaaggat ctggggtgct gggagacggc accccaaagg 1080gaagaggagg aggagcagaa ggcagctctc tttctacaca gtccccctca cgagctccgg 1140ggtccaccca gcatccccag gctgagatcc aggctcctga catggaagct gaagagcatg 1200aggcacataa gatgctcacc agcgccccct tcagccagga aggactccgt gcagcctcag 1260cagccaggcc tgcctcttcc ttccaccaag cattctcttc tgctggtcct tgtcggatgg 1320taaattcgag aacttccagg acaaactcgg gtgtggcaca aaggggctgg acgccagagc 1380cagagccacg ccagagactg cagagagggc acctgaccta acccccctgg aaagccaatc 1440tgcagttccc gtgtccaccc actcctcctg aggacgcctc atgctctgcc cagcccttct 1500cccagggcta ccagagtaaa caccttttgg cctttcggtt tggttcctgg gtcctcatca 1560gcctccagag tgtcccctca tcgatctttt ttgcctttgt cccccaatcc caggggctgg 1620aaggccatca ccatcattgg aggcttaacc tgtcagttac taggaggtgc tgggagcgcc 1680cggggttggt ttggggtaat cactcactgg ctctcagcct tctaacactg cagcccctta 1740atacagttcc ttctgttgtg gtgactccca cgcccccaca cacacaccat aaaattattt 1800cgatgctgtt tcataactgt aaaaaaaaaa aaaaaaaaa                        1839<210>48<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：带有克隆位点的引物<400>48ctggttcttg tcggcttggc ccaaagctca gacatggact ccatggccc             49<210>49<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：带有克隆位点的引物<400>49ggtcctcgct ctgtgtccgt tgaatgcgat tgcccagcaa atgcgaagt             49<210>50<211>471<212>DNA<213>T243的同源物<220><221>经修饰的碱基<222>(260)<223>A、T、G或C<400>50acagaaaaca agaaacaaaa accatgaaag atagtctgtt atccagggct agaatgccca 60aggctggttc atccaaggta tgatgaaggt tcacccgcta ggaactgatg ctccagctac 120tgagcctcct ttagctggca gtgatatcgc tatagggcgc caaagccacc atccgctctc 180tgattgggtg agatgggaaa aaaaaaagat agttcctctc attggctata aagcagacgc 240cgagcgaacc cattggttgn gtcgcccgcg ggccttggtc ggtttcgcaa gccgctagag 300gctaccgggc gaggggcggg ccggagctcg ccgttgccgt ggttacccag agacacgtgc 360gcagtcccgg aagcggccgg gggaagctgc tccgcgcgcg ctgccggagg aagcgccgcc 420gggtccgctc tgctctgggt ccggctgggc catggagtcc atgtctgagc t          471<210>51<211>370<212>DNA<213>T243的同源物<400>51tgcgattgcc cagcaaatgc gaaggtgagg gggcggggcc gcggggcgta gccaagcccg 60aggggcggga gggggcgggg cctgtgggaa gggtctgggc ctggcaggac ctgggctggg 120gtctccttgg ccctgctgtg tgctttgcgg caatgctggg tgctgtgact ctcggataac 180ctggagatcc ctgcttttgg gcgaatccgg gggtagttgc tcatcaagac tagaggtggg 240ggtggaggga aggcttcata caggaagcct gctgcgaaat gaagagttgg ccagggaaag 300catggcgtgc agaggaactc actccgcaga aaccacagaa acagaggcag atgaggacgc 360cctgccggcc                                                        370<210>52<211>276<212>PRT<213>鼠类TRP<400>52Met Glu Ser Met Ser Glu Leu Ala Pro Arg Cys Leu Leu Phe Pro Leu1               5                  10                  15Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro Ala Pro Lys Leu Gly Pro
         20                  25                  30Ser Pro Ala Gly Ala Glu Glu Thr Asp Trp Val Arg Leu Pro Ser Lys
