KR100884564B1 - 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 - Google Patents
이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100884564B1 KR100884564B1 KR1020060109896A KR20060109896A KR100884564B1 KR 100884564 B1 KR100884564 B1 KR 100884564B1 KR 1020060109896 A KR1020060109896 A KR 1020060109896A KR 20060109896 A KR20060109896 A KR 20060109896A KR 100884564 B1 KR100884564 B1 KR 100884564B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sulfatase
- mice
- mouse
- gene
- eduronate
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 title abstract description 64
- 101710096421 Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 title abstract description 45
- 102100029199 Iduronate 2-sulfatase Human genes 0.000 title abstract description 42
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 51
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 25
- 201000002273 mucopolysaccharidosis II Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 208000022018 mucopolysaccharidosis type 2 Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 13
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 12
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 10
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 abstract description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 37
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 17
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 12
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 10
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 8
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 8
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 2
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 101150110586 IDS gene Proteins 0.000 description 2
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 208000025919 mucopolysaccharidosis type 7 Diseases 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010056893 Mucopolysaccharidosis VII Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 201000001828 Sly syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 230000037354 amino acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000003674 cytoplasmic vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 206010019847 hepatosplenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001865 kupffer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007119 pathological manifestation Effects 0.000 description 1
- 210000000449 purkinje cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000004894 snout Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000007332 vesicle formation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
- C12N2015/8536—Animal models for genetic diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
- C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 제조방법 및 상기 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스를 이용한 헌터 증후군 치료제 개발 동물 모델로서의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 일반적인 리소좀 축적병 특히, 이듀로네이트-2-설파타제(Iduronate-2-sulfatase, IDS) 결함에 대한 모델로서 유용한 유전적으로 설계된 마우스 및 이러한 장애의 치료 및 치료제의 조직 특이적 전달 시스템의 평가를 위한 치료제 평가시 이러한 유전적으로 설계된 마우스의 이용에 관한 것이다.
이듀로네이트-2-설파타제, 넉아웃, 마우스, 헌터 증후군, 동물 모델
Description
도 1은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 제조용 타겟팅 벡터의 개요도이다.
도 2는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 제조용 타겟팅 벡터의 유전자 구축을 위한 상세도이다.
도 3은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 배설량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 장기 무게의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 간의 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 신장의 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군에 이듀로네이트-2-설파타제 투여 후 소변 내 글리코사미노글리칸 배설량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군에 이듀로네이트-2-설파타제를 생후 11주 후에 투여한 후 체중변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 제조방법 및 상기 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스를 이용한 헌터 증후군 치료제 개발 동물 모델로서의 용도에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 일반적인 리소좀 축적병 특히, 이듀로네이트-2- 설파타제(Iduronate-2-sulfatase, IDS) 결함에 대한 모델로서 유용한 유전적으로 설계된 마우스 및 이러한 장애의 치료 및 치료제의 조직 특이적 전달 시스템의 평가를 위한 치료제 평가시 이러한 유전적으로 설계된 마우스의 이용에 관한 것이다.
뮤코다당증은 유전성 대사질환의 일종으로 리소좀에 존재하는 효소의 결함으로 유발되는 질환이다. 리소좀은 전자전달(electron transport), 산화적 인산화(oxidative phosphorylation) 및 피르부산, 지방산, 몇몇 아미노산 대사에 관여하는 효소 그리고 다양한 가수분해 효소들을 포함하는 각종 분해 작용에 관여하는 세포 내 기관으로서, 특히 뮤코다당류(mucopolysaccharides), 뮤코지질(mucolipids) 및 스핑고지질(sphingolipids) 등의 분해와 관련이 있다. 이외에도 뮤코다당증과 관련하여 이들의 대사 과정에 많은 효소 결함 및 유전자 이상이 보고되어 있다.
구체적으로, 뮤코다당증은 임상적으로 골격계, 순환계 및 정신 기능 등에 다양한 증상을 나타내고, 임상적, 유전학적 및 생화학적 기초에서 7가지 부류로 나눌 수 있다. 이는 상기 다당류 대사에 관여하는 효소의 이상으로 황산화된 다당류(sulfated polysaccharides)인 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 또는 케라탄 설페이트(keratan sulfate) 등이 조직 내 축적됨으로서 증상을 나타낸다.
