CN1419601A - 用于复合核酸分析的多功能载体材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到一种用于作为平台技术的复合的核酸操作的材料，该平台技术用来研发用于核酸分析的一体化的全自动化的体系。本发明的用于复合的核酸分析的载体材料的特征在于，在其表面至少有一共价键合层，该层至少携带有二个不同的官能团，这些官能团以统计学的分布在表面上，在此，至少一个官能团是带负电荷的，至少有另一个官能团是正电荷的或化学反应性的或具有二种性质。

Description

用于复合核酸分析的多功能载体材料
本发明涉及一种作为平台技术用于核酸的复合操作的材料，该平台技术用来研发用于核酸分析的一体化的全自动化的体系。
本发明潜在的应用领域涉及在医学诊断学、法医诊断学和食品诊断学领域以及其它相关的科研领域中的许多分子生物学工作实验。
核酸(RNA和DNA)的分析具有越来越重要的意义。它涉及到所有的与分子生物技术相关的科研领域。在医学研究中分子核酸分析的重点是证实在医学上感兴趣的基因的测序，其被视为与病理学的过程有因果关系。
由于存在大量要检测的靶序列，由此必须实施越来越多的高流通量能力的应用。在此对可能的高流通量能力的应用基于DNA-芯片(DNA-阵列)的解决办法越来越多的进入实验核酸分析中。
这种技术的原理是，许多不同的寡核苷酸(探针)按照相应的位置结合到固体相或从新合成固体相。这样所生成的DNA-芯片与怀疑具有相应的所要分析的核酸的试样一起保温。迄今为止用来检测已标记了的总的RNA的表达方式以及用来测序(和排列顺序偏离)的通过PCR产生的DNA-片段进行标记用作为所要分析的核酸试样。(参见US 5837832，US 6027880)。这就是说每个相应的有疑问的具有特异性的低核苷酸探针的DNA芯片覆盖，并且接着与核酸试样杂交。杂交的结果用荧光检测读出和分析利用，这样就提供了所述的核酸序列的详细的信息。
用这种技术可分析大量的序列信息。其缺点是昂贵的费用以及在芯片上存储的低核苷酸探针鉴别相对应的等同序列的准确性质量控制的问题。
这个方法的另一个较大的缺点在于，对于测序而言要分析核酸靶，这必须具有所要检测的靶。这种必要性包括，从相关的试样中分离出i.R.核酸，随后将所要检测的靶序列通过PCR扩增。然后存储了所定义的低核苷酸的芯片与扩增的靶序列杂交。
从GB 2,274,409 A获知一些膜，其结构上具有带正电荷和负电荷的区域。这就是说，具有在空间上互相分开的正电荷和负电荷区域。在各种经典的过滤方法中这些膜被用作为分离介质。然而这些膜对于在核酸操作和-分析的复合过程是不适合的，因为由于正电荷和负电荷区域在空间上的分离使得核酸的提纯、结合以及检测不能在一个地方进行。
所以本发明的任务是，制备一种用于复合核酸操作和核酸分析的新型平台技术中的新载体材料。
该任务可根据本发明如下所述解决，即将迄今为止所用的基于芯片技术的工作原理颠倒过来。本发明将根据主权利要求得以实现，从属要求是优选的方案。本发明涉及到一种二-或多种功能的表面，在这表面上所有的迄今为止对于核酸分析(例如用来顺序分析)必要的过程都可实现。
根据本发明的载体材料的特征在于，在表面上至少有一以共价键键合的层，该层至少有二个不同的官能团，这些官能团以统计学的方式分布在表面上，其中
至少一种官能团是带负电荷的，
至少另一种官能团是带正电荷的或化学反应性的或二种性质都具有。
官能团的统计分布在本发明中理解为，这些官能团在空间上不是互相独立的，而是均匀地分布在载体表面。这有很大的优点，即所有的方法步骤都可在载体材料的一个地方进行。