     35                  40                  45Cys Glu Val Cys Lys Tyr Val Ala Val Glu Leu Lys Ser Ala Phe Glu
 50                  55                  60Glu Thr Gly Lys Thr Lys Glu Val Ile Asp Thr Gly Tyr Gly Ile Leu65                   70                  75                  80Asp Gly Lys Gly Ser Gly Val Lys Tyr Thr Lys Ser Asp Leu Arg Leu
             85                  90                  95Ile Glu Val Thr Glu Thr Ile Cys Lys Arg Leu Leu Asp Tyr Ser Leu
        100                 105                 110His Lys Glu Arg Thr Gly Ser Asn Arg Phe Ala Lys Gly Met Ser Glu
    115                 120                 125Thr Phe Glu Thr Leu His Asn Leu Val His Lys Gly Val Lys Val Val
130                 135                 140Met Asp Ile Pro Tyr Glu Leu Trp Asn Glu Thr Ser Ala Glu Val Ala145                 150                 155                 160Asp Leu Lys Lys Gln Cys Asp Val Leu Val Glu Glu Phe Glu Glu Val
            165                 170                 175Ile Glu Asp Trp Tyr Arg Asn His Gln Glu Glu Asp Leu Thr Glu Phe
        180                 185                 190Leu Cys Ala Asn His Val Leu Lys Gly Lys Asp Thr Ser Cys Leu Ala
    195                 200                 205Glu Arg Trp Ser Gly Lys Lys Gly Asp Ile Ala Ser Leu Gly Gly Lys
210                 215                 220Lys Ser Lys Lys Lys Arg Ser Gly Val Lys Gly Ser Ser Ser Gly Ser225                 230                 235                 240Ser Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Asp Ala Asn Ala
            245                 250                 255Glu Glu Glu Glu Gly Val Gln Lys Ala Ser Pro Leu Pro His Ser Pro
        260                 265                 270Pro Asp Glu Leu
    275<210>53<211>1848<212>DNA<213>扩增型T243<400>53ggcacgaggg aggaagcgcc gccgggtccg ctctgctctg ggtccggctg ggccatggag 60tccatgtctg agctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 120ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctgct gctgctgctg 180ctgctgctgc tgcgattgcc cagcaaatgc gaagtgtgca agtatgttgc tgtggagctg 240aagtcggctt ttgaggaaac gggaaagacc aaggaagtga ttgacaccgg ctatggcatc 300ctggacggga agggctctgg agtcaagtac accaagtcgg acttacggtt aattgaagtc 360actgagacca tttgcaagag gcttctggac tacagcctgc acaaggagag gactggcagc 420aaccggtttg ccaagggtat gtcggagacc tttgagacgc tgcacaacct agtccacaaa 480ggggtcaagg tggtgatgga tatcccctat gagctgtgga acgagacctc agcagaggtg 540gctgacctca agaagcagtg tgacgtgctg gtggaagagt ttgaagaggt gattgaggac 600tggtacagga accaccagga ggaagacctg actgaattcc tctgtgccaa ccacgtgctg 660aagggaaagg acacgagttg cctagcagag cggtggtctg gcaagaaggg ggacatagcc 720tccctgggag ggaagaaatc caagaagaag cgcagcggag tcaagggctc ctccagtggc 780agcagcaagc agaggaagga actggggggc ctgggggagg atgccaacgc cgaggaggag 840gagggtgtgc agaaggcatc gcccctccca cacagccccc ctgatgagct gtgagcccag 900cttagtgtcc ttgaatcaag acccctgact tcagagcttg ggacacgcac agcgcagcgc 