상기 뮤코다당증 중 타입 Ⅱ인 헌터 증후군은 이듀로네이트-2-설파타제의 결함으로 유발되는 것으로, 헌터 증후군은 어린 시절부터 심한 증상을 보이는 유아형(juvenile form)과 정신지체 등은 보이지 않는 경한 증상의 늦은형(late form)으로 구분된다. 구체적으로 유아형은 정신지체, 신체 이상의 증상이 나타나고 대부분 15세 이전에 사망하며, 늦은형은 난쟁이, 못난 외모, 간비종(hepatosplenomegaly) 등을 나타내고 오래 생존한다. 헌터 증후군은 우리나라에서 비교적 많이 발견되는 질환으로 X 염색체와 연관된 열성(X-linked recessive) 양식으로 유전되고 있다.
유전성 대사 질환은 매우 다양하고 민족에 따라 질병의 분포가 큰 차이를 보이는데, 따라서 각 나라에서 중점적으로 관심을 가지는 질환이 다르고 각 민족에 따라 특이적으로 많고 연구가 편리한 질환이 많이 연구되고 있다. 헌터 증후군은 특징적인 임상 증상으로 인하여 과거 우리나라에서 여러 예가 보고되어 있으며 최근 효소 진단 등으로 확진되는 예를 찾아 볼 수 있다.
따라서 본 발명은 이와 같은 헌터 증후군의 진단과 치료를 위한 동물 모델을 개발코자 한 것이며 이에 따라 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스를 제조하고 상기 넉아웃 마우스와 대조 마우스간의 각종 생리학적 실험을 통해 헌터 증후군 치료제의 개발을 위한 동물 모델을 확립하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 헌터 증후군의 진단과 치료를 위한 동물 모델을 개발코자 한 것이며 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스를 제조하고 상기 넉아웃 마우스와 대조 마우스간의 각종 생리학적 실험을 통해 헌터 증후군 치료제의 개발을 위한 동물 모델을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 ⅰ) 이듀로네이트-2-설파타제 유전자를 결실시킨 타겟팅 벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 타겟팅 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 도입하는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 배아줄기세포를 수정란의 배반포에 주입하는 단계; ⅳ) 상기 형질전환된 수정란을 통해 키메라 마우스를 수득하는 단계; ⅴ) 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 이형접합체 마우스를 수득하는 단계; 및 ⅵ) 상기 이형접합체 마우스의 암수를 교배시켜 이듀로네이트-2-설파타제 유전자가 넉아웃된 마우스를 수득하는 단계로 구성된 이듀로네이트-2-설파타제 기능이 넉아웃된 마우스 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 이듀로네이트-2-설파타제 기능이 넉아웃된 마우스를 이용하여 헌터 증후군 진단 및 치료제 개발용 동물 모델로 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 이듀로네이트-2-설파타제 기능이 넉아웃된 마우스를 이용하여 이듀로네이트-2-설파타제를 헌터 증후군 치료제로서 그 약리 효과를 동물 모델로서 측정하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 이듀로네이트-2-설파타제 기능이 넉아웃된 마우스는 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같은 타겟팅 벡터를 제조하고 이를 염색체 상에 도입함으로서 넉아웃 마우스를 제조한다.
도 1은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 제조용 타겟팅 벡터의 개요도이다. 도 2는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 제조용 타겟팅 벡터의 유전자 구축을 위한 상세도이다.
상기 도 1, 2에 나타난 바와 같이 본 발명에 사용되는 타겟팅 벡터는 좌측 팔 (2027 bp), PGK-neo (1800 bp), 우측 팔 (5393 bp)로 구성된 유전자 카세트를 포함하고 있으며 상기 타겟팅 벡터는 상보 절편에서 동형 재조합(homologous recombination)이 발생하여 이듀로네이트-2-설파타제 단백질의 일부분이 상실되기 때문에 정상적인 이듀로네이트-2-설파타제 유전자가 발현되지 않는다.
본 발명의 넉아웃 마우스를 제조하기 위해서는 먼저 상기한 타겟팅 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 도입하고, 유전자 적중이 확인된 배아줄기세포 클론을 배양한 후 포배아의 배반포에 주입하여, 정관수술한 수컷과 교배시킨 후 2.5 p.c.된 가임신 대리모 마우스의 자궁에 이식함으로써 키메라 마우스의 발생을 유도하였다. 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 IDS +/- 유전자형을 갖는 이형접합체(heterozygote) 마우스를 얻고, 다시 상기 이형접합체 마우스의 암컷과 수컷을 교배시킴으로써 IDS -/- 유전자형을 갖는 유전자변이 마우스를 제조하였다. 상기 유전자 변이 마우스는 정상적으로 출생하여 정상 마우스와 같은 수명을 갖고 있고, 암수 둘 다 정상 마우스와 교배했을 때 정상적인 생식능력을 갖고 있다.