二-或多功能的固体相的特征是固体相(底物-或载体材料)的化学修饰，固体相至少带二种不同电荷的，都为离子型的官能团或一种带负电荷或正电荷的官能团和一种化学反应性基团，在此后者使得在进行提纯后的目的分子以共价键键合成为可能。化学修饰所使用的过程使得下述情况成为可能，即在相应的表面所具有的官能团(阴离子的、阳离子的、可用来构成共价键键合的)的比例是可调整变动的，所以可以准确的确定的。本发明的最重要的特征是一种带负电荷的官能团与另一种带正电荷和/或化学反应性的官能团结合，这使得下述情况成为可能，即目的分子以共价键结合，并且所有的涉及目的分子进行的提取-、修饰-和检测步骤都在相同的载体材料上实现。根据本发明的对载体材料的修饰通过下述处理进行。
本发明的载体材料的功能性可同时或以任意的顺序先后通过下述的方法制备：
1.生成带负电荷官能团，接着用阳离子官能团进一步修饰(没有热或光化学不稳定的官能团)
2.同时生成具有阳离子功能性的带负电荷官能团(没有热或光化学不稳定的官能团)
3.生成带负电荷官能团，接着用阳离子官能团进一步修饰，接着第三步为用热或光化学不稳定的官能团功能化，
4.同时生成具有阳离子功能性的负电荷官能团，接着用热或光化学不稳定的官能团修饰
5.同时使所有(阴离子、阳离子和热/光化学可活化的)官能团功能化
6.生成负电荷官能团，接着用热或光化学不稳定的官能团进一步修饰。
下面更清楚地解释用来制备根据本发明的载体的方法。
为了生成强负电的官能团，在第一过程步骤中任意一种载体材料在室温下浸入每1000g醇类，优选为异-丙醇中有0.1g-500g氢氧化钠、氢氧化钾或一种其他的强碱性的材料的溶液中一分钟至二个小时，优选为一个小时。接着，从醇溶液中取出的载体材料优选地用水洗涤，直至洗涤溶液变为中性为止，优选地在100℃下干燥30分钟。
在接着的第二个过程步骤中预处理了的载体用一种光敏引发剂涂覆。酮、醇、酯和醚适合作为引发剂的溶剂。在此引发剂的浓度优选为0.01g1-1-0.5gl-1。
将预处理了的和用引发剂涂覆了的载体材料浸入到一种单体溶液中，从单体溶液中取出并且在潮湿的状态下曝光。适合作为能聚合的单体是碳酸-、磺酸-和磷酸衍生物，特别是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸和-磷酸的衍生物或它们的混合物。醇、酮、酯、醚和特别是水以及它们的混合物可用作为单体的溶剂。单体的浓度优选为1gl-1-200gl-1，特别合适的是单体浓度为50gl-1的溶液。
能发射引发剂吸收范围的光线的水银蒸汽灯、高压水银灯、超高压水银灯、卤素灯、钨灯和激光优选用作为曝光光源。曝光时间取决于辐射光源的强度，根据光源的功率可为一瞬间至数小时。
曝光以后洗涤载体材料。用来制备单体溶液的溶剂特别适合作为洗涤液体。最后干燥这样制备了的载体。
为了生成弱阴性的官能团可很大程度上缩短或取消第一步骤。
在接着的第三过程步骤中预修饰了的载体再次用光敏引发剂涂覆。酮、醇、酯和醚可考虑作为引发剂的溶剂。在此引发剂的浓度优选为0.01gl-1-0.5gl-1。预修饰了的和用引发剂涂覆了的载体材料浸入单体溶液中，从单体溶液中取出和在潮湿状态曝光。能聚合的铵-、锍-和磷鎓-衍生物，特别是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯和-乙烯基化合物的衍生物或它们的混合物适合作为单体。醇、酮、酯、醚和特别是水以及它们的混合物可用作为单体的溶剂。单体的浓度优选为1gl-1-200gl-1，特别合适的是单体浓度为50gl-1的溶液。