960agcgcagctc cagcaaggac agctgctgtc cagcatcagg tctcctccct tggctgtgcc 1020cctttccttc ccttgaacaa cagcaagagg tggaaggatc tggggtgctg ggagacggca 1080ccccaaaggg aagaggagga ggagcagaag gcagctctct ttctacacag tccccctcac 1140gagctccggg gtccacccag catccccagg ctgagatcca ggctcctgac atggaagctg 1200aagagcatga ggcacataag atgctcacca gcgccccctt cagccaggaa ggactccgtg 1260cagcctcagc agccaggcct gcctcttcct tccaccaagc attctcttct gctggtcctt 1320gtcggatggt aaattcgaga acttccagga caaactcggg tgtggcacaa aggggctgga 1380cgccagagcc agagccacgc cagagactgc agagagggca cctgacctaa cccccctgga 1440aagccaatct gcagttcccg tgtccaccca ctcctcctga ggacgcctca tgctctgccc 1500agcccttctc ccagggctac cagagtaaac accttttggc ctttcggttt ggttcctggg 1560tcctcatcag cctccagagt gtcccctcat cgatcttttt tgcctttgtc ccccaatccc 1620aggggctgga aggccatcac catcattgga ggcttaacct gtcagttact aggaggtgct 1680gggagcgccc ggggttggtt tggggtaatc actcactggc tctcagcctt ctaacactgc 1740agccccttaa tacagttcct tctgttgtgg tgactcccac gcccccacac acacaccata 1800aaattatttc gatgctgttt cataactgta aaaaaaaaaa aaaaaaaa              1848<210>54<211>279<212>PRT<213>扩增型T243<400>54Met Glu Ser Met Ser Glu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu  1               5                  10                  15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
         20                  25                  30Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu
     35                  40                  45Pro Ser Lys Cys Glu Val Cys Lys Tyr Val Ala Val Glu Leu Lys Ser
 50                  55                  60Ala Phe Glu Glu Thr Gly Lys Thr Lys Glu Val Ile Asp Thr Gly Tyr65                   70                  75                  80Gly Ile Leu Asp Gly Lys Gly Ser Gly Val Lys Tyr Thr Lys Ser Asp
             85                  90                  95Leu Arg Leu Ile Glu Val Thr Glu Thr Ile Cys Lys Arg Leu Leu Asp
        100                 105                 110Tyr Ser Leu His Lys Glu Arg Thr Gly Ser Asn Arg Phe Ala Lys Gly
    115                 120                 125Met Ser Glu Thr Phe Glu Thr Leu His Asn Leu Val His Lys Gly Val
130                 135                 140Lys Val Val Met Asp Ile Pro Tyr Glu Leu Trp Asn Glu Thr Ser Ala145                 150                 155                 160Glu Val Ala Asp Leu Lys Lys Gln Cys Asp Val Leu Val Glu Glu Phe
            165                 170                 175Glu Glu Val Ile Glu Asp Trp Tyr Arg Asn His Gln Glu Glu Asp Leu
        180                 185                 190Thr Glu Phe Leu Cys Ala Asn His Val Leu Lys Gly Lys Asp Thr Ser
    195                 200                 205Cys Leu Ala Glu Arg Trp Ser Gly Lys Lys Gly Asp Ile Ala Ser Leu
210                 215                 220Gly Gly Lys Lys Ser Lys Lys Lys Arg Ser Gly Val Lys Gly Ser Ser225                 230                 235                 240Ser Gly Ser Ser Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Gly Leu Gly Glu Asp