본 발명자는 상기 이듀로네이트-2-설파타제 유전자의 일부가 결실되어 이듀로네이트-2-설파타제 기능이 억제된 상기의 넉아웃 마우스를 이용하여 다양한 생리학적 실험을 통해 헌터 증후군 및 이의 치료제 개발을 위한 동물 모델을 완성하였다.
IDS -/- 유전형의 다양한 표현형 및 병리적 징후로 인해 본 발명의 목적인 넉아웃 마우스 모델이 헌터 증후군에 대한 효소 대체 요법의 시험 및 개발에 응용될 수 있는 것이다. 또한 본 발명의 마우스는 헌터 증후군 치료에 사용하기 위한 치료제를 평가하는데 이용될 수 있다. 이러한 평가는 IDS 유전자 결함에 대한 동형접합성 형질전환 마우스에 치료제를 투여하고, 이듀로네이트-2-설파타제 결함과 관련된 조직 병리 또는 다른 지표에 대해 본 마우스를 평가함으로서 달성될 수 있다.
먼저, 본 발명자는 IDS -/- 변이 마우스를 통해 상기 변이 넉아웃 마우스와 정상 마우스간에 각종 생리학적 실험을 행하였으며 그 결과는 다음과 같다.
동형접합성 돌연변이 마우스는 4주령의 새끼보다 더 작다. 이러한 연령에서 주둥이가 짧고 탈모 증상을 지닌 안면 형태 상에 초기 효과를 나타낸다. 이들 안면 특징은 β-글루쿠로니다제 결함(MPS Ⅶ, 슬라이 증후군) 마우스에서 초기 발견되는 것과 동일하다. 제7형 뮤코다당증 넉아웃에서 나타나는 심한 특징 즉, 심한 성장 지연, 관절병 및 명백한 안면이형증 약 6∼8주령까지 관찰되지 않았다. 4주령의 IDS -/- 및 -/+ 마우스의 방사선 사진은 헌터 증후군에서 초기 발견되는 두개안면 이상증 및 탈모증의 증거를 나타낸다. 척추는 정상으로 나타났고, 제7형 뮤코다당증 마우스에서 주지된 명백한 사지 단축은 나타나지 않았다.
이듀로네이트-2-설파타제 결함을 지닌 환자의 초기 골격 변화는 소아 초기에 더욱 악성인 골 병리와 구분되기 어려울 수 있다. 따라서 연령에 따른 IDS -/- 마우스의 골격의 연구는 이러한 모델의 골격 병리가 인간 결함을 모방하는지 여부 를 결정하는데 요구된다.
본 발명자는 4주령 및 8주령 IDS +/- 및 -/- 마우스 내 다양한 기관의 병리학적 조사를 수행하였다. 분석된 모든 조직은 비정상적인 리조솜 축적의 증거를 나타내었다. 8주령까지 IDS -/- 마우스의 간이 색이 더 흐렸고 정상간의 연분홍색 광채가 없었으나 초기에는 표현형적 간비장비대의 증거가 존재하지 않았다. 도 5는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 간의 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다.
또한 도 6은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 신장의 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다.
4주령에서 가장 유의적인 병리는 쿠퍼(Kupffer) 세포, 비장 시누소이드(sinusoid) 라이닝(lining) 세포, 폐 대식세포 및 신경교 세포 내 리소좀 축적에 의해 나타난 세망내피계에서 발생한다. 간에서 리소좀-적재된 쿠퍼 세포는 4주령에서 유의적인 간세포 축적이 용이하게 관찰되었다. 8주령까지 세망내피계 내의 축적의 추가 진행이 발생하였고 유의적인 간세포 액포형성의 증거가 존재하였다. 8주령에서 정상 간 표본 내의 매우 적은 리소좀과는 대조적으로 간세포의 세포질의 15∼20%는 리소좀에 의해 축적된 것으로 나타났다. 8주령 IDS -/- 마우스 유래의 비장 세포는 시누소이드의 대부분의 세포 내의 현저하게 팽창된 리소좀을 나타내었 다.
