JP2003531573A - Ｔｒｐ遺伝子破壊を有するトランスジェニックマウス - Google Patents

Ｔｒｐ遺伝子破壊を有するトランスジェニックマウス

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Abstract

(57)【要約】 トランスジェニック動物、および遺伝子機能の特徴を決定することに関する方法および組成物に関し、より詳しくは、遺伝子Ｔ２４３のようなトリヌクレオチドリピートプロテイン（ＴＲＰ）をコードする遺伝子に関する。本発明は、ＴＲＰをコードするターゲットＤＮＡ配列における破壊を含む、細胞、好ましくは幹細胞、より好ましくは胚性幹（ＥＳ）細胞を提供する。前記破壊はターゲットＤＮＡ配列に相同な配列を得て、ターゲッティング構築物にその配列を挿入することによって作製される。ターゲッティング構築物は、次いで幹細胞に導入され、ターゲットＤＮＡ配列に破壊をもたらす相同的組み換えを生じる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願は、１９９９年１０月２６日付で出願された米国暫定出願第60/161488号
の利益を受けるものであって、その全内容を参照としてここに含める。 本発明は、トランスジェニック動物、組成物、および遺伝子機能の特徴決定に
関連する方法に関連する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの多様なトリヌクレオチドリピートが、ヒトゲノムに同定されている。こ
れらの変異は、遺伝性の不安定なＤＮＡによってもたらされ、世代から世代へと
遺伝するリピートユニットの総数の変化から、“ダイナミックミューテーション
(dynamic mutations)”と呼ばれている（Koshyら, Brain Pathol, 7:927-42 (19
97)）。これらのリピートは非常に多様であるが、正常患者では、その数は通常
４０リピートを超えない(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM (TM). J
hons Hopkins University, Baltimore, MD. MIM Number:603279:jlewis:7/14/19
99; World Wide Web URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim; Koshyら(1997))
。
【０００３】 対照的に、異常に拡張したトリヌクレオチドリピートが、疾患を引き起こすこ
とが見出された(OMIM 603279)。疾患を引き起こす拡張(expansion)は、通常、４
０以上のトリヌクレオチドリピートを含み、２００以上のリピートのトラクトが
報告されている(OMIM603279; Slegtenhorst-Eegdemanら, Endocrinology, 139:1
56-62 (1998))。４つのタイプのトリヌクレオチドリピート拡張が同定されてい
る：（１）二つの脆弱Ｘ症候群（FRAXAとFRAXE）の長鎖シトシン-グアニン-グア
ニン（ＣＧＧ）リピート、（２）筋緊張性ジストロフィーの長鎖シトシン-チミ
ン-グアニン（ＣＴＧ）リピート拡張、（３）フリートライヒ運動失調の長鎖グ
アニン-アデニン-アデニンリピート拡張、および（４）神経変性疾患に関連する
短鎖シトシン-アデニン-グアニンリピート拡張（ＣＡＧ）。(Koshyら(1997))。
【０００４】 タイプ１およびタイプ２疾患に分類される少なくとも１２の疾患が、トリヌク
レオチド発現変異によって引き起こされ、殆どが神経精神医学的特徴を有する（
Margolisら, Hum Genet.,100:114-122(1997)）。タイプ１疾患は、オープンリー
ディングフレームの（ＣＡＧ）n拡張により引き起こされ、拡張されたグルタミ
ンリピートをもたらす。タイプ１疾患は、脊髄小脳性運動失調タイプ１(SCA1, O
rrら, Nat Genet, 4:221-6(1993))；SCA2(ImbertらNat Genet, 14:285-91 (1996
);Pulstら,Nat Genet,14:269-76(1996); Sanpeiら,Nat Genet,14:277-84 (1994)
)；マチャド‐ジョセフ病(MJDまたはSCA3, kawaguchiら, Nat Genet, 8:221-8(1
994));SCA6(Zhuchenkoら, Nat Genet, 15:62-9(1997));dentatutorubral pallid
oluysioan萎縮症(DRPLA, Koideら, Nat Genet, 6:9-13(1994));ハンティングト
ン病(HD, Huntington's Disease Collaborative Research Group, Cell, 72:971
-83 (1993));および棘状および球状筋性萎縮症(SBMA, La Spada, Nature, 352:7
7-9(1991))を含む。タイプ２疾患は、５’未翻訳領域の拡張(Jacobsen's症候群,
Jonesら, Nature,376:145-9(1995); 脆弱Ｘ症候群, Fuら, Science,1992 255:1
256-8(1992))、３’未翻訳領域の拡張(筋緊張性ジストロフィー,Brookら,Cell,6
8:799-808(1992); Philipsら, Science, 280:737-41(1998))、およびイントロン
領域（Fredreich's運動失調, Campuzanoら, Science, 271:1423-7(1996))によっ
て引き起こされうる。しかしながら、この拡張のメカニズムおよびタイミングは
、殆ど解明されていない(Batesら, Hum Mol Genet.,6:1633-7(1997))。
【０００５】 トリヌクレオチドリピート拡張によって引き起こされる疾患は、通常のメンデ
ル遺伝学によって説明できない予期(anticipation)と呼ばれる現象を示す(Koshy
ら(1997))。予期は、連続する世代で発症の低年齢化を伴い、症状の深刻さも増
すものとして定義されている。予期は、しばしばそれを遺伝させる親の性に影響
され、殆どのＣＡＧリピート疾患では、疾患は、父方の遺伝の場合に、より深刻
である。疾患の深刻さと発症年齢は、リピートのサイズと相関している(Koshyら
(1997))。より長い拡張は、より早期の発症と、より深刻な臨床的症状の発現を
もたらす。予期の現象は、拡張されたリピートの不安定性が所定の疾患(OMIM 60
3279)の基盤となるという疑義を導いた。
【０００６】 拡張されたトリヌクレオチドリピートトラクトを有するタンパクは関連せず、
広く発現され、大規模な重複発現パターンを有する(Batesら(1997))。棘状およ
び球状筋性萎縮症および脊髄小脳性運動失調タイプ６において変異する、アンド
ロゲンレセプターとボルテージゲートアルファ１Ａカルシウムチャネルを除いて
は殆どが新規である。ＣＡＧリピートタンパクは、末梢および中枢神経組織の両
方で至る所に発現されるが、各神経疾患では、選ばれた神経細胞集団しか、拡張
されたリピートの結果としての変性の標的とされていないことは興味深い(Koshy
ら(1997))。
【０００７】 拡張が神経学的機能不全および細胞死を導くメカニズムは未知である（Bates
ら(1997)）。現在の考えは、リピートトラクトの存在が、関連遺伝子、メッセー
ジ、またはタンパクに機能獲得(gain-of-function)を付与するということである
。例えば、ＣＵＧ結合タンパクと筋緊張性ジストロフィー遺伝子（ＭＤ）転写物
の拡張されたＣＵＧリピート領域との不適切な相互作用は、異種核リボ核蛋白粒
子を通常含むタンパクを滴定すると考えられてきた（Bhagwatiら, Biochim Biop
hys Acta, 1317:155-7(1996); Philipsら(1998)）。新規のタンパク−タンパク
相互作用または異常なタンパクホールディングの形成、並びに隣接する遺伝子の
発現およびクロマチン構造の変化も、トリヌクレオチド発現が疾患を引き起こす
メカニズムとして示唆されている（Thorntonら, Nat. Genet.,16:407-9(1997)）
。
【０００８】 トリヌクレオチドリピート疾患のマウスモデルは、これらの疾患の分子的基礎
を明らかにし、かつ、治療的介入を開発するための大きな可能性を秘め、かつ約
束するものである。トランスジェニックマウスは、ヒトの疾患の多くの特徴を再
現し、かくして、in vivoで疾患の進行を研究するのに優れたモデル系である。
かかるマウスを用いて、病理学的メカニズムとマウスにおけるトリヌクレオチド
リピート不安定性の両方をモデルすることができる(Batesら(1997))。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明は、概して、トランスジェニック動物、および遺伝子機能の特徴を決定
することに関する方法および組成物に関し、より詳しくは、本発明は、遺伝子Ｔ
２４３のようなトリヌクレオチドリピートプロテイン（ＴＲＰ）をコードする遺
伝子に関する。
【００１０】 本発明は、ＴＲＰをコードするターゲットＤＮＡ配列における破壊を含む、細
胞、好ましくは幹細胞、より好ましくは胚性幹（ＥＳ）細胞を提供する。好まし
くは、ターゲットＤＮＡ配列はＴ２４３である。好ましい実施態様では、幹細胞
はマウスＥＳ細胞である。一部の実施態様によれば、前記破壊はターゲットＤＮ
Ａ配列に相同な配列を得て、ターゲッティング構築物にその配列を挿入すること
によって作製される。ターゲッティング構築物は、次いで幹細胞に導入され、タ
ーゲットＤＮＡ配列に破壊をもたらす相同的組み換えを生じる。
【００１１】 より好ましい実施態様では、ベクターに、相同配列の二つの異なるフラグメン
トを挿入するために、ライゲーション独立クローニング(ligation-independent
cloning)を用いてターゲッティング構築物を作製し、前記ベクターは、構築物の
二つの異なる相同配列フラグメントの間に位置づけられるように、第二のポリヌ
クレオチド配列、好ましくはポジティブ選択マーカーをコードする遺伝子を有す
る。この実施態様の一つの態様では、相同配列を以下のようにして得ることがで
きる：すなわち、ターゲットに相補的な二つのプライマーを作製する；ターゲッ
ト領域を含むマウスゲノムＤＮＡライブラリーの相補配列に前記プライマーをア
ニーリングする；かつ、ターゲット領域に相同な配列を増幅する。次いで、プラ
イマーにより形成された終点を有する増幅反応の産物を単離する。好ましくは、
増幅はＰＣＲによる。より好ましくは、増幅は、ロングレンジＰＣＲによる。別
の態様では、ベクターは、スクリーニングマーカーをコードする遺伝子も含む。
さらに別の態様では、ベクターはポジティブ選択マーカーに隣接するリコンビナ
ーゼ部位を含む。
【００１２】 さらに本発明は、ＴＲＰをコードする遺伝子に破壊を有する脊椎動物、好まし
くはマウスを提供する。一部の実施態様では、本発明は、機能的ＴＲＰを自然に
コードおよび発現する遺伝子の非機能的アレルを有するノックアウトマウスを提
供する。機能的ＴＲＰを自然にコードおよび発現する遺伝子の二つの非機能的ア
レルを有し、それゆえ野生型ＴＲＰを産生することができないノックアウトマウ
スが、本発明に含まれる。好ましくは、マウスは、胚盤胞に、ＴＲＰをコードす
る破壊された遺伝子を有する幹細胞、ここに記載されたもの、あるいは当該技術
分野で入手可能なものを、注射または他の導入により産生される。得られた胚盤
胞を偽妊娠マウスに移し、このマウスが、後に、その生殖細胞系にＴＲＰをコー
ドする破壊された遺伝子を含むキメラマウスを産む。当業者であれば、ＴＲＰを
コードする遺伝子にヘテロ接合およびホモ接合の破壊を有するマウスを生じるよ
うにキメラマウスを繁殖させることができることを理解できるであろう。
【００１３】 一部の実施態様では、マウスが機能的ＴＲＰタンパクを発現しないように、前
記破壊が、少なくとも一つのＴＲＰ遺伝子プロモーター、エンハンサー、または
スプライシング部位の少なくとも一つを変更する。別の実施態様では、破壊は、
挿入、ミスセンス、フレームシフト、または欠失変異である。次いで、かかるノ
ックアウトマウスの表現型を、観察することができる。
【００１４】 本発明の一部の態様は、平均の正常な野生型の成体マウスと比較して体重減少
を含む表現型を有するノックアウトマウスである。通常、ノックアウトマウスの
体重は、少なくとも約１５％減少する。別の態様は、平均の正常な野生型の成体
マウスと比較して体長減少を含む表現型を有するノックアウトマウスである。一
般に、体長は、少なくとも約１０％減少する。本発明のさらに別の態様は、正常
な野生型の成体マウスと比較して体長に対する体重の比率の減少を含む表現型を
有するノックアウトマウスである。一般的に、少なくとも約２０％の比率の減少
が観察される。
【００１５】 本発明の別の態様では、ノックアウトマウスは、軟骨の疾患を含む表現型を有
する。通常、異常な軟骨が現れ、軟骨形成が低減する。
【００１６】 本発明の別の態様は、骨の疾患を含む表現型を有するマウスである。通常、骨
の疾患は、異常な骨と、骨形成の減少を含む。一部の態様では、ノックアウトマ
ウスの表現型は、軟骨形成不全症によって特徴付けされる。
【００１７】 本発明のさらに別の態様では、ノックアウトマウスの表現型は、腎疾患を含む
。通常、腎奇形が観察される。一部の実施態様では、ノックアウトマウスの表現
型は腎形成異常症を含む。
【００１８】 本発明はまた、ノックアウトマウスの表現型に影響しうる薬剤の同定方法を提
供する。この方法では、推定される薬剤をノックアウトマウスに投与する。次い
で、推定される薬剤に対するノックアウトマウスの反応を測定し、“正常”また
は野生型マウスの反応と比較する。本発明は、さらに、かかる方法に従って同定
された薬剤をも提供する。
【００１９】 本発明のさらなる実施態様では、ＴＲＰをコードするターゲットＤＮＡ配列が
破壊されているノックアウト細胞が提供される。一部の実施態様では、破壊は野
生型ＴＲＰの産生を阻害する。細胞または細胞系統は、ノックアウト幹細胞、組
織、または動物から誘導できる。さらなる実施態様では、細胞は安定な細胞培養
物である。
【００２０】 また本発明は、ＴＲＰをコードする核酸配列を含む細胞系統を提供する。かか
る細胞系統は、細胞系統において機能的なプロモーターに機能的に結合したこと
によりかかる配列を発現することができる。好ましくは、ＴＲＰをコードする配
列の発現は、誘導可能なプロモーターの制御下におかれる。
【００２１】 本発明は、さらに、新規の、以前に特徴決定されていないＴＲＰをコードする
核酸配列を提供する。また、ＴＲＰと薬剤とを接触させる工程、および、薬剤／
ＴＲＰ複合体を検出する工程を含む、ＴＲＰと相互作用する薬剤を同定する方法
も提供する。
【００２２】 また本発明は、ノックアウトマウスの表現型に影響を与えることができる薬剤
を、適当な患者に投与することにより骨の疾患を治療する方法も提供する。適当
な患者は、限定するわけではないが、ヒトを含む哺乳動物を含む。一部の実施態
様では、骨の疾患は軟骨形成不全症である。また本発明は、短縮した骨、異常成
長板、および退化椎骨のような骨疾患の兆候を緩和する方法も提供する。投与さ
れる薬剤の中では、Ｔ２４３タンパク、そのフラグメント、およびＴ２４３の天
然および合成アナログがある。
【００２３】 ノックアウトマウスの表現型に影響を与えうる薬剤を患者に投与することによ
り軟骨の疾患を治療する方法も提供する。一部の実施態様では、軟骨の疾患は軟
骨形成不全症である。巨大な不規則形軟骨島、短い軟骨細胞カラム、および薄い
不規則形軟骨を含む軟骨疾患の症状を緩和する方法も提供される。
【００２４】 腎疾患を治療する方法も本発明の範囲内に含まれる。この方法によれば、Ｔ２
４３タンパク、Ｔ２４３タンパクフラグメント、またはＴ２４３の天然または合
成アナログのような薬剤の有効量を患者に投与する。一部の実施態様では、腎疾
患は、腎形成異常症である。また本発明は、小さい異常形成腎のような腎疾患に
関連する症状を緩和する方法を含む。
【００２５】 また本発明は、ＴＲＰのトリヌクレオチドリピートの拡張が表現型の変化を生
じるか否かを調べる方法を提供する。この方法では、リコンビナーゼ部位が隣接
したポジティブ選択マーカーを有するノックアウト幹細胞が、合成核酸と接触さ
れる。この合成核酸は、リコンビナーゼターゲット部位に隣接したトリヌクレオ
チドリピートを含む。リコンビナーゼターゲット部位を認識するリコンビナーゼ
の存在下で、酵素補助部位特異的組み込みにより、合成核酸中のリコンビナーゼ
部位とポジティブ選択マーカーに隣接するそれとの間にリコンビネーションが生
じ、これによってトランスジェニック幹細胞を生じる。得られたトランスジェニ
ック幹細胞の表現型を、正常な野生型幹細胞と比較して、トリヌクレオチド拡張
が表現型の変化を生じたか否かを調べる。好ましくは、合成核酸は、少なくとも
約２０トリヌクレオチドリピートを含む。酵素補助部位特異的組み込みは、例え
ば、Creリコンビナーゼ-loxターゲット系、またはＦＬＰリコンビナーゼ-ＦＲＴ
ターゲット系とすることができる。
【００２６】 また本発明は、ＴＲＰをコードする遺伝子のトリヌクレオチド拡張を有する脊
椎動物、好ましくはマウスを提供する。好ましい実施態様では、マウスは、胚盤
胞に拡張されたＴＲＰ遺伝子を含むトランスジェニック幹細胞を導入することに
よって産生される。得られた胚盤胞を、偽妊娠マウスに移植し、これは後に生殖
細胞系に拡張されたトリヌクレオチドリピート遺伝子を有するキメラマウスを産
む。このキメラマウスを、ＴＲＰをコードする遺伝子にヘテロ接合またはホモ接
合の破壊を有するマウスを生じるように繁殖させることができる。
【００２７】 本発明は、さらに、新規の拡張されたＴＲＰ遺伝子とこれらの遺伝子によりコ
ードされるタンパクを提供する。また、拡張されたＴＲＰを薬剤と接触させる工
程、および薬剤／拡張されたＴＲＰ複合体を検出する工程を含み、それによって
拡張されたＴＲＰと相互作用する薬剤を同定する、拡張されたＴＲＰと相互作用
する薬剤を同定する方法も提供する。
【００２８】 また、本発明は、拡張されたＴＲＰをコードする核酸配列を含む細胞系統を提
供し、これらは細胞系統のプロモーター機能に対する機能的な結合を介して、か
かる配列を発現することができる。好ましくは、拡張されたＴＲＰをコードする
配列の発現は、誘導可能なプロモーターの制御下である。
【００２９】 ここで用いられるように、“遺伝子ターゲッティング”とは、相同的組み換え
の一種であり、ゲノムＤＮＡのフラグメントが哺乳動物細胞に導入され、かつ、
そのフラグメントが内因的相同配列に位置付けられ組み換わる際に起こる。
【００３０】 ターゲット遺伝子の“破壊(disruption)”とは、正常の野生型遺伝子産物が阻
害されるように、ゲノムＤＮＡのフラグメントが内因性相同配列に位置付けられ
組み換わる際に起こる。破壊の非限定的な例は、挿入、ミスセンス、フレームシ
フト、および欠失変異を含む。また、遺伝子ターゲッティングは、ターゲット遺
伝子のプロモーター、エンハンサー、またはスプライス部位に破壊を引き起こす
ように変更し、そして、プロモーターを、以下に記載する誘導性プロモーターの
ような外因性プロモーターで置換することにも関与しうる。
【００３１】 ここに記載するように、“ノックアウトマウス”とは、遺伝子ターゲッティン
グの方法によって破壊または不活性化された特異的遺伝子をゲノムに含むマウス
である。ノックアウトマウスは、ヘテロ接合マウス（すなわち、一方が破壊アレ
ルで、他方が野生型アレル）とホモ接合変異体（すなわち、二つの破壊アレル）
の両方を含む。また本発明の範囲には、ヘミ接合マウスも含まれる。オスの伴性
遺伝子のような一部の遺伝子は、正常な野生型動物に１コピーだけ存在すること
が知られている（すなわち、正常な野生型動物においてヘミ接合である）。通常
ヘミ接合である遺伝子が破壊されているノックアウトマウスは、その遺伝子の一
つの欠陥アレルを有する。
【００３２】 用語“ポリヌクレオチド”および“核酸分子”とは、あらゆる長さのヌクレオ
チドのポリマー形態を指すために交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、
デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはこれらのアナログ
を含んでもよい。ヌクレオチドは、あらゆる三次元構造をとることができ、公知
または未知のあらゆる機能を有しうる。用語“ポリヌクレオチド”は、一本鎖、
二本鎖、および三重螺旋分子を含む。
【００３３】 “オリゴヌクレオチド”とは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの５から約１００ヌ
クレオチドの間のポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、オリゴマー
またはオリゴとしても知られており、遺伝子から単離、もしくは当該技術分野で
公知の方法によって化学的に合成されうる。“プライマー”とは、通常は一本鎖
のオリゴヌクレオチドを指し、酵素介在核酸合成の開始のために３'-ヒドロキシ
ル末端を備えている。
【００３４】 以下はポリヌクレオチドの非限定な態様である：遺伝子または遺伝子フラグメ
ント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃ
ＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベ
クター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、
核酸プローブ、およびプライマー。核酸分子は、メチル化核酸分子および核酸分
子アナログのような修飾された核酸分子を含んでもよい。プリンおよびピリミジ
ンのアナログは当該技術分野において公知であり、アジリジニシトシン、４-ア
セチルシトシン、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-カルボキシメ
チルアミノメチル-２-チオウラシル、５-カルボキシメチル-アミノメチルウラシ
ル、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルアデニン、１-メチル
シュードウラシル、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２,２-ジメチルグ
アニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチ
ルシトシン、シュードウラシル、５-ペンチルニルウラシル、および２,６-ジア
ミノプリンを含むが、これらに限定されるものではない。デオキシリボ核酸のチ
ミンに代えてウラシルを使用することも、ピリミジンの類似形態と考えられる。
【００３５】 ポリヌクレオチドの“フラグメント”は、少なくとも９の連続するヌクレオチ
ド、１０、１１、１２、１３または１４の連続するヌクレオチドを含み、好まし
くは少なくとも１５の連続するヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも４５
ヌクレオチド、さらには少なくとも６０ヌクレオチドを含む、コードまたは非コ
ード配列のポリヌクレオチドである。
【００３６】 ここで用いるように、“塩基対（ベースペア）”または“ｂｐ”は、相補的な
核酸分子を指す。ＤＮＡでは、これらは四つの“タイプ”の塩基が存在し、プリ
ン塩基アデニン（Ａ）はピリミジン塩基チミン（Ｔ）と水素結合し、プリン塩基
グアニン（Ｇ）はピリミジン塩基シトシン（Ｃ）と水素結合する。各水素結合塩
基対のセットは、ワトソンクリック塩基対としても知られる。１０００塩基対は
しばしばキロベースペア、またはｋｂと呼ばれる。“塩基対ミスマッチ”は、塩
基が相補的ワトソン−クリック対でない核酸分子の位置を指す。表現“いずれの
位置にも少なくとも１のタイプの塩基を含まない”とは、いずれの位置にも４つ
の塩基の内の１つを含まないヌクレオチド配列を指す。例えば、１ヌクレオチド
を欠く（すなわち、１つのタイプの塩基を欠く）配列は、Ａ、Ｇ、Ｔ塩基対から
なり、Ｃ残基を含まない。
【００３７】 ここで用いるように、用語“構築物”は、ターゲット組織、細胞系統またはヒ
トを含む動物に導入される人工的に組み立てられたＤＮＡセグメントを指す。通
常、構築物は、遺伝子または特に興味のある配列、マーカー遺伝子、および適切
な制御配列を含む。用語“プラスミド”は、自律性の自己複製する染色体外ＤＮ
Ａ分子を指す。好ましい実施態様では、本発明のプラスミド構築物は、興味ある
遺伝子の二つのフランキング（隣接）領域間に位置するポジティブ選択マーカー
を含む。任意に、この構築物はスクリーニングマーカー、例えば、緑色蛍光タン
パク（ＧＦＰ）を含む。存在するのであれば、スクリーニングマーカーは、前記
フランキング領域の外側であり、かつ、前記領域からある程度離れて位置する。
【００３８】 用語“ポリメラーゼ連鎖反応”または“ＰＣＲ”は、Ｔａｑポリメラーゼのよ
うな熱安定ポリメラーゼ、および二つのオリゴヌクレオチドプライマー（一方は
増幅される配列の一端の（＋）鎖に相補的であり、かつ他方は他端の（−）鎖に
相補的である）を用いるＤＮＡ塩基配列を増幅する方法を指す。新たに合成され
たＤＮＡ鎖は、次いで、同一のプライマー鎖のさらなる鋳型として作用すること
ができるので、プライマーアニーリング、鎖延長、および分離の連続的な繰り返
しが、所望の配列の指数関数的かつ高度に特異的な増幅を生じる。ＰＣＲは、Ｄ
ＮＡサンプルにおける解明された配列の存在を検出するために用いることもでき
る。“ロングレンジ”とは、例えば１ｋｂよりも大きな、長鎖のヌクレオチドを
増幅することを可能にするＰＣＲ条件を指す。
【００３９】 ここで用いるように、用語“ポジティブ選択マーカー”は、その遺伝子を有す
る細胞のみをある条件下で生存および／または増殖可能にする産物をコードする
遺伝子を指す。例えば、導入されたネオマイシン耐性（Ｎｅｏr）遺伝子を発現
する植物および動物細胞は、化合物Ｇ４１８に対して耐性である。Ｎｅｏr遺伝
子マーカーを有していない細胞は、Ｇ４１８で死滅してしまう。他の可能な選択
マーカーは、当業者に公知であろう。
【００４０】 “ポジティブ−ネガティブ選択”は、特異的ターゲット化部位に組み込まれた
ＤＮＡ挿入物を有する細胞を選択する方法（ポジティブ選択）、および、非ター
ゲット化染色体部位に組み込まれたＤＮＡ挿入物を有する細胞に対する選択方法
（ネガティブ選択）を指す。ネガティブ選択挿入物の非限定的な例は、チミジン
キナーゼ（tk）をコードする遺伝子を含む。ポジティブ−ネガティブ選択に適し
た遺伝子は、当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第５４６４７６４号を
参照のこと。
【００４１】 “スクリーニングマーカー”または“レポーター遺伝子”は、容易にアッセイ
できる産物をコードする遺伝子を指す。例えば、レポーター遺伝子は、特定のＤ
ＮＡ構築物が細胞、器官または組織に首尾よく導入されたかどうかを調べるため
に用いることができる。スクリーニングマーカーの非限定的な例は、緑色蛍光タ
ンパク（ＧＦＰ）をコードする遺伝子または修飾された蛍光タンパクをコードす
る遺伝子を含む。“ネガティブスクリーニングマーカー”は、ネガティブ選択マ
ーカーとして解釈されない；ネガティブ選択マーカーは、通常、それを発現する
細胞を殺してしまう。
【００４２】 用語“ベクター”は、挿入されたＤＮＡを有し、かつ、宿主細胞に永続される
ＤＮＡ分子を指す。ベクターは、クローニングベクター、クローニングビークル
、またはビークルとしても知られる。この用語は、主として細胞への核酸分子の
挿入に機能するベクター、主として核酸の複製に機能する複製ベクター、および
ＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳に機能する発現ベクターを含む。
一以上の上記機能を提供するベクターも含まれる。好ましい実施態様では、ベク
ターはここに記載する方法で有益な部位を有し、例えば、ここに記載するベクタ
ー“ｐＤＧ２”または“ｐＤＧ４”とされる。
【００４３】 “宿主細胞”は、ベクターまたは、核酸分子および／またはタンパクの挿入の
受容体である、または受容体であった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主
細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、自然の、偶然の、または意図
的な変異により、元の親と完全に同一（形態学または全ＤＮＡにおいて）である
必要はない。宿主細胞は、本発明の構築物をトランスフェクトされた細胞を含む
。
【００４４】 用語“ゲノムライブラリー”は、ある生物のゲノムを示す１セットの不規則に
生成された重複ＤＮＡフラグメントからなるクローンの集合を指す。“ｃＤＮＡ
ライブラリー”（相補的ＤＮＡライブラリー）は、逆転写酵素でｃＤＮＡ分子に
変換され、ベクター（外来ＤＮＡの付加後に、複製し続けることができる他のＤ
ＮＡ分子）に挿入された、細胞、組織、または器官に存在するｍＲＮＡ分子の集
合である。ライブラリー用の典型的なベクターは、細菌に感染するウイルスであ
る、バクテリオファージ（“ファージ”としても知られる）、例えばラムダファ
ージを含む。このライブラリーを、興味のある特異的ｃＤＮＡ（および、かくし
てｍＲＮＡ）についてプローブすることができる。一部の実施態様では、ファー
ジベクター系の効率の高さとプラスミド系の利便性とを組み合わせたライブラリ
ー系（例えば、Stratagene, La Jolla, CAのＺＡＰ系）を、本発明の実施に使用
できる。
【００４５】 用語“相同的組み換え”は、相同ヌクレオチド配列の部位における、二つのＤ
ＮＡ分子または染色分体間のＤＮＡフラグメントの交換を指す。すなわち、これ
らの配列は、好ましくは少なくとも約７０パーセントの配列同一性を有し、通常
は少なくとも約８５パーセントの同一性、好ましくは少なくとも約９０パーセン
トの同一性、あるいは少なくとも約９５−９８パーセントの同一性を有する。ホ
モロジーおよび／または同一性のパーセントは、“BLASTN”アルゴリズム、例え
ばオンラインでhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/, (Basic, Advanced or
PSI)から入手可能なBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)2.0を用いて調
べることができ、これらについてはAltschul,S.F., Gish,W., Miller,W., Myers
,E.W. & Lipman,D.J.(1990) "Basic local alignment search tool." J.Mol.Bio
l.215:403-410.(Medline); Gish,W. & States,D.J.(1993)"Identification of p
rotein coding regions by database similarity search." Nature Genet.3:266
-272.(Medline); Madden,T.L., Tatusov,R.L. & Zhang,J.(1996)"Applications
of network BLAST server" Meth.Enzymol.266:131-141.(Medline); Altschul,S.
