CN1417335A - 脱水素基因BcDh1及其启动子在培育耐旱植物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明克隆了厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)一个新的759bp长的脱水素基因及该基因5’端调控序列1159bp。该基因为脱水素家族SK2类型成员，命名为BcDh1。此基因受干旱和寒冷诱导表达，其编码蛋白脱水素在植物干旱情况下与细胞内一些糖醇类小分子协同作用，保护细胞膜和生物大分子，从而帮助植物细胞抵抗干旱胁迫，提高植物的耐旱性。这个基因的5’端调控序列含有干旱、寒冷、热激及ABA反应等元件，命名为BcDh1P，可以用作逆境胁迫诱导的基因调控元件，用于抗逆性基因工程育种。我们构建了该基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导和基因枪的方法将此耐旱基因导入各类植物中，提高了植物的耐旱耐寒性。
Description
本发明克隆了厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifolia Hemsl.)一个新的759bp长的脱水素基因及该基因5’端调控序列1159bp。该基因为脱水素家族SK2类型成员，命名为BcDh1，其启动子命名为BcDh1P。此基因受干旱和寒冷诱导表达，其编码蛋白脱水素在植物干旱情况下与细胞内一些糖醇类小分子协同作用，保护细胞膜和生物大分子，从而帮助植物细胞抵抗干旱胁迫，提高植物的耐旱性。这个基因的5’端调控序列含有干旱、寒冷、热激及ABA反应等元件，可以用作逆境胁迫诱导的基因调控元件，用于抗逆性基因工程育种。我们构建了该基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导和基因枪的方法将此耐旱基因导入各类植物中，提高了植物的耐旱耐寒性。
脱水素是一种广泛存在于高等植物的干旱、寒冷诱导蛋白。我们根据已知的植物脱水素基因保守区域设计引物，采用RT-PCR方法从厚叶旋蒴苣苔总RNA中扩增出一个500bp与植物脱水素基因同源的序列。利用5’RACE技术获得了植物脱水素基因家族的一个新成员BcDh1的全长cDNA(759bp)，并对该基因的表达特性进行了分析。Southern杂交分析表明BcDh1基因在厚叶旋蒴苣苔基因组中以单拷贝形式存在。Northern杂交结果表明，该基因的表达受干旱、寒冷及ABA的诱导。将BcDh1基因克隆到高效原核表达载体pET-30a上，利用IPTG诱导使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，实验表明BCDH1蛋白有很强的热稳定性。将BcDh1基因置于CaMV35S启动子调控下，通过冻融法转化土壤农杆菌LBA4404，再利用叶盘法转化烟草得到了转基因烟草植株。将BcDh1基因置于Ubiquitin启动子调控下，通过基因枪转化草坪草和牧草，得到转基因植株，并初步表现耐旱耐寒性能提高。通过连接介导PCR的方法，克隆到BcDh1基因上游的一段1031bp的序列BcDh1P，将它连接到含有GUS报告基因的中间表达载体pCAMBIA1350中，对转基因烟草中GUS表达的分析表明，BcDh1P能对ABA、干旱和寒冷做出反应。
本发明的主要创新之点在于(1)首次从厚叶悬蒴苣苔中克隆了一个脱水素基因BcDh1；(2)首次从厚叶悬蒴苣苔中克隆了脱水素基因BcDh1的5’端调控区BcDh1P；(3)构建了BcDh1基因的适合于双子叶和单子叶植物的表达载体，通过农杆菌介导和基因枪的途径使植物表达该基因的编码蛋白，从而提高这些物种的耐旱耐寒性能。
本项发明的技术要点之一是从厚叶悬蒴苣苔中克隆BcDh1基因。根据脱水素类基因富含赖氨酸的保守区EKKGIMD(E)KIKEKLPG设计简并引物43217：5’T
GGATCCG GA(A/G)AA(G/C)AT(T/C/A)AA(G/C)GA(A/G)AA 3’