4주령에서 비정상적 리소좀 축적 캡(cab)은 리소좀 축적을 나타내지 않는 피질의 신경교세포 내에서 발견된다. 그러나 8주령에서 세포질 액포형성은 연수막 세포뿐만 아니라 소뇌의 푸르키니에(Purkinje) 세포, 대뇌 피질의 신경세포, 신경교세포 내에서 관찰될 수 있다. 총 세포질 부피 상의 교란된 세포 구조의 증거가 IDS -/- 마우스의 소뇌에서 모든 푸르키니에 세포가 8주령까지 비정상적인 세포질 액포를 통해 검출되었다. 리소좀은 8주령의 정상 마우스에서 검출되지 않았다. 또한 대량의 리소좀 축적은 초기 4주령의 기관뿐만 아니라 뼈의 관절 표면 모두에서 발견되는 연골세포에서도 나타났다.
IDS +/- 마우스 및 IDS -/- 마우스의 소변 내 GAG의 수치는 소변 내 크레아티닌 대비 GAG의 양이 IDS -/- 마우스에서 실질적으로 증가되었음을 나타내었다. 따라서 GAG의 측정은 조직 및 기관 분석을 위해 마우스를 희생하기 전 치료 요법 동안 마우스를 모니터하는 비-침해성 수단으로 작용할 수 있다.
도 3은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 배설량을 나타낸 그래프이다. 도 3에 나타난 바와 같이 16주령의 이형접합성 형질전환 마우스의 경우 30∼35 ㎍/ml의 GAG 배설량을 나타내었고 38주령의 이형접합성 형질전환 마우스의 경우 15∼20 ㎍/ml의 GAG 배설 량을 나타내었다.
한편, 이듀로네이트-2-설파타제 유전자가 모두 결실된 동형접합성 형질전환 마우스의 경우 16주령에서는 130∼135 ㎍/ml, 38주령에서는 160∼165 ㎍/ml의 GAG 배설량을 나타내었다. 이는 동형접합성 형질전환 마우스의 경우 이듀로네이트-2-설파타제 효소가 완전히 결핍되어 GAG를 분해하지 못하고 이를 모두 배설하는 것으로 판단된다.
한편, 도 4는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 장기 무게의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 4에 나타난 바와 같이 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스에 있어서 특히 간의 성장은 정상 마우스에 비해 매우 지체되었으며 비장, 폐 등의 기관의 성장 역시 지체되어 그 장기의 무게가 충분히 증가하지 않았다.
이하, 이듀로네이트-2-설파타제의 헌터 증후군 치료 효과를 넉아웃 마우스를 통해 측정하였다.
이듀로네이트-2-설파타제의 투여는 정맥내, 근육내, 경구 또는 복막내 투여를 포함한 어떠한 경로로도 수행될 수 있다. 이때 "투여"는 조직 또는 의사-기관의 자가 이식 또는 이종 이식의 이용을 포함한다. 유전적으로 변형된 섬유아세포 즉, 신-장기(neo-organ)의 자가 이식은 베타-글루쿠로니다제-결함 MPS Ⅶ 마우스 모델의 증상 개선에 효과적인 리소좀 효소의 안정적 발현을 생성하는 것으로 알려져 있다(Moullier et al., Nature Genet. 4:154-159(1993)). 또한 "투여"는 세포로의 단백질 또는 핵산의 전달을 증진시키는 바이러스성, 감염성 또는 화학적인 어떠한 다른 약제의 이용을 포함한다.
본 발명의 마우스 및 방법을 이용하여 평가될 수 있는 헌터 증후군 치료제 형태의 예는 이듀로네이트-2-설파타제(IDS) 또는 IDS 아날로그, 직접적 효소 대치를 포함하고, 생체 내 또는 생체 외 유전자 치료 기술에서 신-장기를 생성하는 IDS 또는 IDS-아날로그, IDS 또는 IDS 아날로그의 근원세포 발현, 이식 및 벡터-매개 유전자 전달의 이용을 포함한다.
도 7은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군에 이듀로네이트-2-설파타제 투여 후 소변 내 글리코사미노글리칸 배설량 나타낸 그래프이다. 도 7에 나타난 바와 같이 이듀로네이트-2-설파타제 투여후 넉아웃 마우스의 소변 내GAG 함량은 대조군에 비해 크게 감소되었으며 투여후 4주후에는 대조군에 비해 소변 내 GAG 함량이 절반이하로 감소하였다. 이를 통해 넉아웃 마우스에 IDS를 투여함으로서 소변 내 GAG 함량을 정상의 범위로 저하시킴을 알 수 있는 것이다.