F.,Madden,T.L., Schaffer,A.A., Zhang,J., Zhang,Z., Miller,W. & Lipman,D.
J.(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein databas
e search programs."Nucleic Acids Res.25:3389-3402. (Medline); およびZhan
g,J. & Madden, T.L.(1997) "PowerBLAST: A new network BLAST application f
or interactive or automated sequence analysis and annotation." Genome Re
s.7:649-656.(Medline)に記載されている。相同配列は、ヌクレオチド配列の挿
入、置換、および欠失を促進すると理解されている。かくして、ヌクレオチドの
直鎖状配列は、一部のヌクレオチド残基が正確に一致または整列しなくても、本
質的に同じである。
【００４６】 ここで用いるように、“ライゲーション独立クローニング（ligation-indepen
dent cloning）”は、キナーゼまたはリガーゼを使用せずにベクターまたは染色
体にＤＮＡ分子を取り込むことを指す通常の意味で用いられる。ライゲーション
独立クローニング技術は、例えば、Aslanidis & de Jong, Nucleic Acids Res.,
18:6069-74および米国特許第07/847298号（１９９１）に記載されている。
【００４７】 ここで用いるように、用語“ターゲット配列”（あるいは、“ターゲット遺伝
子配列”または“ターゲットＤＮＡ配列”を指す）は、あらゆる疾患または認識
できる表現型に関係しない一般的な集団の配列を有するあらゆるポリヌクレオチ
ドを有する核酸分子を指す。一般的な集団において、野生型遺伝子は、互いと比
較して配列に変化を有し、かつ、認識できる病理学的影響を引き起こさない多数
の優勢なバージョンを含むことに注意すべきである。これらのバリエーションは
、“多型”または“アレルバリエーション”と呼ばれる。
【００４８】 好ましい実施態様では、ターゲットＤＮＡ配列は、患者のゲノムＤＮＡの遺伝
子座または特定の遺伝子の一部を含む。好ましくは、ターゲットＤＮＡ配列は、
好ましくはロイシンをコードするＣＴＧトリヌクレオチドリピートを有するＴＲ
Ｐをコードする。一部の実施態様によれば、ターゲットＤＮＡは、遺伝子産物の
機能が未知である、例えばＥＳＴのような部分ｃＤＮＡ配列を用いて同定された
遺伝子のような、遺伝子座または特定の遺伝子の一部を含む。好ましい実施態様
では、ターゲットＴＲＰ遺伝子がＴ２４３である。好ましくは、ターゲットＤＮ
Ａ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７（マウス）またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（
ヒト）、あるいは、これらの自然に存在するアレル変異体を含む。
【００４９】 用語“エキソヌクレアーゼ”は、直鎖状核酸基質の自由端から連続してヌクレ
オチドを切断する酵素を指す。エキソヌクレアーゼは、二本鎖または一本鎖ヌク
レオチドに特異的であり、かつ／または例えば３'−５'および／または５'−３'
のように方向特異的である。一部のエキソヌクレアーゼは、他の酵素活性を示す
。例えばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼと活性３'−５'エキソヌク
レアーゼの両方である。他の例示的なエキソヌクレアーゼは、リン酸化された３
’末端を持たない二本鎖ＤＮＡの５’末端から一度に一つのヌクレオチドを除く
エキソヌクレアーゼIII、一本鎖ＤＮＡの両端のヌクレオチドを切断することに
よってオリゴヌクレオチドを作製するエキソヌクレアーゼVI、および、結合した
５’リン酸基を有する二本鎖ＤＮＡの５’末端からヌクレオチドを除くエキソヌ
クレアーゼラムダを含む。
【００５０】 用語“リコンビナーゼ”は、組み換えを誘導、媒介、または促進する酵素、お
よび、核酸配列の再配列、または第一の核酸配列を第二の核酸配列から切除、あ
るいは第一の核酸配列を第二の核酸配列に挿入することを引き起こす、媒介する
、あるいは促進する他の核酸修飾酵素を含む。リコンビナーゼの“ターゲット部
位”は、リコンビナーゼにより認識（例えば、特異的に結合）および／または作
用（切除、切断、または組み換え誘導）される核酸配列または領域である。ここ
で用いるように、表現“酵素による部位特異的組み換え”は、以下の三つの事象
、すなわち、 １．リコンビナーゼターゲット部位に隣接した予め選定されたＤＮＡセグメン
トの切断、 ２．リコンビナーゼターゲット部位に隣接した予め選定されたＤＮＡセグメン
トのヌクレオチド配列の逆位、 ３．異なるＤＮＡ分子に位置決定されたリコンビナーゼターゲット部位に近い
ＤＮＡセグメントの相互交換 を含む。
【００５１】
【発明の実施の形態】
本発明は一部として、主にトリヌクレオチドリピートタンパク質と関連する、
遺伝子および遺伝子発現産物の発現および役割の評価に基づく。他のものとして
、これは、診断的および治療的の両者で有用である疾患経路の同定、および前記
疾患経路における標的の同定を可能にする。例えば、疾患状態の下で突然変異さ
れるまたは下流調節される遺伝子は、前記疾患状態の発症または悪化に関与する
であろう。そのような遺伝子の活性の重量調節に向けた治療、または一方の経路
に関与する治療は、前記疾患状態を緩和するであろう。
【００５２】 ここで使用される「遺伝子」は、(a)ここで開示されるDNA配列の少なくとも一
つを含む遺伝子；(b)ここで開示されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配
列をコードするいずれかのDNA配列、および／または(c)ここで開示されるコード
配列の相補体にハイブリダイズするいずれかのDNA配列を指す。好ましくは前記
用語は、コード領域並びに非コード領域を含み、好ましくはプロモーター、エン
ハンサーおよび他の調節配列を含む正常な遺伝子発現に必要な全ての配列を含む
。
【００５３】 本発明はまた、前記段落における(a)から(c)のDNA配列にハイブリダイズし、
それ故前記DNA配列に相補的である核酸分子、好ましくはDNA分子をも含む。その
ようなin vitroのハイブリダイゼーション条件は、非常にストリンジェントでも
あまりストリンジェントでなくても良い。非常に厳格な条件は例えば、65℃で0.
5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTAにおけるフィルター結合
DNAに対するハイブリダイゼーション、および68℃で0.1× SSC/0.1% SDSにおけ
る洗浄を含み(Ausubel F. M.,等, 1989, Current Protocols in Molecular Biol
ogy, Vol. I. Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, I
nc., New York, p. 2.10.3; Sambrook, Fritsch, およびManiatis, Molecular C
loning; A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring, N.Y., 8.46-8.47頁 (1995)参照、この両者は参考
としてここに取り込まれる)、一方で、穏やかに厳格な条件のようなあまりスト
リンジェントではない条件は、例えば42℃で0.2× SSC/0.1% SDS中での洗浄を含
む(Ausubel等, 1989, 前記参照; Sambrook等, 1989, 前記参照)。
【００５４】 核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である場合、非常に厳
格な条件は例えば、37℃（14ベースのオリゴについて）、48℃（17ベースのオリ
ゴについて）、55℃（20ベースのオリゴについて）、および60℃（23ベースのオ
リゴについて）で、6× SSC/0.05%ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄を指して
も良い。これらの核酸分子は、例えば標的遺伝子調節において有用な標的遺伝子
アンチセンス分子として、および／または標的核酸配列の増幅反応におけるアン
チセンスプライマーとして、in vivoで機能しても良い。さらにそのような配列
は、標的遺伝子調節について有用でもある、リボザイムおよび／または三本鎖配
列の一部として使用されても良い。またさらにそのような分子は、診断方法の構
成成分として使用され、疾患原因対立遺伝子の存在を検出しても良い。
【００５５】 本発明はまた、(a)前述のコード配列および／またはそのそれらの相補体（即
ちアンチセンス）のいずれかを含むDNAベクター；(b)前記コード配列の発現に向
けた調節エレメントと機能的に結合した前述のコード配列のいずれかを含むDNA
発現ベクター；および(c)宿主細胞における前記コード配列の発現に向けた調節
エレメントと機能的に結合した前記コード配列のいずれかを含む遺伝学的に操作
された宿主細胞を包含する。ここで使用される調節エレメントは、誘導可能およ
び不可能なプロモーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を実施し調
節する当業者に知られている他のエレメントを制限することなく含む。本発明は
、ここで開示されるDNA配列のいずれかの断片を含む。
【００５６】 前述の遺伝子配列に加えて、例えば多種で存在しても良い前記配列のホモロー
グは、当該技術分野で周知の分子生物学的方法によって、過度の実験なくして同
定され容易に単離されても良い。さらに、そのような遺伝子産物の一つ以上のド
メインに高いホモロジーを有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝的
ローカスで遺伝子が存在しても良い。これらの遺伝子はまた、同様な方法を介し
て同定されても良い。
【００５７】 例えば、単離された特異的に発現される遺伝子配列またはそのタンパク質は、
ラベルされて、興味ある生物から得られたmRNAから構築されたcDNAライブラリー
をスクリーニングするために使用されても良い。ハイブリダイゼーション条件は
、cDNAがラベルされた配列が由来する生物のタイプとは異なる生物から由来する
場合に、より低い厳格性を有するであろう。別法として、ラベルされた断片が、
適度に厳格な条件を使用して、再び興味ある生物から由来するゲノムライブラリ
ーをスクリーニングするために使用されても良い。そのような低い厳格性の条件
は当業者に周知であり、ライブラリーとラベルされた配列が由来する特異的な生
物に依存して事前に変わるであろう。そのような条件に関するガイドラインにつ
いては、例えばSambrook等, 1989, Ausubel等, 1989を参照。
【００５８】 同定された遺伝子が、正常なまたは野生型遺伝子である場合、この遺伝子は、
前記遺伝子のミュータント対立遺伝子を単離するために使用されても良い。その
ような単離は、遺伝学的基礎を有することが周知なまたはその疑いのあるプロセ
スまたは疾患において好ましい。ミュータント対立遺伝子は、疾患症状に寄与す
る遺伝子型を有することが周知なまたはその疑いのある患者から単離されても良
い。次いで、ミュータント対立遺伝子およびミュータント対立遺伝子産物は、治
療上および診断上のアッセイシステムにおいて利用されても良い。
【００５９】 ミュータント遺伝子のcDNAは、例えば当業者に周知の方法であるPCRを使用す
ることによって単離されても良い。この場合、第一のcDNA鎖は、ミュータント対
立遺伝子を有すると推定される患者における組織から単離され、前記患者におい
て発現されることが周知なまたはその疑いのあるmRNAに対してオリゴdTオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイズし、逆転写酵素で新たな鎖を伸長させることによっ
て合成されても良い。次いで、cDNAの第二の鎖は、正常な遺伝子の5'末端に特異
的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して合成される。これらの二
つのプライマーを使用して、次いで前記産物がPCRにより増幅され、適切なベク
ター中にクローン化され、当業者に周知の方法を通じてDNA配列分析にかけられ
る。ミュータント遺伝子のDNA配列を正常な遺伝子のものと比較することによっ
て、ミュータント遺伝子産物の機能の欠損または改変に関与するミューテーショ
ンが確認できる。
【００６０】 別法として、ミュータント対立遺伝子を有する疑いのあるまたは有することが
周知の患者において、興味ある遺伝子を発現することが周知なまたは疑いのある
組織から、ゲノムまたはcDNAライブラリーを構築し、DNAまたはRNAのそれぞれを
使用してスクリーニングすることができる。次いで、正常な遺伝子またはいずれ
かの適切なその断片がラベルされ、ライブラリーにおける対応するミュータント
対立遺伝子を同定するためのプローブとして使用されても良い。次いで、この遺
伝子を含むクローンは、当該技術分野で通常実施されている方法を通じて精製さ
れ、配列分析にかけられても良い。
【００６１】 当該技術分野で知られているいずれかの方法が、トランスジェニック動物の第
一系列を生産するために、動物中に標的遺伝子トランスジーンを導入するように
使用されても良い。上記の方法は、プロヌクレア(pronuclear)マイクロインジェ
クション（米国特許第4,873,191号）；生殖系列へのレトロウイルス介在遺伝子
トランスファー(Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 6148-6
152 (1985))；胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティング(Thompson等, Cell,
56: 313-321 (1989))；胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol Cell Biol., 3: 1
803-1814 (1983))；および精子介在遺伝子トランスファー(Lavitrano等, Cell,
57: 717-723 (1989))等を制限することなく含む。そのような方法のレビューと
して、Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol., 115: 171-229 (1989)
を参照。この文献は参考としてここに完全に取り込まれる。
【００６２】 好ましい実施態様では、相同的組換えが、本発明のノックアウトマウスを生産
するために使用される。好ましくは前記構築物は、(1)標的配列に対して相同的
な配列を増幅する工程（例えば広範囲PCRを使用して）、および(2)PCR産物内に
相同的配列に隣接するように別のポリヌクレオチド（例えば選択マーカー）を挿
入する工程によって、二工程で生産される。典型的に前記ベクターは、プラスミ
ドゲノムライブラリーから得られるプラスミドである。完成した構築物はまた典
型的に、環状プラスミドである。かくして図１に示されるように、「外部的ポイ
ンティング(outwardly pointing)」での広範囲PCRを使用して、オリゴヌクレオ
チドは、好ましくはライゲーション非依存的クローニングにより、選択マーカー
が容易に挿入できるベクターを引き起こす。次いで前記構築物は、相同的標的配
列の機能が破壊できるES細胞内に取り込まれることができる。
【００６３】 相同的組換えはまた、幹細胞、および全能性の胚性幹細胞ではない細胞タイプ
内において遺伝子をノックアウトするためにも使用されて良い。例として幹細胞
は、ミエロイド、リンパ球、または神経始源細胞、および前駆細胞であっても良
い。そのようなノックアウト細胞は、個々の発生経路における標的遺伝子機能の
研究において特に有用であろう。幹細胞は、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ
、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類等のようないかなる脊椎動物種から由来しても良
い。
【００６４】 全能性ではない細胞では、当該技術分野で知られている方法を使用して、両コ
ピーの標的をノックアウトすることが望ましいであろう。例えば、ポジティブ選
択マーカー（例えばNeor）の発現について選択され、非ランダムな挿入について
スクリーニングされている標的ローカスでの相同的組換えを含む細胞は、選択試
薬（例えばG418）の上昇したレベルにさらすことによって選択マーカー遺伝子の
複数のコピーについてさらに選択できる。前記細胞を次いで、標的ローカスでの
同型接合性について分析する。別法として、二つの相同的配列の間で挿入された
異なるポジティブ選択マーカーで、第二の構築物を生産できる。前記二つの構築
物は、連続的または同時的のいずれかの前記細胞内に取り込ませることができ、
引き続きポジティブマーカー遺伝子のそれぞれについて適切に選択できる。最終
の細胞は、標的の両対立遺伝子の相同的組換えについてスクリーニングされる。
【００６５】 別の特徴点では、興味あるクローンの二つの別個の断片を増幅し、ライゲーシ
ョン非依存的なクローニング方法を使用してポジティブ選択マーカーを含むベク
ター内に挿入できる。この実施態様では、興味あるクローンは一般的に、ファー
ジライブラリーから由来し、PCR法を使用して同定され単離される。ライゲーシ
ョン非依存的なクローニングは、二工程または単一の工程で実施できる。
【００６６】 好ましい方法に従って、5'-3'一本鎖領域を作製できる複数の部位を有する構
築物が使用される。これらの構築物、好ましくはプラスミドは、配向的な４方向
ライゲーション非依存的クローニングが可能なベクターを含む。
【００６７】 前記構築物は典型的に、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子のようなポジテ
ィブ選択マーカーをコードする遺伝子；ポジティブ選択マーカーのいずれかの側
での制限酵素部位、および４の塩基対の一つを含まない、制限酵素部位に隣接す
る配列を含む。この整列は、適切な制限酵素で前記構築物を切断し、例えばT4 D
NAポリメラーゼといったエキソヌクレアーゼ活性を有する化合物で前記断片を処
理することによって、配列中に一本鎖末端を作成可能である。
【００６８】 一つの好ましい実施態様では、ES細胞内への標的ミューテーションの取り込み
に適した構築物は、プラスミドゲノムライブラリーから直接的に調製される。特
異的プライマーでの広範囲PCRを使用して、興味ある配列は、単一の工程でプラ
スミドライブリラーから同定され単離される。この配列の単離に引き続き、標的
配列を破壊する第二のポリヌクレオチドが、興味ある配列をコードする二つの領
域の間で容易に挿入できる。この直接的方法を使用して、標的構築物を、７２時
間程度で作製できる。別の実施態様では、標的構築物を、以下に詳細に記載され
るファージゲノムライブラリーにおける興味あるクローンの同定の後に調製する
。
【００６９】 ここに記載される方法は、ハイブリダイゼーション単離、制限マッピング、お
よび複数のクローニング工程に対する必要性を回避する。さらに、いずれかの遺
伝子の機能が、これらの方法を使用して決定できる。例えば、短い配列（例えば
EST）を、オリゴヌクレオチドプローブをデザインするために使用できる。これ
らのプローブは、構築物を作製するための直接的増幅法において使用でき、ある
いはより長い全長遺伝子のためのゲノムまたはcDNAライブラリーのスクリーニン
グのために使用できる。かくして、いずれかの遺伝子が、ES細胞における使用の
ために迅速に且つ有効に調製できることが企図される。
【００７０】 好ましい実施態様では、構築物がプラスミドゲノムライブラリーから直接的に
調製される。前記ライブラリーは、当該技術分野で知られているいずれかの方法
によって生産できる。好ましくは、マウスES細胞から得たDNAを単離し、前記DNA
を断片に切断する制限エンドヌクレアーゼで処理する。次いで前記DNA断片を、
例えばバクテリオファージまたはファージミド（例えば、Lamda ZAP(登録商標),
Stratagene, La Jolla, CA）システムといったベクター内に挿入する。前記ラ
イブラリーが、ZAP(登録商標)システムで作製される場合、前記DNA断片は好まし
くは、約5から約20キロベースの間である。
【００７１】 好ましくは、ライブラリーが作製される生物は、認識可能な疾患または表現型
効果を有さないであろう。好ましくは前記ライブラリーはマウスライブラリーで
ある。このDNAは、いずれかの細胞ソースまたは体液から得られても良い。臨床
的実践において利用可能な細胞ソースの非制限的な例は、ES細胞、肝臓、腎臓、
血液細胞、頬の細胞、子宮頸部細胞、尿から得た上皮細胞、胎児細胞、または生
検によって得られた組織中に存在するいずれかの細胞を含む。体液は、尿、血液
脳脊髄液(CSF)、および感染または炎症の部位での組織滲出物を含む。細胞また
は体液からのDNAの抽出は、当該技術分野で周知のいずれかの方法を使用して実
施される。好ましくは前記DNAは、胚性幹細胞の凝集した100mmのプレートに、5m
lの溶解バッファー(10mM Tris-HCl pH7.5)、10mM EDTA(pH8.0)、10mM NaCl、0.5
% SDSおよび1mg/ml Proteinase Kを添加することによって抽出される。次いで細
胞を、数時間または十分に溶解するまで約60℃でインキュベートする。ゲノムDN
Aを、数回の穏やかなフェノール：クロロホルム抽出、引き続きエタノール沈降
によって溶解細胞から精製する。簡便のため、ゲノムライブラリーは、プールに
整列できる。
【００７２】 好ましい実施態様では、興味ある配列は、オリゴヌクレオチドプライマーと広
範囲PCRを使用して、プラスミドライブラリーから同定される。典型的に、前記
プライマーは、例えばcDNAまたはEST配列といった部分的遺伝子配列から得られ
た配列情報に基づいてデザインされた外部的ポインティングプライマーである。
例えば図１に示されるように、前記産物は、各プライマーの間で配置される領域
を排除する直線状断片であろう。
【００７３】 適切であることを見出されているPCR条件は、以下の実施例に記載される。最
適なPCR条件は、当業者によって容易に決定できることが理解されるであろう(例
えば、PCR 2: A Practical Approach (1995) 編者M.J. McPherson, B.D. Hames
およびG.R. Taylor, IRL Press, Oxford; Yu等, Methods Mol Bio., 58: 335-9
(1996); Munroe等, Proc, Nat'l Acad. Sci., USA, 92: 2209-13 (1995))。ライ
ブラリーのPCRスクリーニングは、多くの問題と、ライブラリーが配置されなけ
ればならない従来のハイブリダイゼーションスクリーニングと関連する時間的遅
