CN1417331A - 生物钢基因及其编码的蛋白质 - Google Patents

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樊宝良
许红韬
曹更生
李宁
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Abstract

本发明为一种生物钢基因及其编码的蛋白质，涉及一种人工合成的基因及其编码的蛋白质。本发明的目的是提供一种生物钢基因及其编码的蛋白质。本发明提供的生物钢单体基因是序列1的核苷酸序列。它编码的是序列2的蛋白质。序列3及序列5均是序列1的多聚体核苷酸序列，分别编码序列4和序列6的蛋白质。含有序列1或其多聚体的质粒，生物细胞，包括微生物细胞、动物细胞、植物细胞，尤其是大肠杆菌和动物细胞以及其他的生物反应器均受本发明的保护。本发明还提供了一种由核苷酸单体序列获得多聚体序列的方法。本发明为今后利用牛、羊乳腺反应器和昆虫等其它生物反应器生产蛛丝蛋白奠定了基础。

Description

生物钢基因及其编码的蛋白质
技术领域
本发明涉及一种人工合成的基因及其编码的蛋白质，特别是涉及一种生物钢(用于制造人工纤维的一种蛋白)基因及其编码的蛋白质。
背景技术
蜘蛛丝是已知最为坚韧且有弹性的天然动物纤维之一，具有优异的机械性能。它的强度非常高，一根直径5mm的牵丝可以拉下一架全速飞行的波音747飞机。蜘蛛丝还具有弹性好、耐腐蚀、耐低温、抗酶解等特性，因此在军工、医疗、建材、航天、航海、汽车、建筑、纺织等行业具有广阔的应用前景。例如可以利用蛛丝制造强度高、重量轻的防弹背心，生产斜拉大桥的拉索、医用线、汽车外壳等，据估计蛛丝潜在的市场需求高达数百亿美元。随着基因操作和蛋白质测定等新技术的发展，人们正逐渐揭开蛛丝蛋白的奥秘。
科学家们对肖蛸科棒络新妇蛛(Nephila clavipes)[又被称为金纺者(Goden-Weaver)]进行了较深入的研究，结果表明，蜘蛛至少分泌7种蛛丝，七种蛛丝通过七种不同的腹部腺体分泌，且作用各不相同。
A、牵丝(Dragline silk)：由主壶腹腺(Major ampullate gland)分泌。主要用于形成蜘蛛的救生丝和构成蜘蛛网的框架。
B、辅助丝(Accessory fiber)：由小壶腹腺(Minor ampullate gland)分泌。主要用于蜘蛛网加固。
C、粘着丝(Viscid silk)：由柔软纤丝腺(Flagelliform gland)分泌。也称为柔软纤丝，主要用于构成蜘蛛捕捉丝。
D、粘性胶(Viscid glue)：由聚集腺(Aggregate gland)分泌。主要用于构成蜘蛛捕捉丝的包膜。
E、子囊丝(Cocoon silk)：由柱状腺(Cylindrical gland)分泌。
F、成簇丝(Swatching silk)：由葡萄状腺(Aciniform gland)分泌。
G、附着丝(Attachmen silk)：由梨状腺(Pyriform gland)分泌。
上述蛛丝中，牵丝和柔软纤丝由于具有独特的机械特性，引起了人们极大的关注。
牵丝由蜘蛛主壶腹腺分泌，主要用于形成蜘蛛的救生丝和蜘蛛网的框架。其结构20％-30％为结晶态。牵丝的强度非常大(见表1)，拉伸强度为4×109Nm-2，与目前最强的人造纤维聚对苯二酰对苯二胺(Kelvar，用于制造防弹背心)强度相当，比相同直经的钢丝大5倍。同时它的弹性也较大，约为30％。牵丝不溶于一般的酸、碱，不被蛋白酶降解，但可溶解于高电离试剂如LiSCN、LiClO4、也可溶于88％的蚁酸。溶解的蛋白质经过透析和适当的溶剂沉淀，再经过针头又可形成牵丝。牵丝非常耐寒，只有温度达到-50℃--60℃才会断裂。可见，牵丝是一种强度极大、弹性优良、重量轻、可生物降解、耐低温的环保型蛋白纤维，是未来发展的新型材料之一。
         表1：蛛丝于其它物质机械性能的比较
材料        强度(Nm-2)    弹性(％)   硬度(JKg-1)
牵丝        4×109        35         1×105柔软纤丝    1×109        ＞200      1×105辅助丝      1×109        5          3×104Kelvlar     4×109        5          3×104Tendon      1×109        5          5×103尼龙        7×107        200        6×104橡胶        1×106        600        8×104
牵丝是分子量高达300000的复合蛋白，主要由甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸、亮氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等氨基酸残基组成。其中甘氨酸占42.89％，缬氨酸占26.32％。美国怀俄明大学Lewis对Nephila clavipes牵丝C末段部分序列研究发现，牵丝是由Masp1和Masp2两种蛋白按3∶2的比例结合在一起构成的。Masp1由一个33个保守氨基酸序列重复构成，Masp2由一个35个保守氨基酸序列重复构成。
Masp1  GGAGQGGYGGLGGQGAGRGGLGGQGAGAA5
Masp2  (GPGGYGPGQQ)2GPSGPGSA8
Masp1和Masp2重复序列一般包括3个主要的结构单元：1)GPGGX/GPGQQ；2)GGX；3)poly-Gla-Ala/polyAla。蜘蛛丝的蛋白不存在随机区域，每一个结构单元都会与特定的二级结构甚至高级结构相对应。而且在进化上具有极高的保守性。poly-Gla-Ala/polyAla结构是β-折叠。通过核磁共振、X衍射研究表明，β-折叠平行于纤维轴连接在一起构成β-折叠片层。在收缩状态时这种定向是无序的，伸展时恢复折叠。这种交联的β-折叠结构是纤维的结晶区，它起到将不同的蛋白分子结合在一起的作用，其所占的比例与纤维的强度成正比。Poly-Ala结构形成的纤丝强度要高于poly-Gly-Ala结构。GGX序列形成一个3氨基酸的螺旋结构，起到分子内部β-折叠(不同的结构域)的转换和连接，以及蛋白分子间的连接。GPGXX序列参与形成β-转角结构。该结构与纤维的弹性有关，重复次数在9-43之间，与弹性即伸展能力成正比，该结构只存在于主壶腹部牵丝蛋白和柔软纤丝蛋白中。Masp1和Masp2的同源性达80.8％。在Masp1中重复序列主要是poly-Gla-Ala、polyAla、GGX。Masp2中的重复序列主要是GPGGX/GPGQQ、polyAla、GGX。Masp1中β-折叠较Masp2含量高，因此强度要大于Masp2。Masp2中由于Gly-Gly-X螺旋较少，限制了Masp2中β-折叠的数量，使其呈旋转状态，强度稍差，但由于它含有较多的GPGGX/GPGQQ，所以弹性要大于Masp1。
与Masp1和Masp2对应的基因分别为Spidorin1和Spidorin2。两个基因的3’端十分保守，这种序列的保守性可能是腺体特异性表达或可溶性结晶的信号。Spidorin1和Spidorin2基因同源性达73.9％。
