CN1424044A - 用于防治奶牛乳房炎的基因药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种疾病的基因治疗药物，为包括表达人溶菌酶基因构件的注射剂，能安全、有效、无残留地防治奶牛乳房炎，治疗成本低。

Description

用于防治奶牛乳房炎的基因药物

技术领域

本发明涉及一种疾病的基因治疗药物。

背景技术

乳房炎是奶牛场危害最大、药费最多、防治最难的疾病之一。特别是隐性乳房炎，在临床上无明显的症状表现，需要用特殊的检测方法根据乳汁的性状变化才能变化。乳房炎对奶牛业的危害主要表现为以下几点：(1)感染率和发病率高，根据世界奶协统计，隐性奶牛乳房炎的发病率高达50％左右；(2)不仅降低奶产量(平均降低奶量10-15％)，而且延长产后发情和妊娠时间；(3)降低牛奶的营养成份和品质，影响人体健康，因为病牛乳汁中含有大量的病原微生物及其毒素，食用后可引起发烧、呕吐、腹泻、脱水、过敏等；(4)增加医药费用，扬报道，每例乳腺炎平均需药费23元，若久治不愈，导致奶牛淘汰，损失更大。

奶牛乳房炎的病因十分复杂，主要原因是病原微生物感染，诱发因素包括不规范的饲养管理、挤奶操作、恶劣环境和外伤等。引起奶牛乳腺炎的病原菌多达150多种，主要包括两大类，一类是传染性病原菌，如金色葡萄球菌、无乳链球菌等，约70％的乳房炎是由有这些革兰氏阳性细菌引起；另一类是条件性病原菌，如大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、乳房链球菌等。上述两类病原菌约占乳房炎病原菌的90％以上。

目前治疗奶牛乳房炎的主要方法有抗菌素治疗法、中药治疗法和疫苗免疫法。其中抗菌素治疗是最为普遍的乳房炎治疗方法，常用的药物有青霉菌、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、土霉素、新霉素、环丙沙星以及黄胺类药物等。由于这些药物都具有一定的抗菌谱和乳房炎致病菌的种类复杂，通常需将这些药物进行组合和超量使用，治疗效果一般在50-90％不等。该疗法的主要问题除治疗效果不够确实外，还包括治疗后的牛奶中残留大量抗菌素，根据国家卫生标准抗菌素治疗5天内的牛奶不能饮用；长期使用抗菌素容易导致耐药菌株的出现，不仅治疗效果下降，而且对人类健康不利；多数抗菌素的半衰期不长，需反复用药，治疗成本较高。

随着“无抗奶”运动的兴起，中药治疗奶牛乳房炎显示出较好的前景。目前兽医临床上使用较多的有乳炎康、乳炎消、乳炎必治、消炎醌和绿草素等，治疗方法主要是乳池内注射，治疗效果与抗菌素接近或稍低。中药治疗奶牛乳房炎虽然没有抗菌素残留和耐药菌株等严重问题，但由于使用的中药剂量较大(如每牛每天肌肉注射30～40毫升或每乳区注射400毫克)，奶中残留的高浓度中药对牛奶的品质、品味、后加工、人体健康等都有待进一步研究。其次是治疗成本较高，如乳炎康的治疗成本为30～80元/头。

疫苗免疫预防奶牛乳房炎的设想虽好，但实际效果不佳，目前尚处于研究阶段。有人对国外进口的疫苗进行过试验，结论是只有中等程序的防治效果。国内也有预防奶牛乳房炎的疫苗出售，据报道在6个月的试验期内3次注射疫苗，免疫组(22％)的乳房炎发病率仅较对照组(41.38％)下降19.38％。由于奶牛乳房炎的致病菌种类复杂，加之乳腺的特殊生理结构和特点，研制安全有效的疫苗将是长期和艰巨的任务。

技术方案

本发明的目的在于发明一种价格适中、安全、有效、无有害残留的用以防治奶牛乳房炎的基因药物。

本发明为包括表达人溶菌酶基因构件的注射剂。

本发明的理论依据是人溶菌酶为人奶中正常的营养、抗菌和非特异免疫因子，对革兰氏阳性菌具有直接的杀灭作用，在补体和抗体的参与下对革兰氏阴性菌也有溶解作用，此外还有消炎和促进组织修复等作用，特别适合病原复杂的奶牛乳房炎的防治。发明的基因药物能代替抗菌素使用，使奶牛隐性乳房炎得到有效预防和治疗，临床型乳房炎的发生率显著降低，治疗后的乳汁中不存在有害残留，也不会产生抗药菌株等问题。

上述基因构件的载体为真核细胞表达载体或山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特异表达载体，前者适用于任何时期的防治，更适合于干奶期的预防；后者更适合于产奶期治疗。

考虑到基因构件注射后不应对奶牛乳腺组织造成损害、进入乳汁后不影响饮用和降低治疗成本，基因药物的注射不使用商品化基因转染脂质体，而是溶解于适当浓度的磷酸盐溶液中，因此注射剂为人溶菌酶基因构件与磷酸盐的混合溶液。

