CN1417217A - 一类新的寡糖分子及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明是关于一类具有生物活性寡糖分子及其制备。所涉及的寡糖可用作生物反应调节剂和各种癌症辅助治疗剂。

Description

一类新的寡糖分子及其制备

本发明是关于一类具有生物活性寡糖及其制备。所涉及的寡糖可用作生物反应调节剂和各种癌症辅助治疗剂。

寡糖，多糖及糖缀合物是生物体内重要的信息物质，参与细胞的接触过程，细胞表面的寡糖在细胞之间的通讯，识别和相互作用，在信号传递，细胞运动与黏附，以及病原与宿主细胞的相互作用方面起着重要作用。科学研究表明，寡糖不仅以它们的缀合物在起作用，寡糖本身就有重要的生理作用，如有的寡糖能激活植物的自我防卫系统，有的寡糖能诱导根瘤菌的固氮作用；有的寡糖可以与入侵的微生物上的糖蛋白相结合而阻止这些微生物对人体正常细胞的侵袭。根据目前所知，能用作生物反应调节剂和各种癌症辅助治疗剂的多糖有香菇多糖、裂褶菌多糖，凝结多糖，灵芝多糖，茯苓多糖等。这些多糖具有一个共同的特点是由1，3-β连接的葡萄寡糖构成基本主链，有的带有1，6-β连接的葡萄寡糖側链。我们研究发现，构成这些多糖的结构片段的衍生物也有类似多糖本身的生物活性，可用作生物反应调节剂和各种癌症辅助治疗剂。本发明就是关于这类寡糖分子及其制备。这类寡糖分子的结构可用式(1)和(2)代表。

式(1)和(2)中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇代表单糖单元，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇可以代表相同的糖或不同的糖，R代表末端基。

所述的结构中，主链为1→3(α和或β)连接，侧链为1→6(α和或β)连接。

所述的结构中，单糖单元可以是任何糖单元，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖。

所述的结构中，R代表末端基，具有以下几种构成：(1)R＝单糖，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖，以1，2，3，4，6位的方式连接在主糖上。(2)R＝O(CH₂)_nOH，；(3)R＝O(CH₂)_nOX，；(4)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OH，；(5)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OX，其中X代表芳基，C_1-12的烃基或小于七个糖基的寡糖基，n为2-18的整数，，m为1-18的整数。

所述的小于七个糖基的寡糖基为单糖，二糖等，优选为：式(1)和(2)中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇代表单糖单元，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇可以代表相同的糖或不同的糖，主链为1→3(α和或β)连接，侧链为1→6(α和或β)连接，单糖单元可以是任何糖单元，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖。

所述的结构中，寡糖具有如下结构：

所述的结构中，主链为1→3(α和或β)连接，侧链为1→6(α和或β)连接。

所述的结构中，单糖单元可以是葡萄糖，甘露糖，半乳糖。

所述的结构中，R代表末端基，具有以下几种构成：(1)R＝单糖，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖，以1，2，3，4，6位的方式连接在主糖上。(2)R＝O(CH₂)_nOH，；(3)R＝O(CH₂)_nOX，；(4)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OH，；(5)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OX，其中X代表芳基，C_1-12的烃基或小于七个糖基的寡糖基，n为2-18的整数，，m为1-18的整数。所述的小于七个糖基的寡糖基为单糖，二糖等，优选为：式(3)和(4)R₁可以是葡萄糖，甘露糖，半乳糖。主链为1→3(α和或β)连接，侧链为1→6(α和或β)连接。

下面结合实施例对本发明进行详细地说明。

1·三糖供体9的制备：

(1)双糖3，4的制备

苯甲酰基葡萄糖三氯乙酰亚胺酯1(5.6克，7.56毫摩尔)溶于40毫升二氯甲烷中，得溶液A，1，2：5，6-二-O-异丙叉基葡萄糖2(2.8克，10.77.毫摩尔)溶于20毫升二氯甲烷中，得溶液B，将B与A混合得溶液C，向C中加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTF，0.08毫摩尔)，在室温反应二小时后，薄层色谱分析表明反应完成。将反应液以100毫升二氯甲烷稀释，用0.5％的HCl/CH₃OH溶液稀释并搅拌1小时，选择性地水解掉5，6-O-异丙叉基，三乙胺中和，减压蒸掉溶剂，用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/2)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到双糖4(5.43克)，产率：90％。(2)三糖5的制备：