BamHI E K I K E用43217和mRNA 3’端的锚定引物43218 5’GCG GCC GCT(18)3’。采用TRIzol试剂从干旱胁迫处理后的厚叶旋蒴苣苔提取叶片总RNA，加DNaseI消化去除残存DNA，用引物43128逆转录合成cDNA第一链后用引物43127和43128进行PCR反应。样品经94℃预变性5min，然后按照下列参数进行PCR：94℃30s，53℃30s，72℃20s，30个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收特异片段，连入pGEM-T Easy载体，用ABI377自动分析仪进行序列分析。为了通过5’RACE的方法获得BcDh1基因的5’端，参照文献(Kimura Y et al，1996)合成上游引物(46121)5’GGC CCG ACGTCG CAT G 3’和锚定引物(46122)5’GGC CCG ACG TCG CAT GAA TTC(12)3’，基因特异引物(43513)5’TTG GAT TCT CAG TGG CAT GC 3’和(43514)5’TAC ACT TCC TCG GTC TTC TTG 3’。采用TRIzol试剂从干旱胁迫处理后的厚叶旋蒴苣苔提取叶片总RNA，加DNaseI消化去除残存DNA，用引物43128逆转录合成总cDNA第一链，玻璃奶纯化后用磷酸转移酶将polyA加到cDNA链的5’末端，接着以加尾的cDNA链为模板PCR扩增。第一次PCR反应使用引物46122和引物43513，反应条件是：94℃预变性5min，94℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环；720C延伸10min。将所得的PCR反应产物稀释100倍，以之为模板，使用引物46121和基因特异引物43514进行嵌套PCR扩增，反应条件是：940C预变性5min，940C 30s，550C 30s，720C 20s，30个循环；720C延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测后，纯化回收特异片段，连入pGEM-T Easy载体，用ABI377自动分析仪进行序列分析。
本项发明的要点之二是BcDh1基因的5’端调控区PB启动子的克隆。厚叶旋蒴苣苔总DNA分别用BamH I、Bgl II、Bcl I、Xho I和Sal I酶切，连上相应的接头，两轮PCR后只有经过Xho I处理的厚叶旋蒴苣苔总DNA能扩增出特异片断，将该片段琼脂糖凝胶电泳回收连接到pGEM-T Easy载体上，筛选阳性克隆并测序。染色体步行法得到的BCDH1基因上游调控区长为1031bp，分析该序列，可见它包有两个TATA盒，两者相距约120bp；另有一个15bp的顺式重复，序列为AAATCAAAGCTTCCA，分别位于-136和-236处。为了研究所获得的BcDh1基因上游调控区启动子活性，设计引物K22125和K22542以厚叶旋蒴苣苔总DNA为模板，扩增出长为1159bp的片段，该片段包含BcDh1基因编码区的部分序列，序列的3’端添加了一个NcoI的酶切位点。扩增片段克隆到pGEM-T Easy载体上，测序结果与源序列一致。
本项发明的要点之三是植物表达载体pBI121BcDh1和pAHC-BcDh1的构建。将连接在pGEM-T Easy载体上的BcDh1基因编码区用Nco I和Sac I切下来，连接到用Nco I和Sac I处理过的原核表达载体pET-30a上，构建表达BcDh1蛋白的质粒pET-30aBcDh1，转化大肠杆菌E.coli DH5α菌株，筛选正确的克隆。用Bg1 II和Sac I消化质粒p30aBcDh1，回收BcDh1片段，将它连接到用BamH I和Sac I消化过的质粒pBI121中，形成pBI121BcDh1，将它连接到用BamH I和Sac I消化过的质粒pAHC25中形成pAHC-BcDh1。载体构建流程见图1：植物表达载体pAHC-BcDh1的构建流程。
在本发明的一个实施方案中，BcDh1基因置于CaMV35S启动子的驱动下，以NPTII基因为标记基因，构建植物表达载体pBI121BcDh1。将此质粒转化农杆菌LBA4404，得到含有此质粒的农杆菌，并侵染烟草叶子，共培养两天，转入筛选培养基，2周后伤口处有愈伤组织形成，4周左右陆续从愈伤组织分化出小苗，苗长至2cm左右时，将小苗切下移入含抗生素的生根培养基中生根。在生长初期，提取烟草叶片总DNA，利用PCR扩增BcDh1基因的特异片段，得到阳性植株。