            245                 250                 255Ala Asn Ala Glu Glu Glu Glu Gly Val Gln Lys Ala Ser Pro Leu Pro
        260                 265                 270His Ser Pro Pro Asp Glu Leu
    275<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>55gggccatgga gtccatgtct gagct                                       25<210>56<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>56acttcgcatt tgctgggcaa tcgca                                       25<210>57<211>1362<212>DNA<213>人类TRP<400>57cgagccatgg attcaatgcc tgagcccgcg tcccgctgtc ttctgcttct tcccttgctg 60ctgctgctgc tgctgctgct gccggccccg gagctgggcc cgagccaggc cggagctgag 120gagaacgact gggttcgcct gcccagcaaa tgcgaagtgt gtaaatatgt tgctgtggag 180ctgaagtcag cctttgagga aaccggcaag accaaggagg tgattggcac gggctatggc 240atcctggacc agaaggcctc tggagtcaaa tacaccaagt cggacttgcg gttaatcgaa 300gtcactgaga ccatttgcaa gaggctcctg gattatagcc tgcacaagga gaggaccggc 360agcaatcgat ttgccaaggg catgtcagag acctttgaga cattacacaa cctggtacac 420aaaggggtca aggtggtgat ggacatcccc tatgagctgt ggaacgagac ttctgcagag 480gtggctgacc tcaagaagca gtgtgatgtg ctggtggaag agtttgagga ggtgatcgag 540gactggtaca ggaaccacca ggaggaagac ctgactgaat tcctctgcgc caaccacgtg 600ctgaagggaa aagacaccag ttgcctggca gagcagtggt ccggcaagaa gggagacaca 660gctgccctgg gagggaagaa gtccaagaag aagagcagca gggccaaggc agcaggcggc 720aggagtagca gcagcaaaca aaggaaggag ctgggtggcc ttgagggaga ccccagcccc 780gaggaggatg agggcatcca gaaggcatcc cctctcacac acagcccccc tgatgagctc 840tgagcccacc cagcatcctc tgtcctgaga cccctgattt tgaagctgag gagtcagggg 900catggctctg gcaggccggg atggccccgc agccttcagc ccctccttgc cttggctgtg 960ccctcttctg ccaaggaaag acacaagccc caggaagaac tcagagccgt catgggtagc 1020ccacgccgtc ctttcccctc cccaagtgtt tctctcctga cccagggttc aggcaggcct 1080tgtggtttca ggactgcaag gactccagtg tgaactcagg aggggcaggt gtcagaactg 1140ggcaccagga ctggagcccc ctccggagac caaactcacc atccctcagt cctccccaac 1200agggtactag gactgcagcc ccctgtagct cctctctgct tacccctcct gtggacacct 1260tgcactctgc ctggcccttc ccagagccca aagagtaaaa atgttctggt tctgaaaaaa 1320aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                    1362<210>58<211>278<212>PRT<213>人类TRP<400>58Met Asp Ser Met Pro Glu Pro Ala Ser Arg Cys Leu Leu Leu Leu Pro1               5                  10                  15Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Pro Glu Leu Gly Pro
         20                  25                  30Ser Gln Ala Gly Ala Glu Glu Asn Asp Trp Val Arg Leu Pro Ser Lys
     35                  40                  45Cys Glu Val Cys Lys Tyr Val Ala Val Glu Leu Lys Ser Ala Phe Glu