能发射引发剂吸收范围的光线的水银蒸汽灯、高压水银灯、超高压水银灯、卤素灯、钨灯和激光优选用作为曝光光源。曝光时间取决于辐射光源的强度，根据光源的功率可为一瞬间至数小时。
曝光以后洗涤载体材料。用来制备单体溶液的溶剂特别适合作为洗涤液体。最后干燥这样制备了的载体。
在另一个实施方案中，在光化学修饰时加入阳离子和阴离子单体的混合物和同时聚合。在此在第一步中预处理了的载体或未预处理过的载体用光敏引发剂涂覆。酮、醇、酯和醚适合作为引发剂的溶剂。引发剂的浓度优选为0.01gl-1-0.5gl-1。
预处理过的或未预处理过的和用引发剂涂覆了的载体材料浸入单体混合的-溶液，从溶液中取出和在潮湿状态曝光。能聚合的碳酸-、磺酸-和磷酸-衍生物，特别是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸和-磷酸的衍生物或它们的混合物与能聚合的铵-、锍-和磷鎓-衍生物的混合物适合作为单体。
二-或多功能的单体也可考虑作为单体。
醇、酮、酯、醚和特别是水以及它们的混合物可用作为单体的溶剂。单体的浓度优选为1gl-1-200gl-1，特别合适的是单体浓度为50gl-1的溶液。
能发射引发剂吸收范围的光线的水银蒸汽灯、高压水银灯、超高压水银灯、卤素灯、钨灯和激光优选用作为曝光光源。曝光时间取决于辐射光源的强度，根据光源的功率可为一瞬间至数小时。
曝光以后洗涤载体材料。用来制备单体溶液的溶剂特别适合作为洗涤液体。最后干燥这样制备了的载体。
光不稳定的或热不稳定的官能团的涂覆或者作为在前面的用阴性的和阳性的官能团功能化结束后的最后的步骤进行，或者立即在用阴性的官能团或用阴性的或/和阳性的官能团一起修饰后进行。在此底物(载体)用光敏引发剂涂覆。酮、醇、酯和醚适合作为引发剂的溶剂。引发剂的浓度优选为0.01gl-1-0.5gl-1。预处理过的或未预处理过的和用引发剂涂覆了的载体材料浸入单体混合物-溶液，从溶液中取出和在潮湿状态曝光。
能聚合的自由基发生剂(氮化物、鎓盐、过氧化物、硝基化合物、酮)或它们的混合物，特别是芳香族的叠氮化物或二苯酮衍生物适合作为单体，其在合适的波长下生成光化学的或热自由基，这样共价键结合变成离子结合的核酸。
醇、酮、酯、醚和特别是水以及它们的混合物可用作为单体的溶剂。单体的浓度优选为1gl-1-200gl-1，特别合适的是单体浓度为50gl-1的溶液。
能发射引发剂吸收范围的光线的水银蒸汽灯、高压水银灯、超高压水银灯、卤素灯、钨灯和激光优选用作为曝光光源。曝光时间取决于辐射光源的强度，根据光源的功率可为一瞬间至数小时。
曝光以后洗涤载体材料。用来制备单体溶液的溶剂特别适合作为洗涤液体。最后干燥这样制备了的载体。
通过这在表面上所有的层，其特别地以在表面引发的自由基聚合的方式通过表面的修饰而生成，并且在表面上以共价键结合，相应的功能化了的载体材料优越地适合用于复合的核酸分析。
根据本发明的载体材料使得试样准备、可能的特殊的放大、可能的特殊的控制的全面过程和用来顺序排列确定所必需的杂交反应以及最后的检测在空间上只固定在反应表面进行成为可能。这相对于迄今为止所应用的复合核酸分析技术是一个重要的优点，因为在迄今为止的芯片-方法中所有必要的试样准备、放大和可能的控制一直在空间上分开进行的。迄今为止的芯片-技术的颠倒基于此，即与现有技术不同的是不用生成DNA-芯片，而是根据本发明的方法将要检测的核酸试样固定作为固体相。