延、作製されるフィルター、調製される放射性活性プローブ、および確立された
ハイブリダイゼーション条件を排除する。PCRスクリーニングは、興味ある配列
（遺伝子）に対するオリゴヌクレオチドプライマーのみを必要とする。PCR産物
は、マイクロ濾過、透析、ゲル電気泳動等を制限することなく含む各種の方法に
よって精製できる。新たなDNA合成が生じうるようにPCRにおいて使用されるポリ
メラーゼを除去することが所望されるであろう。例えばVent(登録商標) DNA Pol
ymerase(New England Biolabs)、Deep Vent(登録商標) DNA Polymerase(new Eng
land Biolabs)、HotTub(登録商標) DNA Polymerase(Amersham)、Thermo Sequena
se(登録商標)(Amersham)、rBst(登録商標) DNA Polymerase(Epicenter)、Pfu(登
録商標) DNA Polymerase(Stratagene)、Amplitaq Gold(登録商標)(Perkin Elmer
)、およびExpand(登録商標)(Boehringer-Mannheim)といった、適切な熱安定性DN
Aポリメラーゼは商業的に入手可能である。
【００７４】 完成した構築物を形成するために、標的配列を破壊する配列は、PCR増幅産物
内に挿入される。例えばここに記載されるように、直接的な方法は、広範囲PCR
産物（即ちベクター）および一つの断片（即ち選択マーカーをコードする遺伝子
）の結合を含む。前述のように、前記ベクターは、標的DNA配列に相同的な二つ
の異なる配列領域を含む。好ましくは前記ベクターは、アンピシリンのような選
択マーカーをコードする配列をも含む。前記ベクターと断片は、一本鎖末端を形
成するように処理された場合に、前記断片が標的遺伝子に実質的に相同的な二つ
の異なる領域の間で配置されるようにアニールするようにデザインされる。
【００７５】 クローニングのいずれかの方法が適切であるが、ライゲーション非依存的なク
ローニングが、選択マーカーと隣接する二つの異なる相同的領域を含む構築物を
構築するために使用されることが好ましい。ライゲーション独立クローニング(L
IC)は、キナーゼまたはリガーゼを使用することのないポリヌクレオチドの配向
的なクローニングのための手法である（例えばAslanidis等, Nucleic Acids Res
., 18: 6069-74 (1990); Rashtchian, Current Opin. Biotech., 6: 30-36 (199
5)参照）。一本鎖テール（クローニング部位またはアニリング配列とも称される
）は、通常一つのみのdNTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼを使用してベクターを
処理することによって（デザインされた制限酵素部位で）、LICベクターにおい
て作製される。T4 DNAポリメラーゼの3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性は、反
応混合物中に存在する単一のdNTPに対応する残基に遭遇するまで、ヌクレオチド
を除去する。この地点で、前記酵素の5'から3'のポリメラーゼ活性が、さらなる
切除を妨げるように、エキソヌクレアーゼ活性を妨げる。前記ベクターは、作製
された一本鎖テールが非相補的であるようにデザインされる。例えば、pDG2ベク
ターにおいて、４のアニリング部位の一本鎖テールの全てが、互いに相補的では
ない。PCR産物は、オリゴヌクレオチドプライマー内に適切な5'伸長を構築する
ことによって作製される。前記PCR産物は、dNTP（もしテンプレートとして使用
されるのであればオリジナルのプラスミド）を除去するように精製され、次いで
特異的なベクター適合性オーバーハングを生産するように適切なdNTPの存在下で
T4 DNAポリメラーゼで処理される。クローニングは、適合的なテールのアニリン
グによって生ずる。一本鎖テールは、例えば化学的または酵素的手段を使用して
、クローン断片の末端で作製される。相補的なテールは、ベクター上で作製され
る；しかしながら、挿入することなくベクターのアニーリングを避けるため、前
記ベクターのテールは互いに相補的ではない。テールの長さは、少なくとも約5
ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約12ヌクレオチド、さらにより好ましくは
少なくとも20ヌクレオチドである。
【００７６】 一つの実施態様では、同じ反応中にオーバーラップするベクターと断片を配置
することは、それらを十分にアニールする。別法として、相補的な配列が組み合
わされ、加熱され、ゆっくりと冷却される。好ましくは加熱工程は、約60℃から
約100℃の間、より好ましくは約60℃から80℃の間、さらにより好ましくは60℃
から70℃の間である。次いで加熱反応物は冷却される。一般的に冷却はむしろゆ
っくりと生じ、例えば前記反応は一般的に、約１時間後に約室温で生じる。冷却
は、アニーリングさせるように十分ゆっくりでなければならない。アニーリング
した断片／ベクターは迅速に使用され、または使用まで-20℃で凍結されて貯蔵
できる。
【００７７】 さらに、アニーリングは、適切な条件を達成するように塩と温度を調節するこ
とによって実施できる。ハイブリダイゼーション反応は、約10mM NaClから約600
mM NaClの範囲の溶液中で、約37℃から約65℃での範囲の温度で実施できる。ハ
イブリダイゼーション反応の厳格性は、塩濃度と温度の両者によって決定される
と解されるであろう。例えば、37℃で10mMの塩で実施されるハイブリダイゼーシ
ョンは、65℃で500mMの塩で実施されるものと同等の厳格性を有するであろう。
本発明について、相同的な相補的な配列の間でハイブリッドを形成する、いずれ
かのハイブリダイゼーション条件が使用されても良い。
【００７８】 図１に示されるように、一つの実施態様では、ベクターの一部が標的遺伝子に
実質的に相同的な二つの異なる領域を含み（広範囲PCRを使用してプラスミドラ
イブラリーから増幅された）、断片が選択マーカーをコードする遺伝子である場
合、構築物がこれらのアニリング方法のいずれかを使用した後に作製される。
【００７９】 アニリングの後、前記構築物は、それを増幅するために当該技術分野で知られ
た方法によって、例えばDH-α細胞といったコンピーテント大腸菌細胞内にトラ
ンスフォームされる。次いで単離された構築物は、ES細胞内に導入するために準
備される。
【００８０】 別の実施態様では、興味あるクローンが、PCRを使用してプールされたゲノム
ライブラリーにおいて同定される。一つの実施態様では、PCR条件は、選択マー
カーをコードする遺伝子がポジティブに同定されたクローン内に直接挿入できる
ようになされる。前記マーカーは、標的DNAに対して実質的なホモロジーを有す
る二つの異なる配列の間で配置される。
【００８１】 ゲノムファージライブラリーは、実施例に記載されたような当該技術分野で周
知のいずれかの方法によって調製できる。好ましくは、マウス胚性幹細胞ライブ
ラリーが、約20キロベースの長さの断片にゲノムDNAを切断することによって、
ラムダファージ内に調製される。次いで前記断片は、例えばラムダFix IIまたは
ラムダDash II(Stratagene, La Jolla, Ca)といったいずれかの適切なラムダク
ローニングベクター内に挿入される。
【００８２】 ライブラリーから大量のクローンを迅速に且つ有効にスクリーニングするため
に、プレート化ライブラリーのプールが作製されても良い。好ましい実施態様で
は、ゲノムラムダファージライブラリーは、プレート当たり約1,000クローン（
プラーク）の密度でプレート化される。数回に亘って生物の完全なゲノムを表す
ように、十分なプレートが作製される。例えば、約100万のクローン(1000のプレ
ート)は、約8のゲノム等量物を生ずるであろう。次いで、例えばプレートをバッ
ファー溶液で覆い、プレートをインキュベートし、バッファーを回収することに
よって、プラークを回収する。使用されるバッファーの量は、プレートのサイズ
に従って変化し、一般的に一つの100mmの直径のプレートは、約4mlのバッファー
で覆うことができ、約2mlが回収されるであろう。
【００８３】 個々のプレート溶解物は、この方法の間のいずれかの時点でプールすることが
でき、それらはいずれかの組み合わせでプールすることができると解されるであ
ろう。しかしながら、後の単一のコロニーの同定における容易性のため、各プレ
ート溶解物を別個に維持し、次いでプールを形成することが好ましい。例えば、
各2mlの溶解物を、96穴の深いウェルを有するプレートに配置することができる
。次いで、各ウェルから好ましくは約100μlの量を採取し、それらを新たなプレ
ートのウェルにおいて組み合わせることによって、プールを形成することができ
る。好ましくは、12の個々のプレート溶解物の100μlを一つのウェルに組み合わ
せ、ライブラリーの12,000クローンを表す1.2mlのプールを形成する。
【００８４】 次いで各プールを、標的遺伝子を増幅することが知られている一セットのPCR
プライマーを使用してPCR増幅する。標的遺伝子は、知られている全長遺伝子、
またはより好ましくは、GenBank若しくはEMBLのような公衆に利用可能な核酸配
列データベースから得られる部分的cDNA配列であっても良い。これらのデータベ
ースは、発現された配列タグとして知られている部分的cDNA配列(EST)を含む。
オリゴヌクレオチドPCRプライマーは、当該技術分野で周知のいずれかの方法に
よっていずれかの生物から単離でき、好ましくは化学的手段によって合成できる
。
【００８５】 一度、標的遺伝子のポジティブクローンがゲノムライブラリーにおいて同定さ
れれば、前記標的遺伝子の別個の部分をコードする二つの断片が生産されるに違
いない。言い換えると、前記標的の小さな既知の領域（例えばEST）の隣接領域
が生産される。各隣接領域のサイズは重要ではなく、100塩基対程度から100kb程
までの範囲であって良いが、好ましくは各隣接断片は、約1kbの長さより大きい
、より好ましくは約1から約10kbの間、さらにより好ましくは約1から約5kbの間
である。より長い断片は、ES細胞における相同的組換えの現象の数を増大するが
、より長い断片は、クローン化するのがより困難であることは、当業者に認識さ
れるであろう。
【００８６】 一つの実施態様では、隣接断片を増大するために使用されるオリゴヌクレオチ
ドPCRプライマーの一つは、例えばラムダファージといったライブラリークロー
ニングベクターに特異的である。それ故、前記ライブラリーがラムダファージラ
イブラリーであれば、ラムダファージのアームに特異的なプライマーが、長い隣
接断片を生産するために、ポジティブクローンに特異的なプライマーと結びつけ
て使用できる。複数のPCR反応を、異なる組み合わせのプライマーを試験するた
めにセットアップできる。好ましくは使用されるプライマーは、約2から約6kbの
間の長さの隣接配列を生産するであろう。
【００８７】 好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、断片がクローン化されて
いるベクターに5'配列相補性を有するようにデザインされる。さらに前記プライ
マーは、構築物がアセンブリーされる際に、隣接断片がベクターと互いに関して
正確に3'-5'の配向を有するようにデザインされる。一つの実施態様では、標的
遺伝子がT243である場合、プライマーの一つは配列番号４８を含み、別の実施態
様では、他のプライマーは配列番号４９を含む。
【００８８】 かくして、PCRベースの方法を使用して、例えばポジティブクローンは、電気
泳動ゲル上のバンドの視覚化によって同定できる。
【００８９】 一つの特徴点では、クローニングは、ベクターと二つの断片とを含む。前記ベ
クターは、好ましくはNeorといったポジティブ選択マーカーと、標的遺伝子の二
つの異なる領域に対するポジティブ選択マーカーの一方の側でクローニング部位
を含む。任意に、前記ベクターは、好ましくはポジティブ選択マーカーの逆側に
配置された、スクリーニングマーカーをコードする配列（レポーター遺伝子）を
も含む。図３Ａは、ベクターの一方の側に配置されたスクリーニングマーカー、
GFPを有するベクターの一つの実施態様を示す。しかしながら、前記スクリーニ
ングマーカーは、ポジティブ選択マーカー、Neorと反対の側でNotIとSite 4の間
のいずれかの位置で配置することができる。
【００９０】 適切なベクターの一つの例は、配列番号１の配列を有する図２に示されたプラ
スミドベクターである。図１において、「部位1、2、3または4」とラベルされた
特異的核酸ライゲーション非依存的クローニング部位（ここでアニリング部位と
も称される）も、ここに示されている。一般的に、前記クローニング部位は、少
なくとも一つのタイプの塩基、即ちチミン(T)、グアニン(G)、シトシン(C)また
はアデニン(A)を欠いている。従って、その一つの欠いているヌクレオチドのみ
の存在下でポリメラーゼとエキソヌクレアーゼの両者として機能する酵素と、前
記ベクターを反応させると、オーバーハングが生じるであろう。例えば、T4 DNA
ポリメラーゼは、3'-5'エキソヌクレアーゼとポリメラーゼの両方として機能す
る。かくして、ポリメラーゼ活性に利用されるヌクレオチドが不十分に存在する
場合、T4はエキソヌクレアーゼとして機能するであろう。それ故特異的なオーバ
ーハングは、dTTPのみの存在下で、T4 DNAポリメラーゼとpDG2ベクターを反応さ
せることによって作製することができる。例えばウラシルDNAグリコシラーゼ(UD
G)（例えばWO 93/18175参照）といった、本発明の実施において有用な他の酵素
は、当業者に周知であろう。ここで例示されるベクターは、24ヌクレオチドのオ
ーバーハングを有する。5ヌクレオチド程度が、ライゲーション非依存的クロー
ニングのために必要であることは、当業者に知られているであろう。
【００９１】 別の実施態様では、構築物は、二段階のクローニングプロトコールでアセンブ
リーされる。第一の工程で、ホモロジーの各クローニング領域が、ベクターのア
ニリング部位の二つに別個にクローン化される。例えば、ホモロジーの「上流」
領域は、アニリング部位１および２にクローン化され、別のクローニングで、ホ
モロジーの「下流」領域が、アニリング部位３および４にクローン化される。一
度ホモロジーの各単一の領域を含むクローンが同定されると、ホモロジーの両者
の領域を含む標的化構築物は、制限酵素で各クローンを切断することによって作
製でき、その場合一つの酵素はアニリング部位１の外側を切断し（例えば図２Ａ
におけるNotI）、別の酵素がポジティブ選択マーカーとアニリング部位３との間
で切断する（例えば図２ＡにおけるSalI）。各構築物から隣接するホモロジー領
域を含む断片を精製し（例えばゲル電気泳動によって）、当該技術分野で周知の
標準的ライゲーション法を使用して組み合わせ、その結果標的化構築物を生産す
る。
【００９２】 また別の実施態様では、本発明の第一の特徴点に従った構築物を、単一工程の
４方向ライゲーション法において形成できる。ベクターと断片を上述のように処
理する。略記すると、ベクターを二つの部分を形成するように処理し、各部分は
各末端で特異的な配列の一本鎖テールを有する。同様に、PCR増幅化隣接断片を
、前記ベクターの部分のものと同補的な一本鎖テールを形成するように処理する
。処理されたベクター部分と断片を組み合わせ、前述のようにアニールさせる。
一本鎖テールの特異性のため、最終構築物は、正確な向きでポジティブ選択マー
カーによって分離された断片を含むであろう。
【００９３】 最終プラスミド構築物を細菌において増幅し、精製し、次いでES細胞内に導入
するか、または使用まで-20℃で凍結して貯蔵できる。所望される場合、ベクタ
ーを胚性幹細胞系に導入し（例えばエレクトロポレーションによって）、導入さ
れたDNAが内因性DNAと相同的に組換わった細胞を選択する（例えばLi等, Cell,
69: 91526 (1992)参照）。次いで選択された細胞を、キメラを形成するために、
動物（例えばマウス）の胚盤胞（または、例えば桑実胚のような、生存能力を有
する動物を作製する目的に適した発生の他の段階）内に注射する(例えばBradley
, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,
E. J. Robertson編, IRL, Oxford, pp. 113-152 (1987))。別法として、選択さ
れたES細胞を、凝集キメラを形成するように、分離したマウス胚細胞と凝集させ
ることができる。次いでキメラ胚を、適切な偽妊娠メス里親動物内に移植し、胚
に期間を与えることができる。その生殖細胞において相同的に組換えられたDNA
を有するキメラ子孫は、動物の全ての細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動
物を繁殖させるために使用できる。一つの実施態様では、キメラ子孫は、標的遺
伝子においてヘテロ接合性の破壊を有するマウスを生産するために使用される。
次いでヘテロ接合性ノックアウトマウスを交尾させる。典型的に、そのような交
尾の子孫の４分の１が、標的遺伝子においてホモ接合性の破壊を有することは、
当該技術分野で周知である。
【００９４】 次いでヘテロ接合性およびホモ接合性のノックアウトマウスを、標的遺伝子の
破壊が表現型の変化、特に病理学的変化を引き起こすかを測定するために、正常
な野生型マウスと比較できる。一つの実施態様では、標的DNA配列がT243である
場合、ホモ接合性のノックアウトマウスは、平均的な正常な野生型成体マウスに
対して体重が減少する。体重は典型的に、少なくとも約15％まで；より典型的に
は約30-90％まで；さらにより典型的には約40-80％まで；最も典型的には約60-7
0％まで減少する。
【００９５】 別の実施態様では、ホモ接合性のノックアウトマウスの体長は、平均的な正常
な野生型成体マウスに対して減少する。体長は一般的に、少なくとも約10％まで
；しばしば約15-50％まで；よりしばしば約20-40％まで；最もしばしば約25-35
％まで減少する。
【００９６】 体長に対する体重の比もまた、正常な野生型成体マウスに対して減少するであ
ろう。一般的に、体長に対する体重の比は、少なくとも約20％、より一般的に約
25-75％；さらにより一般的に約30-65％；最も一般的に約40-55％減少する。
【００９７】 減少した体長と減少した体重の両者を含む表現型を有するマウスもまた観察さ
れる。そのようなマウスは、減少した体長に対する体重の比をも示すであろう。
【００９８】 本発明の別の実施態様では、ノックアウトマウスは、軟骨および／または骨の
疾患を含む表現型を有する。典型的にこの実施態様では、異常な軟骨と、骨の形
成の一般化した減少が存在する。
【００９９】 ここで使用される「疾患」は、生存機能の実効性を妨害または侵害し、苦痛や
弱化を引き起こすまたはそのおそれを生ずる、身体の状態または器官のあるもの
の状態のいずれの改変をも指す。疾患はまた、特徴的な単一のまたは一連の症状
および／または兆候によって顕在化され、病因、病理および／または予後が既知
または未知である、身体のいずれかの部分、器官またはシステム（またはそれら
の組み合わせ）の正常な構造または機能からのいずれかの偏り、またはその破壊
を含むように考慮されても良い。
【０１００】 一般的に観察される病理学的状態は、体軸と四肢の骨格の両者が短くなること
を含む。四肢の近位および遠位の骨が、割合的に短くなる。関節の軟骨は、アル
シアンブルー染色を欠く。この実施態様のさらなる特徴点は、遠位の大腿骨の薄
く成長した板と、骨端軟骨の不在による薄化とを含む。前記疾患はまた、成長し
た板の脆さを誘発する微小骨折をも提供するであろう。生長の範囲内で、増殖中
で過栄養的な領域における軟骨細胞の列が、この実施態様では短い。骨幹端内の
軟骨性スピクラが短く、広く空間を形成する；場合によりスピクラは、無秩序に
向きをとっている。骨芽細胞は豊富であり、しばしば軟骨性スピクラに沿って積
み重なっている。骨端軟骨は薄く、しばしば繊維状結合組織によって置換されて
いる。骨端表面のアルシアンブルー染色の減少も存在する。骨端／骨端軟骨の接
合物での軟骨は、骨端軟骨をオーバーハングする不規則な突出末端でわずかに炎
症している。さらにこの実施態様では、不規則な胸骨分節が含まれる；成長した
板は、欠いているか不連続かのいずれかである。大きな不規則な軟骨の島は、胸
骨分節のシャフト内に伸長し、場合により二次的な骨形成中心を有する。前記軟
骨の端部もまた炎症しているであろう。別の特徴点は、小さく主に軟骨性である
変化しやすい骨化した椎骨性の身体を含む。これらの主に軟骨性胸骨分節の成長
した板は不規則で薄く、横方向のプロセスが先細りする。本発明の一つの特徴点
では、前記疾患は軟骨形成不全症として特徴付けされる。
【０１０１】 本発明のまた別の実施態様では、ノックアウトマウスの表現型は、腎臓疾患を
含む。典型的に腎臓は、小さくて正常の構造を欠く。皮質は薄く、いくつかの糸
球体は被膜下にあっても良い。被膜下の糸球体は、萎縮した過細胞性の糸球体ふ
さ状分岐を有する小さいものである。皮質内側領域は、放射性の弓形血管と別個
のチューブ状形成物を欠いても良い。皮質内側接合部内のチューブ状上皮細胞は
、シート、山状、およびクラスターに無秩序に整列する。いくつかのチューブ状
上皮細胞は小さく、暗い好塩基性の至適再生物である。形成異常の変化が、両方
の腎臓で典型的に存在し、皮質内側接合部で最も優勢であり、より少ない程度で
皮質に存在する。本発明の一つの特徴点に従って、腎臓疾患は腎臓形成異常症と
して特徴付けされる。
【０１０２】 病理学的状態の他の状態もまた観察されても良い。
【０１０３】 ここで記載されるベクターに取り込まれても良いさらなる特徴は、リコンビナ
ーゼ標的部位の使用を含む。バクテリオファージP1 Creリコンビナーゼ、および
酵母プラスミドから得られるflpリコンビナーゼは、特異的な標的部位（creリコ
ンビナーゼについてlox P部位、およびflpリコンビナーゼについてfrt部位）でD
NAを切断し、第二の切断部位へのこのDNAのライゲーションを触媒する、部位特
異的DNAリコンビナーゼ酵素の二つの非制限的な例である。数多くの適切な代替
的部位特異的リコンビナーゼが記載されており、それらの遺伝子が、本発明の方
法に従って使用できる。そのようなリコンビナーゼは、バクテリオファージλの
Intリコンビナーゼ（Xisを含むまたは含まない）(weisberg, R.等, in Lambda I
I, (Hendrix, R.等編), Cold Spring Harbor Press, Cold Springer Harbor, NY
, pp. 211-50 (1983), 参考としてここに取り込まれる)；TpnIおよびβ-ラクタ
マーゼトランスポゾン(Mercier等, J. Bacteriol., 172: 3745-57 (1990))；Tn3
レゾルバーゼ(Flanagan & Fennewald J. Molec. Biol., 206: 295-304 (1989))
；Stark等, Cell, 58: 779-90 (1989))；酵母リコンビナーゼ(Matsuzaki等, J.