 50                  55                  60Glu Thr Gly Lys Thr Lys Glu Val Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ile Leu65                  70                  75                  80Asp Gln Lys Ala Ser Gly Val Lys Tyr Thr Lys Ser Asp Leu Arg Leu
             85                  90                  95Ile Glu Val Thr Glu Thr Ile Cys Lys Arg Leu Leu Asp Tyr Ser Leu
        100                 105                 110His Lys Glu Arg Thr Gly Ser Asn Arg Phe Ala Lys Gly Met Ser Glu
    115                 120                 125Thr Phe Glu Thr Leu His Asn Leu Val His Lys Gly Val Lys Val Val
130                 135                 140Met Asp Ile Pro Tyr Glu Leu Trp Asn Glu Thr Ser Ala Glu Val Ala145                 150                 155                 160Asp Leu Lys Lys Gln Cys Asp Val Leu Val Glu Glu Phe Glu Glu Val
            165                 170                 175Ile Glu Asp Trp Tyr Arg Asn His Gln Glu Glu Asp Leu Thr Glu Phe
        180                 185                 190Leu Cys Ala Asn His Val Leu Lys Gly Lys Asp Thr Ser Cys Leu Ala
    195                 200                 205Glu Gln Trp Ser Gly Lys Lys Gly Asp Thr Ala Ala Leu Gly Gly Lys
210                 215                 220Lys Ser Lys Lys Lys Ser Ser Arg Ala Lys Ala Ala Gly Gly Arg Ser225                 230                 235                 240Ser Ser Ser Lys Gln Arg Lys Glu Leu Gly Gly Leu Glu Gly Asp Pro
            245                 250                 255Ser Pro Glu Glu Asp Glu Gly Ile Gln Lys Ala Ser Pro Leu Thr His
        260                 265                 270Ser Pro Pro Asp Glu Leu
    275<210>59<211>107<212>DNA<213>通过敲除产生的缺失<400>59cgcgccccgc tgcctcttat ttcctttgct gctgctgctt ccgctgctgc tccttcctgc 60cccgaagcta ggcccgagtc ccgccggggc tgaggagacc gactggg               107

Claims (65)

1.一种细胞，所述细胞在编码TRP的靶DNA序列中包含破坏。
2.权利要求1的细胞，其中所述破坏用以下方法产生，所述方法包括：
(a)获得与所述靶DNA序列的第一区同源的第一序列；
(b)获得与所述靶DNA序列的第二区同源的第二序列；
(c)将所述第一序列和所述第二序列插入到打靶构建体中；和
(d)将所述打靶构建体导入所述细胞中，产生在所述靶DNA序列中产生破坏的同源重组体。
3.权利要求2的细胞，其中所述方法还包括：
在步骤(b)之后；
(i)提供一种载体，所述载体具有编码正选择标记的基因；和
(ii)利用不依赖连接作用的克隆，将所述第一序列和所述第二序列插入所述载体中，构成所述构建体；其中所述正选择标记位于所述构建体中所述第一序列和所述第二序列之间。
4.权利要求3的细胞，其中所述载体还包含一个编码筛选标记的基因。
5.权利要求1的细胞，其中所述靶DNA序列包含CTG三核苷酸重复。
6.权利要求5的细胞，其中所述CTG三核苷酸重复编码亮氨酸残基。
7.权利要求1的细胞，其中所述靶基因序列是T243或其天然存在的等位基因变异体。
8.权利要求1的细胞，其中所述靶DNA序列包含SEQ IDNO：47。
9.权利要求1的细胞，其中所述靶DNA序列包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。
10.权利要求3的细胞，其中所述载体还包含邻接所述正选择标记的一个或多个重组酶靶位点。
11.权利要求2的细胞，其中所述第一序列是SEQ ID NO：50，而所述第二序列是SEQ ID NO：51。
12.权利要求2的细胞，其中所述第一序列和所述第二序列用以下方法获得，所述方法包括：
(a)获得能够与所述靶杂交的两种引物，其中所述引物形成扩增产物的终点；
(b)提供含有所述靶序列的小鼠基因组DNA文库；
(c)使所述引物退火至所述文库中的互补序列上；
(d)扩增所述第一序列和所述第二序列；和
(e)分离所述扩增反应的产物。
13.权利要求12的细胞，其中所述第一引物是SEQ ID NO：45。
14.权利要求12的细胞，其中所述第二引物是SEQ ID NO：46。
15.权利要求12的细胞，其中所述扩增包括PCR。
16.权利要求15的细胞，其中所述扩增还包括长距离PCR。
17.权利要求12的细胞，其中所述小鼠基因组文库是一种质粒文库。
18.权利要求12的细胞，其中所述小鼠基因组文库是一种噬菌体文库，所述方法还包括获得能够与噬菌体载体序列杂交的两种引物，使得所述扩增产物在一个末端以一种靶序列引物终止，而在另一个末端以一种载体引物终止。