这可如下实现，即在裂解缓冲体系中临床上重要的试样和固体相保温，并且在起始材料进行了裂解后，如果需要，在加入另一种缓冲剂后细胞的核酸结合到固体相的阴性官能团上。这之后洗涤结合了核酸的固体相，并且去除对于下面的过程有效的抑制剂。在进一步的方法过程中通过与低盐缓冲体系(例如10mM Tris HCl)保温将核酸与阴性官能团分离而进行待测核酸共价键结合固定到固相。这要引起带负电荷的分离了的核酸由于有负电又要与固体相的正电官能团有相互作用。在表面上的自由基在化学的或光化学的发生下最后达到共价键结合，其又通过H-构型的共价键结合的。
接着可以任意的形式来操作共价键固定了的核酸。在一个实施方案中例如通过碱性变性而生成DNA-单链，并且通过专业人员熟知的杂交方法用特异性的低核苷酸探针进行靶检测，在此杂交结果用根据现有技术已知的方法测定。
通过使用具有不同的检测标记的多个探针那么就可例如非常简单测定许多序列信息。另外通过很严格的洗涤步聚可能再去除探针，以接着重新开始用来证实在核酸试样中其他的靶序列的方法。
显然根据该实施例，本发明的方法对于核酸分析的各个核酸操作原理都能实现。通过复合从试样准备(核酸萃取)到在固体相的检测反应的一体化的过程得出结果，即可容易实现核酸分析的复合自动化，所以是特别优越的。
在下面的一个实施例中更清楚地解释了根据本发明的载体材料的制备。
实施例
带负电荷的和正电荷的(离子的)膜
方案a)依次修饰(相继用负电荷基团和正电荷基团)
DIN A4-型号的聚丙烯膜(孔尺寸为0.2μm)浸入到150mM的二苯酮(光敏引发剂)的丙酮溶液中5分钟，接着将其干燥。接着在一个玻璃盆中用溶于水的20g/l丙烯酸反应溶液涂覆该膜。用玻璃板(深度-UV-滤光器，λ＞310nm)盖住这玻璃盆。10分钟后在一个UV-干燥器(Beltron GmbH)中在半载荷下进行曝光10分钟(10个通道通过曝光区域)。接着膜用甲醇和水萃取。然后干燥和测量重量以确定修饰的程度。
已经用阴性基团功能化了的膜浸入到150mM的二苯酮(光敏引发剂)的丙酮溶液中5分钟，接着将其干燥。接着在一个玻璃盆中用反应溶液涂覆该膜，反应溶液由溶于水的30g/l 2-氨乙基甲基丙烯酸酰胺盐酸酯溶液组成。用玻璃板(深度-UV-滤光器，λ＞310nm)盖住这玻璃盆。10分钟后在一个UV-干燥器(Beltron GmbH)中在半载荷下进行曝光20分钟(20个通道通过曝光区域)。接着膜用甲醇和水萃取。然后干燥和测量重量以确定修饰的程度。
方案b)同时修饰(同时用负电荷和正电荷基团)
DIN A4-型号的聚丙烯膜(孔尺寸为0.2μm)浸入到150mM的二苯酮(光敏引发剂)的丙酮溶液中5分钟，接着将其干燥。接着在一个玻璃盆中用反应溶液涂覆该膜，反应溶液由20g/l丙烯酸和30g/l 2-氨乙基甲基丙烯酸酰胺盐酸酯水溶液构成。用玻璃板(深度-UV-滤光器，λ＞310nm)盖住这玻璃盆。10分钟后在一个UV-干燥器(Beltron GmbH)中在半载荷下进行曝光20分钟(20个通道通过曝光区域)。接着膜用甲醇和水萃取。然后干燥和测量重量以确定修饰的程度。
FTIR-ATR-光谱学：
1720cm-1(C＝O键价振动)碳氧-基团
1650cm-1(C＝O键价振动)酰胺I
1540cm-1(N-H-形变)酰胺II
3300cm-1(N-H-键价振动)氨基-基团(质子化了的)

Claims (36)

1.一种用于复合核酸分析的载体材料，其特征在于，在其表面上至少定位了一共价键连接的层，该层至少具有二种不同的官能团，这些官能团按统计学的规则分布在其表面上，其中
至少一个官能团是带负电荷的，
至少另一种官能团是带正电荷的或化学反应性的或具有二种性质。
2.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于，至少一个位于表面上的层除了含有至少一种带负电荷官能团外还含有至少一种带正电荷的官能团。