苯甲酰基葡萄糖三氯乙酰亚胺酯1(3.7克，5.01毫摩尔)溶于30毫升二氯甲烷中，得溶液A，双糖4(4.0克，5.01毫摩尔)溶于30毫升二氯甲烷，得溶液B，将B与A混合得溶液C，在冰盐浴冷却下，向C中加入TMSOTF 0.05毫摩尔，然后自然恢复至室温，在室温反应3小时后，薄层色谱分析表明反应完成。将反应液以三乙胺中和，用水洗涤，弃去水相，有机相在真空下抽干，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的三糖7(5.86克)，产率：85％。

(3)三糖7的制备：

三糖5(6.0克，4.36毫摩尔)溶于50毫升80％乙酸水溶液中，在60℃搅拌下水解，用薄层色谱分析检测反应，反应完成后。将反应液在减压下蒸干，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的三糖6(5.24克)产率：90％，将6按常规方法用乙酸酐/吡啶定量乙酰化，得到全酰化的三糖7。

(4)三糖供体9的制备：

三糖7(5.5克，3.76毫克分子)溶于30毫升二甲基甲酰胺中，加入NH₄HCO₃ 3克，反应在室温下进行，并用薄层色谱分析检测反应，反应完成后，减压蒸干溶剂，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的三糖8(4.8克)，产率：90％，将8(6克，4.2毫克分子)溶于40毫升二氯甲烷中，加入三氯乙睛3毫升，碳酸钾3克，室温下搅23小时，薄层分析表明反应完成，用常规方法进行后处理，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的三糖供体9(6.01克)，产率：91％。

2·三糖受体14的制备：

按1与2偶联的条件，使3-O-烯丙基-2，4，6-三-O-乙酰基-α-D-葡萄糖三氯乙酰亚胺酯10(4.10克，8.38毫克分子)与1，2：5，6异丙叉基葡萄糖2(2.13克8.20毫克分子)偶联，反应完成后，将反应液以100毫升二氯甲烷稀释，用0.5％的HCl/CH₃OH溶液稀释并搅拌1小时，选择性地水解掉5，6-O-异丙叉基，三乙胺中和，减压蒸掉溶剂，用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到双糖12(4.12克)，产率88％。按1与2偶联的条件，再使1与双糖受体12偶联，得到三糖13(5.07克，64％)，将13用乙酸酐-吡啶乙酰化，产率98％。将乙酰化后的13溶于100毫升干燥的甲醇溶液中，加入氯化钯0.5克，在室温、搅拌下反应，并以薄层分析检测，当检测表明烯丙基已被选择性移除时，过滤，减压下蒸干溶剂，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到三糖14(4.22克)，产率：87％。

3.六糖17的制备

将三糖供体9(3克，1.92毫克分子)与三糖受体14(2.12克，1.91毫克分子)溶于40毫升二氯甲烷中，在冰盐浴冷却下加入TMSOTf(0.02毫摩尔)，然后自然恢复至室温，在氮气保护，室温、搅拌下进行反应，用薄层分析检测，反应完成后，用常规方法后处理，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(2/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到六糖15(4.11克)，产率80％。将15(3.5克，1.31毫摩尔)溶于40毫升80％乙酸水溶液中，在60℃搅拌下水解，用薄层色谱分析检测反应，反应完成后。将反应液在减压下蒸干，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(2/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，将其按常规方法用乙酸酐/吡啶定量乙酰化，得到全酰化的六糖17(3.25克)。产率90％。4.六糖18的制备将17(2克，0.72毫克分子)溶于50毫升干燥的二氯甲烷中，加入等当量的己二醇，在三氟化硼乙醚的催化下，将己二醇偶连成化合物18A，色谱柱分离后，将纯化的产物溶于40毫升甲醇中，用氨饱和，室温过夜，用薄层分析检测反应，反应完成后，减压蒸干溶剂，用二氯甲烷洗涤，弃掉洗涤液，得到粉末装产物18(681毫克)。