具体实施例

基因药物的制备：

1、先从细菌培养中提取和纯化质粒DNA，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值达到1∶1.7以上，RNA、基因组DNA和类毒素等含量符合国家基因治疗有关标准。

2、以人溶菌酶基因分别与真核细胞表达载体、山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特异表达载体形成两种不同的基因构件A和B。

3、分别将150～200微克基因构件A、B与2m1 0.15M磷酸盐溶液均匀混合，制成基因注射剂C、D。

治疗方案及治疗效果：

1、分别对两个表达人溶菌酶基因的基因构件的治疗效果进行初步评估。将7个CMT试验为+++以上的乳区分为2组，I组为4个乳区，用注射剂C，即以真核细胞表达载体形成的表达人溶菌酶基因的基因构件(pTLYZ)治疗，II组为3个乳区，用注射剂D，即以山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特异表达载体形成的表达人溶菌酶基因的基因构件(p205CLYZ3)治疗，每乳池每天1次注射150微克基因构件，连续3天。治疗后第10、20和45天时，两组的治疗有效率分别为4/4和3/3。

2、对基因治疗、抗菌素和中药治疗的效果进行了对比，疗效判定主要以CMT试验为依据。其中，5个乳区为基因治疗组，每乳区3次共注射450微克p205CLYZ3基因构件；4个乳区为抗菌素治疗组，每乳区3次共300万单位青霉素和75微克链霉素；3个乳区为中药治疗组，每乳区3次3次共注射45毫升乳炎消。在治疗后第20天时，3个治疗组的有效率分别为4/5、3/4和3/3。

3、扩大试验，疗效判定除CMT外，还对乳汁中的细菌总数和致病菌数进行了系统测定，并对治疗前后的产奶量进行了统计比较。其中，基因治疗组又分为乳池注射组(I组)和乳区基部注射组(II组)，每乳区3次共注射450微克p205CLYZ3基因构件。抗菌素治疗组每乳池3次共注射300万单位青霉素和75微克链霉素；中药治疗组每乳池3次共注射45毫升乳炎消。以CMT试验结果为判定依据，在治疗后第2天时，基因治疗组的CMT结果变化不明显，而抗菌素治疗组和中药治疗组的CMT结果变化明显。到治疗后第6天时，基因治疗I组和II组的有效率分别为8/8和6/6，治愈率分别为4/8和4/6；抗菌素治疗组的有效率和治愈率均  为5/5，中药治疗组的有效率和治愈率分别为8/10和5/10。到治疗后第10天时，基因治疗I组和II组的有效率分别为6/10。上述各组治疗后的细菌总数及致病菌数也呈明显下降趋势，并与CMT结果相一致。在治疗期间(7天)，乳池基因注射组、乳区基部基因注射组、抗菌素治疗组和中药治疗组的日均奶产量分别较治疗前(7天)增长了3.75、2.91、2.73和1.93公斤，治疗后(7天)分别较治疗前增长了1.51、2.79、2.79和0.33公斤。

经过1个疗程治疗后，患病乳区的红肿和乳汁凝乳块等现象消失，不需进一步处理和治疗。若以CMT结果为依据总结上述试验结果，基因治疗组、抗菌素治疗组和中药治疗组的1疗程有效率分别为86.4％、88.9％和69.2％，基因治疗组和抗菌素治疗组的有效率接近，并明显高于中药治疗组。

4、在上述试验所获结果的基础上，对基因治疗的疗程作进一步摸索，从而进一步提高隐性奶牛乳房炎的治愈率。对CMT试验为阳性和弱阳性的奶牛进行治疗试验，一方面减少临床型乳房炎的发生，另一方面提高奶牛的产奶量。在干奶期，对CMT阳性奶牛进行隐性乳房炎预防试验。

1)采用对乳腺组织损伤较轻、容易被临床兽医掌握的乳池注射法，每天于挤奶后用5％碳酸氢钠溶液清洗乳池，然后每乳池注射250微克基因构件，连续用药2天为1个疗程；以后每隔15天，进行第2和第3疗程。除用CMT试验外，还用体细胞直接计数法检测乳汁中的体细胞数，从而更加客观地评价基因治疗的实际效果，使治愈率达到80％以上。

2)在1)的基础上，对CMT阳性和弱阳性的乳区进行较大规模的治疗，除跟踪检测治疗后的CMT指标外，重点统计治疗后的产奶量变化和临床及隐性乳房炎发生情况，使治疗奶牛的日均奶产量增加2公斤，临床及隐性乳房炎的发病率控制在10％以内。

3)选择乳房炎高发奶牛群，在干奶期进行基因注射，注射途径为乳腺基部注射，每次注射pTLYZ基因构件200微克，连续2天为1个疗程。20天后进行第2个疗程。然后在产奶期，以CMT试验和直接体细胞计数为依据，统计临床型和隐性乳房炎的发生率，使其控制在10％以内。

Claims (3)

1、用于防治奶牛乳房炎的基因药物，其特征在于，所述基因药物为包括表达人溶菌酶基因构件的注射剂。

2、根据权利要求1所述药物，其特征在于，所述基因构件的载体为真核细胞表达载体或山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特异表达载体。

3、根据权利要求1所述药物，其特征在于，所述注射剂中含有磷酸盐。