3.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于，至少一个位于表面上的层除了含有至少一种带负电荷官能团外，还含有至少一种化学反应性的官能团。
4.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于，至少一个位于表面上的层除了含有至少一种带负电荷官能团外，还含有至少另一种官能团，它不仅是带正电荷的而且具有化学反应性的。
5.根据权利要求1所述的载体材料，其特征在于，至少一个位于表面上的层除了含有至少一种带负电荷官能团外还含有至少一种带正电荷官能团和至少一种具有化学反应性的官能团。
6.根据权利要求1-5所述的载体材料，其特征在于，至少一种带负电荷的和/或正电荷的官能团是一种离子官能团。
7.根据权利要求1-6所述的载体材料，其特征在于，位于表面上的带负电荷官能团是由具有羧基-、磺酰基-、硫酸根-和磷酸根基团的能聚合的化合物组成，特别是由丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸和-磷酸、丙烯酰胺丙磺酸的衍生物和/或它们的混合物组成。
8.根据权利要求1，2和4-7所述的载体材料，其特征在于，带正电荷的官能团是由具有氨-或铵-、锍-或磷基团的能聚合的化合物组成的，特别是由丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯的衍生物和/或它们的混合物组成的。
9.根据权利要求1和3-8所述的载体材料，其特征在于，具有化学反应性的官能团是可化学的和/或热的和/或光化学活化的。
10.根据权利要求1和3-9所述的载体材料，其特征在于，具有化学反应性的官能团是由固定化了的敏化剂如酮，特别是二苯酮、二苯乙醇酮、氧杂蒽酮构成，或由脂肪族的或芳香族的氮化物组成。
11.根据权利要求1和10所述的载体材料，其特征在于，至少一种位于表面上的层另外还含有UV-VIS-吸收光谱活性的物质，特别是如荧光素、若丹明、蒽、芘或它们的衍生物的染料。
12.根据权利要求1-11所述的载体材料，其特征在于，至少一种位于表面上的层是通过在表面上引发的自由基的聚合的方式对表面进行改进而制备，在此同时或以任意的顺序产生功能性，并且在表面以共价键结合。
13.根据权利要求1-12所述的载体材料，其特征在于，至少一种位于表面上的层通过功能单体的不均匀的光引发的嵌段聚合而制备。
14.根据权利要求1-13所述的载体材料，其特征在于，H-构型的物质用作为光敏引发剂，载体材料用作为共引发剂，并且通过光激发光敏引发剂而进行引发。
15.根据权利要求1-13所述的的载体材料，其特征在于，至少一种位于表面上的层通过表面上的功能单体的化学引发聚合而制备。
16.根据权利要求1-15所述的载体材料，其特征在于，至少一种在表面上的层含有作为引发剂的一种物质，该种物质在物理的或化学的激发后生成用于聚合的自由基或其他的起始物。
17.根据权利要求1-16所述的载体材料，其特征在于，载体材料的表面上的功能性通过双功能氮化物，如对-叠氮亚苄基磺酸的热的或光化学的活化而得到。
18.根据权利要求1-17所述的载体材料，其特征在于，带正电和负电的官能团相继地涂覆到用光敏引发剂，特别是二苯酮预处理过的载体材料上，特别地用丙烯酸和2-氨乙基甲基丙烯酸酰胺盐酸酯的溶液相继对载体材料，如聚丙烯膜进行涂覆，每一次涂覆后通过曝光而功能化。