柔软纤丝由柔软纤丝腺分泌，是构成蜘蛛捕捉丝的主要成份。柔软纤丝的强度一般为1×109Nm-2，比牵丝小，但伸缩高达200％，远远大于牵丝的几倍。柔软纤丝的机械特性见表1。柔软纤丝主要由甘氨酸和脯氨酸组成，两种氨基酸残基含量超过其氨基酸残基总量的60％。N末端为15-50个残基的信号肽，有助于蛋白质从内质网中分泌出来并排出细胞膜外。柔软纤丝可以划分成三种重复单元，有两种富含甘氨酸的重复单元和一种非富含甘氨酸的重复单元，最常见的是5肽重复(Gly-Pro-Gly-Gly-X)，此五肽前四个氨基酸在重复间保守性较强，而X常常被丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或缬氨酸替代。Gly-Pro-Gly-Gly-X序列形成II型β-旋转，这种旋转就像发条一样保持其弹性。各螺旋间也出现反转现象，在有反转力的情况下又恢复到正常状态。这种结构使柔软纤丝具有高弹性。柔软纤丝重复单元含有43-63个五肽重复，而牵丝中五肽重复最多只有9个，所以，牵丝的弹性只有柔软纤丝弹性的30％。第二种富含甘氨酸的重复是一个三肽(Gly-Gly-X)，其出现频率比五肽重复低十倍，经常出现在重复和过渡区端之间。前两个甘氨酸保守性较强，但有时会被精氨酸替代，X一般为丙氨酸或丝氨酸。第三种重复是一种长的、较为罕见的序列，是由不同氨基酸残基组成的中间序列，但序列中缺乏甘氨酸残基。由于其分割了富含甘氨酸和脯氨酸的柔软纤丝主要序列，又被称为间隔序列。尽管间隔序列一般为28个氨基酸，但比前两种序列更加保守，序列间一般仅差1-2个氨基酸。虽然密码子具有兼并性，但核苷酸序列也是十分保守的。间隔区富含带负电荷的Asp、Glu，主要促进纤丝与液态聚集丝的结合。柔软纤丝是由重复序列组成的，这些重复序列再组合成大的完整的重复序列。一般是Gly-Pro-Gly-Gly-X重复43-63次，紧接着是6-12次的Gly-Gly-X重复、间隔序列，最后一个为Gly-Gly-X序列。它们组成大约440个氨基酸的大的重复单元。这些重复序列之后是C末端区，该区缺乏重复序列、甘氨酸含量低、出现了半胱氨酸、组氨酸和甲硫氨酸。在2721bp处出现了TAA终止密码子，此后96bp处为多聚腺甘酸序列。
通过内部旋转的相互作用，可以得出两个主要特性：水合及旋转的再组装。水合可以促进螺旋的伸展，因此蜘蛛网一般覆盖一层湿的、非纤维性的聚集腺分泌物。基于五肽旋转重复的第五个可变氨基酸特性分析可以看出，这些弹性旋转是由氢键和疏水键聚集在一起的形成的。水合有两个作用：(1)使疏水键聚集，螺旋收紧，稳定结构；(2)减缓X5(Ser)与转换后X5(Tyr/Val)的氢键，同时还可以减缓破裂。三肽螺旋主要是改变β-旋转的延伸方向。
Hayashi等人克隆了部分柔软纤丝蛋白基因cDNA序列，发现其基因长度大约30kb。包括13个外显子。其中头两个外显子编码非重复N-末端，3至13个外显子长度基本相同，约为1320bp。
因为蜘蛛不能像家蚕那样大规模群体饲养，所以从蜘蛛中收获蛛丝是行不通的。并且由于其分子量巨大，也无法利用化学合成的方法获得。用生物技术的方法生产蛛丝蛋白是获得大量蛛丝的唯一途径。早期的工作是将牵丝蛋白基因的部分cDNA克隆到大肠杆菌内表达，由于DNA的GC含量过高往往造成蛋白表达过程提前终止或缺失，效果并不理想。目前，正开展用人工合成牵丝蛋白基因序列的研究。采用人工合成的牵丝蛋白基因序列好处在于可以人为调整密码子来改善蛋白质的表达。美国杜邦公司的研究人员已分别在大肠杆菌、酵母中进行了人工合成的牵丝蛋白基因序列克隆表达，获得了分子量约为150KD的牵丝蛋白类似物。但是表达量总体来说较低，表达蛋白占总蛋白的5％，产量为1-20mg纯化蛋白/L。除了利用微生物作为宿主进行克隆表达外，有的研究者希望将牵丝蛋白的基因克隆到蚕中表达，使蚕能分泌蛛丝。加拿大魁北克市的Francois Pothier正在开展利用猪的精液生产牵丝蛋白，因为精液中蛋白含量明显高于乳汁。最近，加拿大NexiaBiotech公司克隆了Nephilaclavipes牵丝蛋白基因部分cDNA序列并制作了转基因山羊体，他们获得了两头含蛛丝蛋白基因的转基因羊。该公司希望能从转基因羊奶中提取该蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工合成的生物钢基因及其编码的蛋白质，该蛋白可用于制作具有较强刚性的人工纤维。
本发明提供的生物钢单体基因是序列1的核苷酸序列，由420个核苷酸组成。它编码的是序列2的蛋白质，由137个氨基酸残基组成。
由序列1形成的多聚体属本发明的保护范围。序列3是生物钢基因8聚体核苷酸序列，由3234个核苷酸组成。它编码的是序列4的蛋白质，由1075个氨基酸残基组成。
序列5是生物钢基因16聚体核苷酸序列，由6450个核苷酸组成。它编码的是序列6的蛋白质，由2147个氨基酸残基组成。
含有序列1或其多聚体的质粒，生物细胞，包括微生物细胞、动物细胞、植物细胞，尤其是大肠杆菌和动物细胞以及其他的生物反应器均受本发明的保护。
本发明的另一目的是提供一种由核苷酸单体序列获得多聚体序列的方法。
一种获得多聚体核苷酸序列的方法，是在单体序列的5’和3’端分别各加入一个同尾酶酶切位点后连接到载体上，用其中的一个同尾酶和另外一种载体上的酶切位点的酶切割基因单体克隆，回收外源片断部分，同时用另一个同尾酶和上述另外一种酶切割基因单体克隆回收其载体部分，将上述回收的两部分连接，得到二聚体的核苷酸序列；如此反复便可得到多聚体的核苷酸序列。
所述单体序列为序列1；所述同尾酶为BglII和BamHI；所述载体为T载体；所述载体上的酶切位点为NcoI酶的切点。
本发明依据牵丝蛋白和柔软纤丝蛋白的序列结构特征和模体功能特性，巧妙地进行了人工设计，合成了能够高效表达的生物钢基因，并在大肠杆菌内表达。设计时考虑了以下几个因素：1、疏水氨基酸和亲水氨基酸的比率。疏水氨基酸的比例增加，蛋白溶解度下降，当溶解度太低时其表达和表达后的加工都会受到影响，在本发明的序列中多聚丙氨酸的两侧各设置了一个甲硫氨酸，该结构起到扳机作用，在有还原剂存在时该结构可增加蛋白的水溶性，使之保持溶解状态，当加入氧化剂时，该结构的溶解性迅速下降，使蛋白迅速聚合成不溶性物质，纺织成丝。2、决定弹性的β-转角和β-片层结构的比例。在本发明的序列中，β-转角和β-片层结构的比例为5∶3，也就是说该蛋白的结晶结构占总结构的60％，而天然牵丝蛋白的结晶结构所占的比例为20-30％，因此从理论上说，本发明蛋白的刚性应达到天然牵丝蛋白的2-3倍，而且本发明将主壶腹丝的两种蛋白MaSp1和MaSp2的结构按天然主壶腹丝中两种蛋白的比例融合在了一起，这样用本发明蛋白纺织成的丝应具有与天然主壶腹丝类似的结构，但强度要比天然主壶腹丝强，弹性要比主壶腹丝弱。
本发明为今后利用牛、羊乳腺反应器和昆虫等其它生物反应器生产蛛丝蛋白奠定了基础。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为本发明生物钢基因单体克隆的测序图谱。
图2基因单体多聚化过程示意图。
图3为本发明生物钢基因单体及多聚体的鉴定结果。
图4为8聚体和16聚体与pGEMEX-1载体连接鉴定结果。
图5为本发明8聚体和16聚体在大肠杆菌中的表达检测结果。
具体实施方式
实验材料及试剂：
1、菌株和质粒
大肠杆菌DH5α、JM109DE3、BL21DE3及BL21DE3plysS和IPTG诱导型原核表达载体pGEMEX-1。pGEMEX-1载体为Promega公司生产的融和表达载体，其采用了T7启动子表达系统与具有可用IPTG诱导表达T7 RNA聚合酶的宿主菌JM109DE3、BL21DE3及BL21DE3plysS配合使用能够高效表达外源基因和噬菌体T7基因10引导肽(260个氨基酸)形成的融合表达结构。
表达载体与目的基因的连接：用BglII和NsiI酶切基因多聚体克隆，回收外源片段。载体pGEMEX-1用BamHI和NsiI酶切。将两者连接。
2、试剂及其它材料