Bacteriol., 172: 610-18 (1990))；B subtilis SpoIVCリコンビナーゼ(Sato等,
J. Bacteriol. 172: 1092-98 (1990))；Flpリコンビナーゼ(Schwartz & Sadows
ki, J. Molec. Biol., 205: 647-658 (1989); Parsons等, J. Biol. Chem., 265
: 4527-33 (1990); Golic & Lindquist, Cell, 59: 499-509 (1989); Amin等, J
. Molec. Biol., 214: 55-72 (1990))；Hinリコンビナーゼ(Glasgow等, J. Biol
. Chem., 264: 10072-82 (1989))；イムノグロブリンリコンビナーゼ(Malynn等,
Cell, 54: 453-460 (1988))；およびCinリコンビナーゼ(Haffter & Bickle, EM
BO J., 7: 3991-3996 (1988); Hubner等, J. Molec. Biol., 205: 493-500 (198
9))を含み、これらの文献は全て参考としてここに取り込まれる。そのようなシ
ステムは、Echols(J. Biol. Chem. 265: 14697-14700 (1990))；de Villartay (
Nature, 335: 170-74 (1988))；Craig, (Ann. Rev. Genet., 22: 77-105 (1988)
)；Poyart-Salmeron等 (EMBO J. 8: 2425-33 (1989))；Hunger-Bertling等 (Mol
Cell. Biochem., 92: 107-16 (1990))；およびCregg & Madden (Mol. Gen. Gen
et., 219: 320-23 (1989))によって議論されており、これらの文献は全て参考と
してここに取り込まれる。
【０１０４】 Creは均質に精製されており、loxP部位との反応は詳細に特徴付けされている(
Abremski & Hess J. Mol. Biol. 259: 1509-14 (1984), ここに参考として取り
込まれる)。Creタンパク質は35,000の分子量を有し、New England Nuclear/Du P
ontから商業的に得ることができる。cre遺伝子（Creタンパク質をコードする）
はクローン化され発現されている(Abremski等 Cell 32: 1301-11 (1983), 参考
としてここに取り込まれる)。Creタンパク質は、同じまたは異なるDNA分子に存
在しても良い二つのloxP配列の間で組換えを介在する(Sternberg等, Cold Sprin
g Harbor Symp. Quant. Biol. 45: 297-309 (1981))。loxP部位の内部スペーサ
ー配列は非対称であるため、二つのloxP部位は、互いに対して配向性を示すこと
ができる(Hoess & Abremski Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 1026-29 (198
4))。かくして、同じDNA分子上に二つの部位が、直接繰り返される向きで存在す
る場合、Creはその部位の間でDNAを摘出するであろう(Abremski等, Cell 32: 13
01-11 (1983))。しかしながら、前記部位が互いに対して逆に配置されているの
であれば、それらの間のDNAは、組換えの後摘出されないが単純に逆向きとなる
。かくして、直接的な向きで二つのloxP部位を有する環状DNA分子は、二つの小
さな環を生産するように組換えられ、そこで逆向きに二つのloxP部位を有する環
状分子は、loxP部位によって隣接したDNA配列を単純に逆向きにする。さらに組
換え作用は、標的が別のDNA分子上に存在する場合、標的部位に対して遠位の領
域の相互の交換を引き起こすことができる。
【０１０５】 リコンビナーゼは、ノックアウトモデルにおける遺伝子機能を特徴付けするた
めの重要な実用性を有する。ここに記載された構築物が、標的遺伝子を破壊する
ために使用される場合、ポジティブ選択マーカーの挿入が標的遺伝子の翻訳開始
部位の下流(3')に生じるときに、融合転写産物が生産できる。融合転写産物は、
未知の重要性を有するタンパク質発現のレベルを引き起こすであろう。ポジティ
ブ選択マーカー遺伝子の挿入は、近くの遺伝子の発現に影響できることが示唆さ
れている。これらの効果は、所定の表現型が、遺伝子の不活性化、または近くの
遺伝子の転写と関連するかどうか識別できないため、ノックアウト現象の後に遺
伝子機能を決定することを困難にするであろう。両者の重要な問題は、リコンビ
ナーゼ活性を活用することによって解決される。ポジティブ選択マーカーが、同
じ向きでリコンビナーゼ部位によって隣接されている場合、対応するリコンビナ
ーゼの添加は、ポジティブ選択マーカーの除去を引き起こすであろう。この態様
では、ポジティブ選択マーカーまたは融合転写産物の発現によって引き起こされ
る効果は避けられる。
【０１０６】 機能の損失または完全なミューテーションモデルは、TRP標的遺伝子と関連す
る疾患を特徴付けするために不十分であろう。数多くの印刷された報告が、TRP
におけるトリヌクレオチド繰り返し領域の拡大が、生成したタンパク質に対して
機能の有害な増加を与えることを示唆する。そのような機能の増加は、他のタン
パク質との新規なまたは増大した相互作用、タンパク質溶解性分解に対する増大
した耐性、異常なタンパク質ホールディング、および／または大きな不溶性タン
パク質形態の毒性の蓄積を含む。それ故、拡張が、機能の増大と関連する表現型
変化を生産するかどうかを測定するために、TRPにおけるトリヌクレオチドリピ
ートの拡張を模倣することは、非常に価値を有するであろう。従って、本発明の
一つの実施態様は、標的遺伝子における破壊の部位での合成トリヌクレオチドリ
ピートの酵素補助的部位特異的統合をもたらすために、リコンビナーゼの使用を
含むであろう。この実施態様は、リコンビナーゼシステムの相互交換能力を含み
、それによってリコンビナーゼ酵素は、別個の分子に存在する二つの標的部位に
対して遠位のDNAの交換を触媒する。ノックアウト幹細胞を精製するために使用
される標的化構築物が、ポジティブ選択マーカーに隣接するリコンビナーゼ標的
部位を含む場合、組換えが、当該部位と、リコンビナーゼ酵素の存在下で合成核
酸上に存在する第二の部位の間で生じることができる。
【０１０７】 当業者は、合成核酸が、リコンビナーゼ標的部位と、いずれかの所望の配列の
繰り返されるトリヌクレオチドの両者を含むように容易に合成できることを認識
するであろう。例えば、合成核酸配列は、ロイシンをコードするCTG、またはグ
ルタミンをコードするCAGのリピートを含むことができる。好ましくは前記合成
核酸は、少なくとも約20のトリヌクレオチドリピート；より好ましくは少なくと
も約40のトリヌクレオチドリピート；より好ましくは少なくとも約100のトリヌ
クレオチドリピートを有するであろう。
【０１０８】 当業者は、トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレ
ーションを制限することなく含む、DNAを導入するためのいずれかの標準的研究
室方法によって、合成核酸が、破壊された遺伝子と接触できることを認識するで
あろう。
【０１０９】 一つの実施態様では、精製されたリコンビナーゼ酵素は、直接的マイクロイン
ジェクションによって細胞に提供される。別の実施態様では、リコンビナーゼは
、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターと機能的に結合した共トランスフ
ェクト化構築物またはベクターから発現される。この実施態様のさらなる特徴点
は、組換えが生じる時期と場所の選択を可能にする、組織特異的または誘導可能
なリコンビナーゼ構築物の使用である。リコンビナーゼ介在組換えの誘導可能な
形態を実施するための一つの方法は、誘導可能なまたは組織特異的なプロモータ
ー、または所望のリコンビナーゼ活性を発現するための他の遺伝子調節エレメン
トを使用するベクターの使用を含む。誘導可能な発現エレメントは好ましくは、
所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導可能なコントロールまたは活性化を可能
にするように、好ましくは機能的に配置される。そのような誘導可能なプロモー
ターまたは他の遺伝子調節エレメントの例は、テトラサイクリン、メタロチオニ
ン、エクジソン、および他のステロイド−応答性プロモーター、ラパマイシン応
答プロモーター等を制限することなく含む(No等, Proc. Natl. Acad. Sci. YSA,
93: 3346-51 (1996); Furth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9302-6 (19
94))。使用可能なさらなるコントロールエレメントは、ウイルスプロモーターの
ような特異的転写因子を必要とするプロモーターを含む。そのようなプロモータ
ーを取り込んだベクターは、必要な転写因子を発現する細胞のみにおいてリコン
ビナーゼ活性を発現するであろう。
【０１１０】 TRP遺伝子配列はまた、TRP遺伝子産物を生産するために使用されても良い。TR
P遺伝子産物は、機能的に同等な遺伝子産物を表すタンパク質を含んでも良い。
そのような同等な遺伝子産物は、ここに記載される遺伝子配列によってコードさ
れるアミノ酸配列を有するアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含むが、そ
れはサイレントな変化を引き起こし、かくして機能的に同等なTRP遺伝子産物を
生産する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水
性、および／または両性の性質における同等性に基づいてなされても良い。
【０１１１】 例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、
バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含
む；極性の性質をアミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チ
ロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む；正に荷電した（塩基性）アミ
ノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む；並びに負に荷電した（
酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。ここで使用され
る「機能的に同等」は、TRP遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物
と実質的に同等なin vivo活性を示すことが可能なタンパク質を指す。別法とし
て、アッセイの一部に使用される場合、「機能的に同等」は、内因性遺伝子産物
の対応する部分と実質的に同様な態様で、他の細胞内または細胞外分子と相互作
用可能なペプチドを指す。
【０１１２】 本発明の方法に従って有用な他のTRPタンパク質産物は、組換えまたは合成的
手段によって生産されたTRPから由来する、またはそのTRPに基づくペプチドであ
る。
【０１１３】 例えばサイトディレクトミュータジェネシスによって、トリヌクレオチド領域
が意図的に拡大されたミュータントTRPタンパク質もまた生産できる。幹細胞に
おける酵素補助的サイトディレクトミュータジェネシスによって拡大されたTRP
もまた使用できる。
【０１１４】 TRPおよび拡大されたTRP遺伝子産物は、当該技術分野で周知の方法を使用して
、組換えDNA法によって生産されても良い。かくして、遺伝子配列をコードする
核酸を発現することによる、本発明の遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを調製
するための方法が、ここに記載される。当業者に周知の方法は、遺伝子タンパク
質コード配列と、適切な転写／翻訳コントロールシグナルを含む発現ベクターを
構築するために使用できる。これらの方法は例えば、in vitro組換えDNA法、合
成法、およびin vivo組換え／遺伝的組換えを含む(例えば、Sambrook等, 1989,
上記参照およびAusubel等, 1989, 上記参照を参照)。別法として、遺伝子タンパ
ク質配列をコード可能なRNAが、例えば自動化合成器を使用して化学的に合成さ
れても良い（例えば、Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gai
t, M, J,編, IRL Press, Oxford (1984)）。
【０１１５】 各種の宿主発現ベクターシスムテが、本発明の遺伝子コード配列を発現するた
めに使用されても良い。そのような宿主発現システムは、興味あるコード配列が
生産され後に精製されるビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列でト
ランスフォームまたはトランスフェクトされた際に、in situで本発明の遺伝子
タンパク質を示す細胞を表しても良い。これらは、遺伝子タンパク質コード配列
を含む組換え、バクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現
ベクターでトランスフォームされた細菌（例えば大腸菌、枯草菌）のような微生
物；遺伝子タンパク質コード配列を含む組換え酵母発現ベクターでトランスフォ
ームされた酵母（例えばSaccharomyces、Pichia）；遺伝子タンパク質コード配
列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染された
昆虫細胞システム；遺伝子タンパク質コード配列を含む、組換えウイルス発現ベ
クター（例えばカリフォルニアモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイル
ス、TMV）で感染された、または組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラ
スミド）でトランスフォームされた植物細胞システム；あるいは哺乳動物細胞の
ゲノムから（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスか
ら（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモー
ター）由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞シス
テム（例えばCOS, CHO, BHN, 293, 3T3）を制限することなく含む。
【０１１６】 細菌システムでは、数多くの発現ベクターが、発現されている遺伝子タンパク
質について企図される使用に依存して有利に選択されても良い。例えば、大量の
そのようなタンパク質が生産される場合、抗体の生産またはペプチドライブラリ
ーのスクリーニングのために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物
の発現に向けたベクターが所望されても良い。そのようなベクターは、遺伝子タ
ンパク質コード配列が、融合タンパク質が生産されるようにlac Zコードタンパ
ク質とフレーム中でベクター内にここにライゲートされている、大腸菌発現ベク
ターpUR278(Ruther & Muller-Hill, EMBO J., 2: 1791-94 (1983))；pINベクタ
ー(Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13: 3101-09 (1985); Van Heeke &
Schuster, J. Biol. Chem., 264: 5503-9 (1989))等を制限することなく含む。p
GEXベクターは、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質の
ような外来ポリペプチドを発現するために使用されても良い。一般的に、そのよ
うな融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに対する
吸着、引き続き遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易
に精製できる。pGEXベクターは、クローン化標的遺伝子タンパク質がGST部分か
ら放出できるように、トロンビンまたはXa因子プロテアーゼ切断部位を含むよう
にデザインされる。
【０１１７】 好ましい実施態様では、全長cDNA配列は、標準的なPCR方法体系を使用して、
アミノ末端でフレーム中のBam HI部位と、カルボキシル末端でEco RI部位とを有
し(Innis等 (編) PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Acad
emic Press, San Diego (1990))、pGEX-2TKベクターにライゲートされる(Pharma
cia, Uppsala, Sweden)。生成したcDNA構築物は、放射性活性ラベリングに対し
てアミノ末端でキナーゼ認識部位を、アフィニティー精製に対してカルボキシル
末端でグルタチオンS-トランスフェラーゼ配列を含む(Nilsson等, EMBO J., 4:
1075-80 (1985); ZabeauおよびStanley, EMBO J., 1: 1217-24 (1982))。
【０１１８】 昆虫システムでは、Autographa colifornica核多角体病ウイルス(AcNPV)が、
外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。前記ウイルスは、Spod
optera frugiperda細胞において生育する。遺伝子コード配列は、ウイルスの非
必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）内に個々にクローン化され、AcNPVプロ
モーター（例えばポリヘドリンプロモーター）のコントロールの下には位置され
ても良い。遺伝子コード配列の成功した挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化
と、非閉塞組換えウイルスの生産を引き起こす（即ち、ポリヘドリン遺伝子によ
ってコードされるタンパク質性コートを欠くウイルス）。次いでこれらの組換え
ウイルスを、挿入された遺伝子が発現されるSpodoptera frugiperda細胞を感染
するために使用する（例えば、Smith等, J. Virol. 46: 584-93 (1983); Smith,
米国特許第4,745,051号参照）。
【０１１９】 哺乳動物宿主細胞では、数多くのウイルスベースの発現システムが使用されて
良い。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、興味ある遺伝子コ
ード配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体、例えば後期プロモ
ーターおよび３成分リーダー配列にライゲートされても良い。次いでこのキメラ
遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入
して良い。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域E1またはE3）への挿入は、
生存可能で昆虫宿主において遺伝子タンパク質を発現可能な組換えウイルスを生
ずるであろう（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 365
5-59 (1984)参照）。特異的な開始シグナルが、挿入された遺伝子コード配列の
有効な翻訳のために必要であっても良い。これらのシグナルは、ATG開始コドン
と隣接配列を含む。それ自体の開始コドンと隣接配列を含む完全な遺伝子が、適
切な発現ベクター中に挿入された場合、さらなる翻訳コントロールシグナルが必
要ではないであろう。しかしながら、遺伝子コード配列の一部のみが挿入された
場合、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳コントロールシグナルが提供さ
れなければならない。さらに、開始コドンは、完全な挿入物の翻訳を確保するた
めに、所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない
。これらの外因性翻訳コントロールシグナルと開始コドンは、天然および合成の
両者の各種の起源で存在できる。発現の効力は、適切な転写エンハンサーエレメ
ント、転写ターミネーター等の挿入によって促進されても良い(Bitter等, Metho
ds in Enzymol., 153: 516-44 (1987)参照)。
【０１２０】 さらに、挿入配列の発現を調節し、または所望の特異的態様で遺伝子産物を修
飾およびプロセッシングする宿主細胞株が選択されても良い。タンパク質産物の
そのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は
、タンパク質の機能について重要であっても良い。異なる宿主細胞は、タンパク
質の翻訳後プロセッシングおよび修飾について特徴的で特異的なメカニズムを有
する。適切な細胞系または宿主システムが、発現される外来タンパク質の正確な
修飾とプロセッシングを確保するために選択できる。この目的のため、遺伝子産
物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確なプロセッシングに対する
細胞マシネリーを有する真核生物宿主細胞が使用されても良い。そのような哺乳
動物宿主細胞は、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38等を制限
することなく含む。
【０１２１】 組換えタンパク質の長期的な高収率生産のため、安定な発現が好ましい。例え
ば、遺伝子タンパク質を安定に発現する細胞系が操作されても良い。複製のウイ
ルスオリジンを含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な
発現コントロールエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転
写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）と選択マーカーによって制御される
DNAでトランスフォームできる。外来DNAの導入に引き続き、操作された細胞を、
富栄養培地で１−２日成長させ、次いで選択培地に切り替えても良い。組換えプ
ラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、その染色体内にプ
ラスミドを安定に挿入された増殖する細胞を、次いでクローン化され細胞系内で
増大する中心を形成させる。この方法は、遺伝子タンパク質を発現する細胞系を
操作するために有利に使用されても良い。そのような操作された細胞系は、遺伝
子タンパク質の内因性活性に影響する化合物のスクリーニングおよび評価におい
て特に有用であっても良い。
【０１２２】 好ましい実施態様では、組換えタンパク質の発現の時期および／または量のコ
ントロールは、誘導可能な発現構築物を使用して制御できる。誘導可能な構築物
および組換えタンパク質の誘導可能な発現のためのシステムは、当業者に周知で
あろう。そのような誘導可能なプロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの
例は、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、および他のステロイド
応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター等を制限することなく含
む(No等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-51 (1996); Furth等, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9302-6 (1994))。使用可能なさらなるコントロール
エレメントは、ウイルス、特にHIVのプロモーターのような特異的転写因子を必
要とするプロモーターを含む。一つの実施態様では、Tet誘導可能遺伝子発現シ
ステムが利用される(Gossen & Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547
-51 (1992); Gossen等, Science, 268: 1766-69 (1995))。Expression Systems
は、大腸菌Tn10トランスポゾン−テトラサイクリンリプレッサータンパク質(Tet
R)と、TetRが結合するテトラサイクリンオペレーター配列(tetO)のテトラサイク
リン耐性オペロンから由来する二つの調節エレメントに基づく。そのようなシス
テムを使用して、組換えタンパク質の発現は、tetOオペレーター配列のコントロ
ールの下に配置され、宿主細胞内にトランスフェクトまたはトランスフォームさ
れる。宿主細胞内に共トランスフェクトされるTetRの存在下で、組換えタンパク
質の発現は、tetO調節エレメントに対するTetRタンパク質の結合により抑制され
る。次いで、高レベルの調節された遺伝子発現が、TetRに結合するtetOエレメン
トと競合する、テトラサイクリン(Tc)またはドキシサイクリン(Dox)のようなTc
誘導体の各種の濃度に応答して誘導可能である。tet誘導可能遺伝子発現のため
の構築物および材料は、LONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CAから商業
的に入手可能である。
【０１２３】 アッセイシステムにおける構成成分として使用される場合、遺伝子タンパク質
と試験物質の間で形成される複合体の検出を容易にするために、直接または間接
のいずれかで、遺伝子タンパク質はラベルされても良い。125Iのような放射性同
位元素；基質にさらされた際に検出可能な熱的シグナルまたは光を生産する酵素
ラベリングシステム；および蛍光ラベルを制限することなく含む、各種の適切な
ラベリングシステムのいずれかが使用されて良い。
【０１２４】 組換えDNA法が、そのようなアッセイシステムのための遺伝子タンパク質を生
産するために使用される場合、それは、ラベリング、固定化および／または検出
を容易にできる融合タンパク質を作製するために有利である。
【０１２５】 間接的なラベリングは、遺伝子産物のそれぞれに特異的に結合する、ラベル化
抗体のようなタンパク質の使用を含む。そのような抗体は、ポリクローナル、モ
ノクローナル、キメラ、一本鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーによって
生産される断片を制限することなく含む。
【０１２６】 一つ以上の遺伝子エピトープを特異的に認識可能な抗体の生産のための方法が
ここに記載される。そのような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体(mAb)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発
現ライブラリーによって生産される断片、抗イディオタイプ（抗Id）抗体、およ
び上述のいずれかのエピトープ結合断片を制限することなく含む。そのような抗
体は、例えば生物学的サンプルにおける標的TRP遺伝子の検出において、または
別法として、異常な標的遺伝子活性の阻害のための方法として使用されても良い
。かくしてそのような抗体は、疾患治療方法の一部として使用されても良く、お
よび／または診断方法の一部として使用されても良く、それによって患者は、標
的TRP遺伝子タンパク質の異常なレベルについて、またはそのようなタンパク質
の異常な形態の存在について試験されても良い。
【０１２７】 遺伝子に対する抗体の生産のため、各種の宿主動物が、TRPタンパク質または
その一部での注射で免疫化されても良い。そのような宿主動物は、例としてウサ
ギ、マウス、およびラットを制限することなく含んでも良い。フロイント（完全
および不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような
表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマ
ルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにBC
G(bacille Calmette-Guerin)およびCorynebacterium pavrumのような潜在的に有
用なヒトアジュバントを制限することなく含む、各種のアジュバントが、宿主の
種類に依存してイムノグロブリン応答を増大するために使用されても良い。
【０１２８】 ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物のような抗原、またはその抗原性の機
能的な誘導体で免疫化された動物の血清から由来する抗体分子の異種集団である
。ポリクローナル抗体の生産のため、前述のような宿主動物は、前述のようなア
ジュバントを補った遺伝子産物での注射によって免疫化されても良い。
【０１２９】 モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の均一な集団であり、培養中
の連続的な細胞系による抗体分子の生産を提供するいずれかの方法によって得ら
れても良い。これらは、KohlerおよびMistein, Nature, 256: 495-7 (1975)；お
よび米国特許第4,376,110のハイブリドーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kos
bor等, Immunology Today, 4: 72 (1983); Cote等, Proc. Natl. Acad.Sci. USA
, 80: 2026-30 (1983))、およびEBV-ハイブリドーマ法(Cole等, Monoclonal Ant
ibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., New York, pp. 77-96 (198
5))を制限することなく含む。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよ
びいずれかのそのサブクラスを含むいずれかのイムノグロブリンクラスを有する
。本発明のｍAbを生産するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養さ
れても良い。in vivoでのmABの高い力価の生産は、これを現在好ましい生産法と
する。
【０１３０】 さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子から得られる遺伝子と、適切な抗
原特異性のマウス抗体分子から得られる遺伝子をスプライシングすることによる
、「キメラ抗体」(Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855 (1984
); Takeda等, Nature, 314: 452-54 (1985))の生産のために開発された方法が使
用できる。キメラ抗体は、ネズミmAb由来の可変領域と、ヒトイムノグロブリン
定常領域を有するもののような、異なる動物種から由来する異なる部分を有する
分子である。
【０１３１】 別法として、一本鎖抗体の生産について記載された方法（米国特許第4,946,77
8号；Bird, Science 242: 423-26 (1988); Huston等, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85: 5879-83 (1988); およびWard等, Nature, 334: 544-46 (1989)）が、
遺伝子−一本鎖抗体を生産するために採用できる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋
を介してFv領域の重鎖および軽鎖断片を結合し、一本鎖ポリペプチドを生成する
ことによって形成される。
【０１３２】 特異的エピトープを認識する抗体断片は、周知の方法によって生産されても良
い。例えばそのような断片は、抗体分子のペプシン切断によって生産できるF(ab
')2断片、およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生産で
きるFab断片を制限することなく含む。別法として、所望の特異性を有するモノ
クローナルFab断片の迅速で容易な同定を可能にするために、Fab発現ライブラリ
ーが構築されても良い(Huse等, Science, 246: 1275-81 (1989))。
【０１３３】 疾患のためのモデルとして利用可能な細胞および動物ベースのシステムがここ
に記載される。マウス、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、並びに例
えばヒヒ、サルおよびチンパンジーといった非ヒト霊長類を制限することなく含
むいずれかの種類の動物が、疾患動物モデルを生産するために使用されても良い
。さらに、ヒトから由来する細胞を使用しても良い。これらのシステムは、各種
の応用において使用されても良い。例えば、細胞および動物ベースのモデルシス
テムは、TRP遺伝子をさらに特徴付けするために使用されても良い。そのような
アッセイは、疾患の症状を緩和可能である化合物を同定するようにデザインされ
たスクリーニングストラテジーの一部として使用されても良い。かくして、動物
および細胞ベースのモデルは、疾患の治療において有効である薬剤、医薬、治療
および介入を同定するために使用されても良い。
【０１３４】 TRPをコードし、さらに疾患と関連する細胞表現型を示す標的遺伝子配列を含
み発現する細胞は、抗疾患活性を示す化合物を同定するために使用されても良い
。
【０１３５】 そのような細胞は、U937 (ATCC# CRL-1593)、THP-1 (ATCC# TIB-202)、および
P388D1 (ATCC# TIB-63)のような非組換え単核細胞系；HUVECおよびウシ大動脈内
皮細胞(BAEC)のような内皮細胞；並びにHeLa細胞および例えばCOS-7 (ATCC# CRL
-1651)といったCOS細胞のような一般的哺乳動物細胞系を含む。さらにそのよう
な細胞は、組換えトランスジェニック細胞系を含んでも良い。例えば、本発明の
ノックアウトマウスは、疾患に関与する一つ以上の細胞系を含む細胞系を生産す
るために使用されても良く、それは当該疾患のための細胞培養モデルとして使用
できる。本発明の疾患トランスジェニック動物から由来する細胞、組織および一
次培養物が使用されても良い一方で、連続的な細胞系の世代が好ましい。トラン
スジェニック動物から連続的な細胞系を導くために使用可能な方法の例としては
、Small等, Mol. Cell Biol., 5: 642-48 (1985)を参照。
【０１３６】 標的遺伝子配列は、興味ある細胞のゲノムに導入され、そこで過剰発現されて
も良く、またはもし内因性標的配列が存在するのであれば、それらは過剰発現さ
れても、または別法として標的遺伝子発現を発現させないまたは不活性化するた
めに破壊しても良い。
【０１３７】 標的遺伝子発現を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコード部分を、興味
ある細胞タイプにおける遺伝子発現を達成可能な調節配列にライゲートしても良
い。そのような調節領域は当業者に周知であり、過度の実験の必要なく使用でき
る。
【０１３８】 内因性遺伝子配列を発現させないために、そのような配列が単離され、興味あ
る細胞タイプのゲノム内に再導入される場合に、内因性標的遺伝子対立遺伝子が
不活性化されるように操作されても良い。好ましくは、操作された標的遺伝子配
列は、内因性標的配列が、細胞のゲノム内に操作された標的遺伝子配列の挿入の
際に破壊されるように、遺伝指標的化を介して導入される。
【０１３９】 標的遺伝子トランスフェクトされた細胞は、疾患と関連する表現型について調
べることができる。
【０１４０】 アッセイを介して同定された化合物は、例えば標的遺伝子産物の生物学的機能
を精査し、疾患を緩和するために有用であっても良い。疾患状態が、細胞または
組織中の標的遺伝子発現および／または標的遺伝子産物の全体に低下したレベル
から生ずる場合、標的遺伝子産物と相互作用する化合物が、結合した標的遺伝に
産物の活性を強調または増幅する化合物を含んでも良い。そのような化合物は、
標的遺伝子産物の活性のレベルを有効に増大することを生じ、かくして症状を緩
和するであろう。
【０１４１】 in vitroシステムは、標的TRP遺伝子または拡大したTRP遺伝子を結合可能な化
合物を同定するためにデザインされても良い。そのような化合物は、Dおよび／
またはL型アミノ酸からなるペプチド（例えばランダムペプチドライブラリーの
形態で；例えばLam等, nature, 354: 82-4 (1991)参照）、ホスホペプチド（例
えば部分的に縮重した配向性ホスホペプチドライブラリーの形態で；例えばSong
yang等, Cell, 72: 767-78 (1993)参照）、抗体、および小さな有機若しくは無
機分子を制限することなく含む。同定された化合物は、例えば標的遺伝子タンパ
ク質、好ましくはミュータント標的遺伝子タンパク質を調節する際に有用であっ
ても良く、標的遺伝子タンパク質の生物学的機能を評価する際に有用であっても
良く、正常な標的遺伝子相互作用を破壊する化合物を同定するためにスクリーニ
ングにおいて使用されても良く、またはそれ自体でそのような相互作用を破壊し
ても良い。
【０１４２】 標的遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイ
の原理は、標的遺伝子タンパク質または拡大した標的遺伝子タンパク質と、試験
化合物との反応混合物を、二つの構成成分が相互作用して結合する条件下で十分
な時間で調製し、かくして複合体を形成させ、それを反応混合物中で取り出すお
よび／または検出することを含む。これらのアッセイは、各種の方法で実施でき
る。例えば、そのようなアッセイを実施するための一つの方法は、標的または拡
大した標的遺伝子タンパク質、あるいは試験化合物を固相につなぎ、反応の最後
で固相につながれた標的または拡大した標的遺伝子タンパク質／試験物質複合体
を検出することを含むであろう。そのような方法の一つの実施態様では、標的遺
伝子タンパク質が固相につながれ、つながれていない試験化合物が、直接または
間接にラベルされても良い。
【０１４３】 実際、ミクロタイタープレートが従来利用されている。つながれた構成成分は
、非共有結合または共有結合によって固定化されても良い。非共有結合は、タン
パク質の溶液での固体表面の被覆および乾燥によって単純に達成されても良い。
別法として、タンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体
が、固体表面にタンパク質をつなぐために使用されても良い。前記表面は、事前
に調製されて貯蔵されても良い。
【０１４４】 前記アッセイを実施するために、非固定化構成成分が、つながれた構成成分を
含む被覆表面に添加される。反応が完成した後、形成されたいずれかの複合体が
固体表面に固定化されたままであるような条件で、非反応構成成分を除去する（
例えば洗浄によって）。固体表面につながれた複合体の検出が、数多くの方法で
達成できる。事前に非固定化構成成分が予備ラベルされている場合、表面で固定
化されたラベルの検出は、複合体が形成されたことを示す。事前に非固定化構成
成分が予備ラベルされていない場合、例えば、事前に非固定化された構成成分に
対して特異的なラベル化抗体を使用して、間接的なラベルが、表面につながれた
複合体を検出するために使用できる（次に前記抗体が、ラベル化抗Ig抗体で直接
間かは間接的にラベルされても良い）。
【０１４５】 別法として、反応は液相で実施でき、例えば、溶液中で形成されたいずれかの
複合体をつなぐように、標的遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定化抗体
と、つながれた複合体を検出するために、可能性のある複合体の他の構成成分に
特異的なラベル化抗体を使用して、反応産物は非反応構成成分から分離され、複
合体が検出されても良い。
【０１４６】 上述の方法の一つを通じて、特定の標的遺伝子産物に結合することが示される
化合物は、標的遺伝子タンパク質から生化学的応答を引き出す能力についてさら
に試験できる。
【０１４７】 細胞ベースのシステムが、疾患症状を緩和するように機能する化合物を同定す
るために使用されても良い。例えばそのような細胞システムは、さらされた細胞
におけるそのような疾患症状の緩和を引き出すのに十分な濃度で且つ十分な時間
で、疾患症状を緩和する能力を示す疑いのある化合物にさらされても良い。さら
した後に、疾患細胞表現型の一つ以上が、より正常またはより野生型の非疾患表
現型に類似するように改変されるかどうかを測定するために、細胞を試験する。
【０１４８】 さらに、ここに記載されたもののような、動物ベースの疾患システムが、疾患
症状を緩和することが可能な化合物を同定するために使用されても良い。そのよ
うな動物モデルは、動物に特徴的な疾患または他の表現型を治療するのに有効な
薬剤、医薬、治療、および介入の同定のための試験物質として使用されても良い
。例えば動物モデルは、さらされた動物におけるそのような疾患症状を緩和する
能力を引き出す疑いのある化合物または試薬にさらされても良い。さらすことに
対する動物の応答は、疾患に関連する疾病の逆転を評価することによってモニタ
ーされても良い。さらすことは、ここに記載されるモデル動物の妊娠の間で母親
動物を治療し、それによって疾患または表現型を予防または緩和する化合物また
は試薬に対して胚または胎児をさらすことを含む。新生児、幼児、および成体の
動物をさらすこともできる。
【０１４９】 同様な疾患症状は、各種の病因から生じ得る。例えば、軟骨形成不全症は、欠
損的コラーゲン形成、シグナリング分子（インスリン様増殖因子(IGF)、甲状腺
ホルモン関連タンパク質(PTHrP)、インドヘッジホッグ(Ihh)、骨モルホジェンタ
ンパク質(BMP)）の破壊、または軟骨マトリックスを含む異常なプロテオグリカ
ン（即ちアグリカン）から引き起こされる広い群の骨の奇形を含む。ヒトにおい
て記載される主要な骨の疾患は、骨形成不全症（欠損タイプIコラーゲン合成）
、ムコ多糖症（異常なマトリックスを引き起こすリソソーム貯蔵疾患）、Blomst
rand軟骨形成不全症（PTH/PTHrPホルモンおよび／またはレセプターの欠損）、
多発性骨端形成異常（欠損タイプIXコラーゲン）、およびSchmid骨幹端軟骨形成
不全症（欠損タイプXコラーゲン合成）。欠損した軟骨および／または軟骨性マ
トリックスのため、減少した鉱化作用および骨形成が存在する。用語、骨粗鬆症
は、骨重量の一般的減少を表すために使用され、一次および二次状態を包含する
。一次骨粗鬆症状態は、突発的な若年期、突発的な中年期、閉経後、および老年
期の骨粗鬆症を含む。骨粗鬆症を生じ得る二次状態は、内分泌疾患（上皮小体機
能亢進症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、性機能低下症、先端肥大症、
クッシング病、１型糖尿病、およびアジソン病）、胃腸疾患（吸収不良、ビタミ
ンC、D欠乏症、栄養失調、および肝機能不全）、慢性閉塞性肺炎、ゴーシェ病、
貧血、およびホモシスチン症を含む。軟骨細胞に加えて、骨芽細胞は、骨の形成
に重要な役割を果たす。骨芽細胞は、ホルモン（PTH、ビタミンD、エストロゲン
）、サイトカイン、および増殖因子、並びに分泌コラーゲン性および非コラーゲ
ン性タンパク質に対するレセプターを有する。非コラーゲン性タンパク質は、細
胞接着タンパク質（オステオポンチン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン
）、カルシウム結合タンパク質（オステオネクチン、骨シアロプロテイン）、鉱
化作用に関与するタンパク質（オステオカルシン）、酵素（コラゲナーゼおよび
アルカリホスファターゼ）、増殖因子（IGF-1、TGF-B、PDGF）、並びにサイトカ
イン（婦ロスタグランジン、IL-1、IL-6）を含む。
【０１５０】 さらに、基底物質の凝集したプロテオグリカン（アグレカン、ベルシカン、ニ
ューロカン、およびブレビカン）は、細胞外マトリックスの重要な構成成分であ
る。アグレカンおよびベルシカンに対する最近記載されたリガンド、フィブリン
-1(Aspberg等, J. Biol Chem, 274: 20444-9 (1999))は、軟骨および骨の発育の
際に強力に発現される。
【０１５１】 症状の別の群である腎形成異常および腎発育不全は、子供の慢性腎機能不全の
20%を数える(Cortan等, Robbins Pathologic Basis of Disease, Sauders, Phil
adelphia (1994))。先天性腎疾患は遺伝的であるが、しばしば妊娠の間で生ずる
後天的発育不全の結果である。罹患した患者では、泌尿器の分化が、マウスにお
いて妊娠の8.5から9日で明らかである（ヒトにおける妊娠の22-24日に対応する
）。発育の間で、形成異常は、異常な細胞分化から生ずると仮説立てられており
、嚢形成を引き起こす維持された細胞増殖と細胞を通過する液体分泌の欠損(Gra
ntham等 (1993) Adv Intern Med 38: 409-20)、または細胞外マトリックスの欠
損を導き、次いでそれが上皮分化に影響する(Calvet等, J. Histochem Cytochem
, 41: 1223-31 (1993))。骨および腎臓発達に共通の増殖因子は、インスリン様
増殖因子およびBMPを含む。しかしながら、慢性腎機能不全は、カルシンウム／
リンおよび酸／塩基のバランスの崩れのため、骨形成にも影響するであろう。
【０１５２】 当業者は、与えられた薬剤が、異種の病因によって引き起こされる同様の症状
を緩和する点で有効であることがあることを認識するであろう。かくして与えら
れた薬剤は、各種の疾患の治療に有用であろう。
【０１５３】 疾患症状を緩和する能力を示す薬剤の中では、アンチセンス、リボザイム、お
よび三本鎖分子が挙げられる。そのような分子は、ミュータント標的遺伝子活性
を減少または阻害するようにデザインされても良い。そのような分子の生産およ
び使用のための方法は、当業者に周知である。
【０１５４】 アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAにハイブリダイズし、タンパク質
翻訳を妨げることによってmRNAの翻訳を直接ブロックするように機能する。アン
チセンスDNAに関して、例えば興味ある標的遺伝子ヌクレオチド配列の-10から+1
0の間の、翻訳開始部位から由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好まし
い。
【０１５５】 リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒可能な酵素的RNA分子である。リボザイ
ム機能のメカニズムは、相補適評的RNAに対するリボザイム分子の配列特異的ハ
イブリダイゼーション、引き続きエンドヌクレアーゼ的な切断を含む。リボザイ
ム分子の組成は、標的遺伝子mRNAに相補的な一つ以上の配列を含まなければなら
ず、mRNA切断に関与する周知の触媒配列を含まなければならない。この配列につ
いては、米国特許第5,093,246号を参照。この文献は参考としてここに完全に取
り込まれる。同様に、標的遺伝子タンパク質をコードするRNA配列のエンドヌク
レアーゼ的な切断を特異的且つ有効に触媒する操作されたハンマーヘッド型モチ
ーフリボザイム分子も、本発明の範囲内にはいる。
【０１５６】 いずれかの潜在的なRNA標的内の特異的なリボザイム切断部位は、以下の配列
、GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位に対して興味ある分子をスキャ
ンすることによって始めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的
遺伝子の領域に対応する15から20リボヌクレオチドの短いRNA配列が、オリゴヌ
クレオぢと配列を不適切なものとする、二次構造のような予測される構造的特徴
について評価されても良い。候補配列の適切性はまた、リボヌクレアーゼ保護ア
ッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにつ
いての接近性を試験することによって評価されても良い。
【０１５７】 転写の阻害のための三本鎖形成において使用される核酸分子は、一本鎖である
べきであり、デオキシリボヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチド
の塩基組成は、Hoogsteen塩基ペアルールにより三本鎖形成を促進するようにデ
ザインされなければならず、それは一般的に二本鎖の一方の鎖に存在するプリン
またはピリミジンのそれぞれのかなり大きいストレッチを必要とする。ヌクレオ
チド配列はピリミジンベースでなければならず、それは生成した三本鎖の三つの
関連した鎖の間でTATおよびCGCトリプレットを生ずるであろう。ピリミジンリッ
チの分子は、当該鎖と平行な向きで二本鎖の単一の鎖のプリンリッチ領域に相補
的な塩基を提供する。さらに、例えばG残基のストレッチを含むプリンリッチで
ある核酸分子が選択される。これらの分子は、GCペアの豊富なDNA日本鎖と三本
鎖を形成し、そこではプリン残基の多数が、標的二本鎖の単一の鎖に配置され、
三本鎖中で三つの鎖を横断してGGCトリプレットを生成する。
【０１５８】 別法として、三本鎖形成に対する標的となりうる潜在的な配列は、「スイッチ
バック」核酸分子と称されるものを作製することによって増大されても良い。ス
イッチバック分子は、5'-3'、3'-5'態様を改変する際に合成され、そこでは、そ
れらは二本鎖の一方の鎖と、次いで他方の鎖と塩基対を形成し、二本鎖の一方の
鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなりのストレッチに対する
必要性を除去する。
【０１５９】 ここに記載されるアンチセンス、リボザイム、および／または三本鎖分子は、
正常およびミュータント標的遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるmRNAの
転写（三本鎖）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を減少または
阻害しても良いことが考慮される。標的遺伝子活性の実質的に正常なレベルを維
持することを確保するために、正常な活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコー
ドし発現する核酸分子を、使用されるアンチセンス、リボザイム、または三本鎖
散文鎖での治療のいずれかに感受性である配列を含まない細胞に導入しても良い
。別法として、細胞または組織標的遺伝子活性の必要レベルを維持するために、
細胞または組織中に正常な標的遺伝子タンパク質を共投与することが好ましいで
あろう。
【０１６０】 本発明のアンチセンスRNAとDNA、リボザイム、および三本鎖分子は、DNAとRNA
分子の合成について当該技術分野で周知の方法によって調製されても良い。これ
らは、例えば固相ホスホロアミダイト化学合成のような、当該技術分野で周知の
オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成
するための方法を含む。別法としてRNA分子は、アンチセンスRNA分子をコードす
るDNA配列のin vitroとin vivoでの転写によって生産されても良い。そのような
DNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターのような適切なRNAポリメラ
ーゼプロモーターを取り込んだ広範囲のベクター内に取り込まれても良い。別法
として、使用されるプロモーターに依存して構成的にまたは誘導可能にアンチセ
ンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物が、細胞系内に安定に取り込まれて
も良い。
【０１６１】 DNA分子に対する各種の周知の修飾が、細胞内安定性および半減期を増大する
手段として導入されても良い。考え得る修飾は、分子の5'および／または3'末端
に対するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、
あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よ
りもむしろ、ホスホロチオアートまたは２’O-メチルの使用を制限することなく
含む。
【０１６２】 標的遺伝子タンパク質に対して特異的である、およびその活性を妨げる両者の
抗体が、標的遺伝子機能を阻害するために使用されても良い。拡大した標的遺伝
子タンパク質に特異的である抗体、および当該タンパク質の独特の相互作用を妨
げる、特にトリヌクレオチド拡大と関連する機能の新たな増大に寄与可能な機能
を妨げる抗体が、拡大した標的遺伝子機能を阻害するために使用されても良い。
特に興味のあるものは、TRPの拡大したトリヌクレオチド領域に向けられた抗体
である。そのような抗体は、タンパク質自体、またはタンパク質の部分に対応す
るペプチドに対して標準法を使用して生産されても良い。そのような抗体は、ポ
リクローナル、モノクローナル、Fab断片、一本鎖抗体、キメラ抗体等を制限す
ることなく含む。
【０１６３】 標的遺伝子タンパク質が細胞内にあり、抗体全体が使用される場合、中和抗体
が好ましい。しかしながら、リポフェクチンリポソームが、細胞内の標的遺伝子
エピトープに結合する抗体またはFab領域の断片を輸送するために使用されても
良い。抗体の断片が使用される場合、標的または拡大した標的タンパク質結合ド
メインに結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に
結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが
使用されても良い。そのようなペプチドは化学的に合成されても良く、または当
該技術分野で周知の方法を使用して組換えDNA法により生産されても良い（例え
ば、Creighton, Proteins : Structures and Molecular Principles (1984) W.H
. Freeman, New York 1983, 上記参照；およびSambrook等, 1989, 上記参照）。
別法として、細胞内標的遺伝子エピトープに結合する一本鎖中和抗体が投与され
ても良い。そのような一本鎖抗体は、例えばMarasco等, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA, 90: 7889-93 (1983)に記載されたもののような方法を利用することによ
って、標的細胞集団内に一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現するこ
とによって投与されても良い。
【０１６４】 TRPまたは拡大したTRPの一つ以上の細胞外ドメインに対して特異的であり、そ
の活性を妨げる抗体は、疾患を治療する際に特に有用である。そのような抗体は
、血流から直接標的ドメインに接近可能であるため、特に有効である。ペプチド
投与のために適した以下に記載される投与法のいずれかが、作用部位に阻害標的
遺伝子抗体を有効に投与するために使用されても良い。
【０１６５】 標的遺伝子タンパク質をコードするRNA配列は、疾患症状が緩和されるような
標的遺伝子タンパク質のレベルを生産するのに十分な濃度で、疾患症状を示す患
者に直接投与されても良い。
【０１６６】 患者は、遺伝子置換治療によって治療されても良い。正常な標的遺伝子、また
は標的遺伝子機能を有する正常な標的遺伝子タンパク質の生産に向けた遺伝子の
一部の一つ以上のコピーが、リポソームのような細胞内にDNAを導入する粒子に
加えて、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスを制限す
ることなく含むベクターを使用して細胞内に挿入されても良い。さらに、上述の
ような方法が、ヒト細胞内に正常な標的遺伝子配列の導入のために使用されても
良い。
【０１６７】 次いで、遺伝子配列を発現する正常な標的遺伝子を含む細胞、好ましくは自己
細胞が、疾患症状の緩和を可能にする位置で患者内に導入または再導入されても
良い。
【０１６８】 標的または拡大した標的遺伝子発現、合成、および／または活性を阻害する同
定された化合物は、疾患を治療または緩和するための治療上の有効量で患者に投
与できる。治療上の有効量は、疾患の症状の緩和を引き起こすのに十分な化合物
の量を指す。
【０１６９】 そのような化合物の毒性および治療上の効力は、例えばLD50（集団の50%の致
死量）およびED50（集団の50%の治療上の有効量）を測定するために、細胞培養
物または実験動物において標準的な医薬的方法によって測定できる。速成と治療
効果の間の投与割合は治療指数であり、それはLD50／ED50の比として表される。
大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物が使用され
る場合、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小化し、それによって副作用を減
少するために、影響される組織の部位にそのような化合物を標的化するデリバリ
ーシステムをデザインするように注意が払われなければならない。
【０１７０】 細胞培養物アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用
のための投与範囲を処方する際に使用できる。そのような化合物の投与量は、ほ
とんどまたは全く毒性を有さないED50を含む循環濃度の範囲内に好ましくは存す
る。投与量は、使用される投与形態および使用される投与経路に依存してこの範
囲内で変化しても良い。本発明の方法において使用されるいずれかの化合物につ
いて、治療上の有効量は、細胞培養アッセイから初めに見積もることができる。
投与量は、細胞培養物で測定されたIC50（即ち、症状の最大の半分の阻害を達成
する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデ
ルにおいて処方されても良い。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量を
より正確に測定するために使用できる。血漿濃度は、例えば高速液体クロマトグ
ラフィーによって測定されても良い。
【０１７１】 本発明に従った使用のための製薬組成物は、一つ以上の生理学的に許容可能な
担体または賦形剤を使用して、従来法において処方されても良い。かくして、前
記化合物および生理学的に給与応可能な塩と溶媒が、吸入または通気（口または
鼻のいずれかを通じて）または経口、口内、非経口、皮下、腹膜内、静脈内、胸
膜内、眼内、動脈内、および直腸内の投与による投与について処方されても良い
。製薬組成物は、化合物の活性を増強する他のプロドラッグと共に投与されても
良く、任意に他の治療成分を含んでも良いことが理解される。
【０１７２】 経口投与のために、製薬組成物は、結合剤（例えば事前ゼラチン化トウモロコ
シデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース
）；フィラー（例えばラクトース、マイクロクリスタリンセルロースまたはリン
酸水素ナトリウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたは
シリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコ
ラート）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）のような、製薬学的
に許容可能な賦形剤で従来手段によって調製された、例えば錠剤またはカプセル
の形態を採用しても良い。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によって被覆され
ても良い。経口投与のための液体調製物は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液