도 8은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군에 이듀로네이트- 2-설파타제를 생후 11주 후에 투여한 후 체중변화를 나타낸 그래프이다. 도 8에 나타난 바와 같이 생후 11주 후에 IDS를 넉아웃 마우스에 0.5 mg/kg 투여한 후 5주 후인 생후 16주에는 넉아웃 마우스와 정상 마우스가 동일한 체중의 증가를 나타내었다. 그러나 IDS를 투여하지 않은 넉아웃 마우스 대조군의 경우 16주 후의 체중은 정상 마우스의 80% 수준에 불과하였다. 이를 통해 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스에 IDS를 투여함으로서 그 성장을 정상 마우스와 동일하게 유지할 수 있음을 알게된 것이다.
헌터 증후군 치료제 시험 이외에 이듀로네이트-2-설파타제가 존재하지 않는 본 발명의 마우스에서 발생하는 광범위한 조직 병리는 다른 질병 및 이상의 치료 이용되는 타겟된 전달 시스템 시험에 이들 마우스가 유용하게 된다. 예를 들어 뇌로의 치료제의 전달을 위한 타겟 시스템을 시험하고자 하는 경우 이러한 타겟 시스템이 이듀로네이트-2-설파타제와 결합되고 본 발명에 따른 IDS 넉아웃 마우스에 투여된다. 일정 기간 후 마우스 뇌 조직이 이듀로네이트-2-설파타제 결함 관련 병리 및 이듀로네이트-2-설파타제 활성에 대해 조사되었다. 예를 들어 뇌 조직은 현미경 관찰로 비정상 리소좀 축적에 대해 조사되거나 이듀로네이트-2-설파타제 활성에 대해 생화학적으로 분석될 수 있다. 이러한 병리의 부재(또는 대조군 대비 감소)는 특히 IDS -/- 마우스로 IDS의 투여가 뇌 내 효소 활성 증가를 유발한다는 관찰의 관점에서 타겟 시스템이 뇌에 치료제를 효과적으로 전달하는데 효과적임을 나타낸다. 이듀로네이트-2-설파타제 결함 관련 병리에 대한 다른 조직의 조사는 타 겟 시스템의 선택성의 표시를 제공한다.
혈뇌장벽의 존재 및 중추신경계를 구성하는 많은 형태의 세포 때문에 뇌에 대한 타겟 시스템의 조사가 본 발명의 방법의 매우 유의적인 적용이나 본 발명의 방법은 다른 형태의 세포에도 적용될 수 있다. 따라서 예를 들어 신장세포, 간세포 또는 신체의 다른 기관 및 조직에 치료제를 전달시키고자 하는 타겟 시스템은 본 발명의 모델 시스템 및 방법을 이용하여 조사될 수 있다.
타겟 시스템을 조사하는 방법은 치료제에 결합된 호르몬 또는 항체와 같은 타겟-특이적 친화성 표지를 지닌 타겟 시스템 및 세포에 발현 가능한 DNA를 도입시키는 타겟 시스템을 포함한 어떠한 형태의 타겟 시스템에도 적용될 수 있다. 따라서 본 발명은 이듀로네이트-2-설파타제 유전자 또는 cDNA를 전달하도록 주문 제작된 헤르페스 아플리콘(applicon)뿐만 아니라 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 헤르페스 바이러스 벡터와 같은 바이러스 발현 벡터를 시험하는데 유용하다.
또한 본 발명은 양이온성 지질 또는 다른 리포솜 성분과 복합될 수 있는 정제된 이듀로네이트-2-설파타제 효소를 복합시키고 그 생성물을 모델에 투여함으로서 리소좀성 타겟 시스템을 시험하는데 유용하다. 조사될 수 있는 다른 타겟 시스템은 유전적 면역화 및 감염 벡터에 사용되는 비가공 DNA의 전달을 위한 시스템 을 포함한다.