5.四糖受体22的制备R’＝Ac R”＝CH₂CH₂OAc按三糖5转化为三糖供体9的条件，将三糖13转化为三糖供体19，然后按1与2偶联的条件，使19(3.12克，2.13毫克分子)与单糖受体20(0.80克，2.50毫克分子)偶联，得到4糖21(2.34克，产率69％)。6.七糖24的制备按13到14的过程制备四糖受体22。按9和14偶联制备六糖18A的方法，由9(2.30克，1.4毫克分子)和22(2.26克，1.45毫克分子)偶联，得到七糖23(3.02克，产率70％)。脱保护基得到七糖24。7四糖27的制备

然后按1与2偶联的条件，使9(3.12克，2.13毫克分子)与单糖受体25(0.80克，2.50毫克分子)偶联，得到4糖26(2.34克，产率69％)。乙酰化后得到4糖给体27。8二糖受体31的制备

苯甲酰基葡萄糖三氯乙酰亚胺酯1(5.6克，7.56毫摩尔)溶于40毫升二氯甲烷中，得溶液A，1，2-O-异丙叉基-3-烯丙基-葡萄糖28(2.8克，10.77.毫摩尔)溶于20毫升二氯甲烷中，得溶液B，将B与A混合得溶液C，向C中加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTF，0.08毫摩尔)，在室温反应二小时后，薄层色谱分析表明反应完成。对所得二糖29的5位苯甲酰化后，用硅胶柱层析法精制得二糖30，用PbCl₂脱掉二糖30的烯丙基，得到二糖受体31。9六糖34的制备将四糖供体27(3克，1.92毫克分子)与二糖受体31(2.44克，1.92毫克分子)溶于40毫升二氯甲烷中，在冰盐浴冷却下加入催化剂，然后自然恢复至室温，在氮气保护，室温、搅拌下进行反应，用薄层分析检测，反应完成后，用常规方法后处理，粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(2/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到六糖32(4.11克)，产率80％。将所的六糖32在80％的醋酸中回流4小时后，再在吡啶的醋酸酐中进行乙酰化，得到全保护的六糖33。脱保护基得到六糖34。10六糖37的制备

将六糖供体34(3克，1.92毫克分子)乙酰化得六糖35，照前述过程偶连乙二醇得36。脱保护基后得六糖37。其余目标化合物可用类似的方法得到。

所述的寡糖在使用时可注射或口服(单独用或与其它物质合用)。可用作增强免疫力、抗肿瘤，治疗癌症的保健品或药物。

下面结合实施例对本发明进行详细地说明。

1.所述的寡糖37对健康人外周血单核细胞IL-2和TNF-α的基因表达水平和活性有显著影响，在0.5毫克/升-15毫克/升的浓度范围内，随浓度增加该基因表达水平及活性增加，诱导免疫反应。

2.所述的寡糖37对肿瘤的抑制作用

        所述的寡糖37的抗癌及抑制癌细胞转移作用的情况肿瘤          宿  主   寡糖剂量    途经  注射时间     寡糖肿       肿瘤完全

                  (1mg/kg×d)                     瘤抑制率     消退率肉瘤180       CD-1/JCR     1×10          i.p.     1 to 10        10010/10

          A/J          5×4           i.p      1 to 4         96.59/10

          DBA/2N       5×4           i.p.     1 to 4         10010/10

          SWM/Ms       1×10          i.p.     1 to 10        10010/10艾氏腹腔癌    CD-1/ICR     1×10          i.p.     1 to 10        54.70/5CCM腺癌       SWM/Ms       1×10          i.p.     1 to 10        65.30/10MC.S1纤维肉瘤 A/J          1×10          i.p.     1 to 10        10018/18MC.CS1纤维肉瘤DBA/2N       1×10          i.p.     1 to 10        76.52/7MM-46癌       C3H/HeN      5×2           i.v.     13，15         1009/9M-109癌       BALB/c       25×2          i.p.     15，18         918/22MC-原发瘤     DBA/2N       1×10          i.p.     1 to 10        80.52/5MH，134肝癌   C3H/HeN      1×14          i.p.     21to40         10010/14甲基胆蒽       SWM/Ms     1×10      i.p.      21to31       83→33％甲基胆蒽       DBA/2N     1×10      i.p.      14to24       78→37％腺病12型       C3H/HeN    3×10      i.p.      14to18       79→40％