の形態を採用しても良く、またはそれらは使用前に水若しくは他の適切なビヒク
ルでの構成用の乾燥物質として存在しても良い。そのような液体調製物は、懸濁
剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；
乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド
油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画化植物油）および防腐剤（例え
ばエチル若しくはプロピル-p-ヒドロキシベンゼンまたはソルビン酸）のような
、製薬学的に許容可能な添加剤で従来手段により調製されても良い。前記調製物
はまた、適当にバッファー、塩、香料、着色料、および甘味剤を含んでも良い。
【０１７３】 経口投与のための調製物は、活性化合物の制御された放出を与えるように適切
に処方されても良い。
【０１７４】 口内投与のために、前記組成物は、従来法によって処方された錠剤またはロゼ
ンジの形態を採用しても良い。
【０１７５】 吸入による投与のために、本発明に従った使用のための化合物は、ジクロロジ
フルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、
二酸化炭素、または他の適切な基体といった適切な噴射剤の使用で、加圧パック
またはネブライザーからのエアゾールスプレー提供物の形態で従来通り輸送され
る。加圧エアゾールの場合、投与量単位は、一定量を輸送するためにバルブを備
えることによって決定されても良い。前記化合物と、ラクトースまたはデンプン
のような適切な粉体ベースの粉体混合物を含む、吸入器または通気器における使
用のための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが処方されても良い。
【０１７６】 前記化合物は、例えばボーラス注射または継続的点滴といった注射によって全
身性の投与のために処方されても良い。注射のための製剤は、添加された防腐剤
と共に、例えばアンプルまたは複数投与容器といった単位投与量形態で提供され
ても良い。前記組成物は、油性または水性ビヒクルにおける懸濁液、溶液または
エマルションのような形態を採用しても良く、懸濁剤、安定剤および／または分
散剤のような製剤化試薬を含んでも良い。別法として前記活性成分は、使用前に
、例えば滅菌した病原体フリーの水といった適切なビヒクルでの構成用の粉体形
態で存在しても良い。
【０１７７】 前記化合物は、例えばココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐薬
ベースを含む、坐薬または維持浣腸のような直腸組成物において製剤化されても
良い。経口消化は、いずれかの医薬を摂取する最も容易な方法だろう。そのよう
な投与経路は、一般的に単純で直接的であり、しばしば患者の立場から投与の少
なくとも不便または不快な経路である。しかしながらこれは、タンパク質および
他の生物学的活性組成物を含む、多くの物質に対する厳しい環境である胃を通じ
て、物質を通過することを含む。胃の酸性で、加水分解性で、タンパク質溶解性
の環境は、後の同化作用のためにタンパク質性物質をアミノ酸およびオリゴペプ
チドに消化するために有効に進化しているので、もし単純に経口で摂取した場合
、広範囲の生物学的活性タンパク質性物質の大半または全てが、小腸において体
内に摂取されるように、胃を通過して生き残らないことは驚くに値しない。この
ため、多くのタンパク質性医薬は、しばしば皮下、筋肉内または静脈内の注射と
いった全身性の別の方法で摂取されなければならない。
【０１７８】 製薬組成物はまた、各種のバッファー（例えばトリス、酢酸、リン酸）、溶解
剤（例えばTween、Polysorbate）、ヒト血清アルブミンのような担体、防腐剤（
チメロゾール、ベンジルアルコール）およびアスコルビン酸のような抗酸化剤を
、製薬学的活性を安定化するために含んでも良い。安定剤は、tween-20、tween-
80、NP-40またはTriton X-100のような界面活性剤であっても良い。EBPは、伸長
した器官に亘る患者に対する制御された投与のためのポリマー状化合物の特定の
調製物中に取り込まれても良い。製薬組成物における構成成分のより詳しい概略
は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, A. R. Gennaro編, Mack P
ublishing, Easton, Pa. (1990)に見出される。
【０１７９】 上述の製剤に加えて、前記化合物はまた、貯蔵調製物として製剤化されても良
い。そのような長期的作用製剤は、移植（例えば皮下または筋肉内または筋肉内
注射によって投与されても良い。かくして例えば、前記化合物は、適切なポリマ
ー状または疎水性物質（例えば許容可能なオイル中のエマルションとして）また
はイオン交換樹脂、またはあまり可溶性ではない複合体、例えばあまり可溶性で
はない塩として製剤化されても良い。
【０１８０】 前記組成物は、所望であれば、活性成分を含む一つ以上の単位投与量形態を含
むパックまたは廃棄可能な容器に実装されても良い。前記パックは、例えばブリ
スターパックのような金属またはプラスチックホイルを含んでも良い。前記パッ
クまたは廃棄可能な容器は、投与のための説明書を添付しても良い。
【０１８１】 各種の方法が、TRPと関連する疾患状態を診断するために使用されても良い。
特に、例えば標的遺伝子ミューテーションの存在の検出、または標的遺伝子mRNA
の過剰若しくは過小発現のそれぞれの検出のための試薬が使用されても良い。
【０１８２】 ここに記載される方法は、疾患の症状または疾患を形成する危険を示す患者を
診断するために、例えば臨床試験において従来使用されている、ここに記載され
る少なくとも一つの特異的遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を含む事前実装診
断キットを使用することによって実施されても良い。
【０１８３】 遺伝子が発現されるいずれかの細胞タイプまたは組織、好ましくは単核細胞、
内皮細胞、または平滑筋細胞が、以下に記載される診断において使用されても良
い。
【０１８４】 分析される細胞タイプまたは組織から得られたDNAまたはRNAは、当業者に周知
である方法を使用して容易に単離されて良い。診断方法はまた、核酸精製が必要
でないような、生検または切除物から得られた患者の組織の組織切片（固定化お
よび／または凍結された）に直接依存するin situで実施されても良い。核酸試
薬は、そのようなin situの方法のためのプローブおよび／またはプライマーと
して使用されても良い（例えばNuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols
and Applications, Raven Press, N.Y. (1992)参照）。
【０１８５】 RNA若しくはDNAのいずれかの遺伝子ヌクレオチド配列は、例えば、疾患関連遺
伝子構造および発現を検出するための生物学的サンプルのハイブリダイゼーショ
ンまたは増幅アッセイにおいて使用されても良い。そのようなアッセイは、サザ
ン若しくはノーザン分析、制限断片長多型アッセイ、一本鎖構造多型分析、in s
ituハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析を制限
することなく含む。つまり、そのような特徴点は、例えば点突然変異、挿入、欠
失、染色体再配置、および／または遺伝子発現の活性化若しくは不活性化を含ん
でも良い。
【０１８６】 遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、分析され
る細胞タイプまたは組織から由来する核酸を、一つ以上のラベル化核酸試薬と、
興味ある核酸分子内の相補的配列に対するこれらの試薬の特異的アニリングのた
めの好ましい条件下で接触させてインキュベートすることを含んでも良い。好ま
しくはこれらの核酸試薬の長さは、少なくとも9から30ヌクレオチドである。イ
ンキュベーションの後、全ての非アニール化核酸が、核酸：フィンガープリント
分子ハイブリッドから除去される。ハイブリダイズしたフィンガープリント組織
からの核酸の提供が、そのような分子が存在するのであれば検出される。そのよ
うな検出スキームを使用して、興味ある組織または細胞タイプから得た核酸が、
例えば膜のような固体の支持体、またはミクロタイタープレートまたはポリスチ
レンビーズ上のもののようなプラスチック表面に固定化されても良い。この場合
、インキュベーションの後、アニリングしないラベル化核酸試薬は容易に除去さ
れる。残余のアニリングしたラベル化核酸試薬の検出は、当業者に周知の標準法
を使用して達成される。
【０１８７】 遺伝子特異的核酸分子の検出のための別の診断方法は、例えばPCR(Mullis, 米
国特許第4,683,302 (1987)に示された実施態様)、リガーゼ連鎖反応(Barany, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189-93 (1991))、自己維持増幅システム(Kwoh
等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173-77 (1989))、Q-Beta Replicase (L
izardi, P. M.等, Bio/Technology, 6: 1197 (1988))、およびいずれかの他の核
酸増幅法、引き続き当業者に周知の方法を使用する増幅分子の検出による増幅を
含んでも良い。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少数で存在す
る場合に、核酸分子の検出のため特に有用である。
【０１８８】 そのような検出スキームの一つの実施態様では、cDNA分子が興味あるRNA分子
から得られる（例えばcDNAへのRNA分子の逆転写によって）。そのようなRNAが単
離される細胞タイプまたは組織は、単核細胞、内皮細胞および／または平滑筋を
制限することなく含む、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されていること
が知られているいずれかの組織を含む。次いで、cDNA内の配列は、PCR増幅反応
等のような核酸増幅反応のためのテンプレートとして使用される。この方法の逆
転写および核酸増幅工程において合成開始試薬（例えばプライマー）として使用
される核酸試薬は、ここに記載される遺伝子核酸試薬の中から選択されても良い
。そのような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも15-30ヌクレオチドである
。増幅産物の検出のため、核酸増幅は、放射性活性または非放射性活性ラベル化
ヌクレオチドを使用して実施されても良い。別法として、十分な増幅産物が、標
準的なエチジウムブロマイド染色、またはいずれかの他の適切な核酸染色法によ
って視覚化されても良い。
【０１８９】 野生型、ミュータント、および拡大した遺伝子ペプチドに対して向けられた抗
体も、疾患診断および予後として使用されても良い。そのような診断法は、遺伝
子タンパク質発現のレベルの異常を検出しても良く、またはフィンガープリント
遺伝子タンパク質の構造および／または組織、細胞、または細胞より小さい配置
の異常を検出しても良い。構造的差異は、例えば正常なフィンガープリント遺伝
子タンパク質に対する、ミュータントフィンガープリント遺伝子タンパク質のサ
イズ、電気的陰性度、または抗原性の差異を含んでも良い。
【０１９０】 分析される組織または細胞タイプから得たタンパク質は、ウエスタンブロット
分析を制限することなく含む、当業者に周知である方法を使用して容易に検出ま
たは単離されても良い。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な
説明については、Sambrook等, (1989), 上記参照、第18章を参照。ここで使用さ
れるタンパク質検出法および単離法は、例えばHarlowおよびLane (Antibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor, New York (1988))に記載されたようなものであっても良い。
【０１９１】 野生型、ミュータント、または拡大した遺伝子ペプチド分子の検出のための好
ましい診断方法は、例えばフィンガープリント遺伝子ペプチドが、抗フィンガー
プリント遺伝子特異的ペプチド抗体と相互作用することによって検出されるイム
ノアッセイを含んでも良い。
【０１９２】 例えば、本発明で有用な抗体または抗体の断片は、野生型、ミュータント、ま
たは拡大した遺伝子ペプチドの存在を質的または量的に検出するために使用され
ても良い。これは例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出
と結合した、蛍光的にラベルされた抗体（以下参照）を使用する免疫蛍光法によ
って達成できる。そのような方法は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞
表面に発現された場合、特に好ましい。
【０１９３】 本発明において有用な抗体（またはその断片）は、さらにフィンガープリント
遺伝子ペプチドのin situ検出のため、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡のように
組織化学的に使用されても良い。in situ検出は、患者から組織化学的標本を取
り出し、本発明のラベル化抗体をそれに適用することによって達成されても良い
。抗体（または断片）は好ましくは、生物学的サンプル上にラベル化抗体（また
は断片）をかぶせることによって適用される。そのような方法の使用を通じて、
フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在だけではなく、試験組織中の配置も測
定可能である。本発明を使用して、当業者は、各種の組織化学的方法（染色法の
ような）のいずれかを、そのようなin situ検出を達成するために修飾できるこ
とを容易に予測できるであろう。
【０１９４】 野生型、ミュータント、または拡大したフィンガープリント遺伝子ペプチドに
対するイムノアッセイは典型的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定可
能な検出可能であるラベル化抗体の存在下で、生物学的液体、組織抽出物、新た
に回収された細胞、組織培養物中でインキュベートされている細胞のような生物
学的サンプルをインキュベートし、当該技術分野で周知の数多くの方法のいずれ
かによって結合抗体を検出することを含む。
【０１９５】 生物学的サンプルは、ニトロセルロースのような固相支持体または担体、ある
いは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化可能な他の固体の支持体と
接触され固定化されても良い。次いで前記支持体は適切なバッファーで洗浄され
、検出可能にラベルされた遺伝子特異的抗体で処理されても良い。次いで固相の
支持体は、非結合抗体を除去するために第二のバッファーでの洗浄を受けても良
い。次いで、固相の支持体に結合したラベルの量が、従来法によって検出されて
も良い。
【０１９６】 「固相の支持体または担体」は、抗原または抗体を結合可能であるいずれかの
支持体を意味する。周知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプ
ロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、中性または変
性セルロース、ポリアクリルアミド、はんれい岩、およびマグネタイトを含む。
担体の性質は、ある程度可溶性であっても、本発明のために不溶性であっても良
い。支持体物質は、結合分子が抗原または抗体に結合可能であれば、実質的にい
ずれの考え得る構造的形態を有していても良い。かくして支持体の構造は、ビー
ズのように球状、または試験チューブの内部表面またはロッドの外部的表面のよ
うにシリンダー状であっても良い。別法として、前記表面は、シート、試験片等
のような平坦であっても良い。好ましい支持体はポリスチレンビーズを含む。当
業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切な担体を知見しており
、または通常の実験を使用することによって同種のものを確認できるであろう。
【０１９７】 野生型、ミュータント、または拡大したフィンガープリント遺伝子ペプチド抗
体の所定の多くのものの結合活性は、周知の方法に従って測定されても良い。当
業者は、通常の実験を使用することによって欠く測定のための操作可能な最適な
アッセイ条件を決定できるであろう。
【０１９８】 遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能にラベルできる方法の一つは、酵素に同
種のものを結合し、酵素イムノアッセイ(EIA)でそれを使用することによる(Voll
er, Ric Clin Lab, 8: 289-98 (1979) ["The Enzyme Immunosorbent Assay (ELI
SA)", Diagnostic Horizons 2: 1-7, 1978, Microbiological Associates Quart
erly Publication, Walkersville, Md.]; Voller等, J. Clin. Pathol., 31: 50
7-20 (1978); Bulter, Meth. Enzymol., 73: 482-523 (1981); Maggio(編), Enz
yme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1980); Ishikawa等, (編) En
zyme Immunoassay, Igaku-Shoin, Tokyo (1981))。応対に結合される酵素は、例
えば分光学的、蛍光的または視覚的手段によって検出可能な化学的部分を生産す
る態様で、適切な基質、好ましくは発光性基質と反応されるであろう。抗体を検
出可能にラベルするために使用できる酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタ
フィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、アルファ-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオー
スリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ
、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを制限するこ
となく含む。前記検出は、酵素に対する発色性基質を使用する色素形成的方法に
よって達成できる。検出はまた、単純に好ましいスタンダードとの比較で、基質
の酵素的反応の程度の視覚的比較によっても達成されて良い。
【０１９９】 検出はまた、各種の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成されても良
い。例えば、抗体または抗体断片を放射性活性的にラベルすることによって、ラ
ジオイムノアッセイ(RIA)の使用を通じて野生型、ミュータント、または拡大し
たペプチドのフィンガープリント遺伝子を検出することが可能である（例えば、
Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course
on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986)。放
射性同位元素は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用す
る手段、またはオートラジオグラフィーによって検出できる。
【０２００】 抗体を蛍光化合物でラベルすることも可能である。蛍光的にラベルされた抗体
が、正しい波長の光にさらされた場合、その存在は蛍光により検出できる。最も
一般的に使用される蛍光ラベリングの中では、フルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-
フタルデヒド、およびフルオレスカミンが挙げられる。
【０２０１】 抗体は、152Euまたは他のランタニドシリーズのような蛍光放射金属を使用し
て検出可能にラベルもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペント酢
酸(DTPA)またはエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)のような金属キレート基を使
用して抗体に結合できる。
【０２０２】 抗体はまた、化学発光化合物にそれを結合することによって検出可能にラベル
できる。化学発光タグ化抗体の存在は、化学反応の過程の間で生じる発光の存在
を検出することによって測定される。特に有用な化学発光ラベリング化合物の例
は、ルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミ
ダゾール、アクリジニウム塩、およびオキサラートエステルである。
【０２０３】 同様に、生物発光化合物が、本発明の抗体をラベルするために使用されても良
い。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の抗力を増大する生物学的シス
テムで見出される化学発光のタイプである。生物発光タンパク質の存在は、発光
の存在を検出することによって測定される。ラベリングの目的のための重要な生
物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【０２０４】 この出願を通じて、各種の文献、特許、および印刷された特許出願が、時化さ
れた引例によって参照される。この出願で参照されたこれらの文献、特許および
印刷された特許明細書の開示は、この発明が属する従来技術をより十分に記載す
るために、本開示に参考としてここで取り込まれる。
【０２０５】 以下の実施例は、本発明を説明するためだけに企図され、いかなる態様でも本
発明を制限するために構成されるものではない。
【０２０６】
【実施例】
実施例１：プラスミドライブラリーからの直接構築物の構築 ラムダＺＡＰ（登録商標）システムを用いたゲノムライブラリーを以下の通り
調製した。胚性幹細胞を、１００ｍｍ組織培養プレートで増殖させた。胚性幹細
胞のコンフルーエント１００ｍｍプレートへの５ｍｌの溶解バッファー（１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ及び１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を添加すること
により、これらのＥＳ細胞から、高分子量ゲノムＤＮＡを単離した。ついで細胞
を数時間又は完全に溶解するまで６０℃でインキュベートした。溶解細胞より、
穏やかなフェノール：クロロホルム抽出とエタノール沈澱を数回繰り返して、ゲ
ノムＤＮＡを精製した。
【０２０７】 ゲノムＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分消化し、約５−２０ｋｂの断片を生成さ
せた。KlenowＤＮＡポリメラーゼの存在下、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの添加によりこ
れらの断片の末端を部分的に埋め、ゲノム断片の不適合末端を作製した。ついで
５から１０ｋｂのサイズ断片をアガロースゲル電気泳動（１×ＴＡＥ、０．８％
ゲル）により精製した。ついで、QIAquick ゲル抽出キット(Qiagen,Inc.,Valenc
ia,CA)を用いて切り取ったアガロース片からＤＮＡを単離した。
【０２０８】 ゲノム断片を、XhoIで切断し、ｄTTP、ｄCTP及びKlenowＤＮＡポリメラーゼを
用いて部分的に埋めておいたラムダＺＡＰ（登録商標）IIベクター（Stratagene
,Inc.,La Jolla,CA）中へライゲーションを行なった。ライゲーションの後、ラ
ムダパッケージングミックス（Gigapack III gold,Stratagene.,Inc.,La Jolla,
CA）ＤＮＡをパッケージし、力価を測定した。
【０２０９】 環状ファージミドＤＮＡは、Ｍ１３ヘルパーファージ、ExAssist（Stratagene
,Inc.）の存在下で、適当な細菌株上（XL-1 Blue MRF1,Stratagene,Inc.）でラ
ムダクローンを増殖させることにより、ラムダライブラリーから作製された。具
体的には、約１００，０００ラムダクローンを１０−１００倍過剰の細菌とヘル
パーファージとともに、３７℃２０分間インキュベートした。１ｍｌのLB培地＋
１０ｍMのＭｇＳＯ4を、各切除反応物に添加し、それを３７℃で一晩振とうしな
がらインキュベートした。９６ウェルディープ−ウェルブロックで一度に、典型
的には２４−９６のこれらの反応を、セットアップした。次の朝、ブロックを６
５℃に１５分間加熱し、細菌とラムダファージを殺した。１５分間約３０００ｇ
の遠心分離により、細菌破砕物を除去した。環状ファージミドＤＮＡを含む上清
を、保持し、プラスミドＰＣＲ実験で直接使用した（プラスミドＰＣＲ実験につ
いて実施例９と１０参照）。
【０２１０】 上記ファージミドＤＮＡのプールを、ロングレンジＰＣＲと、既知の配列（図
１に示されている）に基づき、上述の如く選ばれた、”アウトワードポインティ
ング”オリゴを用いて、対象の特異的遺伝子について、スクリーニングした。Ｐ
ＣＲ反応物は、２μｌのプールファージミドＤＮＡサンプル、３μｌの１０×Ｐ
ＣＲバッファー３（Boehringer Mannheim）、１．１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰｓ
、５０ｎＭプライマー、０．３μｌのEXPAND Long Template PCR Enzyme Mix (B
oehringer-Mannheim)及び３０μｌのＨ2Ｏを含む。サイクル条件は９４℃２分間
（１サイクル）；９４℃１０秒間、６５℃３０秒間、６８℃１５秒間（１５サイ
クル）；９４℃１０秒間、６０℃３０秒間、６８℃１５秒間、各付加的サイクル
についてプラス２０秒間増加（２５サイクル）；６８℃７分間（１サイクル）及
び４℃でホールドであった。
【０２１１】 ＰＣＲ反応物の産物を、１×ＴＡＥバッファーを含むアガロースゲルでの電気
泳動により分離し、エチジウムブロミドとＵＶ光で可視化した。ロングレンジＰ
ＣＲの成功を示すあらゆる大きな断片をゲルから切りだし、QIAquick PCR 精製
キット（Qiagen）を用いて精製した。
【０２１２】 ＰＣＲ断片の制限マップの必要性をなくすために、以下のライゲーション独立
クローニングストラテジーを用いた。対象のロングレンジＰＣＲ断片を、QIAqui
ck PCR精製キット（Qiagen,Inc.,Santa Clarita,California）を用いて"精製"し
た。０．１−２μｇの断片；２μｌのＮＥＢ（New Endland BioLabs）Buffer 4;
１μｌの２ｍＭ ｄＴＴＰ、６単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、全
量を２０μｌとするＨ2Ｏを混合し、２５℃３０分間インキュベートすることに
より、ＰＣＲ断片の一本鎖化末端を生成させた。ポリメラーゼを、７５℃２０分
間加熱することにより不活性化した。プラスミドベクターｐＤＧ２を、SacIとSa
cII（図２Ａに示されたｐＤＧ２）で、ユニークな制限部位で消化し、上述のよ
うにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで各反応物を処理することにより一本鎖化末端を、
Neorの選択可能なマーカー断片上でも作製した。図１に示されたベクターを、ロ
ングレンジＰＣＲ断片上でそれに相補する一本鎖末端で調製した。
【０２１３】 ついで、２工程クローニングストラテジー、又は４ウェイシングル１工程プロ
トコールを用いて、ベクターと断片をアセンブルして構築物とした。要約すると
、１０ｎｇのＴ４処理Ｎｅｏrカセット、１μｌのＴ４処理ＰＣＲ断片、０．２
μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、０．３μｌの０．５Ｍ ＮａＣｌと４μｌとするＨ2 Ｏを含む反応物を６５℃に加熱し、約４５分以上室温まで冷却させた。ついで
混合物は、サブクローニング効率ＤＨ５−αコンピテント細胞に形質転換した。
【０２１４】 実施例２：ファージライブラリーからの構築物の作製 以下の通り、ラムダファージでマウス胚性幹細胞ライブラリーを調製した。Sa
uAI部位でのＤＮＡの部分切断によりゲノムＤＮＡから、ゲノムライブラリーを
構築し、約２０ｋｂの長さのゲノム断片を得た。これらのＤＮＡ断片の末端配列
を、ｄＧＴＰとｄＡＴＰの存在下でKlenow酵素を用いて部分的に埋め、断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて、ｄTTPとdCTPの存在下、Klenowを用いて部分的に埋
めておいた適当なラムダクローニングベクター、例えばラムダFixII（Stratagen
e.,Inc.,La Jolla,Caligornia）のXhoI部位にライゲーションした。あるいは、
部分的に消化したゲノムDNAを、ショ糖勾配と、選択される約２０ｋBの配列を用
いてサイズ選択した。富化分画を、BamHIカットしたラムダベクター、例えばラ
ムダDatsh II(Stratagene.,Inc.,La Jolla,California)中にクローン化した。
【０２１５】 ライブラリーを、各プレートに１，０００クローンを含むように１，１５２の
プレートにプレーティングした。こうして、合計１１０万個のクローン（８ゲノ
ムに相当）をプレーティングした。
【０２１６】 各プレートに４ｍｌのラムダ溶出バッファー（１０ｍM ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ
トリス−ｐＨ８．０）を添加し、３乃至５時間室温でインキュベートすること
により、各プレートからファージを溶出した。インキュベーションの後、各プレ
ートから２ｍｌのバッファーを集め、９６ディープウェルプレート（Costar,In.