이들 타겟 시스템 각각에서 본 발명의 모델 마우스는 타겟 시스템의 조직 특이적 분포 패턴 및 효능의 지속에 대한 조사를 가능하게 한다. 예를 들어 본 발명의 모델 마우스는 치료적 유전자 도입의 안정성을 연구하는 메커니즘을 제공한다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1) 넉아웃 마우스의 제조
대체 형태의 타겟팅 벡터는 벡터 BluescriptTM 내로 클론된 마우스와 유전자의 게놈 단편으로부터 구축되었다. 타겟팅 벡터의 개요는 도 1에 나타나 있으며 타겟팅 벡터의 제한효소 절단 부위는 도 2에 나타난 바와 같다. 상기 타겟팅 벡터의 카세트는 BluescriptTM 골격 내로 도입되었다. 9회 계대배양된 유전자 타겟을 R1 배아줄기세포에 도입시킨 후 섬유아세포 상에서 성장시킨다. 7×107 세포수/ml의 세포 농도로 희석된 배아줄기세포에 상기 타겟팅 벡터 DNA 25 mg을 첨가한 후 400 V/25 uF 조건으로 전기 충격을 가하였다. 일렉트로포레이션 후 세포는 젤 라틴이 코팅된 배양접시 위에서 네오마이신 및 간시클로버(Ganciclovir) 저항성에 의해 선별되었다.
유전자가 타겟팅된 클론은 C57BL6 마우스의 3.5일 p.c. 배반포 내로 9∼10 세포 주입하였다. 더욱 상세하게는 암수 교배 후 3.5일된 암컷을 경부 탈구법으로 희생시킨 후 자궁을 적출하여 1 ml 주사기를 이용 20 mM HEPES, 10% 소태아혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사용액 1 ml를 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세유리관을 사용하여 자궁 조직으로부터 포배아를 분리하였으며 분리된 포배아를 35 mL 페트리디쉬 위에 옮겨 상기에서 선별된 배아줄기세포 클론을 포배아의 배반포 내에 도입하였다.
상기 클론이 주입된 포배아를 가임신 대리모 마우스 자궁에 이식하여 배아줄기세포 클론 및 C57BL6 마우스의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 마우스의 발생을 유도하였다. 상기한 바와 같이 배아줄기세포가 주입된 포배아를 대리모 마우스 자궁에 이식한 후 약 19일 동안 배양함으로서 배아줄기세포 유래의 형질전환 세포와 마우스 포배아 유래의 세포가 융합되어 IDS +/- 유전자형을 지니는 키메라 마우스를 생성하였다.
이후 상기에서 수득된 키메라 마우스를 C57BL6 마우스와 6차례 이상 교배하면서 F1 단계에서 IDS +/+ 및 IDS -/- 마우스를 제조하였으며 최종적으로 IDS 유전 자가 모두 넉아웃된 IDS -/- 넉아웃 마우스를 제조하였다.
(실시예 2) IDS 넉아웃 마우스의 생리학적 특성 분석
ⅰ) 마우스 소변 내 GAG 함량
생후 38주후 IDS 유전자가 모두 결실된 동형접합성 넉아웃 마우스의 경우 소변 내의 GAG 함량은 140∼200 ㎍/ml의 함량을 보였으며 IDS 유전자 한쪽만이 결실된 이형접합성 넉아웃 마우스의 경우 소변 내의 GAG 함량은 5∼40 ㎍/ml 정도이었다. 따라서 동형접합성 넉아웃 마우스의 소변 내 GAG 함량은 이형접합성 넉아웃 마우스에 비해 약 5∼20배 정도의 함량의 증가를 나타낸다. 이는 동형접합성 넉아웃 마우스 체내에서 IDS 효소의 부재로 인해 GAG가 분해되지 않기 때문에 소변으로 배출되는 함량이 증가하는 것이다.
도 3은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스의 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG) 배설량을 나타낸 그래프이다. 도 3에 나타난 바와 같이 16주령의 이형접합성 형질전환 마우스의 경우 30∼35 ㎍/ml의 GAG 배설량을 나타내었고 38주령의 이형접합성 형질전환 마우스의 경우 15∼20 ㎍/ml의 GAG 배설량을 나타내었다.
ⅱ) 마우스 내장기관의 체중
도 4는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 장기 무게의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 4에 나타난 바와 같이 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스에 있어서 특히 간의 성장은 정상 마우스에 비해 매우 지체되었으며 비장, 폐 등의 기관의 성장 역시 지체되어 그 장기의 무게가 충분히 증가하지 않았다.
ⅲ) 간 및 신장 조직 세포
도 5는 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 간의 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다. 또한 도 6은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군의 신장의 조직학적 분석 결과를 나타낸 사진이다. IDS 넉아웃 마우스의 경우 간 및 신장 조직 내의 세포가 충분히 발달하지 못하였을 뿐 아니라 조직 내의 상당한 리소좀의 축적을 관찰할 수 있었다.