Tris、SDS、IPTG、EDTA、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺购自Amersham Pharmacia公司；克隆载体pGEM-T vector、琼脂糖和蛋白分子量标准购自Promega公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自华美生物公司。各种限制性内切酶购自Biolab公司，DNA回收试剂盒为Bio 101产品。
质粒提取的溶液1、2、3和pH8.0的TE、STE、Tris、EDTA缓冲液等各种缓冲液都是按照科学出版社出版的《分子克隆实验指南》(第二版)中的配方配制。
质粒的小量制备及质粒大量制备采用碱裂解法，感受态细胞的制备采用CaCl2方法。
实施例1、生物钢基因单体序列的获得及基因单体多聚化
1、基因单体序列1的获得：
生物钢基因单体序列1由上海生物工程公司直接合成双链DNA，并克隆到pGEM-5zf载体的EcoRV位点。经核苷酸序列测定证明获得了正确的基因单体序列1，如图1所示。
2、基因单体多聚化
如图2所示，在得到单体片段后，利用单体的5’和3’端加入BglII和BamHI两个酶切位点，它们是一对同尾酶，和T载体上另一个酶切位点(NcoI)进行多聚化连接，即用BglII和NcoI切割基因单体克隆，回收外源片断部分，同时用BamHI和NcoI切割基因单体克隆回收其载体部分，然后将两者连接便完成了基因二聚体的克隆，如此反复便可得到8聚体基因序列3和16聚体基因序列5。
如图3所示，是本发明生物钢基因单体及多聚体的鉴定结果。其中，M为1kb ladder分子量标记(购自上海生物工程公司，由MBI公司生产)；1为基因单倍体重组克隆(BamHI+BglII双酶切)；2为基因8聚体克隆(BamHI+BglII+ScaI三酶切)；3为基因16聚体克隆(BamHI+BglII双酶切)。
实施例2、生物钢基因在大肠杆菌中进行表达
1、重组质粒的鉴定
将转化的大肠杆菌单菌落接种于5ml液体LB培养基中，37℃震荡过夜培养，提取质粒DNA，酶切鉴定，保存重组菌落。如图4所示，M为1kb ladder分子量标记(购自上海生物工程公司，由MBI公司生产)；1为本发明8聚体连接鉴定结果(SacI单酶切)；2为本发明16聚体连接鉴定结果(SacI单酶切)。
2、序列分析
利用PE公司的Dye terminator Ready kit进行反应，PE公司ABI-377型自动测序仪进行序列分析，确定序列正确。
3、外源片段在大肠杆菌中的表达
表达结构构建完成后，应用LB培养基作为培养液，JM109DE3、BL21DE3及BL21DE3plysS等大肠杆菌株作为宿主菌，IPTG诱导，起始诱导菌液浓度为OD600＝0.8，IPTG浓度为0.5mM，诱导方案如下：
    挑取单菌落接种于5ml液体LB培养基中37℃震荡过夜培养(14hr-16hr)
                                 ↓
   次日按2％接种于100ml液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.8左右
                                 ↓
  补充38℃预热的液体LB培养基30ml，加入IPTG至终浓度0.1mM/L，继续在
                        37℃震荡培养2-3hr
                                 ↓
        测OD600值，取1ml离心，弃上清，剩余培养物同样离心备用
4、SDS-PAGE电泳检测
使用8％浓度的SDS-PAGE进行蛋白表达检测。凝胶(浓缩胶和分离胶)的配方及染色、脱色过程所需试剂及配方参见科学出版社出版的《分子克隆实验指南》(第二版)中的有关内容，电泳及染色方法方法如下：
将配好的分离胶沿玻璃板壁缓缓倒入已准备好的凝胶模子中，加至距低位置玻璃板顶端2厘米处，立即覆盖一层水，待胶与水层之间形成清晰的界面时表明胶已
                                 凝好。
                                     ↓
    倒出分离胶上的水层，立即将浓缩胶加入分离胶上面，插入样品槽模板，等胶
                               凝好后拔出
                                     ↓
    将标准分子量蛋白和未知样品1∶1溶于SDS蛋白上样缓冲液中，沸水浴中加热
                                  10分钟
                                     ↓
           在两槽内加入电极缓冲液，用微量进样器将样品加入电泳槽内
                                     ↓
            电压50V，电泳至二甲苯青进入分离胶时，升高电压至90V
                                     ↓
                 电泳结束后，将胶取出后考马斯亮蓝染色过夜
                                     ↓
                     脱色4小时，隔两小时换一次脱色液
                                     ↓
                               检测电泳结果
如图5所示，8聚体和16聚体在大肠杆菌中表达得到的蛋白分子量在125kd左右，比预计正常分子量要小，可能由所表达的蛋白高度折叠难以完全变性为线性分子或蛋白极性大小的差异造成目的蛋白电泳速度过快所致，但也不完全排除这类高度重复的大片段基因不适合在细菌中表达，正常分子量产物的产量太低无法检测的可能性，图中M为蛋白分子量标记(购自华美生物工程公司)；1为基因的8聚体阴性对照诱导表达结果；2为8聚体基因诱导表达结果；3为基因的16聚体阴性对照诱导表达结果；4为16聚体基因诱导表达结果。
                               序列表<160>6<170><210>1<211>420<212>DNA<213>artificial<214>人工序列<220><223><400>1catatgagat ctcagggtgc tggccagggt ggctatggtg gcctgggatc tcaaggcgct    60ggtcgcggtg gcctgggtgg ccagggtgca ggtgctgctg ctgctgcggc tgctgcagct   120gcaggtggtg caggcccagg gcagcagggg ccgggcggtt acggtccggg tcagcaaggc   180ccaggtggct acggcccagg ccaacagggg ccatctggtc cgggtagcgg tgctggtatg   240gcagctgcgg cggcagctgc tgctgcagcg atgggtggcg cgggtcaagg tggctacggc   300ggtttaggat ctcaaggtgc gggtcgcggt ggtcagggcg ctggtgcagc agcggcagca   360gcagcagcag ctgctggtgg cgctggccaa ggtggttacg gtggtcttgg atcctgatca   420<210>2<211>137<212>PRT<213>artificial sequence<214>人工序列<220><223><400>2Met Arg Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly
            5                   10                  15Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly
            20                  25                  30Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Pro
            35                  40                  45Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
            50                  55                  60Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser
            65                  70                  75Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met
            80                  85                  90Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
            95                  100                 105Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           110                  115                 120Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
           125                  130                 135Gly Ser
 137<210>3<211>3234<212>DNA<213>artificial sequence<214>人工序列<220><223><400>3catatgagat ctcagggtgc tggccagggt ggctatggtg gcctgggatc tcaaggcgct      60ggtcgcggtg gcctgggtgg ccagggtgca ggtgctgctg ctgctgcggc tgctgcagct     120gcaggtggtg caggcccagg gcagcagggg ccgggcggtt acggtccggg tcagcaaggc     180ccaggtggct acggcccagg ccaacagggg ccatctggtc cgggtagcgg tgctggtatg     240gcagctgcgg cggcagctgc tgctgcagcg atgggtggcg cgggtcaagg tggctacggc     300ggtttaggat ctcaaggtgc gggtcgcggt ggtcagggcg ctggtgcagc agcggcagca     360gcagcagcag ctgctggtgg cgctggccaa ggtggttacg gtggtcttgg atctcagggt     420gctggccagg gtggctatgg tggcctggga tctcaaggcg ctggtcgcgg tggcctgggt     480ggccagggtg caggtgctgc tgctgctgcg gctgctgcag ctgcaggtgg tgcaggccca     540gggcagcagg ggccgggcgg ttacggtccg ggtcagcaag gcccaggtgg ctacggccca     600ggccaacagg ggccatctgg tccgggtagc ggtgctggta tggcagctgc ggcggcagct     660gctgctgcag cgatgggtgg cgcgggtcaa ggtggctacg gcggtttagg atctcaaggt     720gcgggtcgcg gtggtcaggg cgctggtgca gcagcggcag cagcagcagc agctgctggt     780ggcgctggcc aaggtggtta cggtggtctt ggatctcagg gtgctggcca gggtggctat     840ggtggcctgg gatctcaagg cgctggtcgc ggtggcctgg gtggccaggg tgcaggtgct     900gctgctgctg cggctgctgc agctgcaggt ggtgcaggcc cagggcagca ggggccgggc     960ggttacggtc cgggtcagca aggcccaggt ggctacggcc caggccaaca ggggccatct    1020ggtccgggta gcggtgctgg tatggcagct gcggcggcag ctgctgctgc agcgatgggt    1080ggcgcgggtc aaggtggcta cggcggttta ggatctcaag gtgcgggtcg cggtggtcag    1140ggcgctggtg cagcagcggc agcagcagca gcagctgctg gtggcgctgg ccaaggtggt    1200tacggtggtc ttggatctca gggtgctggc cagggtggct atggtggcct gggatctcaa    1260ggcgctggtc gcggtggcct gggtggccag ggtgcaggtg ctgctgctgc tgcggctgct    1320gcagctgcag gtggtgcagg cccagggcag caggggccgg gcggttacgg tccgggtcag    1380caaggcccag gtggctacgg cccaggccaa caggggccat ctggtccggg tagcggtgct    1440ggtatggcag ctgcggcggc agctgctgct gcagcgatgg gtggcgcggg tcaaggtggc    1500tacggcggtt taggatctca aggtgcgggt cgcggtggtc agggcgctgg tgcagcagcg    1560gcagcagcag cagcagctgc tggtggcgct ggccaaggtg gttacggtgg tcttggatct    1620cagggtgctg gccagggtgg ctatggtggc ctgggatctc aaggcgctgg tcgcggtggc    1680ctgggtggcc agggtgcagg tgctgctgct gctgcggctg ctgcagctgc aggtggtgca    1740ggcccagggc agcaggggcc gggcggttac ggtccgggtc agcaaggccc aggtggctac    1800ggcccaggcc aacaggggcc atctggtccg ggtagcggtg ctggtatggc agctgcggcg    1860gcagctgctg ctgcagcgat gggtggcgcg ggtcaaggtg