在本发明的一个实施方案中，BcDh1基因置于Ubiquitin启动子的驱动下，以bar基因为标记基因，构建植物表达载体pAHC25BcDh1。pAHC25BcDh1质粒大量提取后，用于基因枪转化草坪草、牧草等单子叶植物。转化过程包括种子或幼穗诱导愈伤组织、基因枪轰击、抗性愈伤筛选、苗的分化、植株鉴定。种子诱导愈伤的步骤：成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养，继代愈伤可供基因枪转化；幼穗诱导愈伤的步骤：取长约0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超净台内剥出幼穗，接种于诱导诱导培养基上，形成愈伤后，每20天继代培养一次，供基因枪转化；基因枪的转化及苗的分化：质粒：提取的质粒浓度调整为1μg/μL。子弹配制：30mg金粉或钨粉加1mL 100％乙醇旋涡洗涤15分钟，无菌水洗3次，加500μL 50％甘油备用。取上述钨或金粉悬液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亚精胺，旋涡，冰上静置15分钟，离心数秒，70％乙醇142μL洗一次，离心数秒，100％ 140μL乙醇洗一次，离心数秒，加50μL 100％乙醇，供5枪用。供试基因枪：PDS-1000/He(美国伯乐公司)基因枪可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25InHg，6cm射击距离，每皿射击一枪。枪击前的愈伤组织在含0.4M甘露醇的继代培养基上培养4～8小时，枪击16小时后移入正常继代培养基。枪击后的愈伤组织一周后转至含除草剂2-5mg/L的继代筛选2～4轮，每轮20天。筛选后得到的抗性愈伤组织转入含50g糖的培养基中，光照培养20天，然后转入去掉2，4-D的分化培养基中分化成苗。当小苗长到4-5片叶时，取少量叶片提取植物总DNA，进行PCR检测。小苗长至5～10cm大小时，移入蛭石∶松针土为1∶1的土中，塑料袋保温一周后，苗即成活。
在本发明的一个实施方案中，BcDh1基因置于BcDh1P启动子的驱动下，以bar基因为标记基因，构建植物表达载体pAHCP-BcDh2。pAHCP-BcDh2质粒大量提取后，用于基因枪转化草坪草、牧草等单子叶植物。转化过程、抗性植株筛选及PCR检测方法同上。
此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代号为pT-BcDh1，保藏编号为CGMCC NO.0837，保藏日期为2002年11月22日。
Claims (6)
1、厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifoilia Hemsl.)一个759bp长的脱水素基因(BcDh1)及该基因5’端调控序列1159bp(BcDh1P)。该基因及其5’端调控序列的全长和部分序列均在权利要求之内。
2、根据权利要求1。使用此基因构建的植物表达载体，启动子为BcDh1P、Ubiquitin、actin、CaMV35S或其它植物启动子，在本专利权利要求之内。
3、根据权利要求1。使用此基因启动子BcDh1P全部或部分序列驱动目的基因构建的植物表达载体，目的基因为耐旱、耐寒、耐盐碱等抗逆性相关基因，在本专利权利要求之内。
4、根据权利要求1。使用此基因或其启动子构建的植物表达载体，标记基因为bar、hptII、NPT II等植物常用标记基因，在本专利权利要求之内。
5、根据权利要求1。将此基因作适当突变或偏爱密码子改造后的基因，亦在本专利权利要求之内。
6、根据权利要求1。将此基因或其启动子构建的植物表达载体通过基因枪或农杆菌介导的遗传转化得到耐旱耐寒植株的方法，亦在本专利权要求之内。
Priority Applications (2)
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| CN 200310115055 CN1245511C (zh) | 2002-11-26 | 2003-11-24 | 脱水素基因BcDh1及其启动子在培育耐旱植物中的应用 |
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|---|---|---|---|---|
| CN100366634C (zh) * | 2004-12-30 | 2008-02-06 | 中国农业科学院作物育种栽培研究所 | 植物脱水应答元件结合蛋白及其编码基因与应用 |
| CN105452273A (zh) * | 2013-09-27 | 2016-03-30 | 创世纪种业有限公司 | 一种小盐芥脱水素蛋白dh5及其编码基因与应用 |
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