由此可见，所述的寡糖不仅对S180等同种移植癌而且对同系癌，自发癌的生长也能明显抑制，并对化学致癌，病毒致癌均有预防效果。

所述的寡糖抑制肿瘤作用的特点是：对肿瘤细胞没有直接细胞毒作用，其作用依赖于宿主；有最适剂量，过量使用使抑制肿瘤作用及免疫增强作用减弱；其作用因小鼠种系不同而有显著差异。A/J，DBA/2，CD-1等小鼠对寡糖最敏感，肿瘤可完全消失。对C3H/He不消失，BALB/C，CBA中等。对敏感小鼠接种甲基胆蒽(MC)，建立了纤维肉瘤株，以此移植于近交系小鼠后，给与寡糖后肿瘤消失。

所述的寡糖对化学致癌有强的抑制作用。接种MC 35周后几乎所有小鼠均发生癌，但在接种MC2～3周后开始腹腔投与寡糖，致癌率约降低至30％。这是因为接种MC产生的少数癌细胞由于注射寡糖增强了免疫功能而被消灭。寡糖还可使腺病毒的致癌率由80％降低至40％。表明寡糖不单是促进免疫排斥的物质而是真正的抗癌物质。

此外，所述的寡糖对各种细菌，病毒，寄生虫的感染也有突出效果。

药物组合物实施例配方实施例1

将1000毫克、5000毫克和10000毫克式37的6糖分别溶于1000毫升的1％生理食盐水中，分别配置成浓度为1毫克/毫升、5毫克/毫升及10毫克/毫升的注射用药物，此注射药物通常在使用时配置。配方实施例2

使用与上述实施例1配方的相同方法，不同之处在于所用的寡糖为式24的7糖。配方实施例3

取99克淀粉、99克葡萄糖和1克6糖，均匀混合，制成片剂，在此可制成1000片，每片为200毫克，内含1毫克6糖。配方实施例4

使用与上述实施例3配方的相同方法，不同之处在于所用的寡糖为式24的7糖。

Claims (10)

1 一类具有生物活性，可用作生物反应调节剂和各种癌症辅助治疗剂寡糖，这类寡糖分子的结构可用式(1)和(2)代表。

式(1)和(2)中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇代表单糖单元，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇可以代表相同的糖或不同的糖，R代表末端基。

2 如权利1所要求的结构中，主链为1→3(α和或β)连接，侧链为1→6(α和或β)连接。

3 如权利1所要求的结构中，单糖单元可以是任何糖单元，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖。

4 如权利1所要求的结构中，R代表末端基，具有以下几种构成：(1)R＝单糖，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖，以1，2，3，4，6位的方式连接在主糖上。(2)R＝O(CH₂)_nOH，；(3)R＝O(CH₂)_nOX，；(4)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OH，；(5)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OX，其中X代表芳基，C_1-12的烃基或小于七个糖基的寡糖基，n为2-18的整数，，m为1-18的整数。

5 如权利4所述的小于七个糖基的寡糖基为单糖，二糖等，优选为：式(1)和(2)中R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇代表单糖单元，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，和R₇可以代表相同的糖或不同的糖，主链为1→3(α和或β)连接，侧链为1→6(α和或β)连接，单糖单元可以是任何糖单元，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖。

6 如权利1所要求的结构中，寡糖具有如下结构：

7 如权利6所要求的结构中，主链为1→3连接，侧链为1→6连接。

8 如权利6所要求的结构中，单糖单元可以是葡萄糖，甘露糖，半乳糖。

9 如权利6所要求的结构中，R代表末端基，具有以下几种构成：(1)R＝单糖，优选为葡萄糖，甘露糖，半乳糖，以1，2，3，4，6位的方式连接在主糖上。(2)R＝O(CH₂)_nOH，；(3)R＝O(CH₂)_nOX，；(4)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OH，；(5)R＝O(C₂H₄O)_mC₂H₄OX，其中X代表芳基，C_1-12的烃基或小于七个糖基的寡糖基，n为2-18的整数，，m为1-18的整数。

10 如权利9所述的小于七个糖基的寡糖基为单糖，二糖等，优选为：式(3)和(4)R₁可以是葡萄糖，甘露糖，半乳糖。主链为1→3(α和或β)连接，侧链为1→6(α和或β)连接。