gctacggcgg tttaggatct    1920caaggtgcgg gtcgcggtgg tcagggcgct ggtgcagcag cggcagcagc agcagcagct    1980gctggtggcg ctggccaagg tggttacggt ggtcttggat ctcagggtgc tggccagggt    2040ggctatggtg gcctgggatc tcaaggcgct ggtcgcggtg gcctgggtgg ccagggtgca    2100ggtgctgctg ctgctgcggc tgctgcagct gcaggtggtg caggcccagg gcagcagggg    2160ccgggcggtt acggtccggg tcagcaaggc ccaggtggct acggcccagg ccaacagggg    2220ccatctggtc cgggtagcgg tgctggtatg gcagctgcgg cggcagctgc tgctgcagcg    2280atgggtggcg cgggtcaagg tggctacggc ggtttaggat ctcaaggtgc gggtcgcggt    2340ggtcagggcg ctggtgcagc agcggcagca gcagcagcag ctgctggtgg cgctggccaa    2400ggtggttacg gtggtcttgg atctcagggt gctggccagg gtggctatgg tggcctggga    2460tctcaaggcg ctggtcgcgg tggcctgggt ggccagggtg caggtgctgc tgctgctgcg    2520gctgctgcag ctgcaggtgg tgcaggccca gggcagcagg ggccgggcgg ttacggtccg    2580ggtcagcaag gcccaggtgg ctacggccca ggccaacagg ggccatctgg tccgggtagc    2640ggtgctggta tggcagctgc ggcggcagct gctgctgcag cgatgggtgg cgcgggtcaa    2700ggtggctacg gcggtttagg atctcaaggt gcgggtcgcg gtggtcaggg cgctggtgca    2760gcagcggcag cagcagcagc agctgctggt ggcgctggcc aaggtggtta cggtggtctt    2820ggatctcagg gtgctggcca gggtggctat ggtggcctgg gatctcaagg cgctggtcgc    2880ggtggcctgg gtggccaggg tgcaggtgct gctgctgctg cggctgctgc agctgcaggt    2940ggtgcaggcc cagggcagca ggggccgggc ggttacggtc cgggtcagca aggcccaggt    3000ggctacggcc caggccaaca ggggccatct ggtccgggta gcggtgctgg tatggcagct    3060gcggcggcag ctgctgctgc agcgatgggt ggcgcgggtc aaggtggcta cggcggttta    3120ggatctcaag gtgcgggtcg cggtggtcag ggcgctggtg cagcagcggc agcagcagca    3180gcagctgctg gtggcgctgg ccaaggtggt tacggtggtc ttggatcctg atca          3234<210>4<211>1075<212>PRT<213>artificial sequence<214>人工序列<220><223><4O0>4Met Arg Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly
            5                    10                 15Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly
            20                   25                 30Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Pro
            35                   40                 45Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
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            80                   85                 90Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
            95                  100                 105Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            110                 115                 120Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
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            20                   25                 30Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Pro
            35                   40                 45Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
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            65                   70                 75Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met
            80                   85                 90Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
            95                  100                 105Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            110                 115                 120Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
            125                 130                 135Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser
            140                 145                 150Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala
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            410                 415                 420Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala
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             710                715                 720Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
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             995                1000               1005Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala
            1010                1015               1020Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly
           1025                1030                1035Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly
           1040                1045                1050Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala
           1055                1060                1065Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln
           1070                1075                1080Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly
           1085                1090                1095Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1100                1105                1110Ala Ala Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr
           1115                1120                1125Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
           1130                1135                1140Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala
           1145                1150                1155Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr
           1160                1165                1170Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala
           1175                1180                1185Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly
           1190                1195                1200Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly
           1205                1210                1215Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu
           1220                1225                1230Gly Gly Gln G1y Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1235                1240                1245Ala Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly
           l250                1255                1260Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
           1265                1270                1275Pro Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala
           1280                1285                1290Ala Ala Ala Ala Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
           1295                1300                1305Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly
           1310                1315                1320Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln
           1325                1330                1335Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly
           1340                1345                1350Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly
           1355                1360                1365Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1370                1375                1380Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
           1385                1390                1395Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
           1400                1405                1410Ser Gly Pro Gly Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1415                1420                1425Ala Ala Ala Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly
           1430                1435                1440Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala
           1445                1450                1455Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly
           1460                1465                1470Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr
           1475                1480                1485Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly
           1490                1495                1500Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
           1505                1510                1515Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly
           1520                1525                1530Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser
           1535                1540                1545Gly Pro Gly Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1550                1555                1560Ala Ala Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
           1565                1570                1575Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala
           1580                1585                1590Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly
           1595                1600                1605Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
           1610                1615                1620Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln
           1625                1630                1635Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly
           1640                1645                1650Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln
           1655                1660                1665Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly
           1670                1675                1680Pro Gly Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1685                1690                1695Ala Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly
           1700                1705                1710Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala
           1715                1720                1725Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr
           1730                1735                1740Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly
           1745                1750                1755Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly
           1760                1765                1770Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala
           1775                1780                1785Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
           1790                1795                1800Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro
           1805                1810                1815Gly Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1820                1825                1830Ala Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser
           1835                1840                1845Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala
           1850                1855                1860Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly
           1865                1870                1875Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
           1880                1885                1890Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala
           1895                1900                1905Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly
           1910                1915                1920Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
           1925                1930                1935Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly
           1940                1945                1950Ser Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           1955                1960                1965Met Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln
           1970                1975                1980Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala
           1985                1990                1995Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly
           2000                2005                2010Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly
           2015                2020                2025Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly
           2030                2035                2040Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Pro
           2045                2050                2055Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
           2060                2065                2070Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser
           2075                2080                2085Gly Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met
           2090                2095                2100Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly
           2105                2110                2115Ala Gly Arg Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala
           2120                2125                2130Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu
           2135                2140                2145Gly Ser2147

Claims (10)

1、序列1的生物钢基因单体核苷酸序列或序列1生物钢基因的多聚体的核苷酸序列。
2、根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于：所述多聚体的核苷酸序列为序列3的生物钢基因8聚体核苷酸序列。
3、根据权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于：所述多聚体的核苷酸序列为序列5的生物钢基因16聚体核苷酸序列。
4、含有序列1或其多聚体的质粒。
5、含有序列1或其多聚体的生物细胞。
6、序列2的蛋白质。
7、序列4的蛋白质。
8、序列6的蛋白质。
9、一种获得多聚体核苷酸序列的方法，是在单体序列的5’和3’端分别各加入一个同尾酶酶切位点后连接到载体上，用其中的一个同尾酶和另外一种载体上的酶切位点的酶切割基因单体克隆，回收外源片断部分，同时用另一个同尾酶和上述另外一种酶切割基因单体克隆回收其载体部分，将上述回收的两部分连接，得到二聚体的核苷酸序列；如此反复便可得到多聚体的核苷酸序列。
10、根据权利要求9所述的获得多聚体核苷酸序列的方法，其特征在于：所述单体序列为序列1；所述同尾酶为BglII和BamHI；所述载体为T载体；所述载体上的酶切位点为NcoI酶的切点。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103833838A (zh) * 2012-11-22 2014-06-04 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种高性能类蛛丝蛋白材料及其生物合成方法
CN106754946A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 中山大学 一种人工构建的大腹园蛛牵引丝蛋白基因及其构建方法

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