(실시예 3) IDS 넉아웃 마우스에 이듀로네이트-2-설파타제 효소의 투입 효과
IDS 넉아웃 마우스에 이듀로네이트-2-설파타제 효소를 투입하고 소변 내 GAG 함량의 변화를 측정하였다. 도 7은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군에 이듀로네이트-2-설파타제 투여 후 소변 내 글리코사미노글리칸 배설량을 나타낸 그래프이다. 도 7에 나타난 바와 같이 이듀로네이트-2-설파타제 투여후 넉아웃 마우스의 소변 내 GAG 함량은 대조군에 비해 크게 감소되었으며 투여후 4주후에는 대조군에 비해 소변 내 GAG 함량이 절반이하로 감소하였다.
이를 더욱 상세히 살펴보면 IDS를 0.15 mg/kg 투여한 마우스의 경우 대조군에 비해 4주 후부터 현격한 GAG 배설량의 감소를 나타내었으며 IDS를 0.5 mg/kg 투여한 마우스의 경우 3주 후부터 현격한 GAG 배설량의 감소를 나타내었다. 이를 통해 넉아웃 마우스에 IDS를 투여함으로서 소변 내 GAG 함량을 정상의 범위로 저하시킴을 알 수 있는 것이다.
도 8은 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 대조군에 이듀로네이트-2-설파타제를 생후 11주 후에 투여한 후 체중변화를 나타낸 그래프이다. 도 8에 나타난 바와 같이 생후 11주 후에 IDS를 넉아웃 마우스에 0.5 mg/kg 투여한 후 5주 후인 생후 16주에는 넉아웃 마우스와 정상 마우스가 동일한 체중의 증가를 나타내었다. 그러나 IDS를 투여하지 않은 넉아웃 마우스 대조군의 경우 16주 후의 체중은 정상 마우스의 80% 수준에 불과하였다. 이를 통해 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스에 IDS를 투여함으로서 그 성장을 정상 마우스와 동일하게 유지할 수 있음을 알게된 것이다.
본 발명의 효과는 헌터 증후군의 진단과 치료를 위한 동물 모델을 제공하는 것이며 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스를 제조하고 상기 넉아웃 마우스와 대조 마우스간의 각종 생리학적 실험을 통해 헌터 증후군 치료제의 개발을 위한 동물 모델을 제공하기 위한 것이다.
Claims (4)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- ⅰ) 야생형 이듀로네이트-2-설파타제 유전자 (110079 bp)의 대립형질 부위 (12133~21036 bp)를 좌측 팔 (2027 bp), PGK-neo (1800 bp), 우측 팔 (5393 bp)로 구성된 유전자 카세트 (9220 bp)로 치환시킨 타겟팅 벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 타겟팅 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 도입하는 단계; ⅲ) 상기 형질전환된 배아줄기세포를 수정란의 배반포에 주입하는 단계; ⅳ) 상기 형질전환된 수정란을 통해 키메라 마우스를 수득하는 단계; ⅴ) 상기 키메라 마우스를 정상 마우스와 교배시켜 이형접합체 마우스를 수득하는 단계; 및 ⅵ) 상기 이형접합체 마우스의 암수를 교배시켜 이듀로네이트-2-설파타제 유전자가 넉아웃된 마우스를 수득하는 단계로 제조된 이듀로네이트-2-설파타제 기능이 넉아웃된 마우스를 이용하여 헌터 증후군 치료제의 약리 효과를 측정하는 방법에 있어서, 상기 헌터 증후군 치료제의 약리 효과는 이듀로네이트-2-설파타제의 직접적 효소 대치, 유전자 치료 기술을 통한 이듀로네이트-2-설파타제 근원세포의 발현, 세포 이식 및 벡터 매개 유전자 전달로부터 선택하는 것인 헌터 증후군 치료제의 약리 효과를 측정하는 방법
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060109896A KR100884564B1 (ko) | 2006-11-08 | 2006-11-08 | 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060109896A KR100884564B1 (ko) | 2006-11-08 | 2006-11-08 | 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080037543A Division KR20080042058A (ko) | 2008-04-23 | 2008-04-23 | 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060121791A KR20060121791A (ko) | 2006-11-29 |
| KR100884564B1 true KR100884564B1 (ko) | 2009-02-19 |
Family
ID=37707372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060109896A KR100884564B1 (ko) | 2006-11-08 | 2006-11-08 | 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100884564B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120180148A1 (en) * | 2011-01-07 | 2012-07-12 | Jin Thong-Gyu | Transgenic mouse model for developing enzyme replacement therapy for iduronate-2-sulfatase deficiency syndrome |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030022762A (ko) * | 1999-10-26 | 2003-03-17 | 델타젠, 인코포레이티드 | Ｔｒｐ 유전자 파괴를 포함하는 형질전환 마우스 |
-
2006
- 2006-11-08 KR KR1020060109896A patent/KR100884564B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030022762A (ko) * | 1999-10-26 | 2003-03-17 | 델타젠, 인코포레이티드 | Ｔｒｐ 유전자 파괴를 포함하는 형질전환 마우스 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Acta Padiatr. Suppl. 439: 98-99 (2002) |
| Human Molecular Genetics 15(7): 1225-1236 (2006) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20060121791A (ko) | 2006-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sibilia et al. | Strain-dependent epithelial defects in mice lacking the EGF receptor | |