）の１つのウェルに入れた。９６ウェルプレート１２枚を充填し、”サブプール
ライブラリー”とした。１２サブプールプレートを合わせてプールライブラリー
の１プレートを形成した。
【０２１７】 サブプールライブラリーを用いて、新しい９６ウェルプレートの１つのウェル
中に、１２の異なるサブプールウェルの１００μｌを入れることにより”プール
ライブラリー”を作製した。
【０２１８】 対象の遺伝子をＰＣＲ増幅することが知られていた一対のオリゴヌクレオチド
を用いて、”ラージプールライブラリー”の９６プールからの上清を増幅した。
０．５単位のAmplitaq Gold（登録商標）（Perkin Elmer）、１μＭの各オリゴ
ヌクレオチド、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２μｌの１乃至５希釈のプール（又は
サブプール）上清、５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）
及び１，５ｍＭ又は１．２５ｍＭのＭｇＣｌ2の存在下でＰＣＲを行なった。サ
イクル条件は９５℃８分間（１サイクル）；９５℃３０秒間、６０℃３０秒間、
７２℃４５秒間（５５サイクル）；７２℃７分間（１サイクル）及び４℃でホー
ルドであった。遺伝子に応じて、約３から１２のプールが、実施例１に記載され
た如くアガロースゲルで同定されるようなポジティブシグナルを得た。さらなる
精製が必要な場合（すなわち増幅の後、クリアなシグナルが存在しない場合）、
プールを構成する１２サブプールを、同じプライマーを用いて増幅に供し、単一
のサブプール（１０００クローン）を同定した。
【０２１９】 フランキング断片の生成 上述のごとく、ノックアウト構築物は、ポジティブ選択マーカーに隣接した、
ターゲット遺伝子に相同なＤＮＡ配列の２つのブロックを含む。ロングレンジＰ
ＣＲは、実施例２で記載したようにポジティブに同定されたラムダクローンのプ
ールから行なった。各断片は、一つのタイプの塩基を欠く所定の配列とベクター
上の所定の配列に相補的な配列を有する一対のオリゴヌクレオチドを用いて、生
成させた。得られた断片は、１から５ｋｂの間であった。第３の断片は、５ｋｂ
より長く、やはり適当なオリゴヌクレオチドを用いて生成される。ついでこの第
３の断片を用いて、ノックアウトされた遺伝子に近くであるがベクターの外側の
ＤＮＡ配列を得た。
【０２２０】 実施例３：２工程クローニング−一般的手順 ｐＤＧ２プラスミドベクター（図２Ａ）は、ユニークな制限部位SacIIとSacI
を含む。適当な一本鎖化アニーリング部位は、制限酵素SacIIとSacIのいずれか
でｐＤＧ２ベクターを消化し、反応物を上記のごとくＴ４ＤＮＡポリメラーゼと
ｄＴＴＰで処理することにより生成した。各ベクターについて４つの反応物を、
ミクロタイタープレートでセットアップした。反応物は、１μｌの下記のいずれ
かを含んでいた：（１）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理断片；（２）Ｔ４処理断片
反応物の１：１０希釈物；（３）Ｔ４処理断片の１：１００希釈物；又は（４）
Ｈ2Ｏ（挿入なしの対照）。ミクロタイタープレートをシールし、６５℃に加熱
した２つの温度ブロックの間に置き、３０乃至４５分間、室温でゆっくり冷却さ
せた。
【０２２１】 ついで、氷上にミクロタイタープレートを置き、各ウェルにサブクローニング
効率コンピテント細胞２０−２５μｌを添加した。氷上で２０−３０分間、プレ
ートをインキュベートした。マイクロタイタープレートは、ついで、４２℃に加
熱した２つの温度ブロックの間に２分間置き、ついで氷上に２分間置いた。１０
０μｌのＬＢを各ウェルに添加し、パラフィルムでプレートをカバーし、３０−
６０分間３７℃でインキュベートした。各ウェルの全成分を、１つのＬＢ−Ａｍ
ｐプレートに置き、３７℃に一晩インキュベートした。
【０２２２】 約１２−２４の間のコロニーを、挿入なしの対照より少なくとも２−４倍以上
のコロニーを有していたプレートから拾った。コロニーを、ディープウェルプレ
ートで３７℃一晩増殖させ、ついでQiagen mini-prep kitを用いて、プラスミド
ＤＮＡを抽出した。
【０２２３】 プラスミドＤＮＡをNotIとSalI酵素で消化した。図２Ａに示されているように
、NotI/SalI消化物は、クローニング部位３と４を含む大きな断片と、クローニ
ング部位１と２とＮｅｏr遺伝子を含むより小さな断片を生成するであろう。消
化の後、反応物は、０．２μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含む０．８％のア
ガロースゲル上で流した。挿入の無いものについて、２つのバンドが存在し、１
つは１９７５ｂｐであり１つは２７９３ｂｐであった。挿入断片が存在したとき
、それらは、アニーリング部位１/２または部位３/４のいずれかに断片（挿入１
又は２）も含むであろうから、これらのバンドの少なくとも１つが、より大きく
なるであろう。挿入バンドは切り出され、QIAquick ゲル抽出キットで処理され
た。１μｌの１０×ライゲースバッファー（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．５、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、２５μ
ｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）、１μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ、１−２μｌ断片（
部位３/４バンド）、５μｌの部位１/２バンド及び１０μｌとするＨ2Ｏを含む
、第２のライゲーション反応を行なった。部位３/４断片又は部位１/２断片を水
で置換する対照もセットアップした。反応物を１乃至２時間、室温でインキュベ
ートし、２５μｌのコンピテント細胞で形質転換した。
【０２２４】 以下の記載は、以下の実施例に適用される。ターゲット遺伝子の多くの配列は
周知であり、公的に利用可能であり、主にＥＳＴデータベースから得た。ターゲ
ット遺伝子のＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、これらの配
列に基づき調製した。これらの実施例の文脈での「フランキングＤＮＡ」は、欠
失又は変異を受けたターゲット遺伝子の領域に隣接するゲノム配列を意味する。
「フランキングＤＮＡ」は、ターゲット遺伝子と相同なＤＮＡ配列のブロックと
しても上述している。Ｒ１ゲノムライブラリーは、Ｒ１ＥＳセルラインから調製
されたゲノムライブラリーを意味する。そのようなライブラリーは、実施例１に
記載したように調製されることができる。これまで、本発明の方法は、約２００
の既知及び新規のターゲット遺伝子について実施された。
【０２２５】 実施例４：ターゲット２、メタロプロテアーゼ遺伝子のターゲット構築物の２ウ
ェイクローニング ターゲット２、メタロプロテアーゼ遺伝子のフランキングＤＮＡの同定 Ｒ１ゲノムライブラリーの個々のプールを、オリゴ＃１７４（SEQ ID NO:１
９）と＃１８０（SEQ ID NO:２０）を用いて標準条件下でＰＣＲ増幅し、５０
０ｂｐバンドの存在により示されるターゲット＃２のゲノムＤＮＡを含む個々の
ウェルを同定した。各々約１２，０００クローンを含む、１２のプールの全てを
同定した（プールＡ５、Ａ７、Ｃ２、Ｄ２，Ｅ５、Ｅ１０、Ｆ７、Ｇ１、Ｇ７、
Ｈ２、Ｈ４、Ｈ７）。ついで、オリゴ４５４（SEQ ID NO:２１）と４６３（SE
Q ID NO:２２）を用いてプールＣ２を増幅し、２０００ｂｐバンドを生成させ
、オリゴ４６４（SEQ ID NO:２３）と４２（SEQ ID NO:２４）を用いてプー
ルＨ２を増幅し、２７００ｂｐバンドを生成させた。これらの２つのバンドは、
ターゲット２のフランキングＤＮＡを含む。
【０２２６】 ターゲット構築物の構築 ターゲット２についてフランキングＤＮＡの各バンドは、アガロースゲルから
ゲル精製し、ｄＴＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで、個々に末端を処
理し、一本鎖化されたオーバーハングを作製した。ついてこれらのバンドの各々
を、個々にプラスミドベクターｐＤＧ２（図２Ａに示す）にクローン化した。Ｃ
２バンドは、ｄＡＴＰ存在下で、ライゲーション独立クローニングにより、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理しておいたSacII-消化ｐＤＧ２にクローン化した。別
の反応において、Ｈ２バンドを、ｄＡＴＰ存在下で、ライゲーション独立クロー
ニングにより、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理しておいたSACI-消化ｐＤＧ２に
クローン化した。
【０２２７】 ２つのフランキングアームを単一のターゲットベクター内に移すために、上記
各ベクターを、NotI/SalIで消化し、Ｃ２バンドを含む４ｋｂ断片とＨ２バンド
を含む５ｋｂ断片をゲルで精製した。これらの２つの断片が、標準的な条件を用
いてともにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションされ、両方のフランキングアー
ムを含む組換え体が同定された。調べた１２コロニーのうち、１２が正しい挿入
を有しており、すなわち、ポジティブ選択マーカー、Ｎｅｏrに正しく隣接する
両方のアームを含んでいた。
【０２２８】 実施例５：ターゲット５４、セリンプロテアーゼ遺伝子のターゲット構築物の２
ウェイクローニング ターゲット５４のフランキングＤＮＡの同定 Ｒ１ゲノムライブラリーの個々のプールを、オリゴ＃１５１（SEQ ID NO:２
５）と＃１５５（SEQ ID NO:２６）を用いて標準条件下でＰＣＲ増幅し、１７
９ｂｐバンドの存在により示されるターゲット＃５４のゲノムＤＮＡを含む個々
のウェルを同定した。各々約１２，０００クローンを含む、１２のプールの全て
を同定した（プールＡ４、Ａ１０、Ｂ２、Ｂ９、Ｃ９、Ｅ１、Ｅ６、Ｆ８、Ｇ４
、Ｈ６、Ｈ７及びＨ９）。ついで、オリゴ４５４（SEQ ID NO:２７）と４６５
（SEQ ID NO:２８）を用いてプールＧ４を増幅し、１４００ｂｐバンドを生成
させ、オリゴ４６６（SEQ ID NO:２９）と４２（SEQ ID NO:２４）を用いて
プールＨ７を増幅し、３０００ｂｐバンドを生成させた。これらの２つのバンド
は、ターゲット５４のフランキングＤＮＡを含む。
【０２２９】 ターゲット構築物の構築 各バンドは、アガロースゲルからゲル精製し、ｄＴＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで、個々に末端を処理し、一本鎖化されたオーバーハングを作製
した。ついてこれらのバンドの各々を、個々にプラスミドベクターｐＤＧ２にク
ローン化した。Ｇ４バンドは、ｄＡＴＰ存在下で、ライゲーション非依存性クロ
ーニングにより、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理しておいたSacII-消化ｐＤＧ２
にクローン化した。別の反応において、Ｈ７バンドを、ｄＡＴＰ存在下で、ライ
ゲーション非依存性クローニングにより、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してお
いたSacI-消化ｐＤＧ２にクローン化した。
【０２３０】 ２つのフランキングアームを単一のターゲットベクター内に移すために、上記
各ベクターを、NotI/SalIで消化し、Ｇ４バンドを含む６ｋｂ断片とＨ７バンド
を含む８ｋｂ断片をゲルで精製した。これらの２つの断片が、標準的な条件を用
いてともにＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションされ、両方のフランキングアー
ムを含む組換え体が同定された。調べた２４コロニーのうち、１４が正しい挿入
を有していた。
【０２３１】 実施例６；単一工程（４ウェイ）クローニング−一般的手順 各一本鎖化アニール部位がユニークであるため、４ウェイライゲーションスト
ラテジーも用いて、単一工程で構築物を生成させた。各反応がSacIとSacIIの両
方で消化したベクターを含み、両方のＴ４処理断片をこれらの反応物に加えた以
外は上述の如く、アニール反応をセットアップした。
【０２３２】 実施例７：ターゲット４３、Ｇプロテイン結合レセプター遺伝子のターゲット構
築物の４ウェイクローニング ターゲット４３のフランキングＤＮＡの同定 Ｒ１ゲノムライブラリーの個々のプールを、オリゴ＃１（SEQ ID NO:３０）
と＃２（SEQ ID NO:３１）を用いて標準条件下でＰＣＲ増幅し、４１４ｂｐバ
ンドの存在により示されるターゲット＃４３のゲノムＤＮＡを含む個々のウェル
を同定した。各々約１２，０００クローンを含む、１１のプールの全てを同定し
た（プールＡ３２、Ａ５、Ａ９、Ｂ４、Ｄ４，Ｄ１０、Ｅ１、Ｅ９、Ｆ９、Ｇ７
及びＧ８）。ついで、オリゴ４１（SEQ ID NO:３２）と３８（SEQ ID NO:３
３）を用いてプールＥ１を増幅し、１５００ｂｐバンドを生成させ、オリゴ４０
（SEQ ID NO:３４）と３７（SEQ ID NO:３５）を用いてプールＤ１０を増幅
し、３５００ｂｐバンドを生成させた。これらの２つのバンドは、ターゲット４
３のフランキングＤＮＡを含む。
【０２３３】 ターゲット構築物の構築 各バンドは、アガロースゲルからゲル精製し、ｄＴＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで、個々に末端を処理し、一本鎖化されたオーバーハングを作製
した。ついでこれらの挿入物を、SacIとSacII両方で消化し、ｄＡＴＰの存在下
でＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した、〜５０ｎｇのｐＤＧ２と混合した。ＤＮ
Ａ混合物は、２分間６５℃に加熱し、５分間氷上でインキュベートした。ついで
アニールされたＤＮＡは、コンピテントＤＨ５−α細胞に形質転換し、アンピシ
リンアガロースプレート上で選択することにより組換え分子を得た。３７℃一晩
のインキュベーションの後、個々のコロニーを拾い、分析のために増殖させた。
適当な制限酵素消化により組換え分子を同定した。調べた５２コロニーのうち、
３５が、期待される産物の正しい制限パターンを有していた。
【０２３４】 実施例８：ターゲット２４４、新規遺伝子のターゲット構築物の４ウェイクロー
ニング ターゲット２４４のフランキングＤＮＡの同定 Ｒ１ゲノムライブラリーの個々のプールを、オリゴ＃５４０（SEQ ID NO:３
６）と＃５４６（SEQ ID NO:３７）を用いて標準条件下でＰＣＲ増幅し、２４
６ｂｐバンドの存在により示されるターゲット＃２４４のゲノムＤＮＡを含む個
々のウェルを同定した。各々約１２，０００クローンを含む、１６のプールの全
てを同定した（プールＡ１、Ｂ１、Ａ３、Ａ５、Ａ６、Ｂ６、Ａ８、Ｃ９、Ｄ１
０、Ｅ１、Ｆ２、Ｅ５、Ｅ６、Ｆ１０、Ｇ９及びＨ８）。ついで、オリゴ４４５
（SEQ ID NO:３８）と６６７（SEQ ID NO:３９）を用いてプールＧ９を増幅
し、１３００ｂｐバンドを生成させ、オリゴ６６８（SEQ ID NO:４０）と４２
（SEQ ID NO:２４）を用いてプールＡ６を増幅し、１６００ｂｐバンドを生成
させた。これらの２つのバンドは、ターゲット２４４のフランキングＤＮＡを含
む。
【０２３５】 ターゲット構築物の構築 各バンドは、アガロースゲルからゲル精製し、ｄＴＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで、個々に末端を処理し、一本鎖化されたオーバーハングを作製
した。ついでこれらの挿入物を、SacIとSacII両方で消化し、ｄＡＴＰの存在下
でＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した、〜５０ｎｇのｐＤＧ２と混合した。ＤＮ
Ａ混合物は、２分間６５℃に加熱し、５分間氷上でインキュベートした。ついで
アニールされたＤＮＡは、コンピテントＤＨ５−α細胞に形質転換し、アンピシ
リンアガロースプレート上で選択することにより組換え分子を得た。３７℃一晩
のインキュベーションの後、個々のコロニーを拾い、分析のために増殖させた。
適当な制限酵素消化により組換え分子を同定した。調べた１２コロニーのうち、
２が、期待される産物に正しい制限パターンを有していた。 以下の実施例９と１０は、上記実施例に記載した２ウェイ及び４ウェイストラ
テジーの代替かつ好適な方法として、プラスミドＰＣＲ法を提供する。
【０２３６】 実施例９：ターゲット２２７、新規遺伝子のターゲット構築物のクローニングの
プラスミドＰＣＲ法 ゲノムクローンの増幅 Ｒ１ ＥＳ細胞から作製され、ラムダZapIIにクローン化され、その後M13ヘル
パーファージ媒介切除を用いて切り出されたプラスミドＰＣＲゲノムラブラリー
の個々のプールを、オリゴ９０７（SEQ ID NO:４１）と９０８（SEQ ID NO:
４２）を用いて増幅した。これらのオリゴは、ライブラリーのプール６から約９
ｋｂの産物を増幅した。プラスミドpBluescriptバックボーンと、ターゲット２
２７の両方のフランキングアームを含むこの断片を、アガロースゲルから単離し
た。
【０２３７】 ターゲット構築物の構築 単離されたDNA断片は、ｄＴＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理
し、適当な一本鎖化されたオーバーハングを作製した。ついでこの断片を、SacI
とSacII両方で消化し、ｄＡＴＰの存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した
、ｐＤＧ２から得られたNeor遺伝子断片でアニールさせた（ライゲーション独立
）。消化とポリメラーゼ処理で、ターゲット２２７断片に特異的にアニールする
末端を有するNeor遺伝子を得た。アニール反応を、本質的に上記の如くセットア
ップし、ターゲット２２７構築物を得た（１４クローンのうち１３が正しかった
）。
【０２３８】 実施例１０：ターゲット１２５、核ホルモンレセプター遺伝子のターゲット構築
物のクローニングのプラスミドＰＣＲ法 ゲノムクローンの増幅 Ｒ１ ＥＳ細胞から作製され、ラムダZapIIにクローン化され、その後M13ヘル
パーファージ媒介切除を用いて切り出されたプラスミドＰＣＲゲノムラブラリー
の個々のプールを、オリゴ１１５７（SEQ ID NO:４３）と１１５８（SEQ ID
NO:４４）を用いて増幅した。これらのオリゴは、ライブラリーのプール１０
から約１０ｋｂの産物を増幅した。プラスミドpBluescriptバックボーンと、タ
ーゲット１２５の両方のフランキングアームを含むこの断片を、アガロースゲル
から単離した。
【０２３９】 ターゲット構築物の構築 単離されたDNA断片は、ｄＴＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理
し、適当な一本鎖化されたオーバーハングを作製した。ついでこの断片を、SacI
とSacII両方で消化し、ｄＡＴＰの存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した
、ｐＤＧ２から得られたNeor遺伝子断片でアニールさせた。これによりターゲッ
ト１２５構築物に特異的にアニールする末端を有するNeor遺伝子を得た。（１８
クローンのうち１２が正しかった）
【０２４０】 実施例１１：スクリーニングマーカーとしてのGFPの使用 ターゲット遺伝子と相同な領域の外側のGFP（緑色蛍光タンパク質）遺伝子の
添加は、蛍光下でES細胞コロニーをスクリーニングによる相同組換え体（ES細胞
でのターゲット構築物とターゲット遺伝子の間の組換え）の富化を可能にする。
急速に増殖するES細胞はトリプシン処理して、単一細胞サスペンションを作製し
た。各ターゲットベクターを制限エンドヌクレアーゼで直線化し、２０μｇのDN
Aを、ES培地中の｛１０００単位／ｍｌのＬＩＦ（白血病阻害因子−Gibco 13275
-029"ESGRO"）と１２％の牛胎児血清が添加された高グルコースＤＭＥＭ（Ｌ−
グルタミン又はピルビン酸ナトリウムなし）｝１０×１０6ＥＳ細胞に添加した
。細胞は、２ｍｍのギャップキュベットに置かれ、ＢＴＸエレクトロポレーター
上で、４００μＦ抵抗と２００ボルトにおいてエレクトロポレーションした。エ
レクトロポレーションの直後に、ＥＳ細胞を、１００ｍｍゼラチン化組織培養プ
レート当たり１×１０6細胞でプレーティングした。４８時間後、培地を、ＥＳ
培地＋Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）に交換した。４日目、６日目、８日目に培
地をＥＳ培地＋Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌ）に交換した。１０−１２日目に、
プレートを紫外線下において、ＥＳ細胞コロニーを蛍光を有しているか否かを評
価した。この実験の基礎は、蛍光細胞は、ランダムに統合して、ＧＦＰ遺伝子が
インタクトであるということである。相同組換えを受ける細胞は、ＧＦＰ遺伝子
を欠失し、蛍光体でないであろう。これらが対象のクローンである。
【０２４１】 実施例１２：ターゲットＴ２４３のノックアウトと、ホモ接合のノックアウト変
異マウス ターゲットＴ２４３のフランキングＤＮＡの同定 Ｒ１ゲノムライブラリーの個々のプールを、オリゴ＃４２６（SEQ ID NO:５
５）と＃４３２（SEQ ID NO:５６）を用いて標準条件下でＰＣＲ増幅し、１５
０ｂｐバンドの存在により示されるターゲットＴ２４３のゲノムＤＮＡを含む個
々のウェルを同定した。各々約１２，０００クローンを含む、４８のプールの全
てを同定した（プールＡ１、Ａ２、Ａ９、Ｂ４、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｃ３、Ｃ８、
Ｃ１１、Ｃ１２、Ｄ１、Ｄ３、Ｅ４、Ｆ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ１２、Ｈ４、
Ｈ５及びＨ１２）。ついで、オリゴ＃４８８（SEQ ID NO:４８）［一本鎖化末
端配列を有するプライマー］と＃４５４（図８参照）を用いてプールＨ１０を増
幅し、２７００ｂｐバンドを生成させた。ついで、オリゴ＃４８９（SEQ ID N
O:４９）［一本鎖化末端配列を有するプライマー］と＃４２（図８参照）を用い
てプールＡ７を増幅し、５２００ｂｐバンドを生成させた。これらの２つのバン
ドは、ターゲットＴ２４３のフランキングＤＮＡ、（SEQ ID NO:５０）、（SE
Q ID NO:５１）を含んでいた。
【０２４２】 ターゲット構築物の構築 各バンドは、アガロースゲルからゲル精製し、ｄＴＴＰの存在下で、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで、個々に末端を処理し、一本鎖化されたオーバーハングを作製
した。ついでこれらの挿入物を、SacIとSacII両方で消化し、ｄＡＴＰの存在下
でＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した、〜５０ｎｇのｐＤＧ２と混合した。ＤＮ
Ａ混合物は、２分間６５℃に加熱し、５分間氷上でインキュベートした。ついで
アニールされたＤＮＡは、コンピテントＤＨ５−α細胞に形質転換し、アンピシ
リンアガロースプレート上で選択することにより組換え分子を得た。３７℃一晩
のインキュベーションの後、個々のコロニーを拾い、分析のために増殖させた。
適当な制限酵素消化により組換え分子を同定した。
【０２４３】 ＥＳ細胞へのターゲット構築物の導入と相同組換え 急速増殖するES細胞をトリプシン処理して、単一細胞サスペンションを作製し
た。Ｔ２４３ターゲットベクターを制限エンドヌクレアーゼで直線化し、２０μ
ｇのDNAを、ES培地中の｛１０００単位／ｍｌのＬＩＦ（白血病阻害因子−Gibco
13275-029"ESGRO"）と１２％の牛胎児血清が添加された高グルコースＤＭＥＭ
（Ｌ−グルタミン又はピルビン酸ナトリウムなし）｝１０×１０6ＥＳ細胞に添
加した。細胞は、２ｍｍのギャップキュベットに置かれ、ＢＴＸエレクトロポレ
ーター上で、４００μＦ抵抗と２００ボルトにおいてエレクトロポレーションし
た。エレクトロポレーションの直後に、ＥＳ細胞を、１００ｍｍゼラチン化組織
培養プレート当たり１×１０6細胞でプレーティングした。４８時間後、培地を
、ＥＳ培地＋Ｇ４１８（２００ｍｇ／ｍｌ）に交換した。４日目、６日目、８日
目に培地をＥＳ培地＋Ｇ４１８（２００ｍｇ／ｍｌ）に交換した。
【０２４４】 １０−１２日目に、Ｇ４１８耐性コロニー（１９２コロニーの平均）を、９６
ウェルプレートに２連で拾った。ＥＳ培地での２−５日間の培養後、１つのプレ
ートを５０％ＦＢＳ、４０％ＤＭＥＭ及び１０％ＤＭＳＯ中で凍結した。第２の
プレートを過剰に増殖し、分析のためのＤＮＡを調製するため、溶解前の８−１
０日間、再度フィードした（溶解バッファー：１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１０
ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％サルコシル及び１
ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）。ついでＤＮＡを、２容量のエタノールで沈澱さ
せ、適当なバッファーに再懸濁した。
【０２４５】 相同組換えの確認で、２連プレートからのポジティブウェルを融解して、予め
マイトマイシンＣ処理マウス胚繊維芽細胞をプレーティングした（２４時間前）
２４ウェルの組織培養皿に入れた。細胞を、二倍体凝集（ＣＤ−１宿主株）と保
存バイアルのさらなる凍結のために十分なレベルに増殖させた。ＥＳ細胞のハン
ドリングと、ＥＳ細胞からのキメラマウスの生産のための一般的な手順について
、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E.J.