19.权利要求1的细胞，其中所述细胞在所述靶DNA序列中包含纯合破坏。
20.权利要求1的细胞，其中所述细胞是鼠类细胞。
21.权利要求1的细胞，其中所述细胞是人类细胞。
22.权利要求1的细胞，其中所述细胞是干细胞。
23.权利要求22的干细胞，其中所述干细胞是胚胎干细胞。
24.一种胚泡，所述胚泡含有权利要求23的胚胎干细胞。
25.打靶构建体，所述打靶构建体是在权利要求2的方法中使用的打靶构建体。
26.一种非人类脊椎动物，所述脊椎动物在编码TRP的基因中包含杂合破坏。
27.权利要求26的脊椎动物，其中所述脊椎动物是一种哺乳动物。
28.权利要求26的脊椎动物，其中所述哺乳动物是小鼠。
29.权利要求28的小鼠，其中所述小鼠用以下方法产生，所述方法包括：
(a)将权利要求1或权利要求2的干细胞引入胚泡中；
(b)将所得的胚泡植入假孕小鼠体内，其中所述假孕小鼠分娩出在其种系中含有被破坏的编码所述TRP的基因的嵌合小鼠；和
(c)繁育所述嵌合小鼠，以产生在编码所述TRP的基因中包含杂合破坏的小鼠。
30.权利要求28的小鼠，其中所述小鼠用以下方法产生，所述方法包括：
(a)将权利要求3的干细胞引入胚泡中；
(b)将所得的胚泡植入假孕小鼠体内，其中所述假孕小鼠分娩出在其种系中含有被破坏的编码所述TRP的基因的嵌合小鼠；和
(c)繁育所述嵌合小鼠，以产生在编码所述TRP的基因中包含杂合破坏的小鼠。
31.权利要求28的小鼠，其中所述TRP由T243或其天然存在的等位基因变异体编码。
32.一种敲除小鼠，所述敲除小鼠在编码TRP的基因中包含一个纯合破坏，其中所述破坏抑制所述野生型TRP的产生，所述小鼠通过使权利要求28的两只小鼠交配而产生。
33.权利要求32的敲除小鼠，其中所述破坏改变了TRP基因启动子、增强子或剪接位点，使得所述小鼠不表达功能型TRP。
34.权利要求32的敲除小鼠，其中所述破坏是插入突变、错义突变、移码突变或缺失突变。
35.权利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括相对于野生型成年小鼠而言体重降低。
36.权利要求35的敲除小鼠，其中所述表型还包括相对于野生型成年小鼠而言体重降低至少约15％。
37.权利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括相对于野生型成年小鼠而言身长降低。
38.权利要求37的敲除小鼠，其中所述表型还包括相对于野生型成年小鼠而言身长降低至少约10％。
39.权利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括相对于野生型成年小鼠而言体重与身长之比降低。
40.权利要求39的敲除小鼠，其中所述表型还包括相对于正常的野生型成年小鼠而言体重与身长之比降低至少约20％。
41.权利要求32的敲除小鼠，其中相对于野生型成年小鼠而言，所述成年小鼠的表型包括：
(a)体重降低；
(b)身长降低；和
(c)体重与身长之比降低。
42.权利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括与软骨病相关的症状。
43.权利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括与骨病相关的症状。
44.权利要求32的敲除小鼠，其中所述成年小鼠的表型包括与肾病相关的症状。
45.权利要求41的敲除小鼠，其中所述表型在出生时不明显。
46.一种细胞或细胞系，所述细胞或细胞系来源于权利要求28或权利要求32的含有所述破坏的小鼠。
47.一种鉴定能够影响敲除小鼠表型的因子的方法，所述方法包括：
(a)将推定的因子给予权利要求32的敲除小鼠；
(b)测定所述敲除小鼠对所述推定因子的反应；和
(c)将所述反应与野生型小鼠的反应比较；
(d)从而鉴定出能够影响敲除小鼠表型的因子。
48.一种因子，所述因子是按照权利要求47的方法鉴定的。
49.一种确定编码TRP的基因中所述三核苷酸重复的扩增是否引起表型改变的方法，所述方法包括：
(a)提供权利要求10的敲除细胞和一种包含侧翼为重组酶靶位点的三核苷酸重复的合成核酸；
(b)使所述敲除干细胞与所述合成核酸在识别所述重组酶靶位点的重组酶存在下进行接触，使得在所述合成核酸之间发生重组，从而产生转基因细胞；和
(c)比较所述转基因细胞与野生型细胞的表型；从而确定三核苷酸扩增是否引起表型改变。
50.权利要求49的方法，其中所述三核苷酸重复包括CTG。
51.权利要求49的方法，其中所述方法包括应用Cre重组酶-lox靶系统。
52.权利要求49的方法，其中所述方法包括应用FLP重组酶-FRT靶系统。
53.一种敲除细胞或细胞系，所述细胞或细胞系在编码TRP的靶DNA序列中包含破坏。
54.权利要求53的敲除细胞或细胞系，其中所述细胞来源于权利要求32的小鼠。
55.组织，所述组织得自权利要求28或权利要求32的小鼠。
56.权利要求53的敲除细胞，其中所述TRP由T243或其天然存在的等位基因变异体编码。
57.一种鉴定能够影响敲除细胞系表型的因子的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求53的敲除细胞与推定的因子接触；
(b)测定所述细胞对所述推定因子的反应；和
(c)将所述反应与野生型细胞的反应比较；
(d)从而鉴定出能够影响敲除细胞表型的因子。
58.一种细胞系，所述细胞系包含一种与在所述细胞系中有功能的启动子有效连接的编码TRP的核酸序列。
59.权利要求58的细胞系，其中所述TRP由T243或其天然存在的等位基因变异体编码。
60.权利要求59的细胞系，其中所述TRP基本上由SEQ IDNO：52的氨基酸序列或其天然存在的等位基因变异体组成。
61.三核苷酸重复蛋白质，所述蛋白质由T243或其天然存在的等位基因变异体编码。
62.一种鼠类TRP，所述TRP基本上由SEQ ID NO：52的序列或其天然存在的等位基因变异体组成。
63.一种人类TRP，所述TRP基本上由SEQ ID NO：58的序列或其天然存在的等位基因变异体组成。
64.一种核酸序列，所述核酸序列编码权利要求62的鼠类TRP，具有SEQ ID NO：47或其天然存在的等位基因变异体的序列。
65.一种核酸序列，所述核酸序列编码权利要求63的人类TRP，具有SEQ ID NO：47或其天然存在的等位基因变异体的序列。
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