19.根据权利要求1-17所述的载体材料，其特征在于，带正电和负电的官能团同时涂覆到用光敏引发剂，特别是二苯酮预处理过的载体材料上，特别地用含有丙烯酸和2-氨乙基甲基丙烯酸酰胺盐酸酯的反应溶液同时对载体材料，如聚丙烯膜进行涂覆，涂覆后通过曝光而功能化。
20.根据权利要求1-19所述的载体材料，其特征在于，有机聚合物如聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、纤维素和它的衍生物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺以及聚合物的共聚物或掺合物用作为载体材料。
21.根据权利要求1-19所述的载体材料，其特征在于，无机的，特别是矿物材料如玻璃、硅酸盐、陶瓷或金属以及它们与有机聚合物的复合物用作为载体材料。
22.根据权利要求1-21所述的载体材料，其特征在于，其反应空间是多孔的或无孔的膜，薄膜、微纤度板、载物片、纤维、中空纤维、无纺布、织物、粉末、粒状颗粒或颗粒用作为载体材料。
23.根据权利要求1-22所述的载体材料，其特征在于，具有对称的或非对称的孔结构和孔径在纳米和10μm之间的膜用作为载体材料。
24.根据权利要求1-19所述的载体材料，其特征在于，在权利要求20-23中所列举出的材料联合用作为载体材料。
25.根据权利要求1-24所述的载体材料，其特征在于，载体材料预先进行附加的功能化，例如进行亲水性处理。
26.根据权利要求1-25所述的载体材料，其特征在于，将载体材料用由强碱性材料，优选为碱金属-氢氧化物或-酰胺和醇，优选为异丙醇组成的溶液预处理24小时，接着洗涤载体材料直至洗涤溶液变为中性，然后干燥。
27.权利要求1-26所述的载体材料在复合的和自动化的核酸分析中的应用，如用于证实突变、用来证实甲基化作用的样本、用来证实SNP’s和/或用来证实限制性的样本。
28.用于生物材料，特别是核酸的复合的和自动化的分析方法，其特征在于，必要的准备-和分析步聚，特别是在同一载体材料上同时或相继进行萃取、化合、操作和检测。
29.根据权利要求28所述的的方法，其特征在于，在蛋白裂解酶的存在下所要检测的起始试样在溶解缓冲液中与载体材料一起保温，在溶解后，适当条件下掺入结合缓冲液，起始试样的核酸结合到带负电的官能团上，接着洗涤，然后通过加入缓冲液，特别是低盐缓冲液而结合到带正电的官能团上。
30.根据权利要求28和29所述的方法，其特征在于，在蛋白裂解酶的存在下所要检测的起始试样在溶解缓冲液中与载体材料一起保温，在溶解后，适当条件下掺入结合缓冲液，起始试样的核酸结合到带负电的官能团上，接着洗涤，然后通过光作用和/或热处理而结合到化学反应性的基团上。
31.根据权利要求28-30所述的方法，其特征在于，对载体材料上结合的核酸进行操作，特别是进行变性、化学修饰、复制、选择性复制或用限制酶消化。
32.根据权利要求28-31所述的方法，其特征在于，对载体材料上结合的核酸用特异性探针杂交。
33.根据权利要求28-32所述的方法，其特征在于，对载体材料上结合的核酸在操作后用特异性探针杂交。
34.根据权利要求28-33所述的方法，其特征在于，用所用的已标记的探针间接酶解进行杂交检测。
35.根据权利要求28-34所述的方法，其特征在于，用标记探针直接进行杂交的检测。
36.用于生物材料，特别是核酸的分析的试剂盒，其特征在于，应用权利要求1-26的载体材料和/或权利要求28-35的方法以及其他的反应成分进行核酸分析。
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