Robertson編,IRL Press,Oxford(1987))参照。再凝集胚盤胞を、偽妊娠雌ＣＤ−
１マウスに移植した。ついで高度なキメラマウスを繁殖させ、変異２４３遺伝子
を伝える生殖細胞系を作製した。
【０２４６】 ホモ接合Ｔ２４３ノックアウトマウスの生成と変異表現型の分析 へテロ接合Ｔ２４３ノックアウトマウスを繁殖させ、ホモ接合ノックアウト子
孫を、明らかな表現型の相違について、正常及びヘテロ接合の同腹子と比較した
。ホモ接合体は、正常の同腹子に比べて、最初に過剰活性化しており、非常に乾
燥した皮膚を有していた。約１５乃至１７日まで、ホモ接合ノックアウトマウス
は、徐々に不安定かつ不活発になり始めた。約１９−２１目までに、ホモ接合体
は、震えと切迫した死の徴候を示した。死が見られなかったホモ接合ノックアウ
トマウスは、さらなる分析のために約２３−２５日後に犠牲となった（下記参照
）。
【０２４７】 図９と１０は、２匹のヘテロ接合２４３ノックアウトマウスの２つの典型的な
交尾の子孫の身長と体重、及び体重／身長比の算出の毎日の測定の結果を示す。
ホモ接合の子供は、出生時、野生型又はヘテロ接合の同腹子とほぼ同じサイズ又
はやや小さかった。しかしながら、加齢と共に、体重増加と身長の伸びの両方が
ホモ接合ノックアウト子供で著しく低下した。１５−１７日までにホモ接合は、
体重が減少し始め、そのような体重減少は約３週間後の死まで持続した。
【０２４８】 ６匹のホモ接合変異体（４匹の雌と２匹の雄）と３匹の対照（２匹の雌と１匹
の雄）で検死を行なった。骨と腎臓の組織に、２４３変異に寄与できる著しい相
違が観察された。
【０２４９】 骨 変異マウスは異常な軟骨と一般的は骨形成減少を有していた。特に、中心と四
肢の骨格の両方の短縮が観察された。四肢の近位と遠位の骨が、比例して短縮し
、関節の軟骨がアルシアンブルー染色されなかった。
【０２５０】 遠位の代替は薄い成長板を有し、骨端の軟骨を欠いていた。単一の変異マウス
は、皮質から骨幹端を通して骨端軟骨まで斜めにのびる小さなひびが入っていた
（成長板のもろさを示す）。すべての変異マウスの骨端軟骨の内部で、増殖及び
肥大性領域での軟骨細胞カラムが短かった。骨幹端内の軟骨スピクラが短く、広
く隙間が開いていた。ところどころのスピクラは無計画な向きであった。骨芽細
胞は多く、軟骨スピクラに添って、堆積しているものも多かった。骨端軟骨は薄
く、しばしば繊維粘着組織に置換されていた。骨端表面はアルシアンブルーでの
染色の減少を示した。骨端／骨端軟骨結合部は、やや拡大し、骨端軟骨にかぶさ
る不定型のめだつエッジを有していた。
【０２５１】 変異胸骨分節は不定形であった。成長板は欠損しているか不連続であった。軟
骨の大きくて不定形な島が胸骨分節まで伸び、いくつかは骨形成の第２のセンタ
ーを有していた。軟骨の端は拡大していた。
【０２５２】 アルシアンブルー染色によれば、脊椎のボディは不定形に形成されていた。い
くつかは小さく、顕著に軟骨化し、不定形で薄い成長板を有しており、外側に向
かって傾斜していた。
【０２５３】 腎臓 すべての変異マウスは、皮質髄質結合部で最もめだち、皮質にはあまり伸びて
いない、両方の腎臓での形成異常の変化を有していた。腎属は小さく正常な構造
を欠いていた。皮質は薄く、いくつかの糸球が被膜下にあった。被膜下糸球は小
さく、収縮し、ハイパーセルラーな糸球タフトを有し、未成熟を示していた。皮
質髄質領域は、放射弓状血管と異なる細管形成を欠いていた。皮質髄質結合部内
の管状上皮細胞は、シート、パイル、クラスターに無計画に配列されていた。い
くつかの環状上皮細胞は小さく、やや好塩基性であり、再生可能であるようであ
った。
【０２５４】 当業者には明らかであるように、本発明の思想と範囲から離れることなく、上
記実施態様は種々の改変が可能である。これらの改変と変形は本発明の範囲に含
まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のターゲッティングベクターを構築する一つの方法を図示
する。プラスミドＰＣＲ法は、実施例９および１０に記載されている。
【図２Ａ】 ｐＤＧ２ベクターを図示する。このベクターは、アンピシリン
耐性遺伝子と、ネオマイシン（Ｎｅｏr）遺伝子とを含む。Ｎｅｏr遺伝子の両側
には、制限部位を伴ったライゲーション独立クローニングのための二つの部位が
ある。
【図２Ｂ】 ｐＤＧ２の配列が示されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。
【図３Ａ】 ｐＤＧ４ベクターを図示する。このベクターは、アンピシリン
耐性遺伝子、ネオマイシン（Ｎｅｏr）遺伝子、および緑色蛍光タンパク（ＧＦ
Ｐ）を含む。Ｎｅｏr遺伝子の両側には、制限酵素認識部位を伴ったライゲーシ
ョン独立クローニングのための二つの部位がある。
【図３Ｂ】 ｐＤＧ４の配列が示されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
【図４】 ＰＣＲ増幅したゲノムＤＮＡの端部に含まれるアニーリング部位
１−４のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理の前後の核酸配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）。
【図５】 ｐＤＧ２ベクター内に含まれるアニーリング部位１−４のＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ処理の前後の核酸配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１から
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）。
【図６】 アニーリング反応の際のｐＤＧ２ベクター内のアニーリング部位
１、２、３および４に対する５'および３'フランキングＤＮＡのアレンジメント
を示す。
【図７】 アニーリング反応の際のｐＤＧ４ベクター内のアニーリング部位
１、２、３および４に対する５'および３'フランキングＤＮＡ、およびＧＦＰス
クリーニングマーカーのアレンジメントを示す。
【図８】 実施例４内ｓ１０で用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を示す。下側の配列は
、クローニング部位に対するものである（例えば、ライゲーション独立クローニ
ング配列）。
【図９】 二匹のヘテロ接合Ｔ２４３ノックアウトマウス間の交配＃１７９
９の子孫についての、体長、体重、体重／体長比を示す。
【図１０】 二匹のヘテロ接合Ｔ２４３ノックアウトマウス間の交配＃１８
０８の子孫についての、体長、体重、体重／体長比を示す。
【図１１】 ネズミＴＲＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）（特に、Ｔ２４３の
発現産物）をコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、およびヒトＴＲ
Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）をコードする核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７
）を示す。
【図１２】 マウスＴＲＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）とヒ
トＴＲＰのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）を示す。
【図１３】 ターゲット遺伝子Ｔ２４３に相同な配列のＰＣＲ増幅に用いら
れるオリゴヌクレオチドプライマーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５；ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：４６）を示す。さらに、クローニング部位を有する前記と同一の
プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、およびター
ゲット遺伝子Ｔ２４３に含まれるライブラリーのアリコートを同定するために用
いられるプライマーの核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
５６）が示されている。
【図１４】 ＰＣＲ増幅により産生されたターゲット遺伝子Ｔ２４３に相同
な配列の核酸配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）
。
【図１５】 相同配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１
）を含む構築物を用いてターゲット遺伝子Ｔ２４３の欠失された遺伝子フラグメ
ント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）の核酸配列を示す。拡張されたＴ２４３遺伝子
の核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）および対応する拡張産物のアミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）をさらに示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウィリアム・マシューズ アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94025・メンロー・パーク・ハミルトン・ アヴェニュー・1003・ケアオブ・デルタジ ェン・インコーポレイテッド (72)発明者 マーク・ムーア アメリカ合衆国・カリフォルニア・ 94025・メンロー・パーク・ハミルトン・ アヴェニュー・1003・ケアオブ・デルタジ ェン・インコーポレイテッド (72)発明者 キース・ディ・アレン アメリカ合衆国・ノース・カロライナ・ 27513・キャリー・カスター・トレイル・ 224 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 DA02 DA03 EA04 FA01 GA11 GA25 HA01 4B063 QA01 QA18 QQ05 QQ13 QQ42 QQ52 QR01 QR33 QR59 QR77 QR80 QS05 QS25 QS36 QX01 4B065 AA90X AA90Y AB01 BA01 BA16 CA46 4C084 AA06 AA17 NA14 ZA811 ZA961 ZC611 ZC781 4H045 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 EA50 FA72 FA74

Claims (65)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＴＲＰをコードするターゲットＤＮＡ配列に破壊を有する細
    胞。
  2. 【請求項２】 前記破壊が、以下の工程： （ａ）前記ターゲットＤＮＡ配列の第一領域に相同な第一配列を得る工程、 （ｂ）前記ターゲットＤＮＡ配列の第二領域に相同な第二配列を得る工程、 （ｃ）ターゲッティング構築物に前記第一配列および前記第二配列を挿入する工
    程；および （ｄ）細胞に前記ターゲッティング構築物を導入し、相同的組み換えを起こして
    、ターゲットＤＮＡ配列に破壊を生じる工程 を含む方法により生じた、請求項１記載の細胞。
  3. 【請求項３】 前記方法が、前記工程（ｂ）の後に、さらに以下の工程： （i）ポジティブ選択マーカーをコードする遺伝子を有するベクターを準備する
    工程；および （ii）ライゲーション独立クローニング（ＬＩＣ）を用いて、前記ベクターに前
    記第一配列および前記第二配列を挿入して構築物を形成する工程 を含み、前記ポジティブ選択マーカーが前記構築物の第一配列と第二配列との間
    に位置する、請求項２記載の細胞。
  4. 【請求項４】 前記ベクターが、スクリーニングマーカーをコードする遺伝
    子をさらに含む、請求項３記載の細胞。
  5. 【請求項５】 前記ターゲットＤＮＡ配列が、ＣＴＧトリヌクレオチドリピ
    ートを含む、請求項１記載の細胞。
  6. 【請求項６】 前記ＣＴＧトリヌクレオチドリピートがロイシン残基をコー
    ドする、請求項５記載の細胞。
  7. 【請求項７】 前記ターゲット遺伝子配列がＴ２４３またはその天然に生じ
    るアレル変異体である、請求項１記載の細胞。
  8. 【請求項８】 前記ターゲットＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７を含む
    、請求項１記載の細胞。
  9. 【請求項９】 前記ターゲットＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５および
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６を含む、請求項１記載の細胞。
  10. 【請求項１０】 前記ベクターが、前記ポジティブ選択マーカーに隣接する
    一以上のリコンビナーゼターゲット部位をさらに含む、請求項３記載の細胞。
  11. 【請求項１１】 前記第一配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０であり、かつ前記
    第二配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１である、請求項２記載の細胞。
  12. 【請求項１２】 前記第一配列および第二配列が、以下の工程： （ａ）前記ターゲットとハイブリダイズし得る二つのプライマーであって、増幅
    産物の終点を形成するプライマーを得る工程、 （ｂ）前記ターゲット配列を含むマウスゲノムＤＮＡライブラリーを準備する工
    程、 （ｃ）前記プライマーを前記ライブラリー中の相補配列にアニーリングする工程
    、 （ｄ）前記第一配列および第二配列を増幅する工程、および （ｅ）前記増幅反応の産物を単離する工程 を含む方法により得られる、請求項２記載の細胞。
  13. 【請求項１３】 前記第一のプライマーがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５である、
    請求項１２記載の細胞。
  14. 【請求項１４】 前記第二のプライマーがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６である、
    請求項１２記載の細胞。
  15. 【請求項１５】 前記増幅がＰＣＲを含む、請求項１２記載の細胞。
  16. 【請求項１６】 前記増幅が、ロングレンジＰＣＲをさらに含む、請求項１
    ５記載の細胞。
  17. 【請求項１７】 前記マウスゲノムライブラリーがプラスミドライブラリー
    である、請求項１２記載の細胞。
  18. 【請求項１８】 前記マウスゲノムライブラリーがバクテリオファージライ
    ブラリーであり、前記方法が、増幅産物の一端がターゲット配列プライマーで終
    結しかつその他端がベクタープライマーで終結するように、バクテリオファージ
    ベクター配列にハイブリダイズできる二つのプライマーを得ることをさらに含む
    、請求項１２記載の細胞。
  19. 【請求項１９】 前記細胞が、ターゲットＤＮＡ配列にホモ接合破壊を有す
    る、請求項１記載の細胞。
  20. 【請求項２０】 前記細胞がマウスの細胞である、請求項１記載の細胞。
  21. 【請求項２１】 前記細胞がヒトの細胞である、請求項１記載の細胞。
  22. 【請求項２２】 前記細胞が幹細胞である、請求項１記載の細胞。
  23. 【請求項２３】 前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項２２記載の細胞。
  24. 【請求項２４】 請求項２３記載の胚性幹細胞を含む胚盤胞。
  25. 【請求項２５】 請求項２記載の方法に用いられるターゲッティング構築物
    。
  26. 【請求項２６】 ＴＲＰをコードする遺伝子にヘテロ接合破壊を有する、ヒ
    ト以外の脊椎動物。
  27. 【請求項２７】 前記脊椎動物が哺乳動物である、請求項２６記載の脊椎動
    物。
  28. 【請求項２８】 前記哺乳動物がマウスである、請求項２６記載の脊椎動物
    。
  29. 【請求項２９】 以下の工程： （ａ）胚盤胞に請求項１または２記載の幹細胞を導入する工程、 （ｂ）得られた胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し、当該偽妊娠マウスが、生殖細胞
    系にＴＲＰをコードする破壊された遺伝子を有するキメラマウスを産む工程、お
    よび （ｃ）前記キメラマウスを交配させて、ＴＲＰをコードする遺伝子にヘテロ接合
    破壊を有するマウスを得る工程 を含む方法によって産生される、請求項２８記載のマウス。
  30. 【請求項３０】 以下の工程： （ａ）胚盤胞に請求項３記載の幹細胞を導入する工程、 （ｂ）得られた胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し、当該偽妊娠マウスが、生殖細胞
    系にＴＲＰをコードする破壊された遺伝子を有するキメラマウスを産む工程、お
    よび （ｃ）前記キメラマウスを交配させて、ＴＲＰをコードする遺伝子にヘテロ接合
    破壊を有するマウスを得る工程 を含む方法によって産生される、請求項２８記載のマウス。
  31. 【請求項３１】 前記ＴＲＰがＴ２４３またはその天然に生じるアレル変異
    体によってコードされる、請求項２８記載のマウス。
  32. 【請求項３２】 ＴＲＰをコードする遺伝子にホモ接合破壊を有するノック
    アウトマウスであって、前記破壊が野生型ＴＲＰの産生を阻害し、請求項２８記
    載の２匹のマウスをかけ合わせることによって産生されるノックアウトマウス。
  33. 【請求項３３】 前記破壊が、マウスが機能的ＴＲＰを発現しないようにＴ
    ＲＰ遺伝子プロモーター、エンハンサー、またはスプライス部位を変更する、請
    求項３２記載のノックアウトマウス。
  34. 【請求項３４】 前記破壊が挿入、ミスセンス、フレームシフトまたは欠失
    変異である、請求項３２記載のノックアウトマウス。
  35. 【請求項３５】 成体マウスの表現型が、野生型成体マウスと比べて体重減
    少を有する、請求項３２記載のノックアウトマウス。
  36. 【請求項３６】 前記表現型が、野生型成体マウスと比べて少なくとも約１
    ５％の体重減少を有する、請求項３５記載のノックアウトマウス。
  37. 【請求項３７】 マウスの成体表現型が、野生型成体マウスと比べて体長減
    少を有する、請求項３２記載のノックアウトマウス。
  38. 【請求項３８】 前記表現型が、さらに野生型成体マウスと比べて少なくと
    も約１０％の体長減少を有する、請求項３７記載のノックアウトマウス。
  39. 【請求項３９】 マウスの成体表現型が、野生型成体マウスと比べて体長に
    対する体重の比率の減少を有する、請求項３２記載のノックアウトマウス。
  40. 【請求項４０】 前記表現型が、さらに正常の野生型成体マウスと比べて少
    なくとも約２０％減少した体長に対する体重の比率を有する、請求項３９記載の
    ノックアウトマウス。
  41. 【請求項４１】 野生型マウス成体に比べて成体マウスの表現型が、 （ａ）体重減少、 （ｂ）体長減少、および （ｃ）体長に対する体重の比率の減少 を有する、請求項３２記載のノックアウトマウス。
  42. 【請求項４２】 成体マウスの表現型が、軟骨の疾患に関係する症状を含む
    、請求項３２記載のノックアウトマウス。
  43. 【請求項４３】 成体マウスの表現型が、骨の疾患に関係する症状を含む、
    請求項３２記載のノックアウトマウス。
  44. 【請求項４４】 成体マウスの表現型が、腎疾患に関係する症状を含む、請
    求項３２記載のノックアウトマウス。
  45. 【請求項４５】 前記表現型が誕生時には明らかでない、請求項４１記載の
    ノックアウトマウス。
  46. 【請求項４６】 前記破壊を有する請求項２８または３２記載のマウスから
    誘導された細胞または細胞系統。
  47. 【請求項４７】 ノックアウトマウスの表現型に影響を与えうる薬剤を同定
    する方法であって、以下の工程： （ａ）請求項３２記載のノックアウトマウスに推定される薬剤を投与する工程、 （ｂ）前記推定される薬剤に対する前記ノックアウトマウスの反応を測定する工
    程、 （ｃ）前記反応を野生型マウスの反応と比較する工程、および （ｄ）ノックアウトマウスの表現型に影響を与えうる薬剤を同定する工程 を含む方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４７記載の方法によって同定された薬剤。
  49. 【請求項４９】 ＴＲＰをコードする遺伝子におけるトリヌクレオチドリピ
    ートの拡張が表現型の変化を引き起こすか否かを調べる方法であって、以下の工
    程： （ａ）請求項１０記載のノックアウト細胞と、リコンビナーゼターゲット部位が
    隣接したトリヌクレオチドリピートを含む合成核酸とを準備する工程、 （ｂ）前記ノックアウト幹細胞と前記合成核酸とを、前記リコンビナーゼターゲ
    ット部位を認識するリコンビナーゼの存在下で接触させて、前記合成核酸との間
    で組み換えを起こし、トランスジェニック細胞を産生する工程、および （ｃ）前記トランスジェニック細胞の表現型を野生型細胞と比較する工程 を含み、それによりトリヌクレオチドの拡張が表現型の変化を引き起こすか否か
    を調べる方法。
  50. 【請求項５０】 前記トリヌクレオチドリピートがＣＴＧを含む、請求項４
    ９記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記方法が、Creリコンビナーゼ-loxターゲット系の使用
    を含む、請求項４９記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記方法が、ＦＬＰリコンビナーゼ-ＦＲＴターゲット系
    の使用を含む、請求項４９記載の方法。
  53. 【請求項５３】 ＴＲＰをコードするターゲットＤＮＡ配列に破壊を有する
    ノックアウト細胞または細胞系統。
  54. 【請求項５４】 請求項３２記載のマウスから誘導される、請求項５３記載
    のノックアウト細胞または細胞系統。
  55. 【請求項５５】 請求項２８または３２記載のマウスから誘導される組織。
  56. 【請求項５６】 ＴＲＰがＴ２４３またはその天然に生じるアレル変異体に
    よってコードされる、請求項５３記載のノックアウト細胞。
  57. 【請求項５７】 ノックアウト細胞系統の表現型に影響しうる薬剤を同定す
    る方法であって、以下の工程： （ａ）請求項５３記載のノックアウト細胞と推定される薬剤とを接触させる工程
    、 （ｂ）推定される薬剤に対する前記細胞の反応を測定する工程、 （ｃ）前記反応を野生型細胞の反応と比較する工程、および （ｄ）それによりノックアウト細胞の表現型に影響を与えうる薬剤を同定する工
    程 を含む方法。
  58. 【請求項５８】 前記細胞系統において機能するプロモーターに機能的に結
    合したＴＲＰをコードする核酸配列を含む細胞系統。
  59. 【請求項５９】 ＴＲＰがＴ２４３またはその天然に生じるアレル変異体に
    よってコードされる、請求項５８記載の細胞系統。
  60. 【請求項６０】 ＴＲＰが、必須にアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２ま
    たはその天然に生じるアレル変異体からなる、請求項５９記載の細胞系統。
  61. 【請求項６１】 Ｔ２４３またはその天然に生じるアレル変異体によってコ
    ードされるトリヌクレオチドリピートタンパク。
  62. 【請求項６２】 必須にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２の配列またはその天然に生
    じるアレル変異体からなるネズミＴＲＰ。
  63. 【請求項６３】 必須にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８の配列またはその天然に生
    じるアレル変異体からなるヒトＴＲＰ。
  64. 【請求項６４】 配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７またはその天然に生じるアレ
    ル変異体の、請求項６２記載のネズミＴＲＰをコードする核酸配列。
  65. 【請求項６５】 配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７またはその天然に生じるアレ
    ル変異体の、請求項６３記載のヒトＴＲＰをコードする核酸配列。
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