CN1420111A

CN1420111A - 一类萘茜衍生物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN1420111A
Application number: CN 01132243
Authority: CN
Inventors: 陆群; 段文虎; 蔡俊超; 刘卫军; 丁健
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2003-05-28
Anticipated expiration: 2021-11-20
Also published as: CN1199931C

Abstract

本发明提供了一类萘茜衍生物，该类化合物可通过消旋体紫草素于惰性溶剂中在有机碱及缩合剂存在下与酸起反应获得。经药理试验证实该类化合物为端粒酶抑制剂，能抑制端粒酶的活性，抑制肿瘤细胞生长，可用作癌症治疗药物使用。

Description

一类萘茜衍生物及其制备方法和用途

所属技术领域

本发明涉及萘茜类衍生物的合成以及用途。

背景技术

在当今世界上大多数国家中，癌症是危害人类生命的主要疾病之一。尽管目前为止已有数十种化疗或辅助抗癌药物用于临床治疗，但大多药物只能使病情缓解，无法达到治愈的目的。虽然一些儿童的癌症或人皮肤癌有治愈或长期缓解的可能，但大多数死亡率很高而又常见的癌症如胃癌、食道癌肺癌等仍缺乏有效的抗癌药物。

抗癌药物研究的依据是人们对癌症生物学的理解，早期大多数药物发展着眼于细胞分裂分化和免疫等环节。近年来，肿瘤生物学进展迅速，科学家发现，哺乳类细胞其细胞分化成熟，每次分裂都会失去染色体末端的端粒DNA，正常细胞会随着端粒的缩短，达到一定周期，自动凋亡。但肿瘤细胞会不断分裂，端粒DNA不见缩短。这是由于端粒酶不断合成端粒DNA的缘故。大多数正常细胞都没有端粒酶活性，因而肿瘤细胞的端粒维持机制和途径就成了抗肿瘤药物设计的主要靶点。

目前临床上尚没有以端粒酶为靶酶的抗肿瘤药物，但已有多个化合物正处于临床研究或临床前研究。从目前的分析看，这些抑制剂的结构各不相同，没有较明显的共同构效关系。天然产物紫草素的酰化衍生物已有报道，但消旋体紫草素的酰化衍生物，尤其是芳杂酸衍生物及其它结构改造物未有报道。与本发明相近化合物有专利WO09703940，WO09502572。

发明内容

本发明的目的是寻找一类能抑制端粒酶活性并具有抗肿瘤作用的萘茜类化合物。本发明的另一目的是供该类化合物在治疗肿瘤药物中应用。

这类萘茜化合物具有如下结构通式：

R为H，链烷酰基，芳酰基，芳杂酰基。

X为O时，R为H，链烷酰基，芳酰基，芳杂酰基。

更具体，R为乙酰基，丁酰基，苯甲酰基，月桂酰基，异辛酰基，2-呋喃甲酰基，十一烯酰基，2-萘氧乙酰基，2-吲哚乙酰基，烟酰基，苯氧乙酰基，1-萘甲酰基，2-萘甲酰基。

当X为O，R为H时，化合物I为消旋体紫草素，它可由天然产物紫草素和异紫草素混合得到，也可参照文献(Akira Terada et al.Bull.Chem.Soc.Jpn.1987，60，205-213；Sigen Torrri et al.Bull.Chem.Soc.Jpn.，1995，68，2917-2922；)由合成方法获得.

X为O时，R为酰基时的结构通式由以下步骤制得(反应式1)：

反应式1

如反应式1所示，化合物I与酸在惰性溶剂中反应得到酯化物II。反应通常在四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、氯仿(CHCl₃)、苯、甲苯等溶剂中进行。反应需要在有机碱和缩合剂N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)存在下进行。有机碱可为二乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲胺基吡啶(DMAP)等。反应可在-10-30℃之间进行，通常在室温下反应2-24小时。所得产物经有机反应常规的处理方法如柱层析、重结晶等得纯产物。

运用以上方法合成了13个化合物见表1。

表1(结构数据见实施例)：

化合物结构(R)

SH-2 COCH₃

SH-3 COC₃H₇

SH-4 COPh

SH-5 COCH₂(CH₂)₉CH₃

SH-6 COCH₂(CH₂)₃CH(CH₃)₂

SH-7

SH-8 COCH₂(CH₂)₇CH＝CH₂

SH-9

SH-10

SH-11

SH-12

SH-13

SH-14

1.端粒酶抑制活力测定法(TRAP法)：(1)端粒酶反应底物、PCR引物及内标模板的设计端粒酶反应底物TS：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3’端粒酶反应产物扩增反向引物ACX：5’-GCG CGG[CTT ACC]3 CTA ACC-3’内标模板TSNT：5’-AAT CCG TCG AGC AGA GTT AAA AGG CCG AGA AGC GAT-3’内标反向引物NT：5’-ATC GCT TCT CGG CCT TTT-3’(2)端粒酶的抽提

冰预冷的PBS(磷酸盐缓冲液，PH＝7.2)洗涤细胞两次，悬于适量CHAPS(华美试剂)介导的细胞裂解液[10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM MgCl2，1mMEGTA(乙二醇-双(2-氨基)四乙酸)，0.1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，5mMβ-ME，0.5％CHAPS，10％甘油]；冰浴30分钟，然后在4℃下15000×g离心30分钟，取上清分装速冻于-80℃。蛋白浓度用考马斯亮兰法测定(基因工程实验技术：P261-266第二版，彭秀玲等编，湖南科学技术出版社)。(3)端粒酶活性的测定

将细胞粗提物以ddH2O(DEPC处理)稀释至0.25μg/μl，加2μl于44μl端粒酶活性测定反应体系中[20mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，63mM KCl，0.005％Tween-20，1mM EGTA，50μM脱氧核苷酸，0.1μg TS]。混合液于30℃孵育25分钟，然后85℃变性5分钟失活端粒酶，加入0.1μg ACX，0.1μgNT，0.1amol TSNT，及3u Taq DNA聚合酶。于94℃ 30秒，60℃ 30秒扩增29个循环。PCR产物于10％非变性聚丙烯酰胺(1×TBE)电泳2小时，以SYBRGreen I DNA染料(罗氏试剂)染色30分钟，紫外下观察。

2.无细胞体系中端粒酶抑制剂的筛选

将2μl待筛化合物加入42μl端粒酶活性测定反应体系中，然后加入2μl(0.25μg/μl)HL-60细胞端粒酶抽提液，25℃孵育25分钟，然后85℃变性5分钟失活端粒酶，加入0.1μg ACX，0.1μg NT，0.1amol TSNT，及3uTaq DNA聚合酶。于94℃ 30秒，60℃ 30秒扩增29个循环。PCR产物于10％非变性聚丙烯酰胺(1×TBE)电泳2小时，以SYBRGreen I DNA染料(FMC.Bioproducts，Rockland，ME)染色30分钟，紫外下观察。待筛化合物如为端粒酶抑制剂，端粒酶活性将降低。

测定的活性数据如下：

表2：

化合物结构(R) ^TelIC₅₀(μM)

SH-2 乙酰基 10

SH-3 丁酰基 10

SH-4 苯甲酰基＞20

SH-5 月桂酰基＞20

SH-6 异辛酰基 20

SH-7 2-呋喃甲酰基 20

SH-8 十一烯酰基 20

SH-9 2-萘氧乙酰基＞20

SH-10 3-吲哚乙酰基＞20

SH-11 烟酰基＞20

SH-12 苯氧乙酰基＞20

SH-13 1-萘甲酰基＞20

SH-14 2-萘甲酰基 20抗肿瘤活性测定：分别用磺酰罗丹明B蛋白染色法(sulforhodamine B，SRB)和四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法(抗癌药物研究与实验技术的选择：P284-28，韩锐北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社)对合成的衍生物进行了抗肿瘤活性的初步研究。

SRB是一种蛋白结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的光密度(OD)读数与细胞数成良好的线形关系，故可用做细胞数的定量。人肺癌细胞A-549用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液培养，测定时，将对数生长期的细胞配成细胞悬液，接种于96孔培养板上。实验组每孔分别加入10μl不同浓度的化合物，对照组加等体积含最高浓度溶剂(DMSO)的RPMI-1640培养液，在37℃，5％二氧化碳条件下培养72小时后，用三氯乙酸古固定，每孔加入100μlSRB液，洗去未结合的SRB，用自动化分光光度平板读数计测定OD值。以不加药物的肿瘤细胞组为对照，计算药物对该肿瘤细胞的生长抑制率。

抑制率＝[(对照组-给药组)/对照组]*100％

活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色物质(formazan)，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解formazan后用酶标仪在550nm处测定OD值，可对活细胞计数。本法采用小鼠白血病P388细胞系，实验方法SRB法，培养时间为48小时，数据分析同SRB法。

测定的活性数据如下：表3：

化合物结构(R) A549 P388

SH-2 乙酰基强效弱效

SH-3 丁酰基

SH-4 苯甲酰基

SH-5 月桂酰基

SH-6 异辛酰基强效

SH-7 2-呋喃甲酰基强效

SH-8 十一烯酰基

SH-9 2-萘氧乙酰基

SH-10 3-吲哚乙酰基

SH-11 烟酰基

SH-12 苯氧乙酰基

SH-13 1-萘甲酰基

SH-14 2-萘甲酰基

结果评定：无效：10-5mol/L＜85％

弱效：10-5mol/L＞85％或10-6mol/L＞50％

强效：10-6mol/L＞85％或10-7mol/L＞50％表4：IC₅₀μm K-562 A-549 SGC-7901 BEL-7402 MCF-7 WI-38化合物SH-2 29 39 0.29 0.068 31 73SH-6 18 - 0.001 0.0017 250 -SH-7 17 62 0.0024 0.0014 74 -SH-14 31 390 49 67 93 -

细胞株：K562人白血病，A549人肺癌，SGC7901人胃癌，BEL7402人肝癌

MCF7人乳腺癌，WI38人胚纤维细胞。

如表所示，SH6和SH7对人胃癌，肝癌有较强的活性，而对其它肿瘤细胞作用，较弱，且对人胚纤维细胞作用非常弱，显示其具有较好的选择性。

具体实施方式

例1. 5，8-二羟基-2-(1-乙酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-2)28.8毫克5，8-二羟基-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮溶于2毫升干燥二氯甲烷，加入22.6毫克二环己基碳二亚胺(DCC)和催化量4-二甲胺基吡啶(DMAP)，接着加入6毫克乙酸，室温搅拌3小时，反应液中加入10毫升石油醚，过滤，滤液经减压浓缩，剩余物用硅胶(200-300目)柱层析，石油醚∶醋酸乙酯(10∶1)洗脱，得红色粘状物24毫克.

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.58(s，1H)，12.43(s，1H)，7.18(s，2H)，6.99(m，1H)，6.03(m，1H)，5.25-5.10(m，1H)，2.5(m，2H)，2.13(s，3H)，1.69(s，3H)，1.57(s，1H)

例2. 5，8-二羟基-2-(1-丁酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-3)操作过程同例1，只是用丁酸代替乙酸，得红色油状物：

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.69(s，1H)，12.44(s，1H)，7.19(s，2H)，6.98(m，1H)，

6.04(m，1H)，5.25-5.10(m，1H)，2.4-2.6(m，2H)，2.38(m，2H)，1.69(s，3H)，1.58(s，1H).1.26(m，2H)，0.97(t，J＝7.33Hz，3H).

例3. 5，8-二羟基-2-(1-苯甲酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-4)28.8毫克5，8-二羟基-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮溶于2毫升干燥三氯甲烷，加入22.6毫克二环己基碳二亚胺(DCC)和催化量4-二甲胺基吡啶(DMAP)，接着加入12.5毫克苯甲酸，室温搅拌24小时，反应液中加入10毫升石油醚，过滤，滤液经减压浓缩，剩余物用硅胶(200-300目)柱层析，石油醚∶醋酸乙酯(10∶1)洗脱，得红色粘状物20毫克。

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.61(s，1H)，12.40(s，1H)，8.3-7.3(m，5H)，7.18(s，2H)，7.06(d，J＝1.0Hz，1H)，6.27(m，1H)，5.22(m，1H)，2.68(m，2H)，1.69(s，3H)，1.61(s，3H).

例4. 5，8-二羟基-2-(1-十二烷酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-5)操作过程同例1，只是用十二烷基酸代替乙酸，得红色油状物.

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.57(s，1H)，12.42(s，1H)，7.17(m，1H)，6.99(d，J＝0.92Hz，1H)，6.04(m，1H)，5.15-5.10(m，1H)，2.5(m，2H)，2.39(t，J＝7.33Hz，2H)，1.68(s，3H)

1.58(s，3H)，1.55-1.10(m，18H)，0.88(t，J＝6.3Hz，3H).

例5.5，8-二羟基-2-(1-异辛酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-6)操作过程同例3，只是用异辛基酸代替乙酸，得红色油状物.

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.61(s，1H)，12.44(s，1H)，7.19(s，2H)，6.99(s，1H)，

6.05(m，1H)，5.25-5，15(m，1H)，2.5(m，2H)，1.2-1.6(m，9H)，0.9-1.0(m，6H).

EIMS：414(M+，40)，396(40)，270(100).

例6 5，8-二羟基-2-(1-2-呋喃甲酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-7)28.8毫克5，8-二羟基-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮溶于2毫升干燥甲苯，加入22.6毫克二环己基碳二亚胺(DCC)和催化量4-二甲胺基吡啶(DMAP)，接着加入10.5毫克2-呋喃甲酸，室温搅拌8小时，反应液中加入10毫升石油醚，过滤，滤液经减压浓缩，剩余物用硅胶(200-300目)柱层析，石油醚∶醋酸乙酯(10∶1)洗脱，得红色粘状物29毫克。¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.61(s，1H)，12.43(s，1H)，7.64(t，J＝0.74，1H)，7.26(m，1H)，7.19(s，2H)，7.08(d，J＝1.0，1H)，6.22(m，1H)，5.2(m，1H)，2.68(m，2H)，1.69(s，3H)，1.61(s，3H).EIMS：380(M⁺，10)，270(60)，95(100).

例7 5，8-二羟基-2-(1-十一烯酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-8)操作过程同例1，只是用十一烯酸代替乙酸，得红色粘状物.

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.59(s，1H)，12.42(s，1H)，7.16(s2H)，6.98(d，J＝0.99Hz，1H)，6.00(m，1H)，5.80-5.70(m，1H)，5，25-4，80(m，3H)，2.5(m，2H).2.4-0.83(m，22H).

例8 5，8-二羟基-2-(1-萘氧乙酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-9)操作过程同例1，只是用萘氧乙酸代替乙酸，得红色粘状物.

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.57(s，1H)，12.37(s，1H)，7.79-7.37(m，7H)，7.16(s2H)，6.96(s，1H)，6.28(m，1H)，5.02(m，1H)4.84(s，2H)，2.5-2.4(m，2H)，1.64(s，3H)，1.25(s，3H).

例9 5，8-二羟基-2-(1-3-吲哚乙酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-10)操作过程同例1，只是用3-吲哚乙酸代替乙酸，得红色粘状物.

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.55(s，1H)，12.37(s，1H)，8.14(s，1H)，7.7-7.2(m，7H)6.73(d，J＝0.92Hz，1H)，6.02(m，1H)，5.03(m，1H)，3.9(s，2H)，2.48(m，1H)，1.64(s，3H)，1.50(s，3H).

例10 5，8-二羟基-2-(1-3-烟酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-11)28.8毫克5，8-二羟基-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮溶于2毫升干燥四氢呋喃，加入22.6毫克二环己基碳二亚胺(DCC)和催化量二乙胺，接着加入12.5毫克3-烟酸，室温搅拌8小时，反应液中加入10毫升石油醚，过滤，滤液经减压浓缩，剩余物用硅胶(200-300目)柱层析，石油醚∶醋酸乙酯(10∶1)洗脱，得红色粘状物26毫克。¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.61(s，H)，12.51(s，H)，7.6-7.5(m，4H)，7.20(s，2H)，6.99(m，1H)，5.0(m，1H)，2.48(m，2H)，1.70(s，6H).

例11 5，8-二羟基-2-(1-苯氧乙酰基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-12)

操作过程同例1，只是用苯氧乙酸代替乙酸，得红色粘状物.

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.58(s，3H)，6.9(m，1H)，6.10(m，1H)，5.10(m，1H)，4.72(s，2H)，2.48(m，2H)，1.66(s，3H)，1.58(s，3H).

例12.5，8-二羟基-2-(1-1-萘甲酰基，4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-13)

28.8毫克5，8-二羟基-2-(1-羟基-4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮溶于2毫升干燥苯，加入22.6毫克二环己基碳二亚胺(DCC)和催化量吡啶，接着加入18毫克1-萘甲酸酸，室温搅拌4小时，反应液中加入10毫升石油醚，过滤，滤液经减压浓缩，剩余物用硅胶(200-300目)柱层析，石油醚∶醋酸乙酯(10∶1)洗脱，得红色粘状物34毫克。

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.67(s，1H)，12.44(s，1H)，8.66(s，1H)，8.08-7.39(m，6H)，7.19(s，2H)，6.4(m，1H)5.25(m，1H)，2.79-2.66(m，2H)，1.70(s，3H)，1.66(s，3H).

例13. 5，8-二羟基-2-(1-2-萘甲酰基，4-甲基-3-戊烯基)-1，4-萘酮(SH-14)

操作过程同例1，只是用2-萘甲酸代替乙酸，得红色粘状物。

¹HNMR(CDCl₃，AM＝400)：12.67(s，1H)，12.44(s，1H)，8.66(s，1H)，8.08-7.39(m，6H)，7.19(s，2H)，6.4(m，1H)，5.25(m，1H)，2.79-2.66(m，2H)，1.70(s，3H)，1.66(s，3H).

EIMS：442(M⁺，5)，424(10)，270(40)，155(90)，109(100).

Claims

1.一类结构如下的萘茜衍生物

其中X为O

R为乙酰基，丁酰基，苯甲酰基，月桂酰基，异辛酰基，2-呋喃甲酰基，十一烯酰基，2-萘氧乙酰基，2-吲哚乙酰基，烟酰基，苯氧乙酰基，1-萘甲酰基，2-萘甲酰基。

2.根据权利要求1所述萘茜类化合物的制备方法，其特征在于：，可通过消旋体紫草素与不同酸在惰性溶剂中有机碱及缩合剂存在下反应获得不同目的物。

3.根据权利要求2所述的萘茜衍生物的制备方法其特征在于酯化反应的惰性溶剂为四氢呋喃(THF)、二氯甲烷(CH₂Cl₂)、氯仿(CHCl₃)、苯、甲苯。

4.根据权利要求2所述的萘茜衍生物的制备方法其特征在于酯化反应的有机碱为二乙胺、三乙胺、吡啶、4-二甲胺基吡啶(DMAP)。

5.根据权利要求2所述的萘茜衍生物的制备方法其特征在于酯化反应的缩合剂为N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)。

6.如权利要求1所述的萘茜衍生物在制备治疗肿瘤药物中应用。