| Threadgill et al. | Targeted disruption of mouse EGF receptor: effect of genetic background on mutant phenotype | |
| Herrmann et al. | Mice with targeted disruption of the fatty acid transport protein 4 (Fatp 4, Slc27a4) gene show features of lethal restrictive dermopathy | |
| JP6030553B2 (ja) | 高度にリン酸化された活性なヒトｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼの製造およびその使用 | |
| de Geest et al. | Systemic and neurologic abnormalities distinguish the lysosomal disorders sialidosis and galactosialidosis in mice | |
| Kawagoe et al. | Glycosylphosphatidylinositol-anchor-deficient mice: implications for clonal dominance of mutant cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria | |
| US7972601B2 (en) | Method of promoting delivery of an antioxidant agent to a cell expression neuroligin | |
| Pook et al. | Rescue of the Friedreich's ataxia knockout mouse by human YAC transgenesis | |
| Kuang et al. | Disruption of thelama2gene in embryonic stem cells: Laminin α2 is necessary for sustenance of mature muscle cells | |
| JP2008541781A5 (ko) | ||
| Yoshida et al. | Pathological characteristics of mucopolysaccharidosis VI in the rat | |
| KR100884564B1 (ko) | 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 | |
| KR20080042058A (ko) | 이듀로네이트-2-설파타제 넉아웃 마우스 및 그의 이용방법 | |
| US6437215B1 (en) | SR-BI and ApoE knockout animals and use thereof as models for atherosclerosis and heart attack | |
| US6002067A (en) | Transgenic mouse model for iduronidase deficiency and methods of making and using same | |
| Tomatsu et al. | Missense models [Gus tm (E536A) Sly, Gus tm (E536Q) Sly, and Gus tm (L175F) Sly] of murine mucopolysaccharidosis type VII produced by targeted mutagenesis | |
| JP7462234B2 (ja) | ムコ多糖症ｉｖａ型の動物モデル | |
| US11970706B2 (en) | Genetically modified rat that expresses an F54L Txn1 mutant | |
| US7642399B2 (en) | Mouse with deficiency of glutamate transporter GLAST function | |
| EP1391506B1 (en) | Animal with gene hypoexpression | |
| Choi et al. | Insertional mutation in the intron 1 of Unc5h3 gene induces ataxic, lean and hyperactive phenotype in mice | |
| WO2012124752A1 (ja) | 正常眼圧緑内障モデル非ヒト哺乳動物 | |
| KR101619815B1 (ko) | 리소좀 효소를 유효성분으로 포함하는 뮤코지방증 ii의 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
| JP2021526019A (ja) | Ｓｔｅｅｌ症候群の齧歯類モデル | |
| Friderici et al. | Mei Zhu1, Kathryn L. Lovell2, Jon S. Patterson3, Thomas L. Saunders4, Elizabeth D. Hughes4 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| N234 | Change of applicant [patent]: notification of change of applicant and registration of full transfer of right | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| AMND | Amendment | ||
| B601 | Maintenance of original decision after re-examination before a trial | ||
| E801 | Decision on dismissal of amendment | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL NUMBER: 2008101002489; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20080325 Effective date: 20081124 Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20080325 Effective date: 20081124 |
|
| S901 | Examination by remand of revocation | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| GRNO | Decision to grant (after opposition) | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |