CN1416354A - 血管内皮生长因子2 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了人VEGF－2多肽，其生物学活性的、可用于诊断或治疗的片段、类似物或衍生物，以及编码此VEGF－2多肽的DNA(RNA)。本发明还公开了利用重组技术生产此多肽的方法和针对该多肽的抗体和拮抗剂。这种多肽和多核苷酸可在治疗上用于刺激伤口愈合并用于血管组织的修复。本发明还公开了利用该抗体和拮抗剂来抑制肿瘤的血管生成并因而抑制肿瘤的生长、炎症、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎和牛皮癣。

Description

血管内皮生长因子2
发明背景
本发明涉及新鉴定的多核苷酸，编码该多核苷酸的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及这些多核苷酸和多肽的生产。本发明的多肽已确定为血管内皮生长因子家族的成员。更具体地，本发明的多肽是人血管内皮因子2(VEGF-2)。本发明还涉及对这些多肽作用的抑制。
新血管的形成，或者称血管发生，是胚胎发育，随后的生长，和组织修复中的基本要点。血管发生还是某些特定的病理状况，如瘤形成(即，肿瘤和神经胶质瘤)的基本部分。异常的血管发生还与其他的疾病如，炎症，风湿性关节炎，牛皮癣，和糖尿病视网膜病相关(Folkman，J和Klagsbrun，M，科学，235：442-447(1987))。
酸性和碱性成纤维细胞生长因子分子都是内皮细胞和其它细胞类型的促细胞分裂剂。血管紧张素和血管生成素能够诱导血管发生，尽管它们的功能还不十分清楚(Folkman，J，癌症医学，Lea and Febiger出版社，pp153-170(1993))。血管内皮细胞的高度选择性促细胞分裂剂为血管内皮生长因子或称VEGF(Ferrara，N等，内分泌学评论，13：19-32(1992))，也被称为血管通透性因子(VPF)。
血管内皮生长因子是分泌的生血管促细胞分裂剂，其靶细胞特异性表现为只限于血管内皮细胞。鼠的VEGF基因已经被鉴定并且它在胚胎形成时的表达类型也已分析。已发现VEGF在靠近有孔内皮，如脉络丛和肾小球的上皮细胞中持久表达。这些数据与VEGF作为内皮细胞生长和分化的多功能调节因子的作用相一致(Breier，G等，发育，114：512-532(1992))。
VEGF与人血小板衍生的生长因子PDGFa和PDGFb具有序列同源性(Leung，D.W.，等，科学，246：1306-1309，(1989))。同源性的范围分别为约21％和23％。8个半胱氨酸残基形成的二硫键结构在这些蛋白中是严格保守的。虽然它们很相似，但是VEGF和PDGF有着特异性差别。PDGF是结缔组织的主要生长因子，而VEGF则是对内皮细胞高度特异的。在VEGF，PLGF和PDGF中都鉴定出了可变剪接的mRNA，并且这些不同的剪接产物在生物学活性上和受体结合的特异性上有差异。VEGF和PDGF以同源二聚体或异源二聚体形式作用，并在受体二聚体化之后与表现出内在的酪氨酸激酶活性的受体结合。
由于可变剪接，VEGF有121，165，189和206个氨基酸的四种不同的形式。VEGF121和VEGF165是可溶性的并能够促进血管发生，而VEGF189和VEGF206与细胞表面的含有蛋白多糖的肝磷脂结合。VEGF的时相性和空间性表达与血管的生理增殖相关(Gajdusek，C.M.和Carbon，S.J.，细胞生理学，139：570-579(1989)；McNeil，P.L.等，细胞生物学杂志，109：811-822(1989))。其高度亲和性结合位点在组织切片中只定位于内皮细胞(Jakeman，L.B.等，临床调查，89：244-253(1989))。该因子可以从垂体细胞和其它几种肿瘤细胞系中分离到，并在人神经胶质瘤中有所显现(Plate，K.H.，自然，359：845-848(1992))。令人感兴趣的，VEGF121和VEGF165的表达使得中国仓鼠卵细胞具有了在裸鼠上形成肿瘤的能力(Ferrara，N.等，临床调查杂志，91：160-170(1993))。抗VEGF的单克隆抗体对VEGF功能的抑制作用显示出免疫缺陷的小鼠上对肿瘤生长的抑制(Kim，K.J.，自然，362：81-844(1993))。而且，一种VEGF受体的显性失活突变提显示出可以抑制小鼠的成胶质细胞瘤的生长。
还发现血管渗透因子(VPF)也负责着持久的、甚至在伤害停止后仍有的微血管对血浆蛋白的高渗透性，这表明VPF是创伤愈合中的一种重要的因子。Brown，L.F.等，实验医学杂志，176：1375-1379(1992)。
VEGF的表达在血管化的组织中很高，(例如，肺、心、胎盘和实体肿瘤)并与血管发生在时相和空间上都相关。VEGF还显示出诱导体内血管发生。由于血管发生对于正常组织，尤其是血管组织的修复是最基本的，所以VEGF被期望用于促进血管组织的修复(例如，在动脉粥样硬化之中)。
Chen等在1991年12月17日授权的美国专利5,073,492号公开了一种在适当的环境下用以协同增强内皮细胞生长的方法，其中包括在环境中加入VEGF，效应物和来自血清的因子。另外，血管内皮细胞生长因子C亚单位的DNA已经通过聚合酶链反应技术得以制备。此DNA编码一个可能以异源二聚体或者同源二聚体的形式存在的蛋白。该蛋白是哺乳动物血管内皮细胞的促细胞分裂剂，并且因而可用于促进血管发育和修复，正如1992年9月30日公开的欧洲专利申请No.92302750.2所述。
发明概述
基于与人VEGF具有氨基酸序列同源性，本发明的多肽推定是一种新的血管内皮生长因子。
在一个方面，本发明提供了新的成熟多肽，及其具有生物学活性的并可用于诊断和治疗的片段、类似物和衍生物。本发明的多肽是人源的。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包括编码全长的或截短的VEGF-2多肽的多核苷酸，该多肽具有如SEQ ID NOS：2或4分别所示的氨基酸序列，或者由1995年5月12日保藏的ATCC保藏号97149或1994年3月4日保藏的ATCC保藏号75698的细菌宿主中所保藏的cDNA克隆所编码的氨基酸序列。
本发明还涉及VEGF-2的具有生物学活性的并可用于诊断和治疗的片段、类似物和衍生物。
在另一方面，本发明提供了通过重组技术产生这种多肽的方法，包括在有利于所说的蛋白表达和后续的蛋白回收的条件下，培养含有编码本发明的多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了将这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法，所述治疗目的例如，刺激血管发生、创伤愈合、受损骨和组织的生长、以及促进血管组织的修复。尤其是，提供了将这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸用于治疗周围动脉疾病，如严重的肢部缺血和冠状动脉疾病的方法。
在另一方面，本发明提供了针对这种多肽的抗体和产生这种多肽的方法。
在另一方面，本发明提供了这种多肽的拮抗剂，它可以用于抑制这种多肽的作用，例如，防止肿瘤血管发生并因而抑制肿瘤的生长，治疗糖尿病性视网膜病、炎症、类风湿性关节炎和牛皮癣。
在另一方面，本发明提供了含有足够长度的、能与本发明的核酸序列特异杂交的核酸分子的核酸探针。
在另一方面，本发明提供了诊断与本发明的核酸序列中的突变或与这种核酸序列所编码的蛋白相关的疾病或者对这种疾病的易感性的方法。
在另一方面，本发明提供了将这种多肽，或编码这种多肽的多核苷酸用于涉及科学研究、DNA合成和DNA载体的制造等体外目的的方法。
从本文的叙述之中，本领域的熟练技术人员应当对本发明的这些以及其它的方面很清楚。
附图的简要描述
下列的附图是对本发明的实施方案的说明，而并不意味着对权利要求所涵盖的本发明范围的限制。
图1A-1E显示了VEGF-2全长的核苷酸(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸(SEQ ID NO：2)序列。该多肽含有大约419个氨基酸残基，其中大约23个为前导序列。使用了标准的氨基酸单字符缩写。测序是在373型自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.)上进行的。测序的精确度据推测大于97％。
图2A-2D显示了VEGF-2的截短的、生物学活性形式的核苷酸(SEQ ID NO：3)和推导的氨基酸(SEQ ID NO：4)序列。该多肽含有大约350个氨基酸残基，其中大约前24个氨基酸为前导序列。
图3A-3B显示了PDGFa(SEQ ID NO：5)，PDGFb(SEQ IDNO：6)，VEGF(SEQ ID NO：7)，和VEGF-2(SEQ ID NO：4)之间的氨基酸序列的同源性。方框区域表示保守序列和8个保守的半胱氨酸残基的位置。
图4以表格形式显示了PDGFa，PDGFb，VEGF，和VEGF-2之间百分比同源性。
图5显示了在人乳腺肿瘤细胞系中VEGF-2的mRNA的存在。
图6描述了成人组织中VEGF-2的Northern印迹分析的结果。
图7显示了本发明的多肽经体外转录、翻译和电泳之后的SDS-PAGE凝胶的照片。第1道：14C和彩虹分子量标准；第2道：FGF对照；第3道：通过M13-正向和反向引物产生的VEGF-2；第4道：通过M13-反向和VEGF-F4引物产生的VEGF-2；第5道：通过M13-反向和VEGF-F5引物产生的VEGF-2。
图8A和8B显示了SDS-PAGE凝胶的照片。VEGF-2多肽在由Sf9细胞组成的杆状病毒系统中表达。来自培养基和细胞质的蛋白在非还原(图8A)和还原条件下(图8B)通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图9显示了SDS-PAGE凝胶的照片。将感染了本发明的核酸序列的Sf9细胞的培养基沉淀。将重新悬浮的沉淀通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图1O显示了SDS-PAGE凝胶的照片。VEGF-2从培养基上清中纯化，并在存在和不存在还原剂β-巯基乙醇的条件下通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
图11显示了通过RP-300柱(0.21×3cm，Applied Biosystems，Inc.)对纯化的VEGF-2进行的反相HPLC分析。该柱用0.1％三氟乙酸(溶液A)平衡，将蛋白以7.5分钟内从0至60％溶液B(含有0.07％TFA的乙腈)的梯度洗脱。蛋白洗脱液用215nm(“红”线)和280nm(“蓝”线)的吸收来监测。溶液B的百分比以“绿”线表示。
图12是一个柱形图，显示了部分纯化的VEGF-2蛋白与碱性成纤维细胞生长因子相比对血管内皮细胞的生长的作用。
图13是一个柱形图，显示了纯化的VEGF-2蛋白对血管内皮细胞的生长的作用。
图14显示了VEGF-2mRNA在人胎儿和成人组织中的表达。
图15显示了VEGF-2mRNA在人原代培养细胞中的表达。
图16显示了VEGF-2蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达。
图17显示了VEGF-2刺激人脐静脉内皮细胞的增殖。
图18显示了VEGF-2刺激真皮微血管内皮细胞的增殖。
图19显示了VEGF-2对微血管、脐带、子宫内膜和牛主动脉内皮细胞的增殖的刺激作用。
图20显示了对PDGF诱导的血管(人主动脉)平滑肌细胞的增殖的抑制。
图21显示了VEGF-2对HUVEC和牛微血管内皮细胞(BMEC)迁移的刺激。
图22显示了VEGF-2对HUVEC释放一氧化氮的刺激。
图23显示了VEGF-2对微血管内皮细胞(CADMEC)的索状组织形成的抑制。
图24显示了在CAM试验中VEGF，VEGF-2，和bFGF对血管发生的刺激。
图25显示了VEGF-2蛋白(图25，顶部)和裸表达质粒(图25，中部)对肢体局部缺血某些参数的恢复作用：BP比(图25a)；血流量和血流储量(图25b)；血管造影术评分(图25c)；毛细血管密度(图25d)。
图26A-G显示了VEGF-2对自发性高血压大鼠(SHR)的舒张血压的影响能力。图26a和b显示了VEGF-2导致的舒张血压的剂量依赖性下降。图26c和d显示了VEGF-2产生的下降的平均动脉压(MAP)。图26E显示了VEGF-2的增加剂量对SHR大鼠的平均动脉压(MAP)的作用。图26F显示了VEGF-2对SHR大鼠的舒张血压的作用。
图27显示了VEGF-2N和VEGF-2诱导的增殖的抑制作用。
图28显示了pHE4a表达载体(SEQ ID NO：16)的示意图。标出了卡那霉素抗性标记基因，多克隆位点的接头区，oriC序列，和lacIq的编码序列。
图29显示了pHE4a启动子的调控元件的核苷酸序列(SEQ IDNO：17)。标出了两个lac操纵子序列，Shine-Delgamo序列(S/D)，和末端的HindIII和NdeI限制性位点(斜体)。
图30示出含有编码VEGF-2的多核苷酸的pVGI.1表达载体构建体的示意图。
图31A-G示出含有VEGF-2插入体的pVGI.1载体构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO：36)。
优选的实施方案的详细描述
在一个方面，本发明提供了包括编码VEGF-2多肽的多核苷酸的分离的核酸分子，该VEGF-2多肽具有图1推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，它是通过对克隆的cDNA测序而确定的。SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列通过对cDNA克隆的测序而获得，该cDNA克隆于1995年5月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，获得的ATCC保藏号为97149。
在另一个方面，本发明提供了包括编码截短的VEGF-2多肽的多核苷酸的分离的核酸分子，该VEGF-2多肽具有图2推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)，它是通过对克隆的cDNA测序而确定的。SEQID NO：3所示的核苷酸序列通过对cDNA克隆的测序而获得，该cDNA克隆于1994年3月4日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，获得的ATCC保藏号为75698。
除非另外说明，本文中所有通过测序DNA分子而确定的核苷酸序列都是利用自动DNA测序仪(如Applied Biosystems公司的373型)确定的，而本文中所有的由DNA分子所编码的多肽的氨基酸序列都是通过对上述所确定的DNA序列的翻译而预测的。因此，正如本领域对通过自动化方法确定的任何DNA序列所了解的那样，本文所确定的任何一个核苷酸序列都可能含有误差。自动化确定的核苷酸序列与实际的核苷酸序列典型地具有至少大约90％，更典型地至少大约95％至至少大约99.9％的相同性。实际的序列可以通过本领域所熟知的其他方法包括手工DNA测序方法而更为精确地测定。同样正如本领域所了解的，相对于实际序列，在确定的核苷酸序列中的单个插入或缺失，将会导致该核苷酸序列翻译上的移框，因而由确定的该核苷酸序列推导出的所编码的氨基酸序列将会从该插入或缺失点开始，完全不同于该测序DNA分子所编码的实际的氨基酸序列。
编码本发明的多肽的多核苷酸可以从早期人胚胎(8至9周)骨髓瘤、成人心脏或几种乳癌细胞系中获得。发明的多核苷酸在一个来自第9周的早期人胚胎的cDNA文库中已有发现。它在结构上与VEGF/PDG家族相关。它含有一个编码419个氨基酸残基的开放阅读框，其中前23个氨基酸残基是推测的前导序列，因此其成熟的蛋白含有396个氨基酸，该蛋白显示出与人血管内皮生长因子(30％相同性)、PDGFa(24％)和PDGFb(22％)高度的氨基酸同源性(见图4)。尤其重要的是，在该家族中所有四个成员的所有8个半胱氨酸都是保守的(见图3的方框区域)。此外，PDGF/VEGF家族的信号，PXCVXXXRCXGCCN(SEQ ID NO：8)在VEGF-2中是保守的(见图3)。VEGF-2，VEGF和两种PDGF之间的同源性是蛋白质水平上的。没有检测出核苷酸水平上的同源性，因此，很难通过简单的方法如低严格性杂交来分离出VEGF-2。
本发明的VEGF-2多肽是指包括全长的多肽和编码任何前导序列和编码全长多肽的任何活性片段的多核苷酸序列。活性片段是指包括任何一部分的全长氨基酸序列，它少于SEQ ID NO：2所示的全长的419个氨基酸，但仍然含有图3中的8个保守的半胱氨酸并仍然具有VEGF-2活性。
在正常组织中至少有两种可变剪切的VEGF-2的mRNA序列。图7中的两条带，第5道显示出编码本发明的VEGF-2多肽的可变剪切的mRNA序列的存在。
本发明的多肽可以包括RNA形式或者DNA形式，其中DNA形式包括cDNA，基因组DNA，和合成的DNA。DNA可以是双链的或者单链的，如果是单链的，它可以是编码链或者非编码链。编码成熟的多肽的编码序列可以与图1或2中所示的、或者保藏克隆的编码序列相同，或者也可以根据遗传密码的简并性而是不同的编码序列，编码相同于图1或2中或者保藏克隆的DNA导出的成熟多肽。
编码成熟的图1或2的多肽或者编码保藏的cDNA的成熟多肽的核苷酸可以包括：只编码成熟多肽的序列；编码成熟多肽的编码序列和其它的编码序列，如前导或分泌序列或前蛋白序列；成熟多肽(和操纵上相连的其他编码序列)的编码序列和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5，和/或3，端非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”所涵盖了只含有该多肽的编码序列的多核苷酸，以及包括有其他的编码和/非编码序列的多核苷酸。
本发明进而还涉及上文所述的多核苷酸的变异体，该多核苷酸变异体编码具有图1或2中推导的氨基酸序列的多肽或者具有由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物，。此多核苷酸变异体可以是天然存在的等位基因变异体，也可以是非天然存在的该多核苷酸的变异体。
因此，本发明所包括的多核苷酸编码与图1或2所示相同的成熟多肽或者由保藏克隆的cDNA编码的成熟多肽，以及这些多核苷酸的变异体，这些变异体编码图1或2所示多肽或者保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这种核苷酸变异体包括缺失变异、置换变异、和添加或插入变异。
如上所述，该多核苷酸序列可以具有天然存在的、图1或2所示或者保藏克隆的编码序列的等位基因变异体的编码序列。正如本领域所熟知的，等位基因变异体是一个多核苷酸序列的另一种形式，它含有一个或多个核苷酸的置换、缺失或添加，而不实质地改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括一类多肽，其成熟多肽的编码序列可以以相同的阅读框，与一个有助于多肽从宿主细胞中表达和分泌的多核苷酸相融合，例如，一个前导序列，它能够作为分泌序列调控多肽从细胞中的转运。该多核苷酸还可以编码前蛋白，即成熟蛋白加上另外的5’端氨基酸残基。含有前序列的成熟蛋白是前蛋白并且使该蛋白的非活性形式。一旦该前序列被切除则保留下具有活性的成熟蛋白。
因此，例如本发明的多核苷酸可编码成熟蛋白，或编码具有原序列的蛋白质，或编码具有原序列和前序列(前导序列)的蛋白质。
本发明的多核苷酸还可以具有同框融合于一个标记序列的编码序列，从而利于本发明的多肽的纯化。在使用细菌宿主的情况下，标记序列可以是pQE-9载体的六个组氨酸的标签，以利于纯化融合了该标记的成熟多肽，或者，例如，在使用哺乳动物宿主如COS-7细胞的情况下，标记序列可以是红血球凝聚素(HA)标签。HA标签相应于来自流感病毒红血球凝聚素蛋白的表位(Wilson等，细胞，37：767(1984))。
本发明的进一步的实施方案包括分离的核酸分子，其所含的核苷酸序列与下列序列具有至少95％相同性，更为优选的至少96％，97％，98％或99％相同性：(a)编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列但缺少N端的甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列，；(c)编码具有SEQ IDNO：2的大约第1至大约396位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号97149所含克隆编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)编码成熟的、具有由ATCC保藏号97149所含克隆编码的氨基酸序列的VEGF-2多肽的核苷酸序列；或(f)与(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中的任何一种核苷酸序列相互补的核苷酸序列。
本发明的进一步的实施方案包括分离的核酸分子，其所含的核苷酸序列与下列序列具有至少95％相同性，更为优选的至少96％，97％，98％或99％相同性：(a)编码具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，但缺少N端的甲硫氨酸；(c)编码具有SEQ IDNO：4的大约第1至大约326位氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由ATCC保藏号75698所含克隆编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)编码成熟的、具有由ATCC保藏号75698所含克隆编码的氨基酸序列的VEGF-2多肽的核苷酸序列；或(f)与(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中的任何一种核苷酸序列相互补的核苷酸序列。
对于一个多核苷酸，其所含的的核苷酸序列与编码VEGF-2多肽的参照核苷酸序列具有例如至少95％的“相同性”是指，除了相对于每100个参照的编码VEGF-2多肽的核苷酸序列之中该序列最多包含5个点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同的。换言之，为了获得具有与参照的核苷酸序列95％相同性的一个多核苷酸，在参照序列上最多5％的核苷酸可以缺失或用其他核苷酸置换，或者在参照序列上可以插入最多5％的核苷酸。这些在参照序列上的突变可以发生在参照的核苷酸序列的5’端或3’端位置或者位于末端之间的任何位置，可以是在参照序列的核苷酸间各自分散的或者在参照序列上呈连续的一组或多组。
在实际当中，任一特定的核酸分子或多肽与例如SEQ ID NO：1或3所示的核苷酸序列或保藏的cDNA克隆的核苷酸序列是否具有至少95％，96％，97％，98％或99％的相同性，可以方便地利用已知的计算机程序来确定，如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Unix系统第8版，遗传学计算机小组，University Resarch Park，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)。Bestfit利用Smith和Waterman的局部同源算法，应用数学进展，2：482-489(1981)来找出两个序列同源性的最佳片断。当利用Bestfit或者其他任何序列比对程序来确定某一序列是否与本发明的参照序列具有至少，例如，95％的相同性时，需要设置好参数，从而在全长的参照核苷酸序列上计算相同性的百分比，并允许最高达参照序列的核苷酸总数5％的同源性缺口。
正如下文所详细描述的，本发明的多肽可以用于产生单克隆或多克隆抗体，从而用于诊断性试验，检测VEGF-2蛋白的表达，或者用作激动剂或拮抗剂而增强或抑制VEGF-2蛋白的功能。再有，这种多肽还可以用于酵母双杂交系统以“捕获”VEGF-2蛋白的结合蛋白，它们同样是本发明的候选的激动剂或拮抗剂。酵母双杂交系统在Fields和Song，自然，340：245-246(1989)中有所描述。
另一方面，本发明提供了含有带有本发明多肽的表位的肽或多肽。为了筛选带有抗原性表位(例如，含有抗体能够结合的蛋白分子上的区域)的肽或多肽，本领域周知的是，模拟部分蛋白序列的相对短的合成肽通常能够产生与该部分模拟的蛋白相反应的抗血清。参见，例如，Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)与蛋白上预先确定的位点反应的抗体，科学，219：660-66。能够产生蛋白反应性血清的肽常常为蛋白质的初级序列，它可以以一系列简单的化学法则来确定，而不限于免疫功能区域或氨基或羧基端。强烈疏水性的肽或者六个残基以下的肽通常不足以诱导能够结合模拟蛋白的抗体；较长的、可溶性的肽，尤其是含有脯氨酸残基的肽通常是有效的。Sutcliffe等，同上，661。例如，20个根据这些规则设计的肽中的18个，含有8-39个残基，覆盖了75％的流感病毒红血球凝聚素HA1多肽链，诱导出与HA1蛋白或完整病毒反应的抗体；12个来自MuLV聚合酶的肽和18个来自狂犬病糖蛋白的肽都诱导出能够沉淀相应蛋白的抗体。
本发明的带有抗原表位的肽或多肽因而可以用于产生能够特异结合本发明的多肽的抗体，包括单克隆抗体。因此，来自免疫供体的脾细胞与带有抗原表位的肽融合而获得的大部分杂交瘤通常能够分泌与内源蛋白反应的抗体。Sutcliffe等，同上，663。由带有抗原表位的肽或多肽产生的抗体可用于检测模拟蛋白，并且不同的肽的抗体可以用来跟踪经历蛋白后加工的蛋白前体上不同区域的命运。这种肽和抗肽的抗体可用于各种检测模拟蛋白的定性和定量试验，例如竞争性试验，因为在免疫沉淀试验中显示，即使是短肽(如约9个氨基酸)也可以结合并置换较大的肽。见，例如，Wilson等，细胞，37：767-778(1984)，同上，777。本发明的抗肽的抗体还可用于纯化模拟蛋白，例如，根据本领域所熟知的方法利用吸附色谱进行。
根据上述的规则设计的本发明的带有抗原表位的肽或多肽优选地含有至少7个，更优选地至少9个且更为优选地在15至30个氨基酸之间的序列，这些氨基酸包含在本发明的多肽的序列之内。但是，含有较大部分的本发明的多肽的氨基酸序列，包括大约30，40，50，60，70，80，90，100，或150个氨基酸的，或者任何长度直至包括整个本发明的多肽的氨基酸序列的肽或多肽，也可以被视为本发明的带有抗原表位的肽或多肽，并可用于诱导与模拟蛋白反应的抗体。优选地，带有表位的肽的氨基酸序列应选择在水溶液中具有基本的可溶性(例如，序列含有相对亲水性残基而高度疏水性序列则优选地避免使用)；并且，含有脯氨酸残基的序列是尤为优选的。
非限制性的、可用以产生VEGF-2特异性抗体的抗原性多肽或肽的实例包括下列：含有残基为SEQ ID NO：2中的从大约Leu-37至大约Glu-45，SEQ ID NO：2中的从大约至大约，SEQ ID NO：2中的Tyr-58从大约至大约Gly-66，SEQ ID NO：2中的从大约Gln-73至大约Glu-81，SEQ ID NO：2中的从大约Asp-100至大约Cys-108，SEQ IDNO：2中的从大约Gly-140至大约Leu-148，SEQ ID NO：2中的从大约Pro-168至大约Val-176，SEQ ID NO：2中的从大约His-183至大约Lys-191，SEQ ID NO：2中的从大约Ile-201至大约Thr-209，SEQ IDNO：2中的从大约Ala-216至大约Tyr-224，SEQ ID NO：2中的从大约Asp-244至大约His-254，SEQ ID NO：2中的从大约Gly-258至大约Glu-266，SEQ ID NO：2中的从大约Cys-272至大约Ser-280，SEQ IDNO：2中的从大约Pro-283至大约Ser-291，SEQ ID NO：2中的从大约Cys-296至大约Gln-304，SEQ ID NO：2中的从大约Ala-307至大约Cys-316，SEQ ID NO：2中的从大约Val-319至大约Cys-335，SEQ IDNO：2中的从大约Cys-339至大约Leu-347，SEQ ID NO：2中的从大约Cys-360至大约Glu-373，SEQ ID NO：2中的从大约Tyr-378至大约Val-386，和SEQ ID NO：2中的从大约Ser-388至大约Ser-396.这些多肽片断通过Jameson-Wolf抗原性参数分析确定出它们带有VEGF-2蛋白的抗原表位。
本发明的带有表位的肽或多肽可以通过任何方便的用以产生肽或多肽的方法来生产，包括利用本发明的核酸分子的重组方法。例如，可以将一个短的带有表位的氨基酸序列与一个较大的多肽相融合，它在重组生产和纯化过程中，以及在免疫以产生抗肽的抗体过程中作为载体。带有表位的肽还可以通过已知的化学合成方法来合成。例如，Houghten描述了一种简单的方法来合成大量的肽，如在4周内制备并坚定了10-20mg的248种不同的13个残基的肽，它们是HAl多肽的一个片断上的单个氨基酸变异体。美国科学院研究进展，82：5131-5135。此“同时多个肽的合成(SMPS)”过程进一步在Houghten的美国专利4,631,211中有所描述(1986)。在该方法中用于不同的肽的固相合成的各个试剂装于独立的溶剂-渗透性包装中，以利于固相方法中许多相同的独立步骤中的合理使用。完整的操作方法可以同时进行500-1000或更多个合成，Houghten等，同上，5134。
本发明的带有表位的肽或多肽可以通过本领域所熟知的方法用于产生抗体。见，例如，Sutcliffe等，同上；Wilson等，同上；Chow，M.等，美国科学院研究进展，82：910-914；和Bittle，F.J.等，遗传病毒学，66：2347-2354(1985)。通常，动物可以用游离的肽来免疫；但是，抗肽的抗体滴度可以通过将肽与一个大分子载体如匙孔戚血兰蛋白(KLH)或破伤风类毒素相结合而得以提高。例如，含有半胱氨酸的肽可以与载体利用一个接头如m-马来酰亚氨基苯甲酰-N-丁二酰亚胺酯(MBS)来结合，而其它的肽可以利用更为通用的连接试剂如戊二醛与载体结合。动物如兔、大鼠和小鼠用游离的或与载体结合的肽来免疫，例如，通过腹膜内和/或真皮内注射含有大约100mg肽或载体蛋白和Freund赋型剂的乳液。可能需要几次加强注射，例如，以大约两周为间隔，以获得抗肽抗体有效滴度，并可通过例如利用在固体支持物表面游离的肽吸附而进行ELISA试验检测。来自免疫动物的血清中抗肽抗体的滴度可以通过筛选抗肽抗体而提高，例如，通过对固体支持物上的肽的吸附并利用本领域所熟知的方法洗脱所需的抗体。
本发明的带有免疫原性表位的肽，如，当整个蛋白是免疫原时能产生抗体应答的蛋白部分，可以通过本领域所熟知的方法来鉴定。例如，Geysen等，同上，公开了一种方法，在固体支持物上快速同时合成上百个肽，而具有足够的纯度进行酶联免疫吸附试验。然后，不需从固体支持物上去除，就可以很容易检测合成的肽与抗体的相互作用。在此方法中，带有所需蛋白的免疫原性表位的肽可以由本领域的普通的技术人员常规地进行鉴定。例如，Geysen等利用7个氨基酸的溶液定位了口蹄疫病毒衣壳蛋白上具有免疫学意义的表位，他合成了一套所有208种可能的六肽，覆盖了该蛋白全部的213个氨基酸。然后，所有20个氨基酸依次在该表位的每个位置上置换，合成了完全替换的一套肽，并确定特定的氨基酸在与抗体的反应中所产生的特异性。因而，可以通过这种方法，常规地制备本发明的带有表位的肽的类似物。Geysen(1987)的美国专利4,708,781进一步描述了这种鉴定带有所需蛋白的免疫原性表位的肽的方法。
进而，Geysen(1990)的美国专利5,194,392描述了一种通用的方法，检测或确定表位的拓扑相当位点的单体(氨基酸或其它化合物)的序列，它与特定的抗体的互补位(抗原结合位点)相互补。更为通用的，Geysen(1989)的美国专利4,433,092描述了一种方法，检测或确定配体的拓扑相当位点的单体的序列，它与特定受体的该配体的结合位点相互补。类似地，Houghten，R.A等(1996)的美国专利5,480,971，过烷基化寡肽混合物，公开了线性的C1-C7-烷基的过烷基化寡肽系列和文库，用以确定优选地结合于所需的受体分子的过烷基化寡肽。因此，本发明的带有表位的肽的非肽类类似物也可以通过这些方法常规地制备。
正如本领域熟练的技术人员所应当理解的，本发明的VEGF-2多肽和上述的它的带有表位的片段可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定区域部分组合，形成嵌合多肽。这种融合蛋白有利于纯化并在体内显示出延长了半衰期。这一点可参见，例如，人CD4多肽的前两个区域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链上恒定区的不同结构域组成的嵌合蛋白。(EPA 394,827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988))。
本发明还描述了新的VEGF-2的变异体。它们可以通过缺失或置换一个或多个VEGF-2的氨基酸而产生。天然的突变称为等位基因变异。等位基因变异可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或者可具有改变了的氨基酸序列。
为了改进或改变天然的VEGF-2的特性，可以运用蛋白质工程。可以利用本领域熟练技术人员熟知的重组DNA技术来制造新的多肽。突变型蛋白和缺失可以显示出，例如，增强的活性或增强的稳定性。此外，它们至少在某种纯化和保藏条件下，能够更高产量地纯化并表现出更好的溶解性。下面是可构建的突变的实例。氨基末端和羧基末端缺失
再有，表达的VEGF-2显示出水解断裂的现象，在SDS-PAGE凝胶电泳中产生如下大小(大约的)的多肽片段(例如见图6-8)：80，59，45，43，41，40，39，38，37，36，31，29，21，和15kDa。这些多肽片段是由于在该蛋白的N末端和C末端部分的水解所导致的。这些水解产生的片段表现出具有后活性，尤其是21kDa片段。
此外，可以利用蛋白质工程改进或改变天然VEGF-2的一种或多种特性。羧基端氨基酸的缺失可以增强蛋白的活性。一个实例就是γ干扰素在缺失了该蛋白羧基端的10个氨基酸时表现出10倍高的活性(Dobeli等，生物化学杂志，7：199-216(1988))。因此，本发明的一个方面在于提供了VEGF-2的多肽类似物和编码这种相对于天然的VEGF-2多肽显示出增强了稳定性的(例如，在典型的pH，温度条件或其他储藏条件下)类似物的核苷酸序列。
尤为优选的VEGF-2多肽如下所示(数字从该蛋白的第一个氨基酸(Met)开始计起(图1(SEQ ID No：18))：Ala(第24位残基)至Ser(第419位残基)；Pro(25)至Ser(419)；Ala(26)至Ser(419)；Ala(27)至Ser(419)；Ala(28)至Ser(419)；Ala(29)至Ser(419)；Ala(30)至Ser(419)；Phe(31)至Ser(419)；Glu(32)至Ser(419)；Ser(33)至Ser(419)；Gly(34)至Ser(419)；Leu(35)至Ser(419)；Asp(36)至Ser(419)；Leu(37)至(Ser(419)；Ser(38)至Ser(419)；Asp(39)至Ser(419)；Ala(40)至Ser(419)；Glu(41)至Ser(419)；Pro(42)至Ser(419)；Asp(43)至Ser(419)；Ala(44)至Ser(419)；Gly(45)至Ser(419)；Glu(46)至Ser(419)；Ala(47)至Ser(419)；Thr(48)至Ser(419)；Ala(49)至Ser(419)；Tyr(50)至Ser(419)；Ser(52)至Ser(419)；Asp(54)至Ser(419)；Val(62)至Ser(419)；Val(65)至Ser(419)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Met(418)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Gln(417)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Pro(416)；Met(1)，Glu(23)或Ala(24)至Arg(415)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Gln(414)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Trp(413)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Tyr(412)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Ser(411)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Pro(410)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Val(409)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Cys(408)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Arg(407)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Cys(406)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Val(405)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Glu(404)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Glu(403)；Met(1).Glu(23)，或Ala(24)至Ser(402)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Gly(398)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Pro(397)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Lys(393)；Met(1).Glu(23)，或Ala(24)至Met(263)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Asp(311)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)至Pro(367)；Met(1)至Ser(419)；Met(1)至Ser(228)；Glu(47)至Ser(419)；Ala(111)至Lys(214)；Ala(112)至Lys(214)；His(113)至Lys(214)；Tyr(114)至Lys(214)；Asn(115)至Lys(214)；Thr(116)至Lys(214)；Thr(103)至Leu(215)；Glu(104)至Leu(215)；Glu(105)至Leu(215)；Thr(106)至Leu(215)；Ile(107)至Leu(215)；Lys(108)至Leu(215)；Phe(109)至Leu(215)；Ala(110)至.Leu(215)；Ala(111)至Leu(215)；Ala(112)至Leu(215)；His(113)至Leu(215)；Tyr(114)至Leu(215)；Asn(115)至Leu(215)；Thr(116)至Leu(215)；Thr(103)至Ser(228)；Glu(104)至Ser(228)；Glu(105)至Ser(228)；Thr(106)至Ser(228)；Ile(107)至Ser(228)；ILys(108)至Ser(228)；Phe(109)至Ser(228)；Ala(110)至Ser(228)；Ala(111)至Ser(228)；Ala(112)至Ser(228)；His(113)至Ser(228)；Tyr(114)至Ser(228)；Asn(115)至Ser(228)；Thr(116)至Ser(228)；Thr(103)至Leu(229)；Glu(104)至Leu(229)；Thr(103)至Arg(227)；Glu(104)至Arg(227)；Glu(105)至Arg(227)；Thr(106)至Arg(227)；Ile(107)至Arg(227)；Lys(108)至Arg(227)；Phe(109)至Arg(227)；Ala(11O)至Arg(227)；Ala(111)至Arg(227)；Ala(112)至Arg(227)；His(113)至Arg(227)；Tyr(114)至Arg(227)；Asn(115)至Arg(227)；Thr(116)至Arg(227)；Thr(103)至Ser(213)；Glu(104)至Ser(213)；Glu(105)至Ser(213)；Thr(106)至Ser(213)；Ile(107)至Ser(213)；Lys(108)至Ser(213)；Phe(109)至Ser(213)；Ala(110)至Ser(213)；Ala(111)至Ser(213)；Ala(112)至Ser(213)；His(113)至Ser(213)；Tyr(114)至Ser(213)；Asn(115)至Ser(213)；Thr(116)至Ser(213)；Thr(103)至Lys(214)；Glu(104)至Iys(214)；Glu(105)至Lys(214)；Thr(106)至Lys(214)；Ile(107)至Lys(214)；Lys(108)至Lys(214)；Phe(109)至Lys(214)；Ala(110)至Lys(214)；Glu(105)至Leu(229)；Thr(106)至Leu(229)；Ile(107)至Leu(229)；Lys(108)至Leu(229)；Phe(109)至Leu(229)；Ala(110)至Leu(229)；Ala(111)至Leu(229)；Ala(112)至Leu(229)；His(113)至Leu(229)；Tyr(114)至Leu(229)；Asn(115)至Leu(229)；Thr(116)至Leu(229)。
优选的实施方案包括下列缺失突变：图1所示的(SEQ ID NO：18))的Thr(103)-Arg(227)；Glu(104)-Arg(227)；Ala(112)-Arg(227)；Thr(103)-Ser(213)；Glu(104)-Ser(213)；Thr(103)-Leu(215)；Glu(47)-Ser(419)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)-Met(263)；Met(1)，Glu(23)，或Ala(24)-Asp(311)；Met(1)，Glu(23)，或者Ala(24)-Pro(367)；Met(1)-Ser(419)；以及Met(1)-Ser(228)。
本发明还包括在N末端和C末端都具有氨基酸缺失的缺失突变。这种突变包括上述的N末端突变和C末端突变的所有组合。这种组合可以通过利用本领域熟练技术人员所知的重组技术而实现。
尤其是，VEGF-2多肽的N末端缺失可以以通式m-369来描述，其中m是一个从-23至388的整数，m相应于SEQ ID No：2中所定的氨基酸残基的位置。优选地，N末端缺失保留了图3的保守盒(PXCVXXXRCXGCCN)(SEQ ID NO：8)，并且包括含有下列残基的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No：1所示的本发明的多肽的N末端缺失包括含有下列残基的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2的E-1至S-396；A-2至S-396；P-3至S-396；A-4至S-396；A-5至S-396；A-6至S-396；A-7至S-396；A-8至S-396；F-9至S-396；E-10至S-396；S-11至S-396；G-12至S-396；L-13至S-396；D-14至S-396；L-15至S-396；S-16至S-396；D-17至S-396；A-18至S-396；E-19至S-396；P-20至S-396；D-21至S-396；A-22至S-396；G-23至S-396；E-24至S-396；A-25至S-396；T-26至S-396；A-27至S-396；Y-28至S-396；A-29至S-396；S-30至S-396；K-31至S-396；D-32至S-396；L-33至S-396；E-34至S-396；E-35至S-396；Q-36至S-396；L-37至S-396；R-38至S-396；S-39至S-396；V-40至S-396；S-41至S-396；S-42至S-396；V-43至S-396；D-44至S-396；E-45至S-396；L-46至S-396；M-47至S-396；T-48至S-396；V-49至S-396；L-50至S-396；Y-51至S-396；P-52至S-396；E-53至S-396；Y-54至S-396；W-55至S-396；K-56至S-396；M-57至S-396；Y-58至S-396；K-59至S-396；C-60至S-396；Q-61至S-396；L-62至S-396；R-63至S-396；K-64至S-396；G-65至S-396；G-66至S-396；W-67至S-396；Q-68至S-396；H-69至S-396；N-70至S-396；R-71至S-396；E-72至S-396；Q-73至S-396；A-74至S-396；N-75至S-396；L-76至S-396；N-77至S-396；S-78至S-396；R-79至S-396；T-80至S-396；E-81至S-396；E-82至S-396；T-83至S-396；I-84至S-396；K-85至S-396；F-86至S-396；A-87至S-396；A-88至S-396；A-89至S-396；H-90至S-396；Y-91至S-396；N-92至S-396；T-93至S-396；E-94至S-396；I-95至S-396；L-96至S-396；K-97至S-396；S-98至S-396；I-99至S-396；D-100至S-396；N-101至S-396；E-102至S-396；W-103至S-396；R-104至S-396；K-105至S-396；T-106至S-396；Q-107至S-396；C-108至S-396；M-109至S-396；P-110至S-396；R-111至S-396；E-112至S-396；V-113至S-396；C-114至S-396；I-115至S-396；D-116至S-396；V-117至S-396；G-118至S-396；K-119至S-396；E-120至S-396；F-121至S-396；G-122至S-396；V-123至S-396；A-124至S-396；T-125至S-396；N-126至S-396；T-127至S-396；F-128至S-396；F-129至S-396；K-130至S-396；P-131至S-396；P-132至S-396；C-133至S-396；V-134至S-396；S-135至S-396；V-136至S-396；Y-137至S-396；R-138至S-396；C-139至S-396；G-140至S-396；G-141至S-396；C-142至S-396；C-143至S-396；N-144至S-396；S-145至S-396；E-146至S-396；G-147至S-396；L-148至S-396；Q-149至S-396；C-150至S-396；M-151至S-396；N-152至S-396；T-153至S-396；S-154至S-396；T-155至S-396；S-156至S-396；Y-157至S-396；L-158至S-396；S-159至S-396；K-160至S-396；T-161至S-396；L-162至S-396；F-163至S-396；E-164至S-396；I-165至S-396；T-166至S-396；V-167至S-396；P-168至S-396；L-169至S-396；S-170至S-396；Q-171至S-396；G-172至S-396；P-173至S-396；K-174至S-396；P-175至S-396；V-176至S-396；T-177至S-396；I-178至S-396；S-179至S-396；F-180至S-396；A-181至S-396；N-182至S-396；H-183至S-396；T-184至S-396；S-185至S-396；C-186至S-396；R-187至S-396；C-188至S-396；M-189至S-396；S-190至S-396；K-191至S-396；L-192至S-396；D-193至S-396；V-194至S-396；Y-195至S-396；R-196至S-396；Q-197至S-396；V-198至S-396；H-199至S-396；S-200至S-396；I-201至S-396；I-202至S-396；R-203至S-396；R-204至S-396；S-205至S-396；L-206至S-396；P-207至S-396；A-208至S-396；T-209至S-396；L-210至S-396；P-211至S-396；Q-212至S-396；C-213至S-396；Q-214至S-396；A-215至S-396；A-216至S-396；N-217至S-396；K-218至S-396；T-219至S-396；C-220至S-396；P-221至S-396；T-222至S-396；N-223至S-396；Y-224至S-396；M-225至S-396；W-226至S-396；N-227至S-396；N-228至S-396；H-229至S-396；I-230至S-396；C-231至S-396；R-232至S-396；C-233至S-396；L-234至S-396；A-235至S-396；Q-236至S-396；E-237至S-396；D-238至S-396；F-239至S-396；M-240至S-396；F-241至S-396；S-242至S-396；S-243至S-396；D-244至S-396；A-245至S-396；G-246至S-396；D-247至S-396；D-248至S-396；S-249至S-396；T-250至S-396；D-251至S-396；G-252至S-396；F-253至S-396；H-254至S-396；D-255至S-396；I-256至S-396；C-257至S-396；G-258至S-396；P-259至S-396；N-260至S-396；K-261至S-396；E-262至S-396；L-263至S-396；D-264至S-396；E-265至S-396；E-266至S-396；T-267至S-396；C-268至S-396；Q-269至S-396；C-270至S-396；V-271至S-396；C-272至S-396；R-273至S-396；A-274至S-396；G-275至S-396；L-276至S-396；R-277至S-396；P-278至S-396；A-279至S-396；S-280至S-396；C-281至S-396；G-282至S-396；P-283至S-396；H-284至S-396；K-285至S-396；E-286至S-396；L-287至S-396；D-288至S-396；R-289至S-396；N-290至S-396；S-291至S-396；C-292至S-396；Q-293至S-396；C-294至S-396；V-295至S-396；C-296至S-396；K-297至S-396；N-298至S-396；K-299至S-396；L-300至S-396；F-301至S-396；P-302至S-396；S-303至S-396；Q-304至S-396；C-305至S-396；G-306至S-396；A-307至S-396；N-308至S-396；R-309至S-396；E-310至S-396；F-311至S-396；D-312至S-396；E-313至S-396；N-314至S-396；T-315至S-396；C-316至S-396；Q-317至S-396；C-318至S-396；V-319至S-396；C-320至S-396；K-321至S-396；R-322至S-396；T-323至S-396；C-324至S-396；P-325至S-396；R-326至S-396；N-327至S-396；Q-328至S-396；P-329至S-396；L-330至S-396；N-331至S-396；P-332至S-396；G-333至S-396；K-334至S-396；C-335至S-396；A-336至S-396；C-337至S-396；E-338至S-396；C-339至S-396；T-340至S-396；E-341至S-396；S-342至S-396；P-343至S-396；Q-344至S-396；K-345至S-396；C-346至S-396；L-347至S-396；L-348至S-396；K-349至S-396；G-350至S-396；K-351至S-396；K-352至S-396；F-353至S-396；H-354至S-396；H-355至S-396；Q-356至S-396；T-357至S-396；C-358至S-396；S-359至S-396；C-360至S-396；Y-361至S-396；R-362至S-396；R-363至S-396；P-364至S-396；C-365至S-396；T-366至S-396；N-367至S-396；R-368至S-396；Q-369至S-396；K-370至S-396；A-371至S-396；C-372至S-396；E-373至S-396；P-374至S-396；G-375至S-396；F-376至S-396；S-377至S-396；Y-378至S-396；S-379至S-396；E-380至S-396；E-381至S-396；V-382至S-396；C-383至S-396；R-384至S-396；C-385至S-396；V-386至S-396；P-387至S-396；S-388至S-396；Y-389至S-396；W-390至S-396；Q-391至S-396。一个优选的实施方案包含有SEQ ID NO；2的S-205至S-396的氨基酸。同样优选的是编码这些多肽的多核苷酸。
而且，VEGF-2多肽的C末端缺失可以以通式-23-n来描述，其中n是一个从-15至395的整数，n相应于SEQ ID No：2中所定的氨基酸残基的位置。优选地，C末端缺失保留了图3的保守盒(PXCVXXXRCXGCCN)(SEQ ID NO：8)，并且包括含有下列残基的氨基酸序列的多肽。同样地，SEQ ID No：1所示的本发明的多肽的C末端缺失包括含有下列残基的氨基酸序列的多肽；SEQ ID NO：2的E-1至M-395；E-1至Q-394；E-1至P-393；E-1至R-392；E-1至Q-391；E-1至W-390；E-1至Y-389；E-1至S-388；E-1至P-387；E-1至V-386；E-1至C-385；E-1至R-384；E-1至C-383；E-1至V-382；E-1至E-381；E-1至E-380；E-1至S-379；E-1至Y-378；E-1至S-377；E-1至F-376；E-1至G-375；E-1至P-374；E-1至E-373；E-1至C-372；E-1至A-371；E-1至K-370；E-1至Q-369；E-1至R-368；E-1至N-367；E-1至T-366；E-1至C-365；E-1至P-364；E-1至R-363；E-1至R-362；E-1至Y-361；E-1至C-360；E-1至S-359；E-1至C-358；E-1至T-357；E-1至Q-356；E-1至H-355；E-1至H-354；E-1至F-353；E-1至K-352；E-1至K-351；E-1至G-350；E-1至K-349；E-1至L-348；E-1至L-347；E-1至C-346；E-1至K-345；E-1至Q-344；E-1至P-343；E-1至S-342；E-1至E-341；E-1至T-340；E-1至C-339；E-1至E-338；E-1至C-337；E-1至A-336；E-1至C-335；E-1至K-334；E-1至G-333；E-1至P-332；E-1至N-331；E-1至L-330；E-1至P-329；E-1至Q-328；E-1至N-327；E-1至R-326；E-1至P-325；E-1至C-324；E-1至T-323；E-1至R-322；E-1至K-321；E-1至C-320；E-1至V-319；E-1至C-318；E-1至Q-317；E-1至C-316；E-1至T-315；E-1至N-314；E-1至E-313；E-1至D-312；E-1至F-311；E-1至E-310；E-1至R-309；E-1至N-308；E-1至A-307；E-1至G-306；E-1至C-305；E-1至Q-304；E-1至S-303；E-1至P-302；E-1至F-301；E-1至L-300；E-1至K-299；E-1至N-298；E-1至K-297；E-1至C-296；E-1至V-295；E-1至C-294；E-1至Q-293；E-1至C-292；E-1至S-291；E-1至N-290；E-1至R-289；E-1至D-288；E-1至L-287；E-1至E-286；E-1至K-285；E-1至H-284；E-1至P-283；E-1至G-282；E-1至C-281；E-1至S-280；E-1至A-279；E-1至P-278；E-1至R-277；E-1至L-276；E-1至G-275；E-1至A-274；E-1至R-273；E-1至C-272；E-1至V-271；E-1至C-270；E-1至Q-269；E-1至C-268；E-1至T-267；E-1至E-266；E-1至E-265；E-1至D-264；E-1至L-263；E-1至E-262；E-1至K-261；E-1至N-260；E-1至P-259；E-1至G-258；E-1至C-257；E-1至1-256；E-1至D-255；E-1至H-254；E-1至F-253；E-1至G-252；E-1至D-251；E-1至T-250；E-1至S-249；E-1至D-248；E-1至D-247；E-1至G-246；E-1至A-245；E-1至D-244；E-1至S-243；E-1至S-242；E-1至F-241；E-1至M-240；E-1至F-239；E-1至D-238；E-1至E-237；E-1至Q-236；E-1至A-235；E-1至L-234；E-1至C-233；E-1至R-232；E-1至C-231；E-1至I-230；E-1至H-229；E-1至N-228；E-1至N-227；E-1至W-226；E-1至M-225；E-1至Y-224；E-1至N-223；E-1至T-222；E-1至P-221；E-1至C-220；E-1至T-219；E-1至K-218；E-1至N-217；E-1至A-216；E-1至A-215；E-1至Q-214；E-1至C-213；E-1至Q-212；E-1至P-211；E-1至L-210；E-1至T-209；E-1至A-208；E-1至P-207；E-1至L-206；E-1至S-205；E-1至R-204；E-1至R-203；E-1至I-202；E-1至I-201；E-1至S-200；E-1至H-199；E-1至V-198；E-1至Q-197；E-1至R-196；E-1至Y-195；E-1至V-194；E-1至D-193；E-1至L-192；E-1至K-191；E-1至S-190；E-1至M-189；E-1至C-188；E-1至R-187；E-1至C-186；E-1至S-185；E-1至T-184；E-1至H-183；E-1至N-182；E-1至A-181；E-1至F-180；E-1至S-179；E-1至I-178；E-1至T-177；E-1至V-176；E-1至P-175；E-1至K-174；E-1至P-173；E-1至G-172；E-1至Q-171；E-1至S-170；E-1至L-169；E-1至P-168；E-1至V-167；E-1至T-166；E-1至I-165；E-1至E-164；E-1至F-163；E-1至L-162；E-1至T-161；E-1至K-160；E-1至S-159；E-1至L-158；E-1至Y-157；E-1至S-156；E-1至T-155；E-1至S-154；E-1至T-153；E-1至N-152；E-1至M-151；E-1至C-150；E-1至Q-149；E-1至L-148；E-1至G-147；E-1至E-146；E-1至S-145；E-1至N-144；E-1至C-143；E-1至C-142；E-1至G-141；E-1至G-140；E-1至C-139；E-1至R-138；E-1至Y-137；E-1至V-136；E-1至S-135；E-1至V-134；E-1至C-133；E-1至P-132；E-1至P-131；E-1至K-130；E-1至F-129；E-1至F-128；E-1至T-127；E-1至N-126；E-1至T-125；E-1至A-124；E-1至V-123；E-1至G-122；E-1至F-121；E-1至E-120；E-1至K-119；E-1至G-118；E-1至V-117；E-1至D-116；E-1至1-115；E-1至C-114；E-1至V-113；E-1至E-112；E-1至R-111；E-1至P-110；E-1至M-109；E-1至C-108；E-1至Q-107；E-1至T-106；E-1至K-105；E-1至R-104；E-1至W-103；E-1至E-102；E-1至N-101；E-1至D-100；E-1至1-99；E-1至S-98；E-1至K-97；E-1至L-96；E-1至I-95；E-1至E-94；E-1至T-93；E-1至N-92；E-1至Y-91；E-1至H-90；E-1至A-89；E-1至A-88；E-1至A-87；E-1至F-86；E-1至K-85；E-1至1-84；E-1至T-83；E-1至E-82；E-1至E-81；E-1至T-80；E-1至R-79；E-1至S-78；E-1至N-77；E-1至L-76；E-1至N-75；E-1至A-74；E-1至Q-73；E-1至E-72；E-1至R-71；E-1至N-70；E-1至H-69；E-1至Q-68；E-1至W-67；E-1至G-66；E-1至G-65；E-1至K-64；E-1至R-63；E-1至L-62；E-1至Q-61；E-1至C-60；E-1至K-59；E-1至Y-58；E-1至M-57；E-1至K-56；E-1至W-55；E-1至Y-54；E-1至E-53；E-1至P-52；E-1至Y-51；E-1至L-50；E-1至V-49；E-1至T-48；E-1至M-47；E-1至L-46；E-1至E-45；E-1至D-44；E-1至V-43；E-1至S-42；E-1至S-41；E-1至V-40；E-1至S-39；E-1至R-38；E-1至L-37；E-1至Q-36；E-1至E-35；E-1至E-34；E-1至L-33；E-1至D-32；E-1至K-31；E-1至S-30；E-1至A-29；E-1至Y-28；E-1至A-27；E-1至T-26；E-1至A-25；E-1至E-24；E-1至G-23；E-1至A-22；E-1至D-21；E-1至P-20；E-1至E-19；E-1至A-18；E-1至D-17；E-1至S-16；E-1至L-15；E-1至D-14；E-1至L-13；E-1至G-12；E-1至S-11；E-1至E-10；E-1至F-9；E-1至A-8；E-1至A-7。同样优选的是编码这些多肽的多核苷酸。
而且，本发明还提供了同时在氨基和羧基末端具有一个或多个氨基酸缺失的多肽，它可以概括地描述为具有SEQ ID NO：2的m-n的残基，其中的m和n是一个如上所述的整数。
同样优选的本发明如SEQ ID NO：2所示的VEGF-2多肽的C末端缺失包括含有下列残基的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2的F-9至M-395；F-9至Q-394；F-9至P-393；F-9至R-392；F-9至Q-391；F-9至W-390；F-9至Y-389；F-9至S-388；F-9至P-387；F-9至V-386；F-9至C-385；F-9至R-384；F-9至C-383；F-9至V-382；F-9至E-381；F-9至E-380；F-9至S-379；F-9至Y-378；F-9至S-377；F-9至F-376；F-9至G-375；F-9至P-374；F-9至E-373；F-9至C-372；F-9至A-371；F-9至K-370；F-9至Q-369；F-9至R-368；F-9至N-367；F-9至T-366；F-9至C-365；F-9至P-364；F-9至R-363；F-9至R-362；F-9至Y-361；F-9至C-360；F-9至S-359；F-9至C-358；F-9至T-357；F-9至Q-356；F-9至H-355；F-9至H-354；F-9至F-353；F-9至K-352；F-9至K-351；F-9至G-350；F-9至K-349；F-9至L-348；F-9至L-347；F-9至C-346；F-9至K-345；F-9至Q-344；F-9至P-343；F-9至S-342；F-9至E-341；F-9至T-340；F-9至C-339；F-9至E-338；F-9至C-337；F-9至A-336；F-9至C-335；F-9至K-334；F-9至G-333；F-9至P-332；F-9至N-331；F-9至L-330；F-9至P-329；F-9至Q-328；F-9至N-327；F-9至R-326；F-9至P-325；F-9至C-324；F-9至T-323；F-9至R-322；F-9至K-321；F-9至C-320；F-9至V-319；F-9至C-318；F-9至Q-317；F-9至C-316；F-9至T-315；F-9至N-314；F-9至E-313；F-9至D-312；F-9至F-311；F-9至E-310；F-9至R-309；F-9至N-308；F-9至A-307；F-9至G-306；F-9至C-305；F-9至Q-304；F-9至S-303；F-9至P-302；F-9至F-301；F-9至L-300；F-9至K-299；F-9至N-298；F-9至K-297；F-9至C-296；F-9至V-295；F-9至C-294；F-9至Q-293；F-9至C-292；F-9至S-291；F-9至N-290；F-9至R-289；F-9至D-288；F-9至L-287；F-9至E-286；F-9至K-285；F-9至H-284；F-9至P-283；F-9至G-282；F-9至C-281；F-9至S-280；F-9至A-279；F-9至P-278；F-9至R-277；F-9至L-276；F-9至G-275；F-9至A-274；F-9至R-273；F-9至C-272；F-9至V-271；F-9至C-270；F-9至Q-269；F-9至C-268；F-9至T-267；F-9至E-266；F-9至E-265；F-9至D-264；F-9至L-263；F-9至E-262；F-9至K-261；F-9至N-260；F-9至P-259；P-9至G-258；F-9至C-257；F-9至1-256；F-9至D-255；F-9至H-254；F-9至F-253；F-9至G-252；F-9至D-251；F-9至T-250；F-9至S-249；F-9至D-248；F-9至D-247；F-9至G-246；F-9至A-245；F-9至D-244；F-9至S-243；F-9至S-242；F-9至F-241；F-9至M-240；F-9至F-239；F-9至D-238；F-9至E-237；F-9至Q-236；F-9至A-235；F-9至L-234；F-9至C-233；F-9至R-232；F-9至C-231；F-9至1-230；F-9至H-229；F-9至N-228；F-9至N-227；F-9至W-226；F-9至M-225；F-9至Y-224；F-9至N-223；F-9至T-222；F-9至P-221；F-9至C-220；F-9至T-219；F-9至K-218；F-9至N-217；F-9至A-216；F-9至A-215；F-9至Q-214；F-9至C-213；F-9至Q-212；F-9至P-211；F-9至L-210；F-9至T-209；F-9至A-208；F-9至P-207；F-9至L-206；F-9至S-205；F-9至R-204；F-9至R-203；F-9至1-202；F-9至1-201；F-9至S-200；F-9至H-199；F-9至V-198；F-9至Q-197；F-9至R-196；F-9至Y-195；F-9至V-194；F-9至D-193；F-9至L-192；F-9至K-191；F-9至S-190；F-9至M-189；F-9至C-188；F-9至R-187；F-9至C-186；F-9至S-185；F-9至T-184；F-9至H-183；F-9至N-182；F-9至A-181；F-9至F-180；F-9至S-179；F-9至1-178；F-9至T-177；F-9至V-176；F-9至P-175；F-9至K-174；F-9至P-173；F-9至G-172；F-9至Q-171；F-9至S-170；F-9至L-169；F-9至P-168；F-9至V-167；F-9至T-166；F-9至1-165；F-9至E-164；F-9至F-163；F-9至L-162；F-9至T-161；F-9至K-160；F-9至S-159；F-9至L-158；F-9至Y-157；F-9至S-156；F-9至T-155；F-9至S-154；F-9至T-153；F-9至N-152；F-9至M-151；F-9至C-150；F-9至Q-149；F-9至L-148；F-9至G-147；F-9至E-146；F-9至S-145；F-9至N-144；F-9至C-143；F-9至C-142；F-9至G-141；F-9至G-140；F-9至C-139；F-9至R-138；F-9至Y-137；F-9至V-136；F-9至S-135；F-9至V-134；F-9至C-133；F-9至P-132；F-9至P-131；F-9至K-130；F-9至F-129；F-9至F-128；F-9至T-127；F-9至N-126；F-9至T-125；F-9至A-124；F-9至V-123；F-9至G-122；F-9至F-121；F-9至E-120；F-9至K-119；F-9至G-118；F-9至V-117；F-9至D-116；F-9至I-115；F-9至C-114V-113；F-9至E-112；F-9至R-111；F-9至P-110；F-9至M-109；F-9至C-108；F-9至1-107；F-9至T-106；F-9至K-105；F-9至R-104；F-9至W-103；F-9至E-102；F-9至N-101；F-9至D-100；F-9至I-99；F-9至S-98；F-9至K-97；F-9至L-96；F-9至I-95；F-9至E-94；F-9至T-93；F-9至N-92；F-9至Y-91；F-9至H-90；F-9至A-89；F-9至A-88；F-9至A-87；F-9至F-86；F-9至K-85；F-9至I-84；F-9至T-83；F-9至E-82；F-9至E-81；F-9至T-80；F-9至R-79；F-9至S-78；F-9至N-77；F-9至L-76；F-9至N-75；F-9至A-74；F-9至Q-73；F-9至E072；F-9至R-71；F-9至N-70；F-9至H-69；F-9至Q-68；F-9至W-67；F-9至G-66；F-9至G-65；F-9至K-64；F-9至R-63；F-9至L-62；F-9至Q-61；F-9至C-60；F-9至K-59；F-9至Y-58；F-9至M-57；F-9至K-56；F-9至W-55；F-9至Y-54；F-9至E-53；F-9至P-52；F-9至Y-51；F-9至L-50；F-9至V-49；F-9至T-48；F-9至M-47；F-9至L-46；F-9至E-45；F-9至D-44；F-9至V-43；F-9至S-42；F-9至S-41；F-9至V-40；F-9至S-39；F-9至R-38；F-9至L-37；F-9至Q-36；F-9至E-35；F-9至E-34；F-9至L-33；F-9至D-32；F-9至K-31；F-9至S-30；F-9至A-29；F-9至Y-28；F-9至A-27；F-9至T-26；F-9至A-25；F-9至E-24；F-9至G-23；F-9至A-22；F-9至D-21；F-9至P-20；F-9至E-19；F-9至A-18；F-9至D-17；F-9至S-16；F-9至L-15。
特别优选的是含有SEQ ID NO：2的F-9至R-203氨基酸残基的多肽片段，以及编码该多肽的多核苷酸。此SEQ ID NO：2的F-9至R-20多肽优选地与SEQ ID NO：2的S-205至S-396多肽相联。相联可以通过二硫键，共价或非共价作用，通过接头(例如，丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸接头)连接，或通过抗体。
许多多核苷酸序列，如EST序列，可以通过序列文库经公共途径获得。一些这种序列与SEQ ID NO：1相关并且可能在本发明之前就经公共途径获得。优选地，这类相关的多核苷酸特别排除在本发明的范围之外。列出每一个相关序列是很繁琐的。因此，优选的排除在本发明的范围之外的是含有如通式a-b所描述的核苷酸的一个或多个多核苷酸，其中a为一个SEQ ID NO：1中在1至1660之间的整数，b为一个在15至1674之间的整数，a和b都为相应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸残基位置，而且b大于或等于a+14。
因此，另一方面，本发明提供了N末端缺失的突变。这种突变包括那些含有除了至少前24个N末端氨基酸残基(如，至少Met(1)-Glu(24)的缺失)之外的如图1(SEQ ID NO：18)所示的氨基酸序列，但是不多于如图1(SEQ ID NO：18)所示的前115个N末端氨基酸残基。或者，前24个N末端氨基酸残基(如，至少Met(1)-Glu(24)的缺失)但不多于如图1(SEQ ID NO：18)所示的前103个N末端氨基酸残基，等等。
另一方面，本发明提供了C末端缺失的突变。这种突变包括那些含有除了至少最后一个C末端氨基酸残基(Ser(419))之外的如图1(SEQ ID NO：18)所示的氨基酸序列，但是不多于后220个C末端氨基酸残基(如，如图1(SEQ ID NO：18)所示的Val(199)-Ser(419)氨基酸残基的缺失)。或者，缺失包括如图1(SEQ ID NO：18)所示的至少最后一个C末端氨基酸残基但是不多于后216个C末端氨基酸残基。或者，缺失包括如图1(SEQ ID NO：18)所示的至少最后一个C末端氨基酸残基但是不多于后204个C末端氨基酸残基。或者，缺失包括如图1(SEQ ID NO：18)所示的至少最后一个C末端氨基酸残基但是不多于后192个C末端氨基酸残基。或者，缺失包括如图1(SEQ ID NO：18)所示的至少最后一个C末端氨基酸残基但是不多于后156个C末端氨基酸残基。或者，缺失包括如图1(SEQ IDNO：18)所示的至少最后一个C末端氨基酸残基但是不多于后108个C末端氨基酸残基。或者，缺失包括如图1(SEQ ID NO：18)所示的至少最后一个C末端氨基酸残基但是不多于后52个C末端氨基酸残基。
而在另一方面，本法明还包括具有从N末端和C末端都缺失了氨基酸的缺失突变。这类突变包括上述的N末端和C末端缺失突变的所有组合。
术语“基因”是指涉及多肽链产生的DNA片段；它包括在编码区之前和之后的区域(前导和加尾区)以及各个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
本发明进一步是指分离的本文所述的核酸分子片段。一个分离的具有保藏的cDNA核苷酸序列或者如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的核酸分子片段应当至少15nt的片段，并且优选的是长度至少约20nt，更为优选的为至少约30nt，再更为优选的为约40nt，它可用作本文所述的诊断探针和引物。当然也可以根据本发明使用更大的、与大多数，如非全部的保藏的cDNA核苷酸序列或者如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列相应的50，75，100，125，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650，675，700，725，750，775，800，825，850，875，900，925，950，975，1000，1025，1050，1075，1100，1125，1150，1175，1200，1225，1250，1275，1300，1325，1350，1375，1400，1425，1475，1500，1525，1550，1575，1600，1625，1650或者1674nt长度的片段。例如，用一个长度为至少20nt的片段是指包括有来自保藏的cDNA核苷酸序列或者如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的20个或者更多个连续碱基的片段。
而且，VEGF-2多核苷酸片段的代表性实例包括，例如，具有从大约的核苷酸编号1-50，51-100，101-150，151-200，201-250，251-300，301-350，351-400，401-450，451-500，501-550，551-600，601-650，651-700，701-750，751-800，801-850，851-900，901-950或者从951至SEQ ID NO：1或保存在克隆中的cDNA的最后。文中的“大约的”包括该特别提到的范围、在一端或者两端再大几个或小几个(5，4，3，2，或1个)核苷酸。优选地，这些片段编码具有生物学活性的多肽。
本发明的全长的基因片段可用作DNA文库的杂交探针，来分离全长的cDNA并用于分离其他与该基因具有高度序列相似性或相似的生物学活性的cDNA。这种类型的探针优选地具有30个碱基并且还可以含有，例如，50个或更多个碱基。该探针还可以用于鉴定与全长转录物和基因组克隆或者含有包括该基因的调控和启动子区域、外显子和内含子的完整基因的克隆相应的cDNA克隆。扫描的实例包括利用已知的序列合成一个寡核苷酸来分离该基因的编码区。利用标记的具有与本发明的基因相互补的寡核苷酸扫描人cDNA文库、基因组DNA或mNA，以确定哪一个文库成员可与该探针杂交。
VEGF-2的“多核苷酸”还包括那些能够在严格的杂交条件下与SEQ ID NO：1所含的序列或者例如ATCC保藏号97149或75698所含的cDNA克隆及其互补序列相杂交的多核苷酸。“严格的杂交条件”是指在含有50％甲酰胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhadt溶液，10％硫酸右旋糖酐，和20μl/ml的变性的剪切鲑鱼精DNA的溶液中42℃温育过夜，然后在0.1×SSC中于65℃洗涤滤膜。
在的严格性条件下可与VEGF-2多核苷酸杂交的核酸分子也在考虑之中。杂交严格性和信号检测首先通过甲酰胺的浓度(较低百分比的甲酰胺导致较低的严格性)、盐浓度或着温度来调节。例如，较低的严格性条件包括在含有6×SSPEC(20×SSPE＝3M NaCl；0.2MNaH2PO4；0.02M EDTA，pH7.4)，0.5％SDS，30％甲酰胺，100μl/ml的用于封闭的鲑鱼精DNA的溶液中37℃温育过夜，然后在1×SSPE，0.1％SDS中于50℃洗涤。此外，为了达到较低严格性，在严格的杂交之后在较高的盐浓度条件下(如5×SSC)进行洗涤。
值得注意的是上述条件可以通过加入和/或替换其他的用于抑制杂交试验背景的封闭试剂而进行变化。典型的封闭试剂包括Denhardt试剂，印迹TO，肝素，变性鲑精DNA，和可商业获得的专利配方。特殊的封闭剂的加入可能要求根据相容性方面的问题而对上述的杂交条件进行修改。
当然，只与polyA+序列(诸如序列表中所列的cDNA的任何3，末端polyA+串)，或与互补的延伸的T(或U)残基杂交的多核苷酸，并不包括在“多核苷酸”的定义之中，因为这样的多核苷酸将会与任何含有poly(A)延伸或其互补序列的核酸分子(如，实际上任何的双连cDNA克隆)相杂交。
能与一个多核苷酸的“一部分”杂交的多核苷酸是指能够与至少大约15个核苷酸(nt)，优选的是至少大约20nt，更为优选的至少大约30nt，在更为优选的为大约30-70nt长度的参照核苷酸相杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。它们可以如上文中以及下面所更为详细的所讨论的用作诊断探针和引物。
一部分的“至少20nt长度”的多核苷酸，例如，是指20个或更多个连续的来自参照的多核苷酸(例如，保藏的cDNA或SEO IDNOS：1或3所示的核苷酸序列)的核苷酸。当然，只能与polyA序列(诸如SEQ ID NOS：1所示的VEGF-2 cDNA的3，末端poly(A)串)，或者只与T(或U)残基的互补性延伸序列相杂交的多核苷酸，并不包括在本发明中用于与本发明的核酸的一部分杂交的多核苷酸之中，因为这种多核苷酸将能够与任何含有poly(A)延伸或其互补序列的核酸分子(如，实际上任何的双连cDNA克隆)相杂交。
本发明还包括与SEQ ID NOS：1或3所示的核苷酸序列或者与保藏的cDNA的核酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的核酸分子，而不考虑它们是否编码具有VEGF-2活性的多肽。只是因为即使某个核酸分子不编码具有VEGF-2活性的多肽，本领域的熟练技术人员也知道如何将该核酸分子，例如，用作杂交探针或者聚合酶链反应(PCR)的引物。本发明的不编码具有VEGF-2活性的多肽的核酸分子的应用包括，尤其是，(1)从DNA中分离VEGF-2基因或者等位基因变异；(2)与中期染色体原位杂交(例如，“FISH”)以获得VEGF-2基因的精确定位，如Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon Press，New York(1988)中所述；以及Northern印迹分析以检测特异组织中VEGF-2 mRNA的表达。
但是，优选的是与SEQ ID NOS：1或3所示的核苷酸序列或者与保藏的cDNA的核酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或99％相同性的核酸分子，实际上，它们编码具有VEGF-2活性的多肽。“编码具有VEGF-2活性的多肽”是指在特定的生物学试验中显示出VEGF-2蛋白活性的多肽。例如，VEGF-2蛋白活性可以通过例如减数分裂试验和内皮细胞迁移试验来测定。参见，例如Olofsson等，美国科学院研究进展，93：2576-2581(1996)和Joukov等，欧洲分子生物学杂志，5：290-298(1996)。
当然，根据遗传密码简并性，本领域的一个普通的技术人员将能够马上意识到有大量的核酸分子，它们具有的序列与保藏的cDNA的核酸序列或者与SEQ ID NOS：1或SEQ ID NOS：3所示的核苷酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或99％相同性，而编码“编码具有VEGF-2蛋白活性”的多肽。实际上，由于这些核苷酸序列的简并性变异，对于熟练的技术人员来说很显然甚至不需要进行上述的比较试验。本领域所能够进一步理解的是，对于这些非简并性变异的核酸分子，也有相当的数量都编码具有VEGF-2蛋白活性的多肽。这是因为熟练的技术人员完全了解那些较小可能性的或者不可能显著影响蛋白功能的氨基酸置换(例如，以一种脂肪族氨基酸来替换另一种脂肪族氨基酸)。
例如，关于如何进行表型沉默的氨基酸置换的指导可以参见Bowie，J.U.等，“解读蛋白质序列中的信息：氨基酸置换的耐受性”科学，247：1306-131(1990)，作者在该文中提示蛋白质能够惊人地耐受氨基酸置换。
因此，本发明涉及与编码SEQ ID NOS：2或4的多肽、及其片段的多核苷酸、以及该多核苷酸所编码的多肽具有至少70％，优选的至少90％且更为优选的至少95％，96％，97％，98％或99％相同性，其片段具有至少30个碱基且优选的至少50个碱基。
“相同性”本身具有本领域所了解的意义并可以利用已经发表的技术得以计算。(参见，例如：(计算机分子生物学，Lesk，A.M.主编，牛津大学出版社，New York，(1988)；生物计算：信息学和基因组计划，Smith，D.W.主编，Academic Press，New York，(1993)；序列数据的计算机分析，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.主编，HumanaPress，New York(1994)；分子生物学中的序列分析，von Heinje，G.Academic Press，(1987)；以及序列分析初级读本，Gribskov，M.和Dewereux，J.主编，M Stockton Press，New York，(1991).)由于存在着大量的方法计算两个多核苷酸或多肽序列之间的相同性，术语“相同性”对于熟练的业内人员来说是熟知的。(Carillo，H.，和Lipton，D.，SIAM应用数学杂志，48：1073(1988))通常用以确定两个序列之间的方法包括，但不局限于，“巨型计算机指南”(Martin J.Bishop编，Academic Press，San Diego，(1994)和Carillo，H.，以及Lipton，D.，SIAM应用数学杂志，48：1073(1988))所公开的那些方法。比对多核苷酸或多肽的方法已经编有计算机程序，包括GCG程序包(Devereux，J.等，核酸研究，12(1)：387(1984))，BLASTN，FASTA(Atschl，S.F.等，分子生物学杂志，215：403(1990)，Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Unix系统第8版，遗传学计算机小组，University Resarch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711(利用Smith和Waterman的局部同源算法，应用数学进展，2：482-489(1981))。对于一个多核苷酸，它与本发明的一个参照核苷酸序列具有至少，例如，95％的“相同性”是指，除了相对于每100个参照的编码VEGF-2多肽的核苷酸序列之中该序列最多包含5个点突变之外，该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列是相同的。换言之，为了获得具有与参照的核苷酸序列95％相同性的一个多核苷酸，在参照序列上最多5％的核苷酸可以缺失或用其他核苷酸置换，或者在参照序列上可以插入最多5％的核苷酸。查询序列可以是整个的序列SEQID NOS：1，ORF(开放阅读框)，或者任何如上所述的特定片段。
在实际当中，任一特定的核酸分子或多肽与本发明的核苷酸是否具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性可以方便地利用已知的计算机程序来确定。确定查询序列(本发明的序列)和一个目的序列之间的最佳全局匹配，也称全局序列比对，的一个优选的方法可以利用基于Bmtlag等(计算机应用生物科学，6：237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序。序列比对中查询序列和目的序列都是DNA序列。RNA序列可以通过将U转换为T而进行比较。所说的全局序列比对的结果以百分比相同性表示。进行DNA序列的FASTDB比对以计算百分比相同性时优选的参数为：Matrix＝Unitay，k-tuple＝4，Mismath Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，GapSize Penalty＝0.05，Window Size＝500或者目标核苷酸序列的长度，取较短的。
如果目的序列因5’或3’缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么必须对结果作手工修正。这是因为FASTDB程序在计算百分比相同性时不计算目的序列5’或3’的短缺。对于目的序列相对于查询序列5’或3’端的短缺，百分比相同性的修正是通过计算不匹配的位于目的序列5’或3’端的查询序列的碱基数，以作为查询序列总碱基数的百分比。通过FASTDB序列比对的结果来确定一个核苷酸是否匹配。然后将此百分数从百分比相同性中减去，从而获得最终的百分比相同性结果。此修正的结果才可用于本发明。FASTDB序列比对中所显示出的，只有在目的序列5’或3’端外侧的碱基，它们不与查询序列相匹配，才用于计算，以手工调节百分比相同性结果。
例如，一个90个碱基的目的序列与一个100个碱基的查询序列比对以确定百分比相同性。缺失发生于目的序列的5’末端，因此，FASTDB比对不显示出5’端前10个碱基的匹配。这10个不匹配的碱基相当于序列的10％(5’或3’端不匹配的碱基数/查询序列中的碱基总数)，因而从FASTDB程序计算的百分比相同性中减去这10％。如果剩余的90个碱基都完全匹配，那么最终的百分比相同性就是90％。再例如，一个90个碱基的目的序列与一个100个碱基的查询序列相比较。这时的缺失是内部的核苷酸，因而目的序列的5’或3’端碱基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的百分比相同性不需手工修正。再强调一次，只有目的序列的5’或3’端碱基与查询序列不匹配的才需要手工修正。对于本发明不需要进行其他的手工修正。
对于一个多肽所含有的氨基酸序列与本发明的查询氨基酸序列具有，例如，95％“相同性”是指，除了相对于每100个查询序列的氨基酸之中该目的序列可最多包含5个氨基酸改变之外，该目的序列的氨基酸与查询序列是相同的。换言之，为了获得所含的氨基酸序列与查询序列至少95％相同的多肽，目的序列上最多5％的氨基酸残基可以被插入、缺失(内部缺失)或用其他的氨基酸替换。这些在参照序列上的改变可以发生在参照的氨基酸序列的氨基端或羧基端位置或者位于末端之间的任何位置，可以是在参照序列的残基间各自分散的或者在参照序列上呈连续的一组或多组。
在实际中，任一特定的多肽与，例如，表1所示的或保藏的cDNA所编码的氨基酸序列是否具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性，可以方便地利用已知的计算机程序来确定。确定查询序列(本发明的序列)和一个目的序列之间的最佳全局匹配，也称全局序列比对，的一个优选的方法可以利用基于Bmtlag等(计算机应用生物科学，6：237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序。序列比对中查询序列和目的序列都是核苷酸序列或者都是氨基酸序列。所说的全局序列比对的结果以百分比相同性表示。进行氨基酸序列的FASTDB比对以计算百分比相同性时优选的参数为：Matrix＝PAM0，k-tuple＝2，Mismath Penalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或者目标核苷酸序列的长度，取较短的。
如果目的序列因N-或C-端缺失而非由于内部缺失而比查询序列短，那么必须对结果作手工修正。这是因为FASTDB程序在计算全局百分比相同性时不计算目的序列N-或C-端的短缺。对于目的序列相对于查询序列在N-或C-端的短缺，百分比相同性的修正是通过计算不匹配的位于目的序列N-或C-端的查询序列的残基数，以作为查询序列总数的百分比。一个残基是否匹配通过FASTDB序列比对的结果来确定。然后将此百分数从百分比相同性中减去，从而获得最终的百分比相同性结果。此修正的结果才可用于本发明。FASTDB序列比对中所显示出的，只有在目的序列N-或C-端不与查询序列相匹配的残基，才被计算用以手工调节百分比相同性结果。就是说，只有目的序列的最外端的N-或C-端残基之外的查询残基才需要调节。
例如，一个90个氨基酸残基的目的序列与一个100个残基的查询序列比对以确定百分比相同性。缺失发生于目的序列的N末端，因此，FASTDB比对不显示出N端前10个残基的匹配。这10个不匹配的残基相当于序列的10％(N-或C-端不匹配的残基数/查询序列中的残基总数)，因而从FASTDB程序计算的百分比相同性中减去这10％。如果剩余的90个残基都完全匹配，那么最终的百分比相同性就是90％。再例如，一个90个残基的目的序列与一个100个残基的查询序列相比较。这时的缺失是内部缺失，因而目的序列的N-或C-端残基没有与查询序列不匹配的。在这种情况下，FASTDB程序计算的百分比相同性不需手工修正。再强调一次，只有目的序列的N-或C-端残基与查询序列不匹配的才需要手工修正。对于本发明不需要进行其他的手工修正。
VEGF-2多肽
本发明进一步涉及了具有图1或2推导出的氨基酸序列的，或者由保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽，以及这些多肽的片段、类似物和衍生物。
对于图1或2的或由保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽所说的“片段”、“类似物”和“衍生物”是指保留了如图所示的VEGF蛋白的保守性基序并具有基本上相同的生物学功能和活性的多肽。
本发明中，“多肽片段”是指一段短的包含在SEQIDNO：2中的或者由保藏克隆所含的cDNA编码的氨基酸序列。蛋白片段可以“自立的”或者包含在一个较大的多肽之内而该片段构成其中的一部分或一个区域，优选的作为一个单独的连续的区域。本发明的多肽片段的代表性的实例包括，例如，下列片段：从大约第1-20位氨基酸，21-40，41-60，61-80，81-100，101-120，121-140，141-160，161-180，181-200，201-220，221-240，241-260，261-280，281至编码区的末端。而且，多肽片段的长度可以大约为20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150个氨基酸。文中的“大约”包括了所特别提及的范围，在一侧或两侧增加或减少几个(5，4，3，2或1)氨基酸。
优选的多肽片段包括分泌的VEGF-2蛋白及其成熟型。更为优选的多肽片段包括在氨基端或羧基端或者两端具有连续的系列缺失残基的分泌的VEGF-2蛋白或其成熟型。例如，从分泌的VEGF-2蛋白或其成熟型的氨基端可以缺失范围在1-60之内的任何数量的氨基酸。相似地，从分泌的VEGF-2蛋白或其成熟型的羧基端可以缺失范围在1-30之内的任何数量的氨基酸。而且，优选的是上述的氨基端和羧基端缺失的任何组合。相似地，编码这些VEGF-2多肽片段的多核苷酸片段也是优选的。
同样优选的是具有结构或功能域特征的VEGF-2多肽和多核苷酸片段，诸如，含有α-螺旋和α-螺旋形成区，β-折叠和β-折叠形成区，转折和转折形成区，盘旋和盘旋形成区，亲水区，疏水区，α兼性区，β兼性区，柔性区，表面形成区，底物结合区，和高抗原性指数区。处于保守的结构域中的SEQIDNO：2的多肽片段是本发明所特别考虑的。(见图2)另外，编码这些结构域的多核苷酸也是本发明所考虑的。
其它的优选的片段为具有生物学活性的VEGF-2片段。有生物学活性的片段是显现出相似的活性的片段，而不需要与VEGF-2片段的活性相同。该片段的生物学活性可包括增强的所需的活性，或降低的所不需要的活性。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽，或者合成的多肽，优选的是重组多肽。
在本领域中能够认识到的是，VEGF-2片段的一些氨基酸序列可以改变而不显著地影响该蛋白的结构或功能。如果要考虑序列上的这类差异，那么应当记住的是该蛋白上决定活性的重要区域。
因此，本发明进一步包括VEGF-2多肽的变异体，它们可表现出基本的VEGF-2活性的，或者含有VEGF-2蛋白区域诸如下文中将要描述的蛋白质部分。这种突变包括缺失、插入、倒置、重复、和类型置换。如上所述，关于如何进行表型沉默的氨基酸置换的指导可以参见Bowie，J.U.等，“解读蛋白质序列中的信息：氨基酸置换的耐受性”科学，247：1306-131(1990)。
因此，图1或2的或由保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物可以是：(I)其中的一个或多个氨基酸残基被保守型或非保守型氨基酸残基(优选的为保守型氨基酸残基)所替换，而且这种替换氨基酸残基可以是也可以不是遗传密码所编码的；或者(II)其中的一个或多个含有替换基团的氨基酸残基；或者(III)其中的成熟多肽与另一种化合物相融合，诸如能够增强该多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)；或者(IV)其中添加的氨基酸与成熟多肽相融合，诸如前导或分泌序列或用与成熟多肽或前体蛋白序列的纯化；或者(V)其中含有较少的SEQIDNO：2或4所示的氨基酸残基，而保留了保守基序并仍然保留了VEGF家族多态活性特征。从本文的叙述中本领域的熟练技术人员应当能够了解这些的片段、类似物和衍生物。
所特别感兴趣的置换是将带电荷氨基酸用另一个带电荷的氨基酸和用中性的或带负电荷的氨基酸所替换。后者导致蛋白降低了正电荷而提高了VEGF-2的特性。防止凝聚作用是非常需要的。蛋白的凝聚不仅仅导致活性的丢失而且还会在制备药学配方时产生问题，因为这会产生免疫原性。(Pinckard等，临床实验免疫学，2：331-334(1967)；Robbins等，糖尿病，36：838-845(1987)；Cleland等，治疗性药物载体系统评论，10：307-377(1993))。
氨基酸的替换还可以改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等，自然，361：266-268(1993)描述了某种突变导致TNFα只与两者已知类型TNF受体之中的一种选择性地结合。因此，本发明的VEGF-2可包括来自天然的突变或者人工操作的一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。
正如所表明的，优选的改变是非本质性的，诸如不会显著地影响蛋白质的折叠或活性的保守型氨基酸置换(见表1)。
表1：保守型氨基酸置换
    芳香类疏水型极性碱性酸性小型     苯丙氨酸色氨酸酪氨酸亮氨酸异亮氨酸缬氨酸谷氨酰胺天冬酰胺精氨酸赖氨酸组氨酸天冬氨酸谷氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸甘氨酸
当然，熟练的技术人员可以根据许多，包括上述的，因素来确定氨基酸置换的数量。一般地讲，任一给定的VEGF-2多肽的氨基酸置换的数量不应超过50，40，30，25，20，15，10，5或3个。
本发明的VEGF-2蛋白中的基本的功能性氨基酸可以通过本领域所熟知的方法来确定，诸如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，科学，244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子定额每一个残基上引入丙氨酸突变。然后将获得的突变分子进行生物学活性测验如受体结合或体外增殖活性。对于配体-受体结合具有重要性的位点可以通过结构分析如结晶、核磁共振或光亲和标记来确定(Smith等，分子生物学杂志，224：899-904(1992)和de Vos等，科学，255：306-312(1992))。
本发明的多肽和多核苷酸优选地已分离的形式提供，并且优选地纯化至同质程度。
术语“分离的”是指材料是从其原始环境(例如，天然环境，如果它是天然产生的)中获得的。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是从一些或者全部共同存在于天然体系的物质中分离出来的同样的多核苷酸或DNA或多肽就是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分而且/或者这种多核苷酸或多肽可以是一种组合物的一部分，而在这种载体或组合物之中它仍然是分离的而非其天然环境中的一部分。
在特殊的实施方案中，本发明的多核苷酸长度小于300kb，200kb，100kb，50kb，15kb，10kb，或7.5kb。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸含有至少15个连续核苷酸的VEGF-2编码序列，但并不含有全部的或者部分的VEGF-2内含子。在另一个实施方案中，该核酸所含的VEGF-2编码序列不含有基因组的两侧基因的编码序列(例如，基因组中VEGF-2基因的5’或3′侧)。
本发明的多肽包括SEQ ID NOS：2和4的多肽(尤其是成熟的多肽)以及与SEQ ID NOS：2和4的多肽具有至少70％相似性(优选的为至少70％相同性)，且更为优选的是及与SEQ ID NOS：2和4的多肽具有至少90％的相似性(更优选的为至少95％的相同性)，而再更为优选的是及与SEQ ID NOS：2和4的多肽具有至少95％的相似性(更优选的为至少90％的相同性)并且包括的这些多肽一部分，通常是含有至少30个氨基酸且优选的是至少50个氨基酸的一部分。
正如本领域所了解的，两个多肽之间的“相似性”可以通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸置换与第二个多肽的序列进行比较来确定。
本发明多肽的片段和部分通过肽的合成可以用于产生相应的全长的多肽；因此，该片段可以用作产生相应的全长多肽的中间产物。本发明多核苷酸的片段和部分可以用于合成全长的本发明的多肽。
本发明的多肽包括由保藏的含有前导序列的cDNA所编码的多肽；由保藏的去除了前导序列的cDNA所编码的成熟多肽(例如成熟蛋白)；含有SEQ ID NOS：2中大约-23至大约396位氨基酸的多肽；含有SEQ ID NOS：2中大约-22至大约396位氨基酸的多肽；含有SEQID NOS：2中大约1至大约396位氨基酸的多肽；以及与上述的多肽具有至少95％，更有选的是至少96％，97％，98％或99％相同性的多肽，并且还包括这些多肽的含有至少30个氨基酸且优选的是至少50个氨基酸的一部分。
融合蛋白
任何的VEGF-2多肽都可以用于产生融合蛋白。例如，VEGF-2多肽在与第二个蛋白融合时，可以用作抗原性标签。针对该VEGF-2多肽产生的抗体可以通过与VEGF-2的结合用于对第二个蛋白直接检测。而且，由于分泌蛋白根据转运信号来进行细胞定位，所以VEGF-2多肽一旦与其他蛋白相融合就可以用作为靶向性分子。
可以与VEGF-2多肽融合的结构域的实例不仅包括异源性信号序列，还包括其他异源性功能区域。融合不一定必须是直接的，也可以通过接头序列来实现。
而且，融合蛋白也可以通过操作而改进VEGF-2多肽的特性。例如，可以将添加的氨基酸区域，尤其是带电荷的氨基酸，加到VEGF-2多肽N末端，从而在从宿主细胞中纯化或者后续的操作和储藏过程中提高其稳定性和持续性。另外，可以将肽半族添加到VEGF-2多肽上以利于纯化。该区域可以在VEGF-2多肽的最终制备之前去除。添加肽半族以利于多肽的操作是本领域中熟知的常规性技术。
而且，VEGF-2多肽，包括片段，和特异表位可以与免疫球蛋白(IgG)的部分恒定区域相结合，形成嵌合多肽。这些融合蛋有利于纯化并在体内显示出延长了半衰期。一个已报道的实例描述了一种嵌合蛋白，它由人CD4多肽的前两个区域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链上恒定区的不同结构域组成。(EPA 394,827；Traunecker 等，自然，331：84-86(1988))。含有二硫键连接的二聚体结构的融合蛋白(由于IgG)还可在结合和中和其他分子的过程中比单体的分泌蛋白或单独的蛋白片段更为有效。(Fountoulakis等，生物化学杂志，270：3958-3964(1995)。
类似地，EP-A-0 464 533(Canadian counterpart 2045869)公开了含有免疫球蛋白分子的恒定区的不同部分育龄一个人蛋白或其部分一起所构成的融合蛋白。在多数情况下，融合蛋白的Fc部分对治疗和诊断有利，因而可以，例如，改进遗传药理学特性。(EP-A 0232 262.)也可能需要对表达、检测和纯化后的融合蛋白去除Fc部分。例如，如果融合蛋白用作免疫的抗原，Fc部分可能会阻碍治疗和诊断。在药物开发中，例如，人蛋白如hIL-5，曾与Fc部分融合，为的是进行高效率的扫描试验以鉴定hIL-5的拮抗剂。(见D.Bennett等，分子识别杂志，5：52-58(1995)；K.Johanson等，生物化学杂志，270：9459-9471(1995)。
而且，VEGF-2多肽可以与标记序列相融合，如有利于纯化VEGF-2的肽。在优选的实施方案中，标记的氨基酸序列是一个六个组氨酸的肽，如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)上所提供的标签，等等，其中很多都可以商业购得。正如Gentz等，美国科学院研究进展，56：821-824(1989)中所述，例如，六个组氨酸提供了对该融合蛋白的纯化提供了方便。另一个用于纯化的肽标签是“HA”标签，它相应于来自流感红血球凝聚素蛋白的表位(Wilson等，细胞，37：767(1984)。
因此，可以用VEGF-2多核苷酸或多肽操作产生上述的任何融合形式。
VEGF-2的生物学活性
VEGF-2多核苷酸或多肽可以用于检测一种或多种生物学活性的试验。如果在某个试验中VEGF-2多核苷酸或多肽表现出活性，VEGF-2就可能与该生物学活性相关的疾病有关联。因此，VEGF-2可以用来治疗相关疾病。
免疫活性
VEGF-2多肽或多核苷酸通过激活或抑制免疫细胞的增殖、分化或激动(趋药性)，可以用于治疗免疫系统的缺陷或紊乱。免疫细胞通过造血作用发育，由多能干细胞产生脊髓细胞(血小板、红细胞、嗜中性粒细胞、和巨噬细胞)和淋巴细胞(B和T淋巴细胞)。这些免疫缺陷或疾病的发病原因可能是遗传性的、体细胞的，如癌症或自身免疫性疾病，获得性(如化疗或毒素引起的)，或感染性的。再者，VEGF-2多核苷酸或多肽可以作为某种特异的免疫系统疾病或紊乱的一种标记或检测物。
VEGF-2的多核苷酸或多肽可用于治疗或检测造血细胞的缺陷或功能异常。VEGF-2的多核苷酸或多肽可用于提高造血细胞的分化和增殖，包括多能干细胞，试图用于治疗那些与某种(或多种)类型造血细胞有关的疾病。免疫缺陷综合征的实例包括，但不仅限于这些：血红蛋白病(如丙种球蛋白缺乏症，丙种球蛋白异常症)，共济失调性毛细血管扩张症，常见的变异性免疫缺陷症，Digeorge综合征，HIV(人免疫缺陷病毒)感染，HTLV-BLV(人T淋巴细胞一B淋巴细胞)感染，白细胞粘附缺陷综合征，淋巴细胞减少症，吞噬细胞杀伤功能异常，重症联合免疫缺陷症(SCIDs)，Wiskott-Adrich病，贫血，血小板减少症，或血红蛋白尿。
再者，VEGF-2的多核苷酸或多肽还可用于调节止血(中止出血)或血栓活性(血栓形成)。例如，通过提高止血或血栓活性，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以用于治疗血液凝固性疾病(如纤维蛋白原缺乏症，凝血因子缺陷)，血小板异常(如血小板减少症)，或由外伤，手术或其他原因造成的创伤。另一方面，VEGF-2的多核苷酸或多肽还可降低止血或血栓活性，可用于抑制或溶解血栓，这在治疗心脏病发作(心肌梗塞)，中风或疤痕形成时，非常重要。
VEGF-2的多核苷酸或多肽还可用于治疗或检测自身免疫性疾病。许多自身免疫性疾病起源于免疫细胞将自身的组织作为外源性的异物进行的异常识别。这种异常识别导致宿主组织破坏的免疫应答。因此，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以抑制免疫应答，尤其抑制T细胞的增殖、分化或趋化，所以VEGF-2的多核苷酸或多肽在预防自身免疫性疾病时，可能是一种有效的治疗措施。
可以用VEGF-2治疗或诊断的自身免疫性疾病的实例包括，但不仅限于这些：艾迪森氏病，溶血性贫血，抗磷脂综合征，类风湿性关节炎，皮炎，过敏性脑脊髓炎，肾小球肾炎，Goodpasture综合征，Graves病，多发性硬化，重症肌无力，神经炎，眼炎，大天疱样疮，天疱疮，多内分泌腺病，紫癜，Reiter病，Stiff-Man综合征，自身免疫性甲状腺炎，系统性红斑狼疮，自身免疫性肺部炎症，格林—巴里(Guillain-Barre)综合征，胰岛素依赖的糖尿病和自身免疫性炎性眼病。
同样地，过敏反应和疾病，例如哮喘(尤其是过敏性哮喘)或其他呼吸系统疾病，也可用VEGF-2的多核苷酸或多肽进行治疗。再者，VEGF-2还可用于治疗过敏反应，抗原分子或血型不符所引起的超敏反应。
VEGF-2的多核苷酸或多肽还可用于治疗和/或预防器官排斥或移植物抗宿主反应(GVHD)。器官排斥反应是宿主的免疫细胞通过免疫应答破坏移植组织的反应。同样地，GVHD还会发生另一种免疫应答，而此时却是外源移植物的免疫细胞破坏宿主组织。VEGF-2的多核苷酸或多肽可以抑制免疫应答，尤其可以抑制T细胞的增殖、分化或趋化，因此可以作为预防器官排斥或GVHD的一种有效的治疗手段。同样，VEGF-2的多核苷酸或多肽还可用于调节炎症反应。例如，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以抑制参与炎症反应的细胞的增殖与分化。这些分子可用于治疗急性和慢性炎性疾病，包括与炎症相关的感染(如感染性败血症性休克，脓毒症，或全身炎性反应综合征(SIRS)，缺血—再灌注性损伤，内毒素性损害，关节炎，补体介导的超急排斥反应，肾炎，细胞因子或趋化因子引起的肺损伤，炎性肠病，克隆(Crohn)病，或细胞因子生成过多引起的疾病(如TNF或IL-1)。
过度增殖性疾病
VEGF-2的多核苷酸或多肽可用于治疗或检测过度增殖性疾病，包括肿瘤。VEGF-2拮抗剂的多核苷酸或多肽通过直接或间接作用，可以抑制此类疾病的增殖。另一方面，VEGF-2拮抗剂的多肽类或多核苷酸类可以使其他细胞增殖，而这些细胞可以抑制过度增殖性疾病。
例如，通过提高免疫应答，尤其是提高过度增殖性疾病的抗原质量或通过使T细胞的增殖，分化或动员，用于过度增殖性疾病的治疗。通过提高现有的免疫应答，或启动新的免疫应答，均可提高这种免疫应答。另一种情况，降低免疫应答还可作为治疗过度增殖性疾病的一种方法，如化疗药物。
VEGF-2拮抗剂的多肽类或多核苷酸类可用于治疗或检测过度增殖性疾病的实例包括，但不仅限于以下部位的肿瘤：腹部，骨骼，乳腺，消化道，肝脏，胰腺，腹膜，内分泌腺(肾上腺，甲状旁腺，垂体，睾丸，卵巢，胸腺，甲状腺)，眼睛，头颈部，神经(中枢和周围神经)，淋巴系统，盆腔，皮肤，软组织，脾脏，胸部和泌尿生殖器。
同样地，其他过度增殖性疾病还可用VEGF-2拮抗剂的多肽类或多核苷酸类治疗或检测。这些过度增殖性疾病的实例包括，但不仅限于以下这些情况：高丙种球蛋白血症，淋巴增殖性疾病，异型蛋白血症，紫癜，结节病，Sezary综合征，Waldenstron巨球蛋白血症，Gaucher(高雪)氏病，组织细胞增多症，以及其他所有过度增殖性疾病，还包括位于上述所列举的各器官、系统的肿瘤。
感染性疾病
VEGF-2的多核苷酸或多肽可用于治疗或检测传染病原体。例如，通过提高免疫应答，尤其是提高B和/或T细胞的增殖和分化，治疗感染性疾病。通过提高现有的免疫应答，或启动新的免疫应答，均可提高这种免疫应答。另外，VEGF-2的多核苷酸或多肽还可直接抑制感染性病原体，而不产生免疫应答。
病毒是一种可以引起疾病或症状的感染性病原体，此类疾病可以用VEGF-2的多核苷酸或多肽进行治疗或检测。包括以下病毒：虫媒病毒科，腺病毒科，动脉病毒，双节RNA病毒科，布尼亚病毒科，杯状病毒科，Circoviridae，冠状病毒科，黄病毒科，DNA肝病毒科(肝炎病毒)，疱疹病毒科(例如，巨细胞病毒，单纯疱疹病毒，带状疱疹病毒)，Mononegavirus(如，副粘病毒科，麻疹病毒，弹状病毒科)，正粘病毒科(如流感病毒)，乳多空病毒科，细小病毒科，小RNA病毒科，痘病毒科(如水痘或牛痘病毒)，呼肠孤病毒科(如轮状病毒)逆转录病毒科(HTLV-I，HTLV-II，慢病毒)和外衣病毒科(如风疹病毒)。上述不同种类的病毒可以引起各种各样的疾病或症状，包括，不仅限于这些：关节炎，细支气管炎，脑炎，眼部感染(如结膜炎，角膜炎)，慢性疲劳综合征，肝炎(甲、乙、丙、戊、慢性活动性肝炎、非甲非乙型肝炎)，脑膜炎，机会感染(如艾滋病)，肺炎，Burkitt淋巴瘤，水痘，出血热，麻疹，腮腺炎，副流感，狂犬病，普通感冒，脊髓灰质炎，白血病，风疹，性传播疾病，皮肤病(如卡波氏瘤，疣)，病毒血症。VEGF-2的多核苷酸或多肽可用于治疗或检测所有疾病和症状。
同样，细菌或真菌也可以引起疾病或症状，并能用VEGF-2的多核苷酸或多肽治疗或检测，包括以下革兰氏阴性和革兰氏阳性菌和真菌，不仅限于这些：放线菌(如棒状杆菌，分枝杆菌，奴卡氏菌)，曲霉菌，芽孢杆菌(如炭疽杆菌，梭状芽孢杆菌)，多形杆状菌，芽生菌，博代杆菌，疏螺旋体菌，布鲁杆菌，念珠菌，弯曲杆菌，球孢子菌，隐球菌，Dermatocycoses，肠杆菌(如克雷伯杆菌，沙门氏菌，沙雷氏菌，耶尔森氏菌)，丹毒丝菌，螺杆菌，军团菌，钩端螺旋体，李斯特菌，支原体，奈瑟氏菌(如不动杆菌，淋球菌，脑膜炎球菌)，巴斯德菌感染(如放线杆菌，嗜血杆菌，巴斯德菌)，假单胞菌，立克次氏体，衣原体，梅毒和葡萄球菌。这些杆菌或真菌可引起以下疾病和症状，包括但不仅限于这些：菌血症，心内膜炎，眼部感染(结膜炎，结核，葡萄膜炎)，牙龈炎，机会感染(如艾滋病相关的感染)，甲沟炎，修复术有关的感染，Reiter病，呼吸道感染，如百日咳或脓胸，败血症，莱姆病，猫抓病，痢疾，副伤寒，食物中毒，伤寒，肺炎，淋病，脑脊膜盐炎，衣原体病，梅毒，白喉，麻风病，类结核，结核，狼疮，肉毒素中毒，坏疽，破伤风，脓疱病，风湿热，猩红热，性传播疾病，皮肤病(如蜂窝组织炎，Dermatocycoses)，毒血症，尿路感染，伤口感染。VEGF-2的多核苷酸或多肽可以治疗或检测上述任何疾病和症状。
再者，寄生虫引起的疾病和症状也可以用VEGF-2的多核苷酸或多肽治疗或诊断，包括以下疾病，不仅限于这些：阿米巴病，巴贝虫病，球虫病，Cryptosporidiosis，双核阿米巴病，Dourine，体外寄生虫病，贾第鞭毛虫病，蠕虫病，利什曼原虫病，Theileriasis，弓形体病，锥虫病和毛滴虫病。这些寄生虫可以引起多种疾病和症状，包括但不仅限于这些，疥疮，Trombiculiasis，眼部感染，肠病(如痢疾，贾第鞭毛虫病)，肝病，肺病，机会性感染(如艾滋病相关的)，疟疾，妊娠期并发症，弓形体病。VEGF-2的多核苷酸或多肽可用于治疗或检测这些症状和疾病。
优选的方法，用VEGF-2的多核苷酸或多肽进行治疗，既可通过给患者使用有效剂量的VEGF-2的多肽，也可通过先从患者体内取出细胞，将VEGF-2多核苷酸装入此种细胞，再将这些“工程”细胞输回患者体内(间接体内治疗)。再者，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以作为疫苗的一种抗原，提高机体抗感染性疾病的免疫应答。
再生
VEGF-2的多核苷酸或多肽可用于诱导细胞的分化、增殖，以及吸引细胞，促进组织的再生(见科学，1997，276：59-87)。组织再生可用于修复、取代或保护由以下原因造成的组织损伤：先天性缺陷，创伤(伤口，烧伤，切口或溃疡)，衰老，疾病(如骨质疏松症，骨关节炎，牙周疾病，肝功衰竭)，手术，包括美容整形术，纤维化，再灌注性损伤，或系统性细胞因子受损。
使用本发明可以使组织再生，包括器官(如胰腺，肝脏，肠，肾脏，皮肤，内皮)，肌肉(平滑肌，骨骼肌或心肌)，血管(包括血管内皮)，淋巴管(包括淋巴管内皮)，神经，造血器官，骨骼(骨骼，软骨，肌腱和韧带)组织。尤其是，再生不伴有或降低疤痕的形成。再生还包括血管发生。
再者，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以促进难愈合组织的再生。例如，肌腱/韧带再生能力的提高，可以加快损伤后痊愈时间。本发明的VEGF-2的多核苷酸或多肽还可用于预防，避免损伤。用于一些特殊疾病的治疗，包括肌腱炎，腕骨通道综合征和其他腱或韧带缺损。还有一些不愈合性伤口的组织再生的实例，包括紧张性溃疡，血管缺损性溃疡，手术和外伤。
同样地，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以使神经和脑组织再生，因为它可以使神经细胞增殖和分化。使用该方法治疗的疾病包括中枢和周围神经系统疾病，神经病变，或机械性和外伤性疾病(如，脊索疾病，头外伤，脑血管病和中风)。尤其是与周围神经损伤有关的疾病，周围神经病(如由化疗或其他疗法引起)局部神经病和中枢神经系统疾病(如阿尔兹海默病，帕金森病，亨廷顿病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症和Shy-Drager综合征)，均可用VEGF-2的多核苷酸或多肽进行治疗。
趋化性
VEGF-2的多核苷酸或多肽具有趋化活性。趋化分子可以吸引或动员细胞(如单核细胞，成纤维细胞，中性粒细胞，T细胞，肥大细胞、嗜酸性粒细胞，上皮细胞和/或内皮细胞)到达体内特定的位点，如炎症，感染或过度增殖等部位。动员的细胞继而对抗和/或愈合特异的损伤或异常。
VEGF-2的多核苷酸或多肽可以提高某些特定细胞的趋化活性。这些趋化分子继而又通过提高细胞到达体内特异靶组织位点的数量治疗炎症、感染、过度增殖性疾病，或任何免疫系统疾病。例如，趋化分子通过吸引免疫细胞到达受损部位，可以治疗伤口和其他组织创伤。VEGF-2作为一种趋化分子还可吸引成纤维细胞用于治疗伤口。
还应该考虑到VEGF-2的多核苷酸或多肽可以抑制趋化活性。这些分子还用于疾病的治疗。因此，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以作为一种趋化抑制剂。
结合活性
VEGF-2多肽可用于筛选结合VEGF-2的分子，或VEGF-2结合的分子。VEGF-2与分子的结合可以活化(激动剂)、提高、抑制(拮抗剂)、或降低VEGF-2或结合分子的活性。这样的分子实例包括抗体、寡核苷酸、蛋白质(如受体)、或小分子。
优选的分子应是与天然的VEGF-2配体密切相关，如一段配体，或天然的底物，配体，结构或功能的类似物。(见Colihan等，当代免疫学方法，1(2)：第五章，1991。)。同样地，分子应与VEGF-2结合的天然受体密切相关(即Flt-4)，或者至少可以结合VEGF-2受体的一部分(如活性位点)。在二者中任何一种情况下，分子可以通过已知的技术进行合理设计。优选，对这些分子的筛选，包括生成可表达VEGF-2的细胞，VEGF-2既可以作为一种分泌蛋白，也可以是一种膜结合蛋白。优选的细胞包括哺乳动物，酵母，果蝇，或大肠杆菌的细胞。表达VEGF-2的细胞(或含有表达多肽的细胞膜)优先与一种检测化合物作用，该化合物具有潜在的结合、刺激，或抑制VEGF-2或分子本身活性的分子。
该分析方法可以很容易地检测备选化合物与VEGF-2结合，可通过某种标记进行检测，或通过与标记的竞争物的竞争来分析测定。再者，该方法可以检测备选化合物是否导致结合VEGF-2的信号。
另一种情况，还可以用不含细胞的标本，与固相结合的多肽/分子，化学制剂文库，或天然产品混合物进行测试。该方法非常简单，仅包括以下步骤：将备选化合物与含有VEGF-2的溶液混合，检测VEGF-2/分子的活性或结合，以及将VEGF-2/分子活性或结合与标准物比较。
应用单克隆抗体或多克隆抗体，优选ELISA(酶联免疫吸附试验)法，来检测样本(如生物样本)中VEGF-2的量或活性。抗体通过直接或间接地结合VEGF-2，或与VEGF-2竞争结合底物，用来检测VEGF-2的水平或活性。
上述所有的检测方法可以作为诊断或预后的指标。用这些方法发现的分子，通过活化或抑制VEGF-2/分子，可治疗疾病或给患者带来某种特殊后果(如血管生长)。再者，这些检测方法可以发现某些可以抑制或增加VEGF-2从合适的细胞或组织中合成的物质。
因此，本发明包括一种鉴别与VEGF-2结合的化合物的方法，包括以下步骤：(a)将一种备选的具有结合功能的化合物与VEGF-2一起孵育；(b)如果已经结合，进行检测。再者，本发明包括一种识别激动剂/拮抗剂的方法，有以下几步：(a)将一种备选化合物与VEGF-2一起孵育，(b)确定VEGF-2的生物学活性是否已经发生变化。
其他活性
VEGF-2的多核苷酸或多肽还可以提高或降低胚胎干细胞，以及前面所提及造血干细胞的分化或增殖。
VEGF-2的多核苷酸或多肽还可用于调节哺乳动物的特征，如身高，体重，毛发的颜色，眼睛的颜色，皮肤，脂肪组织的百分比，色素，大小和体形(如美容手术)。同样，VEGF-2的多核苷酸或多肽可以用于调节哺乳动物的代谢，影响能量的合成代谢，分解代谢，能量的合成、利用和储存。
VEGF-2的多核苷酸或多肽通过影响生物节律，心律，抑郁(包括抑郁症)，暴力倾向，疼痛的耐受，生殖能力(尤其是受活化素或抑制素样的活性的作用)，体液或内分泌水平，食欲，性欲，记忆，应激，或其他认知特性，还可用来改变哺乳动物的精神状态或物理状态。
VEGF-2的多核苷酸或多肽还可作为食品的添加剂或防腐剂，例如可以提高或降低储存能力，脂肪含量，脂类，蛋白质，碳水化合物，维生素，无机盐，辅助因子或其他营养成分。
载体，宿主细胞和蛋白生成
本发明还与含有分离的本发明核酸分子的重组载体、含有重组载体的宿主细胞，以及制造载体、宿主细胞和应用重组技术，借助载体和宿主合成VEGF-2的多肽或肽的方法有关。
应用本发明的载体，例如可以是克隆载体或表达载体，通过遗传学(转导，转化，或转染)方法，可以制备工程化的宿主细胞。例如载体的形式可以是质粒，病毒颗粒，噬菌体，等。工程化宿主细胞可以在改进的普通的营养培养基上生长，活化启动子，筛选转化子，或扩增本发明的VEGF-2基因。培养条件，如温度，pH等，应是前面筛选宿主细胞表达所使用的条件，本领域中的熟练技术人员对此非常清楚。
本发明的VEGF-2多核苷酸，借助于重组技术可用于合成多肽。因此，例如，VEGF-2的多核苷酸序列可以放置在多种可以表达多肽的表达载体中。这些载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，如SV40的衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，酵母质粒，质粒和噬菌体DNA共同构建的载体，病毒DNA，如牛痘病毒，腺病毒，禽类痘病毒和假狂犬病毒。但是，只要可以在宿主体内复制、存活，任何质粒和载体均可使用。
有许多方法可以把适当的DNA序列插入到表达载体中。本领域通常采用的方法是把DNA序列插入在一个合适的限制性内切酶的酶切位点。该过程和其他步骤是本领域的熟练的技术人员所熟知的。
表达载体中的DNA序列与一个合适的表达调控序列相连，可以直接调节mRNA的合成。推荐可以使用的启动子是：LTR或SV40启动子，大肠杆菌的乳糖操纵子(1ac)或色氨酸操纵子(trp)，λ噬菌体PL启动子和其他已知的可以调控原核或真核细胞或它们的病毒基因表达的启动子。表达载体还含一个具有翻译起始结合位点的核糖体和一个转录终止子。载体还含有提高表达的合适的序列。
另外，表达载体应该优选含有至少一个选择标记基因，生成特异的表型特征，用来筛选转化的宿主细胞。这些标记基因有：用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶(DHFR)或新霉素抗性基因，以及用于大肠杆菌或其他细菌培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。
正如本文上述所列出的带有适当DNA序列和启动子或调控序列的载体，可用于转化合适的宿主，使宿主表达蛋白。推荐使用的适当宿主的实例包括，但不仅限于这些：细菌细胞，如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和链霉菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞如CHO、COS和Bowes melanoma；以及植物细胞。合适宿主的选择对本领域熟练的技术人员而言是不成问题的。
更为特殊的是，本发明还包括含有一个或多个上面已充分描述的DNA序列的重组构建体。重组构建体含有一个载体，如质粒或病毒载体，并插入本发明的序列，该序列在载体中可以为正向，也可以为反向。在一个优选的实施方案中，重组构建体还含有调节序列，例如包括启动子，可操纵与之相连的基因序列。有大量合适的载体和启动子为本领域熟练技术人员所熟知，并且已有商业化的产品供应。以下顺便列举常使用的载体：细菌：pQE70，pQE60和pQE9，从Qiagen公司可以获得；pBS载体，Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A，可以从Stratagene公司获得；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5，可从Pharmacia公司获得。优选的真核载体有，pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG，可从Stratagene公司获得；pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL，可以从Pharmacia公司获得。其他合适的载体熟练的技术人员会逐渐熟悉的。
除本发明中所使用的表达载体外，本发明还包括一些新载体，含有操纵基因和启动子元件，调控与之相连的可编码感兴趣蛋白质的核苷酸序列。一个实例载体是pHE4a，下面还将详述。
正如图28和29所总结的，pHE4a载体的成分(SEQ ID NO：16)包括：1)一个新霉素磷酸转移酶基因作为选择标记，2)一个E.coli的复制起始位点，3)一个T5噬菌体启动子序列，4)两个lac操纵子序列，5)一个Shine-Delgamo序列，6)一个乳糖操纵抑制基因(lacIq)，和一个多克隆连接位点。复制起始位点(oriC)来自pUC19(LTI，Gaithersburg，马里兰州)。启动子序列和操纵基因序列是人工合成的。核苷酸序列的合成本领域已非常清楚。CLONTECH95/96目录，第215-216页，CLONTECH公司位于美国加州的Palo Alto，EastMeadow Circle，1020号，邮编94303。pHE4a载体于1998年2月25日用保存在ATCC，编号为209645。
编码VEGF-2的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)与具有调控作用的pHE4a的启动子和操纵基因相连，分别用NdeI与XbaI或BamHI或XhoI或Asp718进行限制性酶切，通过凝胶分离出载体的大片段(多克隆位点区大约长310核苷酸)。然后再合成带有合适限制性酶切位点并可编码VEGF-2的序列(SEQ ID NO：1)，例如，可根据实施例1中所述的PCR方法，合成带有NdeI限制性酶切位点XbaI的引物(作为5′端引物)，另一条含有XbaI或BamHI或XhoI或Asp718位点引物(作为3′端引物)，进行PCR反应。PCR产物经过凝胶纯化，并用相应的限制性内切酶进行酶切。按照标准的操作规程，把插入片段和载体连接起来。
如上所述，pHE4a载体含有一个lacIq基因。lacIq是lacI的一个等位基因，受lac操纵基因的严格调节。Amann，E，等，基因，1988，69：301-305；Stark，M.等，1987，51：255-267。lacIq基因编码一种抑制蛋白，可以与lac操纵基因结合，抑制下游序列的转录(即3′端)。但是，在乳糖或某些乳糖的类似物如异丙基巯代-β-D-半乳糖苷(IPTG)存在时，lacIq基因产物从lac基因上解离下来。这样，VEGF-2在含有pHE4a载体的非诱导细胞中，就不能产生足够量的产物。但在加入诸如IPTG之类的物质后，就可以诱导宿主细胞中编码VEGF-2的基因表达。
pHE4a载体的启动子/操纵子序列(SEQ ID NO：17)含有一个T5噬菌体启动子和两个lac操纵基因序列。一个操纵基因位于5′端转录起始位点，另一个位于3′端相同的区域。这些操纵基因可与lacIq基因的表达产物结合，在缺乏lac操纵子诱导剂如ITPG时，操纵基因严格地抑制下游序列的表达。位于lac操纵基因下游的基因的表达是受操纵控制的，在添加lac操纵子的诱导剂如IPTG后，可以诱导表达。lac诱导剂与lacIq蛋白结合后，lacIq蛋白即从lac操纵基因序列上解离下来，启动相连序列的转录。lac操纵子调控基因表达，请参见Devlin，T的综述，临床相关生物化学教材，第四版，1997年，第802-807页。
pHE4系列载体含有pHE4a载体中除VEGF-2基因外的所有成分。pHE4a载体的特征包括最适的人工合成的T5噬菌体启动子，lac操纵基因和Shine-Delagarno序列。再者，这些序列还是最适分布的，这样，插入基因的表达可以受到严格调控，高表达有赖于诱导。
已知的适于本发明蛋白质合成的细菌启动子包括，大肠杆菌的lacI和lacZ启动子，T3和T7启动子，gpt启动子，λ的PR和PL启动子和trp启动子。真核适用的启动子包括CMV立刻早期启动子，HSV一胸苷激酶(tk)启动子，SV40的早期和晚期启动子，逆转录病毒的LTR启动子，如Rous肉瘤病毒和金属硫蛋白启动子，如小鼠金属硫蛋白—I启动子。
pHE4a载体在起始密码子AUG的5’端还含有Shine-Delgarno序列。Shine-Delagarno序列为一个短序列，通常位于起始密码子AUG上游10个核苷酸处。这些序列本质上可以指导原核生物的核糖体到达起始密码子AUG。
因此，本发明还可用来指导表达载体合成本发明的蛋白质。这一点可以用pHE4a加以实施(SEQ ID NO：16)。
借助CAT(氯酰基转移梅)载体或其他带有选择标记载体，可以从任何所需基因中选择启动子区。两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特殊的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λ噬菌体的PR、PL和trp。真核的启动子包括CMV的立刻早期启动子，HSV-tk，早期和晚期SV40，逆转录病毒的LTR，和小鼠的金属硫蛋白-I。选择合适的启动子和载体对本领域的专业技术人员而言已是一常规技术。
在另一个实施方案中，本发明与含有上述重组体的宿主细胞有关。宿主细胞可以是高等的真核细胞，例如哺乳动物的细胞，或者是低等的真核细胞，如酵母细胞，或者也可以是原核细胞，例如细菌细胞。应用下列方法可以把重组体导入宿主细胞中，如磷酸钙转染法，DEAE-纤维素介导的转染法，电穿孔法，转导，感染，或者其他方法(Davis，L，等，分子生物学的基本方法，1986)。
宿主细胞中的重组体可以很方便的用来合成由重组序列编码的基因产物。另外，本发明的多肽可以用普通的多肽合成仪进行人工合成。
成熟蛋白质在合适启动子调控下，可以在哺乳细胞，酵母，细菌，或其他细胞中表达。用不含细胞的翻译体系，借助于本发明所构建的重组体DNA的RNA，合成所需要的蛋白质。根据所使用的原核与真核宿主的不同，选择合适的克隆和表达载体，这一点，Sambrook，等已在其编著的“分子克隆：实验指南”(第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989年)，详细解释请见这里所附的参考文献。
高等真核生物转录一种编码本发明多肽的DNA，在载体中插入一个增强子后，可以使转录增强。增强子为DNA的顺式激活元件，通常长为10-300bp(碱基对)，可以作用于启动子，提高基因的转录。实例包括位于复制起始位点晚期的一侧(100-270bp)的SV40增强子，巨细胞病毒的早期启动子增强子，位于复制起始位点晚期侧的多瘤增强子，腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制位点和允许宿主细胞转化的选择标记如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因，啤酒酵母TRP1基因和来自高效表达基因的启动子，指导下游结构基因的转录。这些启动子可以是编码糖原分解酶的操纵子，如3-磷酸甘油激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，或者热激蛋白等其他蛋白质。异源的结构序列在合适的时期与翻译起始位点和终止序列进行装配，而前导序列具有指导翻译蛋白分泌到质膜周隙或胞外培养基中。异源序列可以选择性地编码一种融合蛋白，包括具有典型特征的N端识别肽，如稳定重组蛋白或易于纯化。
细菌表达载体的构建：将一个编码所需蛋白的结构DNA序列插入载体，与带有合适的翻译起始和终止信号，功能启动子可以调控序列的读码。载体将含有一个或多个表型选择标记和一个复制起始位点，以确保载体在宿主中扩增，维持载体的量。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌，枯草杆菌，伤寒沙门氏菌和各种普通假单孢菌，链霉菌和葡萄球菌，尽管其它菌也可以使用。
作为推荐用表达载体，并不仅限于这些实例，较常用的细菌表达载体含有一个选择性的标记和细菌的复制起始位点，后者可以从商业化质粒的遗传元件中获得，该质粒包括广为熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)。此类商业化的载体包括，例如pKK223-3(Pharmacia精细化学试剂公司，阿普萨拉，瑞典)和GEM1(Promega生物技术公司，麦迪逊，威斯康星，美国)。这些pBR322的“骨架”部分是由一个合适的启动子和表达的结构基因序列共同构成。
先进行合适宿主株的转化，并使宿主株长到合适的细胞密度，接着使用适当的方法(如改变温度或化学物质诱导)，选择性地抑制启动子，再将细胞培养一段时间。
细胞的收获通常采用离心的方法，用物理或化学的方法进行破坏，这样所得到的粗提物以备进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可以使用任何常用的方法进行破坏，这一点本领域里的熟练技术人员非常清楚，包括反复冻融，超声波，机械性破坏，或使用细胞裂解剂。
各种哺乳细胞培养体系还可用于表达重组蛋白。哺乳表达体系的实例包括猴肾的成纤维细胞的COS-7细胞系，由Gluzman报道，细胞，1981，23：175。其它具有表达相应载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK等细胞系。哺乳类的表达载体将含有一个复制起始位点，一个合适的启动子和增强子和任何必需的核糖体结合位点，多聚腺苷化位点，剪接“给”点和“受”点，转录终止序列和5，侧区非转录序列。来自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40的复制起始位点，早期启动子，增强子，剪接和多聚腺苷化位点可以提供所需非转录的遗传元件。
除包括本文所讨论的携带载体的重组体的宿主细胞外，本发明还包括来自脊椎动物的原代，第二代和永生化的宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，这些细胞已经工程化，并已删除或取代内源性的遗传物质(如VEGF-2序列)和/或包括与本发明的VEGF-2序列有关的具有调控功能的遗传物质(异源性启动子)，它可以激活，改变和/或增加内源性VEGF-2多核苷酸。例如，经同源重组，本领域所熟悉的技术方法，可以用于调节相关异源性调控区和内源性多核苷酸序列(如编码VEGF-2)(见，如美国专利第5641670号，1997年6月24日出版；国际出版，世界专利第96/29411，1996年9月26日出版；国际出版，世界专利第94/12650，1994年8月4日出版；Koller等，美国科学院研究进展，1989，86：8923-8935和Zijlstra等，自然，1989，342：435-438；详细阐述见每篇文章所附的参考文献)。
宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(如来自人的细胞)，或者也可以是原核细胞，如细菌细胞。筛选出的宿主株可用于调节插入基因序列的表达，或按所需的特殊方式修饰和处理基因产物。源自特定启动子的表达在特定的诱导物存在时，可以提高表达水平；因此基因工程化多肽的表达是可以调控的。再者，不同的宿主细胞具有各自的蛋白质翻译和蛋白质翻译后的加工和修饰的特征和机制(如糖基化，磷酸化，裂解)。选择合适的细胞系以确保表达蛋白质的所需要的修饰和加工。
采用本文所使用的方法，可以从重组细胞的培养中获得和纯化多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸层析，疏水交换层析，亲和层析，层析和层析。在纯化过程中，最好含有低浓度(约0.1-5mM)钙离子(Price等，生物化学杂志，1969，244：917)。必要时，可以对蛋白质进行重新折叠，以获得天然蛋白质的完整构象。最后用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化。
本发明中的多肽可以是天然的纯化产品，或化学法人工合成的产品，或通过重组技术由原核或真核宿主合成(如，由培养的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞合成)。根据在重组生产过程中所使用的宿主，本发明的多肽可以使哺乳细胞或其它真核生物的糖类发生糖基化或不发生糖基化。本发明的多肽还可以含有一个起始的甲硫氨酸残基。
另外，应用本领域中已知的技术，本发明的多肽可以化学合成(如见Creighton，1983，蛋白质：结构与分子原理，W.H.Freeman & Co.，纽约；及Hunkapiller，M，等，1984，自然，310：105-111)。例如，一个与本发明的多肽VEGF-2的一段相关的肽可以用肽合成仪进行合成。再者，必需时，可以把非典型氨基酸或氨基酸的化学类似物作为替代物或附加物，引入VEGF-2多核苷酸序列。不典型氨基酸包括，但不仅限于这些：普通氨基酸的D型同分异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己丙氨酸，b-丙氨酸，含氟氨基酸，含修饰基团的氨基酸，如b-甲基氨基酸，钙-甲基氨基酸，钠-甲基氨基酸，以及通常的氨基酸的类似物。再者，氨基酸既可以为D型(右旋)亦可以为L型(左旋)。
本发明所涉及的VEGF-2多肽，在翻译或翻译后可以进行修饰，如糖基化，酰基化，磷酸化，酰胺化，通过基团的保护或抑制而形成的衍生物，蛋白水解酶的裂解，与抗体分子或其它细胞配体的偶联，等。许多化学修饰均可通过已知的技术方法来完成，包括以下方法(但不仅限于这些)：溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，四氢硼化钠(NaBH4)所引起的特异化学裂解；乙酰化，甲酰化，氧化，还原；衣霉素存在时所引起的代谢合成增加；等等。
本发明中也涉及到其他翻译后的修饰，例如包括N-偶联或O-偶联的糖链，N末端或C末端的加工处理，化学小分子粘附于氨基酸的骨架上，N-或O-连接糖链的化学修饰，以及原核生物宿主细胞表达后，添加或去除N末端的甲硫氨酸残基，均可以看成宿主细胞表达的增加。多肽还可以用检测标记进行修饰，例如酶，荧光，同位素或亲和标记，用于蛋白质的检测和分离。
本发明还提供了化学修饰的VEGF-2的衍生物，它具有其他优点，如多肽的溶解性、稳定性和循环时间均增高，或免疫性降低(见美国专利第4179337号)。衍生的小片段可以从水溶性的多聚体中分离出来，如聚乙二醇，丙二醇/丙三醇共多聚物，羰甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯乙醇及其类似物。多肽可以在分子内任何位点进行随机修饰，或在分子内预定的位点进行修饰，多肽分子可包括一个、两个、三个或多个粘附的化学小分子。
多聚体可以有任何大小的分子量，并且可以有侧链，也可以没有侧链。对聚乙二醇而言，优选的分子量在约1kD到100kD之间(“大约”一词表明不同的聚乙二醇的制备，有些分子比所说的分子量重些，有些则轻些)，并较易处理和制备。也可使用其他大小的分子，要根据治疗方案而定(如要求持续释放的时程，效应，如果有的话，取决于生物学活性，易于操作，抗原性的大小或缺失，以及其他已知的聚乙二醇对某种治疗性蛋白或蛋白类似物的效应)。
聚乙二醇分子(或其他化学小分子)应当与蛋白质结合，应当考虑到对蛋白质的功能或抗原性结构域的影响。对本领域熟练的技术人员而言，有许多结合方法，如EP0401384，并附有参考文献(PEG与G-CSF偶联)，还可以参见Malik等，实验血液学，1992，20：1028-1035(用tresyl chloride报告GM-CSF的pegylation)。例如，聚乙二醇可以与氨基酸残基上的反应基团共价结合，例如游离的氨基或羰基。反应基团是那些活化的聚乙二醇可与之结合的分子。带有游离的氨基的氨基酸残基，包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；带有游离羰基的氨基酸包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C-末端氨基酸残基。磺酸基团还可以作为粘附聚乙二醇分子的反应基团。聚乙二醇治疗用时优选的分子是连接在氨基，如粘附在N末端或赖氨酸基团上。
人们特别希望在蛋白质N末端进行化学修饰。聚乙二醇作为现有组份的实例，你可以从各种不同的聚乙二醇分子中进行挑选(根据分子量，侧链，等)，混合物中，聚乙二醇与蛋白质(或多肽)分子的比例，所进行的pegylation反应类型，以及获得选择的N端pegylated蛋白质分子的方法。获得N端pegylated标本的方法(即必要时，就将这种分子与其他monopegylated分子分离开)为通过把N末端pegylated成分从大量的pegylated分子中纯化出来。选择那些在N端发生化学修饰的蛋白质是通过还原烷基化实现的，还原烷基化为检测不同原始氨基基团的类型(赖氨酸比N末端)的分化的反应性，这些基团为某种特异蛋白质的衍化物。在适当的反应条件下，可以有选择性的获得蛋白质的衍生物，这类蛋白质为N末端携带羰基，并含有多聚体。
本发明的VEGF-2多肽可以是单体或多聚体(即二聚体，三聚体，四聚体和更大的多聚体)。因此，本发明与本发明中VEGF-2多肽的单体和多聚体，它们的分离制备，以及它们的组成(尤其是指药理成分)有关。在特殊的实例中，本发明的多肽为多基因，二聚体，三聚体或四聚体。在另外的实例中，本发明的多聚体至少是二聚体，三聚体或四聚体。
本发明所涉及的多聚体可以是同聚体或异聚体。本文这里所使用的“同聚体”术语，是指仅含有本发明的VEGF-2多肽(包括本文这里所述的VEGF-2片段，变异体，不同的剪接产物和融合蛋白)。这些同聚体为含有相同或不同的氨基酸序列的VEGF-2多肽。在一个特殊的实例中，本发明的一个同聚体为一个仅含有VEGF-2多肽的多聚体，后者含有相同的氨基酸序列。在另一个特殊的实例中，本发明的一个同聚体为一个含有VEGF-2多肽的多聚体，而后者含有不同的氨基酸序列。在特殊的实例中，本发明的多聚体为一同源二聚体(例如，含有相同或不同的氨基酸序列的VEGF-2多肽)或一同源三聚体(如，含有相同和/或不同的氨基酸序列的VEGF-2多肽)。在另外的实例中，本发明的同聚物性多聚体至少应是一个同源二聚体，同源三聚体或同源四聚体。
“异聚体”这一术语，在本文是指一个除含有本发明的VEGF-2多肽外，还含有一个或多个异源性多肽的多聚体(即不同的蛋白多肽)。在一个特殊的实例中，本发明的多聚体为异源二聚体，异源三聚体，或异源四聚体。在另外的实例中，本发明的同源多聚体至少为一个同源二聚体，同源三聚体，或同源四聚体。
本发明的多聚体是由亲水，疏水，离子和/或共价连接和/或间接连接，例如通过脂质体的形成。因此，在一个实施例中，本发明的多聚体，如，同源多聚体或异源多聚体在本发明的多肽在溶液中与另一个分子接触时，就可以形成多聚体。在另一个实施例中，本发明的异源多聚体，例如，在溶液中，本发明的多肽与此肽的抗体接触(包括针对本发明的融合蛋白中的异源多肽序列的抗体)就可以形成异源三聚体或四聚体。在另外一些实施例中，本发明的多聚体可以通过与和/或本发明的VEGF-2多肽之间的共价连接形成。这些共价连接包括一个或多个存在于该多肽内的氨基酸残基(如，引自SEQ ID NO：2，或存在于由保存克隆所编码的多肽中)。在某种情况下，共价连接为位于多肽序列内的半胱氨酸残基之间的交联，它们在天然状态下就发生作用(即自然发生)。而在另一种情况下，共价连接为化学或重组操作的结果。另外，这些共价连接含有一个或多个存在于VEGF-2的融合蛋白的异源多肽序列中的氨基酸残基。在一个实施例中，共价连接是位于本发明中的一个VEGF-2-Fc融合蛋白的异源序列之间(见，如美国专利号为：5478925)。在一个特殊实施例中，共价连接为位于本发明中的一个VEGF-2-Fc融合蛋白的异源序列之间(见本文所述)。在另一个实施例中，本发明融合蛋白的共价连接存在于另一个TNF家族的配体/受体家族成员的异源序列多肽之间，该序列能够形成共价连接的多聚体，例如osteroprotegetin(见，例如，国际出版，世界专利第98/49305，这里的所有内容均附有参考文献)。
本发明的多聚体应用本领域所熟知的化学技术方法可以合成。例如，存在于本发明多聚体中的多肽，应用本领域中所熟知的连接子分子和连接子分子长度最佳技术，进行化学交联(见，如美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。再者，本发明的多肽应用在多肽的C末端或N末端增加半胱氨酸或生物素方法，可进行常规修饰，本领域的这些技术可用于合成含有一个或多个此类修饰的多肽的多聚体(见，例如美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。另外，这些本领域所熟知的技术可用于合成含有多肽的脂质体，而多肽存在于本发明的多聚体中(见，例如，美国专利号：5478925，本文附有全部的参考文献)。
另一方面，本发明的多聚体可以应用本领域所熟知的遗传工程技术进行合成。在一个实施例中，存在于本发明的多聚体中的多肽，使用本文所述的融合蛋白技术可以进行重组合成(美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。在一个特殊的实施例中，编码本发明的同源二聚体的多核苷酸序列可通过以下技术进行合成，即将一个编码本发明的多肽的多核苷酸连接到一个编码连接子多肽的序列上，然后再连接到一个人工合成的可以翻译成多肽产物的序列中，而该多肽为反向排列的，即从C末端到N末端(无前导序列)(见，例如，美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。在另一个实施例中，本文所述的重组技术或其他本领域中所熟知的技术可用于合成本发明的含有一个跨膜结构域的重组多肽(或疏水或前导肽)，并且通过膜的重组技术可以整合脂质体中(见，例如，美国专利号：5478925，本文附有完整的参考文献)。
治疗作用
本发明的VEGF-2多肽为一种对血管和淋巴管内皮细胞具有强烈作用的丝裂原。正如图12和13所示，编号为SEQ ID NO：2的VEGF-2多肽，去除开始的46个氨基酸后的多肽序列，为一种对血管内皮细胞具有强烈作用的丝裂原，可以刺激它们的生长和增殖。用32P-VEGF-2对20mg人的多种组织的RNA进行探针标记，对编码该多肽的VEGF-2核酸序列进行Northern印迹检测，其结果表明该蛋白在心、肺组织中高效表达，这进一步证实VEGF-2具有丝裂原活性。
因此，VEGF-2或它的生物学活性部分通过促进血管增生来治疗血管损伤。例如，在施行冠状动脉搭桥手术后，为了刺激移植组织的生长。VEGF-2或其生物学活性部分，还可用于促进伤口的愈合，尤其对受损组织的血管再生或刺激缺血时侧枝循环的血液流动，以及治疗部位的新毛细血管。VEGF-2或它的生物学活性部分可以用于治疗透壁(full-thickness)性伤口，如皮肤溃疡，包括褥疮，静脉溃疡和糖尿病性溃疡。另外，VEGF-2或它的生物学活性部分可用于治疗透壁性烧伤和损伤，此时的皮肤移植或皮瓣可用于修复诸如烧伤和损伤。VEGF-2或它的生物学活性部分。还可用于整形外科，例如修复撕裂，烧伤，或其它创伤。另外，VEGF-2可用于促进伤口愈合，以及治疗眼部疾病所引起的损伤。
诸如此类，VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于诱导受损骨骼、牙周组织或韧带组织的的生长。VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于牙营养组织因诸如牙周疾病或创伤所引起的损伤后再生，包括牙骨质和牙周韧带。
由于血管发生在维护伤口清洁和不被感染中非常重要，所以VEGF-2或它的生物学活性部分可用于与手术和由此而造成的切口和刀口的修复。VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于治疗感染性很高的腹部损伤。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于促进血管移植术中的血管内皮的发生。应用移植或合成材料而进行血管移植时，VEGF-2或它的生物学活性部分可用于移植物的表面或交界处，以促进血管内皮细胞的生长。VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于修复心肌梗塞所造成的心肌组织的损害。VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于修复心肌缺血后的心血管系统。VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于治疗由冠状动脉疾病，以及周围、中枢神经系统血管疾病所致的血管组织的损伤。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于包被人工假体或天然器官，最大程度地降低移植物在体内的排斥反应，并刺激移植物血管的形成。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于由诸如动脉粥样硬化和球囊血管成形术所造成的血管组织损伤的修复。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于治疗周围动脉血管疾病。因此，VEGF-2多肽为治疗周围动脉疾病提供了一种方法。VEGF-2多肽应优先用于减轻或治疗周围动脉疾病。合适的剂量、配方和步骤见下述。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于促进淋巴组织和淋巴管内皮的功能，如治疗淋巴管缺失，淋巴管阻塞和淋巴血管瘤。VEGF-2还可用于刺激淋巴细胞的生成。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于治疗新生儿血管瘤。因此，VEGF-2多肽为治疗新生儿血管瘤提供了一个方法。优选方案为，将VEGF-2多肽用于患者，以减轻或治疗新生儿在出生前就已发生的异常视网膜病。合适的剂量、配方和步骤见下述。
VEGF-2或它的生物学活性部分可用于治疗原发性(特发性)淋巴瘤，包括Milroy病和早发性淋巴瘤。因此，VEGF-2多肽提供了一种治疗原发性(特发性)淋巴瘤的方法，包括Milroy病和早发性淋巴瘤。优选方案为，将VEGF-2多肽用于患者，以减轻或治疗原发性(特发性)淋巴瘤，包括Milroy病和早发性淋巴瘤。VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于治疗水肿，以及影响动物的血压。合适的剂量，配方和步骤见下述。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于治疗继发性(阻塞性)寿命(lifetimes)，包括那些发病于：(I)淋巴结和淋巴管切除者，(II)癌症的放疗和手术治疗，(III)创伤和感染。因此，从另一方面看，应用VEGF-2多肽为治疗继发性(阻塞性)lifetimes提供了一种方法，包括那些发病于：(I)淋巴结和淋巴管切除者，(II)癌症的放疗和手术治疗，(III)创伤和感染。优选方案为，将VEGF-2多肽用于患者，以减轻或治疗继发性(阻塞性)lifetimes，包括那些发病于：(I)淋巴结和淋巴管切除者，(II)癌症的放疗和手术治疗，(III)创伤和感染。合适的剂量，配方和步骤见下述。
VEGF-2或它的生物学活性部分还可用于治疗卡波氏(kaposi)肉瘤。因此，从另一方面看，VEGF-2多肽为治疗卡波氏(kaposi)肉瘤提供了一种方法。优选方案为，将VEGF-2多肽用于患者，以减轻或治疗卡波氏(kaposi)肉瘤。合适的剂量，配方和步骤见下述。
VEGF-2的拮抗剂通过抑制维持癌症和肿瘤生长所必需的血管形成来治疗癌症。
心血管疾病
本发明者已表明VEGF-2可以刺激血管内皮细胞的生长，刺激内皮细胞的迁移，刺激CAM法中的血管的生成，降低原发性高血压大鼠的血压，以及增加兔子的缺血四肢的血流。因此，编码VEGF-2的VEGF-2多肽或多核苷酸可用于治疗心血管疾病，包括周围动脉血管疾病，例如四肢缺血。
心血管疾病包括心血管的异常，例如动脉—动脉瘘，动静脉瘘，脑动静脉畸形，先天性心脏病，肺动脉闭锁和Scimitar综合征。先天性心脏病包括主动脉狭窄，cortriatriatum，冠状血管异常，十字心脏(crisscross heart)，右位心，动脉导管闭锁不全，Ebstein(爱波斯坦)异常，Eisenmenger(埃森曼格)综合症，发育不全性的左心综合征，左位心，法乐氏四联症，大血管转位，双流出道的右心室，三尖瓣闭锁，持续性腹主动脉关闭不全和心脏间隔缺损，例如主动脉一肺动脉间隔缺损，心内膜垫缺损，Lutembacher综合征，法乐氏三联症，心室间隔缺损。
心血管疾病还包括心脏病，例如心律失常，瘤样心脏病，高心输出量，低心输出量，心脏压塞，心内膜炎(包括细菌性)，心血管瘤，心脏停搏，充血性心力衰竭，充血性心肌病，振发性呼吸困难，心源性水肿，心肌肥大，左心室肥大，右心室肥大，梗塞后心脏破裂，室间隔破裂，心瓣膜病，心肌病变，心肌缺血，心包积液，心包炎(包括缩窄性和结核性)，心包积气，心包切除后综合征，肺心病，风湿性心脏病，心室功能失常，充血，妊娠期心血管并发症，Scimitar综合征，心血管性梅毒和心血管性结核。
心律失常包括窦性心律失常，房颤(心房颤动)，房扑(心房扑动)，心动过缓，期前收缩，阿一斯(Adams-Strokes)综合征，束枝阻滞，窦房阻滞，长QT综合征，平行收缩，Lown-Ganong-Levine综合征，Mahaim型的预激综合征，Wolff-Parkinson-White综合征，病窦综合征，心动过速和室颤(心室颤动)。心动过速包括振发性心动过速，室上性心动过速，进行性心室自发节律，房室结折返性心动过速，异位交界性心动过速，窦房结折返性心动过速，窦性心动过速，Torsades de Poiners，和室性心动过速。
心瓣膜疾病包括主动脉瓣关闭不全，主动脉瓣狭窄，心脏杂音，主动脉瓣脱垂，二尖瓣脱垂，三尖瓣脱垂，二尖瓣关闭不全，二尖瓣狭窄，肺动脉闭锁，肺动脉瓣关闭不全，肺动脉瓣狭窄，三尖瓣闭锁，三尖瓣关闭不全和三尖瓣狭窄。
心肌病变包括酒精性心肌病，扩张性心肌病，肥厚性心肌病，主动脉瓣膜下狭窄，肺动脉瓣膜下狭窄，限制性心肌病，Chagas心肌病，心内膜下纤维组织增生，心内膜纤维化，Kearns综合征，心肌再灌注性损伤，心肌炎。
心肌缺血包括冠心病，例如心绞疼，冠状动脉瘤，冠状动脉粥样硬化，冠状血栓，冠状动脉痉挛，心肌梗塞和心肌顿抑。
心血管疾病还包括血管疾病，如动脉瘤，多发性血管瘤，杆状多发性血管瘤，Hippel-Lindau病，Klippel-Trenaunay-Weber综合征，Sturge-Weber综合征，血管神经瘤性水肿，Takayasu动脉炎，主动脉炎，Leriche综合征，动脉阻塞性疾病，动脉炎，杵臼动脉炎，结节性多发性动脉炎，脑血管疾病，糖尿病性血管病，糖尿病性视网膜病，栓塞，血栓，红斑性肢痛病，痔疮，肝静脉阻塞性疾病，高血压，低血压，缺血，外周血管疾病，静脉炎，肺静脉阻塞性疾病，雷诺(Raunaud)氏病，CREST综合征，视网膜静脉阻塞，Scimitar综合征，上腔静脉综合征，毛细血管扩张症，共济失调性毛细血管扩张症，遗传性出血性毛细血管扩张症，精索静脉曲张，静脉曲张，静脉曲张性溃疡，脉管炎和静脉功能不全。
动脉瘤包括分割性动脉瘤，假性动脉瘤，感染性动脉瘤，破裂性动脉瘤，主动脉瘤，脑动脉瘤，冠状动脉瘤，心脏室壁瘤和髂动脉瘤。
动脉阻塞性疾病包括动脉粥样硬化，间歇性跛行，颈动脉狭窄，纤维肌肉发育不全，间质血管阻塞，Moyamoya病，肾动脉阻塞，视网膜动脉阻塞，血栓闭塞性脉管炎。
脑血管疾病包括颈动脉疾病，脑淀粉样血管病，脑动脉瘤，脑缺氧，脑动脉粥样硬化，脑动静脉畸形，脑动脉疾病，脑栓塞和血栓，颈动脉血栓，窦血栓，Wallenberg综合征，脑出血，脑梗塞，脑缺血(包括短暂性的脑缺血)，锁骨下动脉改道综合征，脑室leukomalacia，血管性头疼，丛集性头疼，偏头疼和椎底功能不全。
栓塞包括气拴，羊水栓塞，胆固醇栓塞，肺栓塞和血栓栓塞。血栓包括冠状血管血栓，肝静脉血栓，视网膜静脉阻塞，颈动脉血栓，窦性血栓，Walenberg综合征和血栓性静脉炎。
缺血包括脑缺血，缺血性结肠炎，脑室综合征，前脑室综合征，心肌梗塞，灌注性损伤和周围四肢缺血。血管炎包括主动脉炎，动脉炎，Behcet综合征，Churg-Strauss综合征，粘膜淋巴结综合征，血栓闭塞性脉管炎，高反应性血管炎，Schoenlein-Henoch紫癜，过敏性皮肤血管炎和Wegener肉芽肿。
VEGF-2多肽或多核苷酸对治疗重症肢体缺血和冠状血管疾病非常有效。如例18所示，给兔子的实验诱发缺血的后肢应用VEGF-2多肽或多核苷酸，可以使血压比、血流、血管造影值和毛细血管密度恢复。
VEGF-2多肽的应用可以使用任何本领域所熟知的方法进行，但不仅限于此，对治疗部位的直接注射，静脉注射，体表用药，导管灌注，浓缩注射，颗粒速溶剂，明胶海绵存储，其它商业可以获得的保存材料，渗透泵，口服或栓剂固体药物配方，在外科手术时的冲洗或体表应用，气雾用药法。这些方法本领域的人员均熟知。VEGF-2多肽可以作为药物组成的一部分加以应用，详细情况见下述。VEGF-2更详细的使用方法见下述。
基因治疗措施
本发明的另一方面为治疗功能紊乱、疾病和状态的基因治疗方法。基因治疗方法为将核酸(DNA，RNA和反义DNA或RNA)的序列导入动物体内，表达本发明的VEGF-2多肽。该方法需要一个编码VEGF-2多肽的多核苷酸序列，该序列与一个具有调控作用的启动子和在靶组织内表达所必需的其他所有遗传元件相连接。基因治疗和转移技术为本领域的技术人员所熟知。见，例如，WO90/11092，并附有参考文献。
因此，例如，患者的细胞可以用一个带有调控作用的启动子的多核苷酸(DNA或RNA)与一个VEGF-2的多核苷酸序列进行间接体内连接，并对细胞进行工程化，再将工程化的细胞用于患者，达到VEGF-2治疗疾病的目的。这些方法为本领域的专业技术人员所熟知。例如，见Belldegrun，A，等，国家癌症研究所杂志，1993，53：1107-1112；FerrantiniM，等，免疫学杂志，1994，153：4604-4615；KaidoT，等，国际癌症杂志，1995，60：221-229；OfuraH，等，癌症研究，1990，50：5102-5106；SantodonatoL，等，人类基因治疗，1996，7：1-10；SantodonatoL，等，基因治疗，1997，4：1246-1255；和ZhangJ-F，等，癌症基因治疗，1996，3：31-38。这些文章均附有参考文献。在一个实施例中，所使用的工程化细胞为动脉细胞。动脉细胞可以通过直接注射到动脉，动脉周围的组织，或通过导管注射，再次导入患者体内。
VEGF-2多核苷酸构建体可以使用任何可以将注射物转运到动物细胞内的方法，例如注射到组织间隙(心脏，肌肉，肺，肝脏和相似的组织)。VEGF-2多核苷酸的构建体可以以药物性的液体或水性载体的形式进行转运，更详细的描述见下文。
在一个实施例中，VEGF-2多核苷酸是以裸多核苷酸进行转移的。“裸”多核苷酸、DNA或RNA这一术语是指不借助任何具有帮助、促进或便于进入细胞的运载工具的序列，包括病毒的序列、病毒颗粒、脂质体的形成、lipofectin或沉淀剂，与其它类似的方法。但是，VEGF-2多核苷酸还可用形成脂质体和形成lipofectin等类似的方法进行处理、实施，这些方法为本领域的熟练的技术人员所熟知。例如，这些方法在美国专利No：5593972，5589466和5580859中均有叙述，这里附有参考文献。
用于基因治疗的VEGF-2多核苷酸载体应优选那些不整合到宿主基因组，也不含有复制序列的构建体。合适的载体包括pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG，这些载体可以从Stratagene公司获得；pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL，可以从Parmacia公司获得；和pEF1/V5，pcDND3.1和pRc/CMV2可以从Invitrogen公司获得。其它合适的载体熟练的技术人员将逐渐熟悉。
本领域的熟练的技术人员所熟知的强启动子可用于驱动VEGF-2DNA的表达。合适的启动子包括腺病毒启动子，如腺病毒主要的晚期启动子；或异源性启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼合胞病毒(RSV)启动子；可诱导启动子，包括MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI(载脂蛋白AI)启动子；人类球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒-胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(长末端重复序列)；b-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子还包括VEGF-2自身的启动子。
与其它的基因治疗方法不同，将裸核苷酸序列导入靶细胞的一大优点为多核苷酸序列在靶细胞中短暂合成。研究表明非复制DNA序列可以导入细胞，使所需多肽的合成长达6个月。
VEGF-2多核苷酸构建体可放置在动物体内的组织间隙中，包括肌肉，皮肤，脑，肺，肝脏，脾脏，骨髓，胸腺，心脏，淋巴，血液，骨骼，软骨，胰腺，肾脏，胆囊，胃，肠，睾丸，卵巢，直肠，神经系统，眼睛，腺体和结缔组织。组织间隙包括细胞间质，组织液，组织器官中的网状纤维间的粘多糖基质，血管或管腔壁中的弹性纤维，纤维组织中的胶原纤维，或缠绕在肌细胞周围的结缔组织或骨间隙中的相同的基质。同样，这些间隙也充满着循环血浆和淋巴管中淋巴液。优选转移至肌肉组织间隙的原因见下述。可能是向含有肌肉细胞的肌肉组织中注射非常方便的缘故。尽管构建体可以在非分化或几乎不分化的细胞中获得转运和表达，如造血干细胞，或皮肤成纤维细胞，但还优先选择那些长期稳定的，已经分化的不再分裂的细胞作为转运的靶细胞进行表达。在体内肌细胞具有摄取和表达多核苷酸序列的能力，作为靶细胞尤其合适。
对裸核苷酸序列的注射而言，注射DNA或RNA的量将在每公斤体重0.05毫克(0.005mg/kg·体重)至每公斤体重50毫克(50mg/kg·体重)。优选的剂量在0.005mg/kg·体重到20mg/kg·体重，更常用的剂量在0.05mg/kg·体重至5mg/kg·体重。所以，对一位本领域的熟练的技术人员而言，所使用的剂量应根据注射的组织部位进行调整。合适、有效的核苷酸剂量完全取决于本领域技术人员的技术熟练程度，以及所治疗的疾病和注射途径。
为输送至心肌，可以将多剂量的pVGI.1(VEGF-2)施用于患者，在各种剂量水平例如200，800和2000ug。一种输送方法可以通过例如微小切口胸廓切开术直接注射入心肌中。如果需要，可根据通过基线心肌profusion研究如SPECT(单光子发射计算机X线断层摄影)显影鉴别的局部缺血区域情况，选择多个注射位置。
为输送至肢体，可以将多剂量的pVGI.1(VEGF-2)施用于患者肢体，在各种剂量水平例如2，4，和8mg。一种输送方法可以通过例如肌内注射。
优选的使用途径为肠外途径，将其注射到组织间隙。但是，也可用其它的肠外途径，如气雾剂的吸入法，该法尤其适合肺或支气管组织，咽部或鼻腔粘膜。另外，裸VEGF-2DNA构建体通过血管成形术时的导管转运到动脉组织。
裸多核苷酸通过本领域已知的任何方法进行转运，包括，但并不局限于这些，在转运位点的直接注射，静脉注射，表皮应用，导管灌注和基因枪注射。这些转运方法本领域的人员均熟知。
如实施例18所示，裸VEGF-2核酸序列可在体内(in vivo)应用，结果在兔子的股动脉中获得VEGF-2多肽的成功表达。
构建体还可借助运载工具进行转运，例如病毒序列，病毒颗粒，脂质体的形成，lipofectin，沉淀剂，等。这些转运方法本领域的人员均熟知。
在有些实施例中，VEGF-2多核苷酸构建体在脂质体的制备中非常复杂。本发明所使用的脂质体的制备包括阳离子(带正电荷)，阴离子(带负电荷)和中性样品。但特别选择阳离子脂质体，因为在阳离子脂质体和带大量负电荷的核酸之间可以形成稳定的阳离子复合体。阳离子脂质体已表明可以介导质粒DNA(Felgner，等，美国科学院研究进展，1987，84：7413-7416，这里附有参考文献)；mRNA(Malone，等，美国科学院研究进展，1989，86：6077-6081，这里附有参考文献)；和纯化的转录因子(Debs，等，生物化学杂志，1990，265：10189-10192，这里附有参考文献)等的功能形式的胞内转运。
可以获得阳离子脂质体。例如，[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)脂质体非常有用，从GIBICO公司(美国纽约的Grand Island)可以买到商品名为Lipofectin的试剂(还可见于，Felgner，等，美国科学院研究进展，1987，84：7413-7416，这里附有参考文献)。其它可以获得的商品化的脂质体包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(宝灵曼公司)。
其它的阳离子脂质体可以应用本领域里所熟知的技术，用易得的材料制备。见，例如，PCT出版物No.WO90/11092(本文附有参考文献)中有合成DOTAP[N-1-(2，3-二油酰氧)-N，N，N-三甲铵丙烷]脂质体。DOTAP脂质体的制备在文献中已做了阐述，见，如P.Felgner，等，美国科学院研究进展，1987，84：7413-7416，这里附有参考文献)。类似的方法还可用于从其它的阳离子脂类物质制备脂质体。
同样地，阴离子和中性脂质体也是容易获得的，例如从AvantiPolar Lipids(伯明翰，阿拉巴马州，美国)获得，或很容易用易得的材料进行制备。这些材料包括磷脂酰，胆碱，胆固醇，磷脂酰乙醇胺，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，还有其它物质。这些材料还可与DOTMA和DOTA原料按一定的比例进行混合。应用这些材料制备脂质体的方法在本领域中已经非常成熟。
例如，商品化的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)可以进行不同的组合制备常用的脂质体，其中可加或可不加胆固醇。因此，例如DOPG/DOPC囊泡，在超声处理过的瓶中，通氮气流干燥DOPG和DOPC各50毫克，进行制备。样本放置在真空泵中过夜，第二天用去离子水溶解。用装有倒置杯状(槽式)探头，型号为Heat Systems-350超声仪，在15EC循环水浴槽中，对带盖瓶中的样本，用最大设置强度下，超声处理2小时。另一种情况为，带负电荷的囊泡不需超声处理成多层的囊泡就可以制备，或通过核孔膜的外突，生成不同大小的单层囊泡。其它方法为本领域的熟练技术人员所熟知。
脂质体包括多层囊泡(MLVs)，单层囊泡(SUVs)，或大单层囊泡(LUVs)，后者更象SUV。不同的脂质体-核酸复合体可以应用本领域所熟知的方法进行制备。见，如，Straubinger等，免疫学方法，1983，101：512-527，并附有参考文献。例如，MLV含有核酸，可通过在玻璃管壁上放置一层薄膜来制备，用该物质的溶液进行水合，并包裹在囊内。SUV通过延长MLV超声的时间，生成大量的同源的单层脂质体来制备。将要包裹的物质加到处理过的MLV悬浮液中，进行超声处理。在使用含有阳离子脂质的脂质体时，干燥的脂膜悬浮在适当的溶液中，如无菌水或等张的缓冲液中，如10mMTris/NaCl，再进行超声处理，接着处理过的脂质体直接与目的DNA混合。脂质体与DNA形成一种非常稳定的复合体，这是因为带正电荷的脂质体与带负电荷的DNA结合。SUV可以与小分子的核酸片段结合。LUV可以通过本领域的许多方法进行制备。通常使用的方法包括Ca2+-EDTA螯合物(Papahadjopoulos等，生物化学与生物物理学学报，1975，394：483；Wilson，等，细胞，1979，17：77)；乙醚注射(Deamer，D和Bangham，A，生物化学与生物物理学学报，1976，443：629；Ostro等，生物化学与生物物理学研究通讯，1977，76：836；Fraley等，美国科学院研究进展，1979，76：3348)；去垢剂的透析(Enoch，H和Strittmatter，P，美国科学院研究进展，1979，76：145)；和反相蒸发(REV)(Fraley，等，生物化学杂志，1980，255：10431；Szoka，F和Papahadjopoulos，D，美国科学院研究进展，1978，75：145；Schaefer-Ridder，等，科学，1982，215：166)，本文附有参考文献。
通常，DNA与脂质体的比例可以从10∶1到1∶10。优选的比例为5∶1到1∶5。更优选的比为3∶1到1∶3。还有更合适的比例为1∶1。
美国专利No.5676954(本文附有参考文献)报道，给小鼠注射遗传物质与阳离子脂质载体形成的复合体的方法。美国专利No.4897355，4946787，5049386，5459127，5589466，5693622，5580859，5703055和国际出版物No.WO94/9469(本文附有参考文献)均提供了给动物转运DNA-阳离子脂质复合体的方法。
在某些实施例中，应用含有编码VEGF-2序列的RNA的逆转录病毒颗粒，通过间接体内(ex vivo)或在体(in vivo)法使细胞工程化。用于制备逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括，但不局限于这些，莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒，脾坏死病毒，Rous肉瘤病毒，Harvey(哈维)肉瘤病毒，禽类造血白细胞组织增生病毒，长臂猿白血病病毒，人类免疫缺陷病毒，髓性增生性肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。
逆转录病毒质粒载体可使包装细胞系转变为可以形成制造细胞的细胞系。可用于转染的包装细胞的种类包括，但不局限于这些，PE501，PA317，R-2，R-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，RCRE，RCRIP，GP+E-86，GP+envAm12和在Miller，人类基因治疗，1990，1∶5-14，中所述的，并附有参考文献。载体可以通过本领域所熟知的任何方法来转导包装细胞DNA细胞系。这些方法包括，但不局限于这些，电穿孔，脂质体介导，CaPO4沉淀法。另一种选择为，逆转录病毒质粒载体可以包裹在脂质体内，或与脂质偶联，然后再用于宿主。
产细胞的细胞系可以生成具有感染性的逆转录病毒载体颗粒，再进行在体或体外应用，用于转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达VEGF-2。
在其它一些实施例中，通过间接体内或在体手段，用含有腺病毒载体的VEGF-2多核苷酸对细胞进行工程化处理。腺病毒经过处理，可以编码和表达VEGF-2，并同时在正常的病毒裂解生活周期进行复制时失活。腺病毒不需要把病毒DNA整合到宿主细胞的染色体上就可获得表达，因此，无插入突变之忧。再者，腺病毒已经作为活的肠道疫苗已有多年，稳定性高(Schwartz，A.R.，等，美国呼吸疾病综述，1974，109：223-238)。最后，介导基因转移的腺病毒已用于多种情况，包括把α1-抗胰蛋白酶和CFTR转运到棉鼠(cottonrat)的肺中(Rosenfeld，M.A.，等，科学，1991，252：431-434；Rosenfeld，等，细胞，1992。68：143-155)。还有，进一步研究证实，腺病毒并不能作为一种诱发人类癌症的原因(Green，M等，美国科学院研究进展，1979，76：6606)。
本发明所使用的合适的腺病毒载体见：Kozarsky和Wilson，当代遗传发育见解，1993，3：499-503；Rosenfeld等，细胞，1992，68：143-155；Engelhardt等，人类遗传治疗，1993，4：759-769；Yang等，自然遗传学，1994，7：362-369；Wilson等，自然，1993，365：691-692；和美国专利No.5652224，及其所附的参考文献。例如，腺病毒载体Ad2非常有用，并且可以在人类293细胞中生长。这些细胞含有腺病毒的E1区，并持续表达E1a和E1b，通过提供从载体中删除的基因表达产物，以弥补腺病毒的缺陷。除Ad2外腺病毒的其它变种(例如Ad3，Ad5和Ad7)在本发明中也非常有用。
本发明中优选的腺病毒为复制缺陷型。复制缺陷型腺病毒需有辅助病毒和/或包装细胞系的帮助，以形成感染性的颗粒。结果这种病毒具有感染细胞的能力，并能表达所需的多核苷酸序列，该序列与具有调控作用的启动子相连，例如，本发明中的HARP启动子，但是不能在大多数细胞中复制。复制缺陷型病毒可以删除腺病毒中的一个或多个基因，或下述基因的一部分：E1a，E1b，E3，E4，E2a或从L1到L5等基因。
在其它的实施例中，通过间接体内或在体手段，应用腺相关病毒(AAV)对细胞进行工程化。AAV为天然的发生缺陷的病毒，该病毒现有辅助病毒的帮助才能生成有感染性的颗粒(Muzyczka，N，当代微生物学和免疫学课题，1992，158：97)。它还是一种非常少见的可以把自身DNA整合到非分裂细胞基因组中的病毒。仅含有300bp的AAV载体可以进行包装与整合，但外源性DNA的长度应限制在4.5kb内。制备和使用该载体的方法，本领域均已熟知。见，例如，美国专利No.5139941，5173414，5354678，5436146，5474935，5478745和5589377。
例如，本发明所使用的合适的AAV载体将包括DNA复制、包被和宿主细胞的整合所需要的所有序列。使用标准的克隆技术把VEGF-2多核苷酸的构建体插入到AAV载体中，这些技术可参见Sambrook等编著的“分子克隆：实验指南”一书，冷泉港出版社，1989。重组的AAV载体被转染到包装细胞中，后者需要借助病毒的帮助，这些均借助规范的技术，包括lipofectin，电穿孔，磷酸钙沉淀法，等。合适的辅助病毒包括腺病毒，巨细胞病毒，痘病毒，或疱疹病毒。包装细胞一旦被转染和感染，它们将产生具有感染性的带有VEGF-2多核苷酸构建体的病毒颗粒。这些病毒颗粒再用于转导真核细胞，既可以是间接体内方式，也可以是在体的方式。转导的细胞将含有整合到细胞基因组中的VEGF-2多核苷酸构建体，并可以表达VEGF-2。
基因治疗的另一种方法包括具有调控作用的异源性调控区和通过同源重组的内源性的多核苷酸序列(如编码VEGF-2)(见，如，美国专利No.5641670，1997年6月24日出版；国际出版物，No.WO94/12650，1994年8月4日出版；Koller，等，美国科学院研究进展，1989，86：9832-9835；Zijlstrra，等，自然，1989，342：435-438)。该方法包括靶细胞内的基因活化，但通常该基因在该细胞中并不表达，或仅以很低的水平表达。
制备多核苷酸构建体所采用的技术为本领域中规范的技术，该构建体含有启动子，靶序列在启动子的旁侧。适宜的启动子见本文所述。靶序列与内源性序列完全互补，以便于启动子—靶序列与内源性序列发生同源重组。靶序列距内源性的多核苷酸序列，即VEGF-2的5’端足够近，这样启动子将通过同源重组与内源性序列相连，发挥调控作用。
借助PCR技术，可以对启动子和靶序列进行扩增。优选的扩增启动子的5’端和3’端含有不相邻的限制性酶切位点。在第一个靶序列的3’端的限制性酶切位点与扩增启动子的5’端相同，而第二个靶序列的5’端的限制性酶切位点与扩增启动子的3’端相同。扩增的启动子和靶序列在酶切消化后，再连接起来。
启动子—靶序列构建体转移到细胞内，可以以裸多核苷酸序列的方式，也可以与促进转染的试剂相连接的形式进行，如上所述的脂质体，病毒序列，病毒颗粒，整个病毒，lipofectin，沉淀剂，等等。P启动子—靶序列可以通过任何方法进行转移，包括直接注射，静脉注射，表皮应用，导管灌注，颗粒加速剂，等。下面将详细地叙述。
启动子—靶序列的构建体被细胞摄取。在构建体与内源性的序列之间发生同源重组，如内源性VEGF-2序列受启动子的调控。启动子驱动内源性VEGF-2序列的表达。
编码VEGF-2多核苷酸序列可以与编码其它促血管生成的蛋白的多核苷酸序列共同使用。促血管生成的蛋白包括，但不局限于这些，酸性和碱性成纤维细胞生长因子，VEGF-1，表皮生长因子-α和β，血小板源性的内皮细胞生长因子，血小板源性的生长因子，肿瘤坏死因子-α，肝细胞生长因子，胰岛素样的生长因子，集落刺激因子(CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，一氧化氮合酶。
编码VEGF-2的多核苷酸序列应优选含有一个分泌性的信号序列，这样可以利于蛋白质的分泌。信号序列通常位于多核苷酸序列的编码区朝向表达的方向，或在编码区5’端。信号序列对表达的靶序列可以是同源的或异源的，同样，对转染细胞而言，信号序列也可以是同源的或异源的。另外，信号序列可以通过本领域所熟知的方法进行化学合成。
只要表达的一种或多种分子的量足以具有治疗作用，那么上述任何多核苷酸构建物的任何施用形式均可以使用。这包括，直接注射，静脉注射，表皮应用，导管灌注，弹丸注射，颗粒加速剂(即基因枪)，明胶海绵埋植，其它可以获得的商业埋植材料，渗透泵(如Alza微型泵)，口服或栓状(片剂或丸剂)药物的形式和外科手术时的清洗或表面应用。例如，直接注射裸露的磷酸钙沉淀的质粒到大鼠的肝脏和脾脏，或将蛋白质包被的质粒注射到门静脉，在肝脏中已经获得外源基因的表达(Kaneda等，科学，243：375(1989))。
优选的一种局部用药的方法是直接注射。应优先采用直接注射法，将本发明的重组分子与运载工具形成的复合体注射到动脉内或动脉的局部组织中。在动脉的局部组织内注射混合物是指在动脉的数厘米，最好数毫米的范围内注射。
局部应用的另一种方法是将本发明的多核苷酸构建体用于外科手术伤口中或伤口周围。例如，患者可以进行手术，并且该多核苷酸构建体可以包被在伤口内的组织表面或将该多核苷酸构建体注射进伤口组织区。
治疗性的组合物的全身应用非常有效，包括本发明的重组分子与本发明的靶向性的运输载体组成的复合物。适合全身应用的载体包括脂质体，后者含有配体，使载体靶向性地与特异位点结合。
全身应用的有效方法包括静脉内注射，气溶胶，口服和经皮(表面)转运。使用一些本领域的常规方法，进行静脉内注射。气溶胶法还可用本领域的常规方法来施行(见，例如，Stribling，等，美国科学院研究进展，1992，189：11277-11281，并附有参考文献)。通过将本发明的多核苷酸构建体与一个可耐受动物的胃肠道内的消化酶降解的载体形成复合体，可采用口服法进行转运。这类载体的实施例包括可塑性胶囊或片剂，这些均为本领域所熟知。通过将本发明的多核苷酸构建体与一种亲脂的试剂(如DMSO)混合，这种亲脂的试剂能够透过皮肤，可采用皮肤表面法进行转运。
确定一种被转运物质的有效剂量有多种因素，例如包括该物质的化学结构和生物学活性，动物的年龄和体重，治疗疾病的确切病情和严重程度，以及给药途径。治疗次数有赖于多种因素，例如每次使用多核苷酸构建体的量，以及治疗个体的健康状况和病史情况。准确的剂量、次数和应用的时间将由施行医生或兽医决定。
本发明的治疗组合物可用于任何动物，尤其是哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人，狗，猫，小鼠，大鼠，兔子，绵羊，牛，马和猪，尤其对人更是优选。
核酸用途
VEGF-2核酸序列和VEGF-2多肽在体外还有以下用途，有关的科学研究，DNA的合成与DNA载体的制备和用于诊断和治疗人类疾病。例如，VEGF-2可以体外用于培养内皮细胞，按10pg/ml至10ng/ml的浓度加到条件培养基中。
VEGF-2基因的全长的片段可作为cDNA文库的杂交探针来分离其它基因，后者与该基因片段有高度的相似性或相似的生物学活性。这种探针通常至少有50bp，尽管它们可以大于此数。该探针还可用于证实与全长转录本相对应的cDNA克隆和基因组克隆或含有全部VEGF-2基因(包括调节区和启动子区，外显子和内含子)的克隆。一个筛选实施例包括应用已知的DNA序列合成一个寡核苷酸探针，分离VEGF-2基因的编码区。标记与基因本发明的基因互补的寡核苷酸序列，用后者进行筛选人类的cDNA文库，DNA文库或mRNA文库，确定探针与文库中哪些杂交。
该发明为证实VEGF-2受体提供了一些方法。编码受体的基因可以用多种本领域的熟练技术人员所熟知的方法进行证实，例如配体淘洗法和FACS过筛(Coligan，等，当代免疫学操作规程，1991，1(2)，第五章)。应优选表达克隆，由于多聚腺苷酸化的RNA可以从VEGF-2作用的细胞中制备，从这种RNA制备的cDNA文库被分成多个库(pool)，应用转染COS细胞或其它不对VEGF-2起作用的细胞。可以在载玻片上生长的转染细胞暴露在标记的VEGF-2环境中。VEGF-2可以用多种方法进行标记，包括碘标或对某个特异的蛋白激酶的识别位点的内含物(inclusion)。接着进行固定和孵育，再对载玻片进行放射自显影分析。阳性库被证实，以及制备亚库，并用重复的亚库和反复筛选步骤进行转染，最终获得编码假定受体的单个克隆。
作为受体发现的另一种替代方法，标记的VEGF-2可以是亲光性的(photoaffinity)，并与表达受体分子的细胞膜或细胞的提取物相连。交联物可以通过PAGE或X光片的曝光进行分辨。标记的含有VEGF-2的复合体被切除，分割成许多肽段，便于进行蛋白质的微量测序。测序所得的氨基酸序列用来制成一套简并的寡核苷酸探针，用于筛选cDNA文库，以证实编码假定受体的基因。
VEGF-2激动剂和拮抗剂
本发明还与筛选化合物，即用于证实哪些为激动剂或拮抗剂所使用的方法有关。本法的一个实施例，在辅助有丝分裂原ConA存在时，VEGF-2具有显著地刺激人内皮细胞的增殖的优点。内皮细胞可以在96孔的平底培养板(Costar，Cambridge，麻省)中加入ConA(Calbiochem，La Jolla，加州)的反应混合液，进行培养并获得。ConA、本发明的多肽和筛选用的化合物均加入到培养基中。在37EC下孵育后，用1FCi的3H-胸腺嘧啶核苷(5Ci/mmol；1Ci＝37BGq；NEN)处理培养物足够的时间，使3H掺入，并在玻璃纤维滤膜(Cambridge，Technology，Watertown，麻省)。通过对三份培养样本的液闪(BeckmanInstruments，Irvine，加州)计数，计算出3H-胸腺嘧啶核苷的掺入(cpm)的平均值。再与未加激动剂化合物的对照组进行比较，发现有显著的3H-胸腺嘧啶核苷的掺入，表明刺激内皮细胞的增殖。
用上述方法对拮抗剂进行分析，分析化合物拮抗剂可以抑制VEGF-2对3H-胸腺嘧啶核苷的掺入，表明该化合物为VEGF-2的拮抗剂。另一种情况，应用竞争抑制法，在适当的条件下，通过细胞膜上的VEGF-2受体或重组受体与VEGF-2和一种潜在的拮抗剂结合的方法，来检测VEGF-2拮抗剂。VEGF-2可以进行标记，如放射性标记，结合在受体上的VEGF-2分子数可以确定潜在拮抗剂的效应。
另外，VEGF-2与受体相互作用所引起的已知第二信使反应，可通过加或不加拮抗剂时进行测量或比较。第二信使系统包括但不仅限于这些，cAMP，鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇的水解。另一种方法，一种哺乳细胞或表达VEGF-2受体的细胞膜与标记的VEGF-2和拮抗剂一起孵育。可以测出拮抗剂提高或抑制这种受体与配体之间的相互作用。
潜在的VEGF-2拮抗剂包括抗体，或在某些情况下可以为寡核苷酸，它可以结合多肽并有效地消除VEGF-2的功能。另一种情况，潜在的拮抗剂可以是一种可以与VEGF-2受体结合，而与VEGF-2又密切相关的蛋白质，但是它们是VEGF-2多肽的无活性的形式，可以抑制VEGF-2的作用。这些拮抗剂的实施例包括一种VEGF-2多肽的不显性突变体，例如，VEGF-2异源性二聚体的一条链可以为显性的，也可以为突变的，这样就不存在生物学活性。显性阴性突变体包括VEGF-2二聚体的截短的形式，VEGF-2二聚体可以与另一个二聚体相互作用，形成野生型的VEGF-2，但是形成的同源性二聚体是没有活性的，也不具有典型的VEGF特征。
另一种潜在的VEGF-2拮抗剂为借助反义技术制备的反义构建体。反义技术通过三螺旋的形式或反义DNA或RNA，用于调控基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA结合的原理。例如，多核苷酸序列的5′编码区(该核苷酸序列编码成熟的本发明的多肽)可用于设计长度为10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸序列。制备的DNA寡核苷酸序列与参与基因转录的一个区互补(三螺旋，见，Lee等，核酸研究，1979，6：3073；Cooney，等，科学，1988，24：456；和Dervan，等，科学，1991，251：1360)，因此，可以阻止转录和VEGF-2的生成。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交，抑制mRNA分子翻译成VEGF-2多肽(反义——Okano，神经化学杂志，1991，56：560；寡聚脱氧核糖核酸作为基因表达的反义抑制剂，1988，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达)。上述的寡核苷酸还可以导入细胞中，从而使反义RNA或DNA可以在体内表达，抑制VEGF-2的生成。
潜在的VEGF-2拮抗剂还包括可以结合和占据VEGF-2多肽的活性位点的小分子，因此可以催化位点不能接近底物，从而抑制多肽正常的生物学活性。小分子的实施例包括，但不仅限于这些，小肽或肽样的分子。
拮抗剂可以用于减少实体瘤转移所必需的血管形成。VEGF-2证明可用于制备一些血管内皮生长因子的抑制剂。由于血管形成和新生血管化为实体瘤生长所必需的步骤，抑制血管内皮生长因子的促血管形成活性，在抑制肿瘤进一步生长，延缓或使肿瘤退化方面，将非常有用。尽管VEGF-2的表达水平在正常组织中包括乳腺非常低，但发现VEGF-2在至少两种乳腺恶性肿瘤细胞系中呈中度水平的表达。因此，VEGF-2可能参与肿瘤血管的发生和生长。
神经胶质瘤也可以用本发明VEGF-2的拮抗剂治疗。
该拮抗剂还可以用于治疗由血管的通透性增加引起的慢性炎症。除这些疾病外，该拮抗剂还可以用于治疗糖尿病性的视网膜病，类风湿性关节炎和牛皮癣。
拮抗剂可以与可以接受的有治疗作用的载体混合使用，见下述。
药物组成
VEGF-2多肽，多核苷酸和激动剂和拮抗剂可以与合适的药物载体一起联合使用。这些组合物包括具有治疗量的VEGF-2或激动剂或拮抗剂和一种适合药用的载体或赋形剂。此类载体包括但不仅限于这些，金属盐类，缓冲盐，水，甘油，乙醇，以及上述几种的混合物。配方应适合应用。
本发明还提供了一套药物试剂包或盒，其中包括一个或多个充满一种或多种本发明的药物组分的容器。所使用的容器应参照负责药品或生物制品生产，应用或销售的政府部门的建议，所提的建议必需被用于临床的生产，应用或销售部门接受。另外，药物成分可以与其他有治疗作用的化合物联合使用。
药物混合物成分可以按方便的方法使用，如外用，静脉，腹腔，肌肉，肿瘤内，皮下，肛门内或皮内等途径。使用的药物成分的量应是对适应症起到有效的治疗和/或预防。总的来说，药性混合物使用剂量至少为10mg/kg·体重，并且在多数情况下，使用的剂量每天不超过8mg/kg·体重。多数情况下，使用剂量为每天从10mg/kg到1mg/kg，还应考虑到用药途径，症状，等。
本发明中，VEGF-2多肽和多肽类的激动剂或拮抗剂还可通过在体内表达进行应用，也就是在前文经常提到的“基因治疗”。
因此，诸如骨髓之类的细胞可借助于编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)进行间接体内实验，进行工程化处理，再把工程化细胞植入患者体内，利用表达的多肽进行治疗。这些方法为本领域里所熟知的。例如，应用本领域所熟知的操作方法，即用含有编码本发明多肽RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行工程化处理。
例如，同样也可以通过本领域所熟知的技术方法，进行在体细胞的工程化处理，使多肽在体内表达。正如本领域所熟知的，用于制备含有编码本发明多肽RNA的逆转录病毒颗粒的细胞，可以用于患者，在体内制备工程细胞，以及在体内进行多肽的表达。用于制备本发明多肽的这些方法和其他方法，对本领域的熟练的技术人员来说，非常清楚。例如，用于工程细胞的表达载体，可以不是逆转录病毒颗粒，例如，腺病毒，与其他合适的载体联用，也可以用于在体内制备工程细胞。
上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒可来自，但不仅限于这些，莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒，脾坏死病毒，逆转录病毒如Rous肉瘤病毒，Harvey(哈维)肉瘤病毒，禽类造血白细胞组织增生病毒，长臂猿白血病病毒，人类免疫缺陷病毒，腺病毒，髓性增生性肉瘤病毒和乳腺瘤病毒。在一个实施例中，逆转录病毒质粒载体来自莫罗尼(Moloney)鼠白血病病毒。
载体包括一个或多个启动子。所使用的合适的启动子包括，但不仅限于这些，逆转录病毒LTR启动子；SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子(见Miller，等，生物技术，1989，7：980-990)，或其它任何启动子(如细胞启动子如真核细胞启动子，包括但不仅限于这些，组蛋白，pol III，和b-肌动蛋白等的启动子)。也可以使用其它病毒的启动子，包括但不仅限于这些，腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。选择合适启动子的方法，本领域的熟练的技术人员非常清楚。
编码本发明多肽的核酸序列是在合适的启动子的调控之下。可以使用的合适的启动子包括，但不仅限于这些，腺病毒启动子，如腺病毒主要的晚期启动子；或异源性启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼合胞病毒(RSV)启动子；可诱导启动子，例如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；Apo AI(载脂蛋白AI)启动子；人类球蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，如单纯疱疹病毒—胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括上述的经过修饰的逆转录病毒LTR)；b-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子还包括调控编码VEGF-2多肽基因的自身启动子。
逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系，形成可产生细胞的细胞系。可以转染的包装细胞的实施例包括，但不仅限于这些，PE501，PA317，y-2，y-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，yCRE，yCRIP，GP+E-86，GP+envAm12和上述DNA细胞系(Miller，人类基因治疗，1990，1：5-14，以及所附的参考文献)。通过本领域所熟知的任何方法，可以用载体进行转导包装细胞。这些方法包括，但不仅限于这些，电穿孔，脂质体和磷酸钙沉淀法。另一种情况，逆转录病毒载体质粒可以包被在脂质体中，或与脂质偶联，再用于宿主。
产生细胞的细胞系可以生成具有感染能力的逆转录病毒的载体颗粒，其中含有编码多肽的核酸序列。再用这些逆转录病毒载体颗粒去转导真核细胞，既可以是体外，也可以是体内。转导的真核细胞将表达编码所需的多肽的核酸序列。用于转导的真核细胞包括，但不仅限于这些，胚胎干细胞，胚胎瘤细胞，以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质细胞，内皮细胞和支气管上皮细胞。
诊断方法
本发明还有一用途：应用VEGF-2基因作为诊断方法的一部分，用来检测疾病或VEGF-2核酸序列突变所致的相关疾病的易感性。
携带突变VEGF-2基因的个体，应用多种方法可以在DNA水平上进行检测。用于诊断的核酸可以从患者的细胞中获得，例如可从血液，尿，唾液，组织活检和尸检标本中获得。基因组DNA可直接用于检测或在检测分析之前，先进行PCR扩增(Saiki，等，自然，1986，324：163-166)。RNA或cDNA也可以用于同样的检测。有一个实施例，与编码VEGF-2的核酸互补的PCR引物可用于证实和分析VEGF-2的突变。例如，通过比较扩增产物与正常的基因型的大小，用于缺失和插入突变的检测。通过扩增的DNA与放射性标记的VEGF-2RNA或也可以是放射性标记的VEGF-2的反义DNA序列进行杂交，用于点突变的检测。通过RNA酶A的消化或解链温度的差异，可以把完全匹配的序列与错配双链体区别开。
基于DNA序列差异的遗传检测可通过检测DNA片段在凝胶(加变性剂或不加变性剂)中迁移率的改变来进行。小序列的缺失和插入通过高分辨率的凝胶电泳可以区别开(看到)。根据它们各自特异的解链或部分解链温度，不同DNA片段的迁移率在凝胶中的不同位点被阻滞下来，不同序列的DNA片段在变性的甲酰胺梯度胶上就可以区别开(见，如Myers，等，科学，1985，230：1242)。
在特异位点序列的改变，通过核酸酶保护法也可以揭示出来，如RNA酶和S1的保护或化学裂解法(如，Cotton，等，美国科学院研究进展，1985，85：4397-4401)。
因此，通过诸如杂交，RNA酶保护，化学裂解，直接DNA的序列测定或限制性酶切(限制性片段长度多态性，RFLP)和基因组DNA的Southern印迹等方法，进行特异DNA的检测。
除了更方便的凝胶电泳和DNA测序法外，还可以通过原位分析法进行检测。
本发明还通过检测不同的组织中的VEGF-2的水平的改变进行诊断，因为与正常组织进行比较发现有些蛋白质过度表达，可以检测患有某种疾病或对该病有易患性，例如，异常的细胞分化。用于检测宿主样本中VEGF-2蛋白水平的方法是本领域的熟练的技术人员所熟悉的，包括放射性免疫法(放免)，竞争结合法，Western印迹法，ELISA(酶联免疫吸附)法和“三明治”(双抗夹心法)。ELISA法(Coligan，等，当代免疫学操作规程，1(2)，第六章，1991)通常包括，针对VEGF-2特异抗原的抗体的制备，最好是单抗隆抗体。另外，还要制备一种抗单抗隆抗体的报告抗体。一种可以检测的物质如放射性同位素，荧光或在这一实施例中的辣根过氧化物酶，结合在报告抗体上。从宿主体内取出样本，在一个固相中孵育，如聚苯乙烯的平皿，后者可以结合样本中的蛋白质。平皿上的所有游离的蛋白质结合位点通过与非特异性蛋白的孵育被封闭，如牛血清白蛋白。然后，单抗隆抗体在平皿中进行孵育，在这期间，单抗隆抗体与结合在聚苯乙烯平皿上的所有VEGF-2结合。所有未结合的单抗隆抗体用缓冲液冲洗掉。再往平皿中加入带有辣根过氧化物酶的报告抗体，与所有结合VEGF-2的抗体结合。未结合的报告抗体就被冲洗掉。接着向平皿中加入过氧化物酶的底物，在一定时间内，根据显色的深浅，对照标准曲线，测定患者样本中VEGF-2的量。
在使用竞争法时，VEGF-2特异的抗体结合在固相上。然后对本发明的多肽进行标记，例如，放射性同位素，宿主的标本包被在固相上，如用液闪色谱法检测标记的量，结果与样本中VEGF-2量呈正相关。
“双抗夹心”法与ELISA法相似。在用“双抗夹心”法进行检测时，VEGF-2包被在固相上，并且与结合在固相上的抗体结合。然后，第二抗体(二抗)与VEGF-2结合。三抗为标记的，并与二抗特异结合，然后再加到固相上，并与二抗结合，可以进行定量分析。
染色体发现
本发明的序列对鉴定染色体也是有价值的。该序列是靶特异性的，能够与人的某一染色体上的特异位点杂交。当前还用于鉴别染色体上的特异位点。目前根据实际的序列数据(重复序列的多态性)，还几乎不能对染色体进行定位。根据本发明对染色体进行DNA作图，对那些与疾病有关的基因序列而言，是至关重要的第一步。
简而言之，作图通过从cDNA合成PCR引物(最好15-25bp)，可以对染色体的序列进行作图。用计算机对cDNA进行分析，可以快速地筛出在基因组DNA中不跨越两个或两个以上外显子的引物，否则，会使扩增反应复杂化。这些引物用来于PCR，来筛选含有人染色体的体细胞的杂合体。只有那些含有符合引物的人类基因的杂合体才能产生扩增片段。
体细胞杂合体的PCR作图，在确定某个特异的染色体上的一个特异的DNA时，是非常快速的。同样的寡核苷酸引物用于本发明的序列，按相同的方式，借助于来自特异染色体的一组片段或者许多大的基因组克隆，可以获得进一步的定位。其他的类似的染色体作图策略包括原位杂交，用标记的流式染色体进行的预筛和通过杂交进行预选来构建染色体的cDNA的特异文库。
cDNA克隆与展开的有丝分裂中期的染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以只用一步就可对染色体进行精确定位。该技术可以与来自长度仅50或60bp的cDNA的探针一起使用。该技术的综述请见Verma，等，人类染色体：基本技术指南，Pergamon出版社，纽约，1988。
某一序列一旦在染色体上精确作图定位，该序列在染色体上的物理位置应符合遗传作图数据。例如，这些数据请参见V.McKusick的“人类的孟德尔遗传”(可以在网上从约翰霍普金斯大学的Welch医学图书馆获得)。在基因和已经在同一染色体的部位作图定位的疾病之间的关系可以通过连锁分析来进行鉴定(物理位置相近的共遗传)。
再者，有必要确定在发生异常和未发生异常的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部发生异常的个体(而不是所有正常个体)中均发现存在突变，那么该突变有可能是该疾病的病因。
根据现有的物理作图和遗传作图技术的分辨率，将与某种疾病有关的、精确定位在染色体上的某个cDNA可能只是50-500种可能病因之一。(这假定100万个碱基对的作图分辨率和每20kb一个基因)。
比较异常和正常的个体通常包括先寻找染色体中的结构变异，如缺失或移位，可以从展开的染色体上看出或用基于cDNA序列的PCR技术检测出来。最后，证实在多个个体的基因的完整序列那个发生突变，并把突变与多态性区别开。
反义
通过应用反义技术，本发明还可进一步靶向性的在体内抑制VEGF-2。通过形成三螺旋结构或反义DNA或RNA，反义技术可用于调控基因表达，这两种方法均基于一个多核苷酸结合DNA或RNA。例如，编码本发明多肽的天然多核苷酸序列的5′端编码区，可用于设计一种长度为10-40bp的反义RNA的寡核苷酸。一个DNA寡核苷酸可设计为一条与参与基因转录的某个区互补的寡核苷酸(三螺旋——见Lee，等，核酸研究，1979，6：3073；Cooney，等，科学，1988，241：456；和Dervan，等，科学，1991，251：1360，因此，可以抑制转录和VEGF-2的合成。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，并抑制mRNA分子翻译成VEGF-2(反义——Okano，神经化学杂志，1991，56：560；寡聚脱氧核糖核酸作为基因表达的反义抑制剂，1988，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达)。
另一种情况，应用本领域的技术，上述的寡核苷酸可以导入细胞，从而反义RNA或DNA可以在体内表达，按上述方式抑制VEGF-2的合成。
因此，VEGF-2的反义构建体可以抑制VEGF-2的血管形成活性和和抑制实体瘤进一步生长或使肿瘤退化，因为血管形成和新生血管化为实体瘤生长所必需的。这些反义构建体还可以用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病性视网膜病和卡波氏肉瘤，上述这些疾病的共同特征是血管异常性增生。
表位部分
另一方面，本发明所提供的肽和多肽均含有本发明多肽的表位区。这些表位是本发明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指蛋白质的一部分，当本发明的蛋白质的全部或一部分是免疫原时，该蛋白质在体内可产生体液应答。另一方面，多肽的一个可以结合抗体的功能区被称为“抗原决定簇”或“抗原表位”。一个蛋白在体内的免疫原表位数通常少于抗原表位数。见，如，Geysen，等，美国科学院研究进展，1983，81：2998-4002。但是，不管它是否为免疫原表位，可以应用噬菌体展示等方法，制备任何抗原表位的抗体。见，如，Petersen，G，等，分子普通遗传学，1995，249：425-431。因此，本发明中的所涉及的既是免疫原性表位，也是抗原性表位。
特别要指出的是，免疫原性表位包括根据Jameson-Wolf分析所预计的关键氨基酸残基。因此，在N末端，C末端或N，C两端的附加的旁侧残基可以添加到这些序列上，合成本发明含有表位的多肽。因此，免疫原性表位可以包括附加的N末端或C末端的氨基酸残基。添加的旁侧氨基酸残基可以紧连在本发明的多肽，异源性多肽序列，或含有本发明的多肽的连续旁侧序列和异源性多肽的序列的N末端和/或末端序列的旁侧。
含有免疫原性或抗原性表位的本发明多肽至少有7个氨基酸残基长。“至少”意思是含有免疫原性或抗原性的表位的本发明多肽，长至少有7个氨基酸残基或者在7个氨基酸与本发明的多肽的全长任何数目的氨基酸之间进行整合。优选含有免疫原性或抗原性表位的多肽至少有10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，或100个氨基酸残基长。但是，需要指出的是，每个和每次在7个氨基酸和全部多肽的氨基酸残基之间进行整合，也包括在本发明中。
氨基酸和含有抗原表位的片段可通过上述的连续氨基酸数目进行说明，或通过这些片段的N末端和C末端在SEQ ID NO：2中的位置进一步说明。本发明还包括每一次的N末端和C末端位点的结合，例如该位点长度至少为7个或至少15个连续的氨基酸残基的片段，可以占据SEQ ID NO：2的氨基酸序列。再者，“至少7个连续的氨基酸残基长”意思是长度为7个氨基酸残基，或在7个氨基酸与本发明的多肽的所有的氨基酸之间进行的任何整合。尤其是每个和每次在7个氨基酸和全部多肽的氨基酸残基之间进行整合，也包括在本发明中。
例如，具有免疫原性和抗原性表位的本发明多肽可用于制备可特异结合本发明多肽的抗体，借助免疫方法检测本发明的多肽。例如，抗体对本发明的多肽进行亲和纯化时非常有用。抗体还可以常规地用于多种定量或定量免疫方法中，尤其在应用本领域中所熟知的方法，可以对本发明的多肽进行检测。见，如Harlow，等，抗体：实验指南，冷泉港实验室出版社，第二版，1988。
本发明的含有表位的多肽可以通过本领域所熟知的化学合成法和重组方法进行合成。例如，带有表位的多肽可以用已知的化学合成法进行合成。例如，Houghten已经描述了一种简单的用于合成大量多肽的方法。，例如10-20毫克的248种不同的长度为13个氨基酸残基的的多肽，分别代表一个HA1多肽的片段的单个氨基酸变异，所有这些多肽的制备和弄清其特征(利用ELISA结合法进行研究)不到4周的时间(Houghten，R.A.，每美国科学院研究进展，1985，82：5131-5135)。这种“相同的多肽合成(SMPS)”过程在Houghten及其同事的美国专利No.463211中有更详细的阐述(1986)。在这一过程中，用于各种肽固相合成的不同的树脂存在于隔离的可溶解透过的袋子中，保证固相法的中的许多相同的重复步骤的最优化。完全的手工操作过程可以同时进行500-1000种或更多的多肽的合成(Houghten，等，美国科学院研究进展，1985，82：5131-5135中的第5134页)。
根据本领域所熟知的方法，包括但不仅限于这些，直接体内免疫，体外免疫和噬菌体展示等方法，本发明的含有表位的多肽可用于诱导抗体的产生。见，例如Sutcliffe，等，见上述；Wilson，等，见上述，和Bittle，等，普通病毒学杂志，1985，66：2347-2354。如果动物直接进行体内免疫，可以应用游离的多肽；但是，抗肽抗体的滴度透过多肽与一种大分子的载体偶联，匙孔嘁血兰蛋白(KLH)或破伤风毒素类物质。例如，含有半胱氨酸残基的肽可以应用连接子如间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酸亚胺酯(MBS)与载体偶联。而其他多肽可以应用更常见的连接试剂如戊二醛与载体偶联。兔子、大鼠和小鼠等动物既可以用游离的肽，也可以用与载体偶联的肽进行免疫，例如，通过向腹腔注射和/或皮内注射含有约100微克的多肽或载体蛋白和弗氏(Freund)佐剂。需要几次加强注射，如间隔为两周，以获得高滴度的抗肽抗体，例如可以应用吸附在固相上的游离多肽，借助于ELISA法进行检测。免疫动物血清中抗肽抗体的滴度通过抗肽抗体的筛选而增加，例如，根据本领域中所熟知的方法，可以通过与结合在固相上的多肽的吸附和选择性抗体的冲洗进行选择。
作为本领域中的一项技术在上文已做了讨论，含有免疫原性或抗原表位的多肽可以与异源性的多肽序列融合。例如，本发明的多肽可以与免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定结构域，或其中的一部分(CH1，CH2，CH3，任何含有整个的结构域和部分结构域的组合)，结果均能形成嵌合型的多肽。这些融合性的多肽有利于纯化，并在体内表现出较长的半衰期。已表明例如，嵌合蛋白含有人CD4多肽的前两个结构域和哺乳动物的免疫球蛋白的重链或轻链的恒定区的可变结构域。见，例如，EPA 0394827；Traunecker，等，自然，1988，331：84-86。由于IgG的片段含有二硫键连接的嵌合结构的融合蛋白，所以还表现为结合和中和其他分子比单聚体的多肽或单聚体的片段的能力更强。见，例如，Fountoulakis，等，生物化学杂志，1995，270：3958-3964。编码上述1表位的核酸还可与一条感兴趣的基因进行重组，作为一条表位标记，有助于不到多肽的检测和纯化。
抗体
本发明还进一步与抗体和T细胞抗原受体有关，二者可特异地与本发明的多肽结合。本发明的抗体包括IgG(包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)，IgA(包括IgA1和IgA2)，IgD，IgE，或IgM和IgY。本文这里所使用的“抗体”(Ab)这一术语包括所有抗体，包括单链的完整抗体，及其可以结合抗原的片段。本发明中最优选的抗体是结合人抗原的抗体片段，包括，但不仅限于这些，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFv)和含有VL或VH的结构域的片段。抗体可来自任何动物，包括鸟类和哺乳动物。最常用的抗体是人，鼠，兔子，山羊，豚鼠，骆驼，马或鸡。
结合抗原的抗体片段，包括单链抗体，可以仅含有可变区或可以与以下全部或部分成分结合：绞链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明还包括可变区与绞链区，CH1，CH2，CH3结构域的任何组合。本发明还包括嵌合的，人性化的和人单克隆抗体和多克隆抗体，可以特异地结合本发明的多肽。本发明还包括抗本发明抗体的独特型抗体。
本发明的抗体可以是单特异的，双特异的，三特异的或具有更多的特异性。多特异性的抗体可以是对本发明多肽的不同的表位具有特异性，或可以对本发明的多肽和异源性组合物如异源性多肽或固相物质均特异。见，如WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt.A.等，免疫学杂志，1991，147：60-69；美国专利5573920，4474893，560819，4714681，4925648；Kostelny，S.A.等，免疫学杂志，1992，48：547-1553。
本发明的抗体可以根据本发明的多肽的表位或区段进行描述或分类，这些部分可被抗体特异性地结合或识别。表位或多肽的区段可按本文所述进行分类，如通过N末端和C末端的位点，连续的氨基酸残基的大小，或本中图表中所列出的方法。可以特异地结合任何表位或本发明多肽的抗体还被排斥。因此，本发明包括可特异结合本发明多肽的抗体，并且进行同样的排斥。
本发明的抗体还可以根据它们的交叉活性进行描述或分类。还包括那些不与本发明多肽的其他任何类似物，同源物(ortholog)或同源物结合的抗体。与本发明多肽的同源性分别低于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％(根据本领域所熟知的方法和本文所述的方法进行计算)并不与多肽结合的抗体也包含在本发明中。本发明还包含的抗体是那些只结合由多核苷酸序列编码的多肽，而多核苷酸序列可以在非常严格的杂交条件下(如本文所述)，与本发明的多核苷酸序列发生杂交。本发明的抗体还可以根据它们的结合的亲和性进行描述或分类。优选的亲和性包括那些解离常数或Kd小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10- 14M、5×10-15M和10-15M。
本发明的抗体具有以下用途，包括但不仅限于这些，本领域所熟知的对本发明进行纯化，检测和定位的方法，包括体内和体外的诊断和治疗方法。例如，抗体用于免疫方法，用于定量和定性地进行检测生物样本中本发明的多肽的水平。见，例如，Harlow，等，抗体：实验指南，冷泉港实验室出版社，第二版，1988(附有完整的参考文献)。
本发明的抗体可以单独应用，也可以与其他成分联合使用。抗体可以进一步在C或N末端进行重组、融合成异源性的多肽，也可以对多肽或其他组分进行化学连接(包括共价和非共价连接)。例如，本发明的抗体可以进行重组融合或对分子进行连接，可作为有用的检测标记和效应分子，如异源性多肽，药物或毒素。见，例如WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5314995；和EP 0396387。
本发明的抗体可以通过本领域已知的任何适当方法制备。例如，可将本发明的多核苷酸或其片段施用于底物，以泳道含有多克隆抗体的血清产生。可以使用本领域已知的许多方法制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤和重组方法。见例如Harlow，等，抗体：实验指南，(冷泉港实验室出版社，第二版，1988)；Hammerling，等，见：单克隆抗体和T细胞杂交瘤，563-681(Elsevier，纽约，1981)(以其全文作为参考文献)。Fab和F(ab′)2片段可通过蛋白质的酶性水解获得，如木瓜酶(生成Fab片段)或胃蛋白酶(生成F(ab′)2片段)。
另一方面，本发明的抗体可以通过本领域所熟知的DNA重组技术或化学合成方法进行制备。例如，本发明的抗体应用本领域所熟知的不同的噬菌体展示法进行制备。在噬菌体展示法中，功能性的抗体的结构域出现在噬菌体颗粒的表面，而噬菌体携带编码上述结构域的核苷酸序列。通过通常是结合或吸附在固相表面或玻璃珠上的抗原进行直接筛选，具有所需结合特性的噬菌体可以从抗体池或联合抗体文库中筛选出来(例如，人或鼠)。这些方法中所使用的噬菌体为典型的线性噬菌体，包括fd和M13，并具有Fab，Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域，它们为与噬菌体的基因III或基因VIII蛋白重组融合而成。噬菌体展示法的实施例可以于制备本发明的抗体，包括Brinkman U，等，免疫学方法杂志，1995，182：4l-50；Ames，R.S.，等，免疫学方法杂志，1995，184：177-186；Kettleborough，C.A.，等，欧洲免疫学杂志，1994，24：952-958；Persic，L，等，基因，1997，187：9-118；Burton，D.R.，等，免疫学进展，1994，57：191-280；PCT/GB9111/01134；WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15892；WO95/20401和美国专利5698426，5223409，5403484，5580717，5427908，5750753，5821047，5571698，5427908，5516637，5780225，5658727和5733743(以其全文作为参考文献)。
正如上述的参考文献，在噬菌体筛选后，分离含有噬菌体编码区的抗体，并用于合成完整的抗体，包括人的抗体，或其他任何结合抗原的片段和可以在所有指定宿主中进行表达，包括哺乳细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌。例如，重组产生Fab，Fab′和F(ab′)2片段的技术方法还可以使用本领域所熟知的方法，如见：WO92/22324；Mullinax，R.L.等，生物技术，1992，12(6)：864-869；和SawaimH，等，AJRI，1995，34：26-34；和Better，M，等，科学，1988，240：1041-1043(以其全文作为参考文献)。
用于合成单链Fvs的抗体的技术的实施例包括以下文献中所陈述实施例：美国专利4946778和5258498；Huston，等，酶学方法，1991，203：46-88；Shu，L，等，美国科学院研究进展，1993，90：7995-7999；和Skerra，A，等，科学，1988，240：1038-1040。为了这些用途，包括在人的体内使用抗体和用于体外的检测，优先使用嵌合，人性化的或人的抗体。用于合成嵌合抗体的方法，本领域的技术人员非常熟悉。见，如，Morrison，科学，1985，229：1202；Oi等，生物技术，1986，4：214；Gillies，S.D.，等，免疫学方法杂志，1989，125：191-202；和美国专利5807715。应用多种技术对抗体进行人性化，包括CDR移植(EP0239400；WO91/09967；美国专利5530101；和5585089)，镶面技术或重新布置技术(EP0592106；EP0519596；Padlan E.A.，分子免疫学，1991，28(4/5)：489-498；StudnickaG.M.等，蛋白质工程，1994，7(6)：805-814；RouguskaM.A.等，美国科学院研究进展，1994，91：969-973和链重排技术(美国专利5565332)。人类的抗体可以通过本领域所知的许多方法进行合成，包括上述的噬菌体展示技术。还可见：美国专利4444887，4716111，5545806和5814318；98/46645(以其全文作为参考文献)。
本发明还包括对重组融合或化学偶联(包括共价和非共价连接)的本发明的多肽的抗体。抗体对非本发明多肽的抗原是特异的。例如，通过本发明的多肽与可以特异结合细胞表面的受体的抗体，进行融合或偶联的方法，抗体可用以与体内或体外的特异类型细胞中的本发明的多肽靶向性地结合。与本发明多肽的融合或偶联的抗体还可以用于本领域所熟知的体外的免疫检测方法和纯化技术。见，例如，Harbor，等，同上述和WO93/21232；EP0439095；Naramura，M，等，免疫学通信，1994，39：91-99；美国专利，5475981；Gillies，S.O.等，美国科学院研究进展，1991，89：1428-1432；Fell，H.P.等，免疫学杂志，1991，146：2446-2452(以其全文作为参考文献)。
本发明还包括含有与本发明多肽重组融合或化学共轭的抗体的结构域而不是可变区的组分。例如，本发明的多肽可以与抗体的Fc区或Fc区的部分进行融合或共轭。与本发明的多肽融合的抗体部分含有绞链区，CH1，CH2，CH3结构域或所有结构域或其部分的任何组合。本发明的多肽还可以与上述的抗体部分进行融合或共轭，以提高多肽在体内的半衰期或用于本领域所熟知的免疫检测方法。多肽还可以与上述的抗体部分进行融合或共轭形成多聚体。例如，与本发明的多肽进行融合的Fc片段，应用Fc的片段之间的二硫键形成二聚体。通过多肽与IgA和IgM中的部分结合，形成高级的多聚体。用于本发明的多肽与抗体的部分进行融合或共轭的方法，为本领域所熟知的。将，例如，美国专利，5336603，56229229，5359046，5349053，5447851，5112946；EP0367166；WO96、04388，WO91/06570；Ashkenazi，A，等，美国科学院研究进展，1991，88：10535-10569；Zheng，X.X.，等，免疫学杂志，1995，154：5590-5600；和Vil，H，等，美国科学院研究进展，1992，89：11337-11341(上述参考文献附此仅供参考)。
本发明的还涉及作为本发明多肽激动剂或拮抗剂的抗体。例如，本发明包括完全或部分抑制受体/配体与本发明多肽相互作用抗体。包括受体特异的抗体和配体特异的抗体。还包括的不能抑制配体结合但可抑制受体激活的受体的特异抗体。受体的激活(即信号转导)可以通过本文所述的方法或本领域所熟知的其他方法来确定。还包括既可抑制结合配体又可以抑制受体激活的受体特异的抗体。同样地，还包括可以结合配体，并能抑制配体与受体的结合的中和性抗体，以及结合配体的抗体，因此，可以抑制受体的活化，但是不能抑制配体与受体的结合。还包括可以激活受体的抗体。这些抗体可以作为激动剂，在配体-受体的活化过程中，完全发挥或部分发挥其生物学活性。作为具有生物学活性(包括本文所阐述的特异的活性)的激动剂或拮抗剂的抗体可以是特异的。上述抗体的激动剂应用本领域所熟知的方法进行合成。见，例如，WO96/40281；美国专利5811097；Deng，B，等，血液，1998，92(2)：1981-1988；Chen，Z，等，癌症研究，1998，58(16)：3668-3578；Harrop，J.A.，等，免疫学杂志，1998，161(4)：1786-1794；Zhu，Z，等，癌症研究，1998，58(15)：3209-3214；Yoon，D.Y.等，免疫学杂志，1998，160(7)：3170-3179；Prat，M，等，细胞科学杂志，1998，111(Pt2)：237-247；Pitard，V，等，免疫学方法杂志，1997，205(2)：177-190；Liautard，J，等，细胞因子，1997，9(4)：233-241；Carlson，N.G.，等，生物化学杂志，272(17)：11295-11307；Taryman，R.E.，等，神经元，1995，14(4)：755-762；Muller，Y.A.，等，结构，1998，6(9)：1153-1167；Bartunek，P，等，细胞因子，1996，8(6)：14-20(上述参考文献附此仅供参考)。
抗体还可用于免疫方法，来检测某些个体发生肿瘤。酶免法可用于检测患者的血标本。VEGF-2的升高可以诊断癌症。
还可以合成截短的VEGF-2，后者可以与野生型的VEGF-2形成二聚体，从而使VEGF-2不能激活内皮细胞的生长，因此，使内源性的VEGF-2失活。或者，VEGF-2的突变体自身形成二聚体，并占据了靶细胞表面的正常的酪氨酸激酶受体的配体结合区域，但不能活化细胞生长。
另一种情况，也可以使用本发明多肽的拮抗剂，可以与特异结合本发明多肽的受体结合。拮抗剂与蛋白质密切相关，如可以1识别和结合天然蛋白的受体的位点，但是，由于受体的位点被占据，所以它们是天然蛋白质的无活性的形式，因此，可以抑制VEGF-2的作用。按这些方式，VEGF-2的作用可以被抑制，并且拮抗剂/抑制剂可以作为抗肿瘤的药物用于肿瘤的治疗，通过占据肿瘤上的受体位点，而这些位点可以被VEGF-2或失活的VEGF-2所识别。拮抗剂/抑制剂还可用于抑制由VEGF-2导致的血管的通透性增加所致的炎症。拮抗剂/抑制剂还可用于治疗固体肿瘤的生长，糖尿病性的视网膜病，牛皮癣和类风湿性关节炎。
拮抗剂/抑制剂还可以与一种可用于人体的药物载体(见本文上述)组成混合物。
本发明将以下面的实施例作进一步描述，仅供参考，但必须清楚，本发明并不仅限于这些实例。所有份数或剂量，如不特殊说明均指重量。
为了便于理解下述的实施例，下面叙述一些经常遇到的方法和/或术语。
“质粒”的第一个字母是为小写p，接着是/或大写字母和/或数字。本文使用的质粒可以购买到，在要求不太严格的条件下可以公开获得，或按照公开发表的方法，应用现有的质粒进行构建。另外，与所述等效的质粒为本领域所熟知，并且熟练的技术人员也非常清楚。
DNA的“消化”，是指应用限制性内切酶对DNA进行催化裂解，后者只作用于DNA中的特定序列。本文所使用的不同的限制性内切酶可以从商家买到，反应条件，辅助因子和其他所必需使用的，为本领域的熟练技术人员所熟知。
在分析研究时，通常1毫克的质粒或DNA片段在20微升的缓冲反应体系中加入2单位的酶。在用分离的片段构建质粒时，通常是5-50毫克的DNA在更大的反应体系中加入20-250单位的酶。不同的限制性内切酶厂家特异提供合适的缓冲液和底物的用量。通常是在37EC孵育一小时，但可以根据试剂供应商的说明进行改变。在酶切消化后，在聚丙烯酰胺凝胶上直接进行电泳，分离所需的片段。
应用8％的聚丙烯酰胺凝胶，对酶切片段进行大小的分离，具体方法见，Goeddel，D，等，核酸研究，1980，8：4057。
“寡核苷酸”是指单链的多聚脱氧核糖核苷酸或两条互补的多聚脱氧核糖核苷酸链，可以化学合成。这些合成的寡核苷酸没有5′端的磷酸，因此不能与另一个寡核苷酸连接，不能在激酶的作用下，加上由ATP提供的磷酸。合成的寡核苷酸将与没有去磷酸化的片段连接。
“连接”是指在双链的核酸片段之间形成磷酸二脂键的过程(Sambrook，等，分子克隆：实验指南，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989，P146)。除非使用其他方法，在已知的缓冲液和反应条件下，大约每0.5毫克的DNA片段可以用10单位的T4DNA连接酶(“连接酶”)进行连接。
除上述的方法外，转化可以按下述方法进行，Graham，F，和VanderEb，A，病毒学，1973，52：456-457。
实施例
实施例1
人组织和乳腺癌细胞系中VEGF-2的表达模式
应用Northern印迹分析检测人组织和人组织乳腺癌细胞VEGF-2的表达水平。用RNAzolTMB系统(Biotecx实验室，有限公司)分离细胞总RNA样品。用1％的琼脂糖凝胶分离从每个乳腺癌组织和特异性细胞系分离出的总量约10mg的RNA，并点于尼龙滤膜上，〔Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)〕。根据Stratagene Prime-It试剂盒用50ngDNA片段进行标记反应。用Select-G-50柱从5Prime-3Prime中纯化标记DNA，有限公司〔Boulder，CO〕。在0.5M NaPO4和7％SDS溶液中将滤膜与标记放射活性为1,000,000cpm/ml的全长VEGF-2基因65℃杂交过夜。室温用0.5XSSC，0.1％SDS，60℃各洗两次，然后用增感屏于-70℃曝光过夜。在两个乳腺癌细胞系中可观察到1.6kd的信息。图5第4泳道代表一个特别的致瘤性细胞系，其生长是不依赖于雌激素的。
同样的，从10个人成体组织中取得的10mg总RNA用琼脂糖凝胶分离再点于尼龙滤膜上。在7％SDS，0.5M NaPO4，pH7.2的溶液中用放射性标记的VEGF-2探针杂交滤膜；1％BSA中65℃过夜。65℃0.2XSSC中洗后，用增感屏于-70℃将滤膜曝光于底片上24小时。参照图6。
实施例2
通过体外转录和翻译表达截短形式的VEGF-2(SED ID NO：4)
体外转录翻译VEGF-2cDNA以确定VEGF-2截短形式和部分VEGF-2cDNA编码的可翻译多肽的大小。用三对引物PCR扩增在pBluescript SK载体中的两个VEGF-2插入片段，1〕M13反向和正向引物；2〕M13反向引物和VEGF引物F 4；和3〕M13反向引物和VEGF引物F5。这些引物序列如下所示。
M13反向引物：5’-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3’(SEQ IDNO：9)。此序列定位于pBluescript载体中VEGF-2 cDNA插入片段5‘末端的上游，作为cDNA它为反义起始方向。一个T3启动子序列定位于引物和VEGF-2 cDNA之间。M13-2正向引物：5’GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO：10)。此序列定位于VEGF-2cDNA插入片段3’末端的下游，作为cDNA插入它为正义起始方向。VEGF引物F4：5′-CCACATGGTTCAGGAAAGACA-3’(SEQ ID NO：11)。此序列以正义起始方向定位于VEGF-2 cDNA内碱基1259-1239，距终止密码子3’末端约169bp而在cDNA最后一个核苷酸前约266bp。
用三对引物进行的PCR反应产生的扩增产物在cDNA插入片段前有T3启动子序列。第一对和第三对引物产生编码SEQ ID NO：4所示的VEGF-2多肽的PCR产物。第二对引物产生在VEGF-2多肽C末端缺失36个氨基酸编码序列的PCR产物。
从第一对引物中取约0.5mg的PCR产物，第二对引物取1mg，第三对引物取1mg进行体外转录/翻译。体外转录/翻译反应用TNTJ偶联网织红细胞溶胞产物体系(Promega，CAT#L4950)在25F1体积中进行。反应体系特异性的含有12.5F1的TNT兔网织红细胞溶胞产物2F1的TNT反应缓冲液，1F1的T3聚合酶，1F1的1mM氨基酸混合物(无甲硫氨酸)，4F1的35S-甲硫氨酸(＞1000Ci/mmol，10mCi/ml)，1F1的40U/ul；Rnasin核酶抑制剂，0.5或1mg的PCR产物。加入不含核酸酶的水至体积为25F1。反应于30℃孵育2小时。用4-20％的梯度SDS-PAGE胶分析五毫升的反应产物。用25％异丙醇和10％的醋酸固定后，使胶干燥并于70℃X射线曝光过夜。
如图7所示，含有截短VEGF-2cDNA(例如，如SEQ ID NO：3中描述的)和在3’非翻译区(3’-UTR)缺失266bp的cDNA的PCR产物产生相同长度的翻译产物，估计它们的分子量为38-40kd(泳道1和3)。缺失所有3’-UTR和编码C-末端36个氨基酸序列的cDNA翻译出估计分子量为36-38kd的一条多肽(泳道2)。
实施例3
用杆状病毒表达系统克隆表达VEGF-2
参照ATCC No.97149，用相应于该基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码无N端46个氨基酸的VEGF-2c蛋白的DNA序列：
5’引物序列是TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAT CCCGCC ATG GAG GCC ACG GCT TAT GC(SEQ ID NO：12)并含有一个BamH1内切酶位点(以粗体字表示)和与VEGF-25’序列互补的17核苷酸序列(nt.150-166)。
3’引物具有序列GATC TCT AGA TTA GCT CAT TTG TGGTCT(SEQ ID NO：13)并含有限制酶切割位点XbaI和与VEGF-23’序列互补的18核苷酸包括终止密码子和终止密码子前的15nt序列。
用可买到的试剂盒(“Geneclean，”BIO101，Inc.，La Jolla，CA)从1％的琼脂糖凝胶中分离扩增片段。用内切酶BamH1和XbaI消化该片段后，再用1％琼脂糖凝胶纯化。于BamH1和XbaI位点将此片段连入pAcGP67A杆状病毒穿梭载体(Pharmingen)。连接时，VEGF-2cDNA被克隆到杆状病毒gp67基因信号序列的框架中并定位于载体中该信号序列3’末端。命名为pAcGP67A-VEGF-2。
为将带gp67基因信号序列的VEGF-2克隆到pRG1载体以表达，用XhoI和XbaI限制酶将VEGF-2及信号序列和一些上游序列从pAcGP67-VEFG-2质粒上定位于VEGF-2cDNA上游的Xho限制内切酶位点和XbaI限制内切酶位点切割下来。此片段在1％琼脂糖凝胶上与其它载体分离，用“Geneclean”试剂盒纯化。命名为F2。
利用杆状病毒表达系统(综述参照Summers，M.D.及Smith，G.E.，“杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序方法手册”得克萨斯农业实验站公报NO：1555，(1987))将PRG1载体(pVL载体修饰而来)用于表达VEGF-2蛋白。该表达载体含有一个Autographa californica核多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子随后有BamH1，Smal，XbaI，BhlII和Asp718限制内切酶识别位点。限制内切酶Xhol定位于BamH1位点上游。Xhol和BamH1中间的序列与PacGp67A(static on tape)载体中的一样。猿猴病毒(SV)40的多聚腺苷酸位点被用于高效的腺苷酸化。为简便筛选重组病毒将大肠杆菌β-半乳糖苷酶以与连有多角体蛋白基因多聚腺苷酸信号的多角体蛋白启动子相同的起始方向插入。多角体蛋白序列两侧连有病毒序列使得共转染的野生型病毒可发生细胞介导的同源重组。许多其它杆状病毒载体也可代替pRG1例如pA373，pVL941和pACIM1(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，病毒学170：31-39(1989))。
用限制酶XhoI和Xbal消化该质粒，然后根据本领域所知的程序用牛肠磷酸酶去磷酸化。用商业可得的试剂盒(“Geneclean”BIO101 Inc.，La Jolla，Ca)将DNA从1％的琼脂糖凝胶中分离出来。此载体DNA命名为V2。
用T4DNA连接酶连接片段F2和去磷酸化的质粒V2。再转化大肠杆菌HB101细胞并用酶BamH1和XbaI鉴定含携带VEGF-2基因的质粒(pBac gp67-VEGF-2)的菌株。通过DNA测序确定克隆片段的序列。
用脂质体法(Felgner等，美国科学院研究进展84：7413-7417(1987))共转染5mg pBac gp67-VEGF-2质粒和1.0mg商业可得的线性杆状病毒(“BaculoGoldJ杆状病毒DNA，Pharmingen，SanDiego，CA.)。
在含有50ml无血清Grace’s培养基(生命科技有限公司，Gaithersburg，M.D.)的微样滴定板的一个无菌孔中混合1mgBaculoGoldJ病毒DNA和5mg pBac gp67-VEGF-2质粒。然后加入10ml脂质体和90ml Grace’s培养基，混匀室温孵育15分钟。再将转染混合物逐滴加到培养于有1ml无血清Grace‘s培养基的35mm组织培养皿中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)。前后摇动培养皿以混匀新加入的溶液。于27℃孵育5小时。5小时后从皿中移去转染溶液，加入补充了10％胎牛血清的1ml Grace’s培养基。培养皿放回孵箱，继续于27℃孵育四天。
四天后收集上清，用Summers和Smith所描述的相似方法分析噬菌斑，见上述。选用可简便分离蓝色噬菌斑的加有“Blue Gal”(生命科技有限公司，Gaithersburg)的改良胶。(“噬菌斑分析”的详细叙述可见生命科技有限公司，Gaithersburg，出版的昆虫细胞培养和杆状病毒用户指南，9-10页)。
系列稀释后四天，向细胞中加入病毒，用Eppendorf移液枪头挑走蓝色噬菌斑。在含200mlGrace‘ s培养基的Eppendorf试管中重悬含重组病毒的琼脂。稍加离心移去琼脂，将含重组杆状病毒的上清感染培养于35mm平皿的Sf9细胞。四天后收集这些平皿中的上清储存于4℃。
Sf9细胞生长于补充有10％热灭活FBS的Grace‘s培养基中。感染复数为1用重组杆状病毒V-gp67-VEGF-2感染细胞。四小时后移去培养基，换以无甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培养基(生命科技有限公司，Gaithersburg)。42小时后加入5mCi35S-甲硫氨酸和5mCi35S-半胱氨酸。进一步培养细胞16小时后离心收集细胞并通过SDS-PAGE和放射自显影观察标记蛋白。
在非还原和还原条件下分析培养基中的蛋白和Sf9细胞的细胞质。分别见图8A和8B。用pH5.8的50mM MES透析培养基。透析后可得沉淀，用pH5.0的100mM柠檬酸钠重悬。重悬沉淀再用SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。见图9。
培养基上清也用pH5.8的50mM MES1：10稀释，以1ml/分钟的流速过SP-650M柱。蛋白用200，300，和500mM NaCl step梯度洗脱。用洗脱液500mM NaCl可获得VEGF-2。在还原剂巯基乙醇存在或缺失的条件下用SDS-PAGE分析洗脱液并用考马斯亮蓝染色。见图10。
实施例4
在COS细胞中表达重组VEGF-2
质粒VEGF-2-HA的表达衍生于含1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性，3)大肠杆菌复制起点，4)其后有接头区，一个SV40内含子和多聚腺苷酸位点的CMV启动子的pcDNA/Amp载体(Invitrogen)。将编码整个VEGF-2前体的DNA片段和融合于其框架内3‘末端的HA标签克隆到载体的接头区，因此重组蛋白的表达直接受控于CMV启动子。HA标签与衍生自前述的流感血凝素(Wilson等，细胞37：767(1984))的表位相应。HA标签与靶蛋白的融合使得可以使用识别HA表位的抗体简便检测重组蛋白。
质粒构建机理如下所述：
用两个引物PCR构建编码VEGF-2，ATCC No：97149的DNA序列：5‘引物(CGC GGA TCC ATG ACT GTA CTC TAC CCA)(SEQID NO：14)含一个BamH1位点，该位点后有起始于起始密码子的18核苷酸VEGF-2编码序列；3’序列(CGC TCT AGA TCA AGC GTAGTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA CTC GAG GCT CAT TTG TGGTCT 3‘)(SEQ ID NO：15)含XbaI位点，HA标签，XhoI位点，和VEGF-2编码序列的后15个核苷酸(不包括终止密码子)。所以，PCR产物含一个BamHI位点，连有一个XhoI限制内切酶位点和融合于框架中的HA标签的编码序列。用BamH1和XbaI限制酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，再进行连接。用连接混合物转化大肠杆菌菌株SURE(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037)，转化培养基铺于氨苄青霉素培养基平板并筛选抗性克隆。从转化子中分离质粒DNA限制性分析检测正确片段的存在。通过DEAE-DEXTRAN法(J.Sambrook，C.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆：实验室手册，冷泉实验室出版社，(1989))用表达载体转染COS细胞以表达重组VEGF-2。通过放射性标记和免疫沉淀法(E.Harlow和D.Lane，抗体：实验室手册冷泉港实验室出版社，(1988))检测VEGF-2-HA蛋白的表达。在转染后两天用35S-半胱氨酸标记细胞8小时。收集培养基用去垢剂裂解细胞(RIPA缓冲液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)(Wilson等，细胞37：767(1984))。通过HA特异性单抗隆抗体沉淀细胞裂解物和培养基介质。沉淀的蛋白用15％SDS-PAGE胶分析。
实施例5
部分纯化的VEGF-2蛋白对血管内皮细胞生长的影响
第一天以2-5×104个细胞/35mm平皿的密度在含4％的胎牛血清(FBS)，16个单位/ml肝磷脂，和50个单位/ml内皮细胞生长补充物(ECGS，生物技术有限公司)的M199培养基中培养脐带血管内皮细胞(HUVEC)。第二天，用含10％的FBS，8个单位/ml肝磷脂的M199更换培养基。按所示浓度加入SEQ ID NO2无起始45个氨基酸残基的VEGF-2蛋白(VEGF)和碱性FGF(bFGF)。在第四天和第六天换培养基。第8天，用Coulter计数器测定细胞数(如图12)。
实施例6
纯化VEGF-2蛋白对血管内皮细胞生长的影响
第一天以2-5×104个细胞/35mm平皿的密度在含4％的胎牛血清(FBS)，16个单位/ml肝磷脂，和50个单位/ml内皮细胞生长补充物(ECGS，生物技术有限公司)的M199培养基中培养人脐带血管内皮细胞。第二天，用含10％的FBS，8个单位/ml肝磷脂的M199换培养基。此时向培养基中加入纯化的SEQ ID NO2无起始45个氨基酸残基的VEGF-2蛋白。第4和第6天用新鲜培养基和补充物更换培养基。第8天，用Coulter计数器测定细胞数(如图13)。
实施例7
通过基因治疗的表达
通过皮肤活检从一组织取得成纤维母细胞。将待测组织放入组织培养培养基中并分离成小片。将小块组织放于一组织培养瓶的潮湿表面，约十片一瓶。颠倒瓶子，封严并于室温过夜。室温24小时后倒转瓶子，组织块仍保持贴附瓶底加入(例如含10％FBS，氨苄青霉素和链霉素的Ham′s F12培养基)新鲜培养基。然后37℃孵育约一周。这时加入新鲜培养基并几天换一次。再培养两星期后出现单层成纤维母细胞。用胰蛋白酶消化单层细胞并于大摇瓶中大规模培养。
用EcoRI和HindIII消化两侧为Moloney鼠瘤病毒的长末端重复序列的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA7：21119-225(1988))，接着用牛胰磷酸酶处理。于琼脂糖凝胶上分离线性载体并用玻璃珠纯化。
用各相应于5′和3′末端序列的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。含一个EcoRI位点的5′引物和3′引物进一步含有了一个HindIII位点。在T4DNA连接酶存在下，加入等量的Moloney鼠瘤病毒线性骨架和扩增的EcoRI和HindIII片段。在适于两片段相连的条件下孵育该混合物。用连接混合物转化细菌HB1011，将转化混合物铺于含卡那霉素的琼脂上以确定有正确插入基因的载体。
用含10％小牛血清(CS)，氨苄青霉素，和链霉素的Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM)培养基组织培养兼嗜性pA317或GP+am12包装细胞使生长至汇合密度。然后将含基因的MSV载体加入培养基中，包装细胞将被该载体转导。包装细胞现在可产生含该基因的感染性病毒颗粒(该包装细胞现被成为生产细胞)。
向被转导的生产细胞中加入新鲜培养基，接着，从汇合包装细胞的10cm平板中收集培养基。将含感染性病毒颗粒的用过的培养基通过微孔滤器过滤以除去分裂的生产细胞并用该培养基感染成纤维母细胞。从亚汇合状态的成纤维母细胞平板中移去培养基并快速换成生产细胞的培养基。移去这种培养基并换成新鲜培养基。如果病毒滴度高，那么实际上成纤维母细胞都会被感染无需选择。如果滴度低那么就有必要用有选择标记的逆转录病毒载体，例如neo或his。
再将工程成纤维母细胞注入受体中，或者单独注入或者在其于cytodex3微载体珠上生长至汇合浓度后。成纤维母细胞现可用于生产蛋白产品。
实施例8
在人胎儿或成体组织中表达VEGF-2mRNA实验设计
应用Northern印迹分析检测人胎儿和成人组织中VEGF-2mRNA的表达水平。根据厂商说明通过放射引物DNA标记系统(AmershamLife Science)用32P标记一种含VEGF-2蛋白整个核苷酸序列的cDNA探针。标记后，根据厂商PT1200-1号程序用一种CHROMA SPIN-100*柱〔Clontech实验室，有限公司)纯化该探针。然后用纯化探针检测各种人组织中的VEGF-2mRNA。
从Clontech得到一种含各种人组织(胎肾，胎肺，胎肝，脑，肾，肺，肝，脾，胸腺，骨髓，睾丸，胎盘和骨骼肌)的多组织Nothern(MTN)印迹。根据厂商PT1190-1号程序MTN印迹是通过使用ExpressHb*杂交溶液(Clontech)用标记探针检测的。杂交及洗后，通过增感屏于70℃将印迹曝光于底片上，并根据标准程序显象。
结果
VEGF-2mRNA在血管平滑肌和几个富含血管的组织中过量表达。VEGF-2在与造血和血管生成活性相关的组织中有显著性高表达，例如，胎肾，胎肺，骨髓，胎盘，脾和肺组织。VEGF-2在成人肾，胎肝，成人肝，睾丸中的表达水平较低；在胎脑和成人脑中几乎检测不到(见图14)。
在原代培养的细胞中VEGF-2mRNA在平滑肌细胞和皮肤成纤维母细胞中过量表达，但在人脐带血管内皮细胞中表达低的多(见图15〕。这种mRNA分布模式与VEGF的很相似。
实施例9
构建氨基端和羧基端缺失突变型
为了鉴定和分析生物学活性的VEGF-2多肽，通过表达载体pHE4a构建了一系列VEGF-2缺失突变型。
1.在pHE4中构建VEGF-2T103-L215
为了可以进行聚合酶链式反应定点扩增和将VEGF-2T103-L215(图1中氨基酸103-105 SEQ ID NO：18)亚克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pHE4中，根据下列序列合成了与VEGF-2目的区段互补的两个寡核苷酸引物：
5’引物(NdeI/起始和编码序列的18个核苷酸)：
5’-GCA GCA CAT ATG ACA GAA GAG ACT ATA AAA-3’(SEQ ID NO：19)
3’引物(Asp718，终止密码子和编码序列的15个核苷酸)：
5’-GCA GCA GGT ACC TCA CAG TTT AGA CAT GCA-3’(SEQ ID NO：20)
上述5’引物(SEQ ID NO：19)，有一个NdeI限制位点和上述3’引物(SEQ ID NO：20)有一个Asp718限制位点。5’引物(SEQ ID NO：19)也含有一个邻近于VEGF-2编码区并与其框架相符的ATG序列使得在大肠杆菌可表达该克隆片段，然而3’引物(SEQ ID NO：20)含一个与VEGF-2编码区邻近并框架相符的终止密码子(大肠杆菌嗜好性)这保证了大肠杆菌中正确的翻译终止。
用本领域熟练技术人员熟知的标准条件进行聚合酶链式反应并以成熟VEGF-2(SEQ ID NO：18中氨基酸24-419)为模板，例如，实施例3中所构建的。产生的扩增产物用NdeI和Asp718消化并亚克隆到NdeI/Asp718消化的pHE4a表达载体中。
2.在pHE4上构建VEGF-2 T103-R227
为了可以进行聚合酶链式反应定点扩增并将VEGF-2T103-227(图1中的氨基酸103到227或SEQ ID NO：18)亚克隆到大肠杆菌表达载体pHE4中，根据下列碱基序列合成了VEGF-2目的区段：
5’引物(NdeI/起始密码子和编码序列的18个核苷酸)：
5’GCA GCA CAT ATG ACA GAA GAG ACT ATA AAA-3’(SEQ ID NO：19)
3’引物(Asp718终止和编码序列的15个核苷酸)：
5’-GCA GCA GGT ACC TCA ACG TCT AAT AAT GGA-3’(SEQ ID NO：21)
在上述的引物中，5’和3’引物个含NdeI或Asp718限制位点。5’引物(SEQ ID NO：19)也含一个与VEGF-2编码区相邻且框架相符的ATG序列使得可以在大肠杆菌中翻译该亚克隆片段，然而3’引物(SEQ ID NO：21)含一个终止密码子(大肠杆菌嗜好性)与VEGF-2编码区邻近且框架相符这保证了大肠杆菌中翻译的正确终止。
用本领域熟练技术人员熟知的标准条件进行聚合酶链式反应并以成熟VEGF-2(SEQ ID NO：18氨基酸24-419)核苷酸序列为模板，例如，实施例3中构建的。产生的扩增产物用NdeI和Asp718限制消化并亚克隆到NdeI/Asp718消化的pHE4a蛋白表达载体上。
3.在pA2GP上构建VEGF-2 T103-L215
在这个说明性实施例中，通过Summers等编著的杆状病毒和昆虫细胞培养程序方法手册，得克萨斯农业实验站公告1555号(1987)中所述的主导和标准方法用穿梭载体pA2GP将编码N-末端和C-末端缺失的VEGF-2蛋白(图1中氨基酸103-215或SEQ ID NO：18)的克隆DNA插入杆状病毒中以表达N-末端和C-末端缺失的VEGF-2蛋白。此实验载体含Autographa californica核多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，其后是杆状病毒gp67蛋白的分泌信号肽(先导肽)和方便的限制位点例如BamHI，XbaI和Asp718。选用猿猴病毒40(“SV40”)的多聚腺苷酸位点以产生有效的多聚腺苷酸化。为了简便筛选重组杆状病毒，质粒在相同的起始方向含有受弱Drosophila启动子调控的大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，随后是多角体蛋白基因的多聚腺苷酸位点。为了使野生型病毒DNA发生细胞介导的同源重组后可产生表达克隆多核苷酸的可存活病毒，插入基因两侧都是病毒的序列。
许多杆状病毒载体可以代替上述载体，例如pAc373，pVL941和pAcIM1，正如本领域任一熟练技术人员可轻易理解的，只要该结构可提供转录，翻译，分泌等诸如此类的适当定位信号，包括一个所需的信号肽和框架内AUG。这些载体在例如Luckow等的病毒学170：31-39(1989)中有叙述。
图1中编码缺失N-末端102个氨基酸和C-末端240个氨基酸的VEGF-2蛋白的cDNA序列通过与该基因5’和3’序列相应的PCR寡核苷酸得到扩增。
5’引物序列5’-GCA GCA GGA TCC CAC AGA AGA GACTAT AAA-3’(SEQ ID NO：22)含有BamH1限制酶位点(以粗体字表示)随后是一个分隔核苷酸以保持与载体提供的信号肽和VEGF-2蛋白的17个编码序列碱基框架相同。3’引物序列5N-GCAGCA TCT AGA TCA CAG TTT AGA CAT GCA-3’(SEQ ID N0：23)含有XbaI限制位点〔以粗体字表示〕随后是一个终止密码子和与VEGF-23’编码序列互补的17核苷酸。
通过商业获得的试剂盒从1％琼脂糖凝胶中分离扩增序列(“Geneclean”，BI0101，有限公司，La Jolla，CA)。然后用内切酶BamH1和XbaI消化该片段并再用1％琼脂糖凝胶纯化。于BamH1和XbaI位点将该片段连入pA2 GP杆状病毒转运载体(Supplier)。通过连接，代表N-末端和C-末端缺失的VEGF-2蛋白的VEGF-2cDNA(图1中的氨基酸103-215或SEQ ID NO：18)被克隆到杆状病毒GP基因的信号肽框架内并定位于载体信号肽的3’末端。命名为pA2GPVEGF-2.T103-L215。
4.在pA2GP上构建VEGF-2 T103-R227
图1中编码缺失N-末端102个氨基酸和C-末端192个氨基酸的VEGF-2蛋白(例如SEQ ID NO：18的氨基酸103-227)的cDNA序列通过与此基因5’和3’序列相应的PCR寡核苷酸引物得到扩增。
5’-GCA GCA GGA TCC CAC AGA AGA GAC TAT AAAATT TGC TCG-3’的序列(SEQ ID NO：24)含有BamH1限制位点(以粗体字表示)随后是一个分隔核苷酸使保持与载体提供的信号肽和VEGF-2蛋白的26个编码序列碱基框架相符。3’引物序列5N-GCA GCA TCT AGA TCA ACG TCT AAT AAT GGA ATG AAC-3′〔SEQ ID NO：25〕含有XbaI限制位点〔以粗体字表示〕随后是一个终止密码子和与VEGF-23’编码序列互补的21核苷酸。
通过商业获得的试剂盒〔“Geneclean”BIO101，有限公司，LaJolla，CA〕从1％的琼脂糖凝胶中分离扩增序列。用BamH1和XbaI消化该片段再用1％琼脂糖凝胶纯化。将此片段连入pA2 GP杆状病毒转运载体的BamH1和XbaI位点。通过连接，代表N-末端和C-末端缺失的VEGF-2蛋白〔图1中的氨基酸103-227或SEQ IDNO：18〕的VEGF-2cDNA以相同的框架被克隆到杆状病毒GP基因并定位于载体信号序列的3’末端。该结构命名为pA2GPVEGF-2.T103-R227。
5.在pC1上构建VEGF-2
表达载体pC1和pC4含有鸟肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(三月，1985))及一个CMV-增强子片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985)).多克隆位点，例如，有限制酶切割位点BamH1，XbaI和Asp718，便于克隆目的基因。这样的载体另含3N内含子，多聚腺苷酸位点和大鼠胰岛素原前体基因的终止信号。
载体pC1用于表达VEGF-2蛋白。质粒pC1是质粒pSV2-dhfr[ATCC收录号37146]的一个衍生物。两个质粒都含有受SV40早启动子调控的鼠DHFR基因。转染这些质粒的中国苍鼠卵巢-或其它缺失二氢叶酸活力的细胞能通过在添加有化学治疗试剂氨甲喋呤的选择性培养基(α缺失MEM生命科技)生长得到筛选。细胞中DHFR基因的扩增产生的对氨甲喋呤的抗性已有很好的论述(参照，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，和Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志253：1357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化学和生物物理学学报1097：107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术9：64-68)。生长于浓度逐渐增高的MTX中的细胞通过过量表达靶酶DHFR增强抗性，因此产生了DHFR基因的扩增。如果另一个基因与DHFR基因连锁，通常也会被一起扩增和过量表达的。本领域正处培养携带超过1,000拷贝该基因的细胞系。所以当去除氨甲喋呤时，细胞系就含有整合于染色体的扩增基因。
质粒pC1含鸟肉瘤病毒长末端重复序列的强启动子(Cullen等，分子和细胞生物学，三月1985：438-4470)和从人巨细胞病毒CMV中分离的增强子片段(Boshart等，细胞41：521-530)以便获得目的基因的表达。启动子下游是可进行基因整合的单一限制酶切割位点：BamH1，PvuII，和NruI。除这些克隆位点外该质粒在随后为3N内含子和大鼠胰岛素原前体基因的多聚腺苷酸位点的三个阅读框架内含有终止密码子。其它高效启动子也能用于表达，例如，人b-肌动蛋白启动子，SV40早或晚启动子或其它逆转录病毒长末端重复序列，如，HIV和HTLVI。mRNA的其它信号例如来自人生长激素或球蛋白基因也能用于多聚腺苷酸化。
携带整合于染色体的目的基因的稳定细胞系也可通过与如gpt，G418或潮霉素的筛选标记共转染得到筛选。开始时使用一个以上的筛选标记是有利的，如G418和氨甲喋呤。
用限制酶BamH1消化质粒pC1，再按本领域所知的程序用牛胰磷酸酶去磷酸化。从1％的琼脂糖凝胶中分离载体。
编码VEGF-2，ATCC收录号97149的DNA序列是通过两个相应于5’和3’VEGF-2基因末端的引物PCR构建的：5’引物(5’-GAT CGA TCC ATC ATG CAC TCG CTG GGC TTC TTC TCTGTG GCG TGT TCT CTG CTC G-3’(SEQ ID NO：26))含有一个Klenow补平的BamH1位点和起始于起始密码子的40个核苷酸的VEGF-2编码序列；3’引物(5’-GCA GGG TAC GGA TCC TAGATT AGC TCA TTT GTG GTC TTT-3’〔SEQ ID NO：27〕)含有一个BamH1位点和不含终止密码子的16个VEGF-2编码序列的核苷酸。
PCR扩增的DNA片段按上述方法从1％琼脂糖凝胶中分离出来后用内切酶BamH1消化，再用1％琼脂糖凝胶纯化。分离片段和去磷酸化载体用T4连接酶连接。接着转染大肠杆菌HB101细胞并鉴定含质粒pC1的菌株。插入基因的序列和方向通过DNA测序鉴定。此结构命名为pC1VEGF-2。
6.构建pC4Sig VEGF-2 T103-L215
质粒pC4Sig是含有人IgGFc部分和蛋白信号序列的质粒pC4(收录号209646)。
为了进行聚合酶链式反应定点扩增和将VEGF-2T103-L215(图1中的氨基酸103-215或SEQ ID NO：18)亚克隆到pC4Sig，根据下列碱基合成互补于VEGF-2目的区段的两个寡核苷酸引物：
5’引物(BamH1和26个核苷酸的编码序列)：
5’-GCA GCA GGA TCC ACA GAA GAG ACT ATA AAA TTTGCT CG-3’(SEQ ID NO：34)
3’引物(Xbal，终止密码子，和15个核苷酸的编码序列)：
5’-CGT CGT TCT AGA TCA CAG TTT AGA CAT GCA TCGGCA G-3’〔SEQ ID NO：35〕
以本领域熟练技术人员熟知的标准条件进行聚合酶链式反应并以成熟VEGF-2〔氨基酸24-419〕，例如实施例3中构建的，为模板。产生的扩增产物用BamH1和XbaI限制消化并亚克隆到BamH1/XbaI消化的pC4Sig载体。
7.构建pC4Sig VEGF-2 T103-R227
为了进行聚合酶链式反应定点扩增和将VEGF-2 T103-L215(图1中氨基酸103-227或SEQ ID NO：18)亚克隆到pC4Sig上，根据下列碱基下列合成了互补于VEGF-2目的区段的两个寡核苷酸引物：
5’引物〔BamH1和26个核苷酸的编码序列〕：
5’-GCA GCA GGA TCC ACA GAA GAG ACT ATA AAA TTTGCT GC-3’〔SEQ ID NO：34〕
3’引物〔XbaI和21个核苷酸的编码序列〕：
5’-GCA GCA TCT AGA TCA ACG TCT AAT AAT GGA ATGAAC-3’〔SEQ ID NO：25。
以本领域熟练技术人员熟知的标准条件进行聚合酶链式反应并以成熟VEGF-2〔氨基酸24-419〕例如实施例3中构建的，为模板。产生的扩增产物用BamH1和XbaI消化并亚克隆到BamH1/XbaI消化的pC4Sig载体。
8.pC4 VEGF-2 M1-M263
表达载体pC4含鸟肉瘤病毒的强启动子〔LTR〕〔Cullen等，分子和细胞生物学，438-447〔三月，1985〕〕及一个CMV-增强子片段〔Boshart等，细胞41：521-530〔1985〕〕。多克隆位点，例如有限制酶切割位点BamH1，XbaI和Asp718，使得目的基因得到克隆。载体另含3N内含子，多聚腺苷酸和大鼠胰岛素原前体基因的终止信号。
在这个说明性实施例中，克隆的编码C-末端缺失的VEGF-2 M1-M263蛋白(图1中的氨基酸1-263或SEQ ID NO：18〕的DNA被插入质粒载体pC4中表达C-末端缺失的VEGF-2蛋白。
为了进行聚合酶链式反应定点扩增并将VEGF-2 M1-M263亚克隆到表达载体pC4，根据下列序列合成了互补于VEGF-2目的区段的两个寡核苷酸引物：
5’引物5’-GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCTGGG CTT CTT CTC-3’〔SEQ ID NO：28〕
3’引物5’-GAC TGG TAC CTT ATC ACA TAA AAT CTTCCT GAG CC-3’〔SEQ ID NO：29〕
在上述的5’引物中，构建了一个BamH1限制位点，而在3’引物中含一个Asp718限制位点。5’引物还含有6个核苷酸，20个核苷酸的VEGF-2编码序列。和与VEGF-2编码区邻近并框架相符的ATG序列使得大肠杆菌中的克隆片段得以表达，而3’引物含有2个核苷酸，20核苷酸的VEGF-2编码序列，和一个与VEGF-2编码区邻近且框架相符的终止密码子〔大肠杆菌优选使用的〕保证大肠杆菌中的正确终止。
用本领域熟练技术人员熟知的标准条件进行聚合酶链式反应定点扩增并以成熟VEGF-2〔氨基酸24-419〕为模板正如实施例3中构建的。产生的扩增产物用BamH1和Asp718限制消化并亚克隆到BamH1/Asp718消化的pC4蛋白表达载体上。此结构命名为pC4VEGF-2 M1-M263。
9.pC4 VEGF-2 M1-D311
在这个说明性实施例中，克隆的编码C-末端缺失的VEGF-2 M1-D311蛋白(图1中氨基酸1-311或SEQ ID NO：18)的DNA被插入到质粒载体pC4中表达C-末端缺失的VEGF-2蛋白。
为了进行聚合酶链式反应定点扩增并将VEGF-2 M1-D311亚克隆到表达载体pC4根据下列碱基序列合成互补于VEGF-2目的区段的两个寡核苷酸引物：
5’引物5’-GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCTGGG CTT CTT CTC-3’〔SEQ ID NO：30〕
3’引物5’GAC TGG TAC CTT ATC AGT CTA GTT CTT TGTGGG G-3’〔SEQ ID NO：31〕
上述的5’引物中构建了一个BamH1限制位点，而在3’引物中，构建了一个Asp718限制位点。5’引物也含有6个核苷酸，20个核苷酸的VEGF-2编码序列，和一个与VEGF-2编码区邻近且框架相符的ATG序列使得大肠杆菌中的克隆片段表达，然而3’引物含有2个核苷酸，20个核苷酸的VEGF-2编码序列，和一个与VEGF-2编码区邻近且框架相符的终止密码子〔大肠杆菌嗜好性〕保证大肠杆菌中的翻译终止。
以本领域熟练技术人员熟知的标准条件进行聚合酶链式反应并以成熟VEGF-2〔氨基酸24-419〕为模板，如实施例3中构建的。产生的扩增产物用BamH1和Asp718消化并亚克隆到BamH1/Asp718消化的pC4蛋白表达载体上。
10.构建pC4 VEGF-2 M1-Q367
在这个说明性实施例中，编码C-末端缺失的VEGF-2 M1-D311蛋白〔SEQ ID NO：18的氨基酸1-311〕的克隆DNA被插入到质粒载体pC4上表达C-末端缺失的VEGF-2蛋白。
为了进行聚合酶链式反应定点扩增并将VEGF-2 M1-D311亚克隆到表达载体pC4上，根据下列序列合成互补于VEGF-2目的区段的两个寡核苷酸引物：
5’引物5’-GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCTGGG CTT CTT CTC-3’〔SEQ ID NO：32〕
3’引物5’-GAC TGG TAC CTC ATT ACT GTG GAC TTTCTG TAC ATT C-3’〔SEQ ID NO：33〕
在上述的5’引物中构建了一个BamH1限制位点，而在3’引物中构建了一个Asp718限制位点。5’引物也含有6个核苷酸，20个核苷酸的VEGF-2编码序列，和一个与VEGF-2编码区邻近且框架相符的ATG序列使得大肠杆菌中的克隆片段得以翻译，然而3’引物含有2个核苷酸，20个核苷酸的VEGF-2编码序列，和一个与VEGF-2编码区邻近且框架相符的终止密码子〔大肠杆菌嗜好性〕保证大肠杆菌中的翻译终止。
以本领域熟练技术人员熟知的条件进行聚合酶链式反应并以成熟VEGF-2〔氨基酸24-419〕为模板，如实施例3中构建的。产生的扩增产物用BamH1和Asp718消化并亚克隆到BamH1/Asp消化的pC4蛋白表达载体上。此结构命名为pC4 VEGF-2 M1-Q367。
实施例10
VEGF-2蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达
实验设计
例如实施例4中构建的结构中的融合蛋白VEGF-2-HA的表达是根据如Harlow和其同事〔抗体：实验室手册，第二版：冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约〔1988〕〕描述的方法通过放射性标记和免疫共沉淀得到了检测。在结束前，转染后两天细胞在含有35S-半胱氨酸的培养基中孵育8小时得到标记。收集细胞和培养基，洗细胞再用含RIPA缓冲液的去垢剂裂解：150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTRIS，pH7.5，见Wilson和其同事的描述〔如上文〕。用一种HA特异性的单抗隆抗体从细胞裂解液和培养基中沉淀蛋白。通过SDS-PAGE和放射自显影分析沉淀的蛋白。
结果
如图16所示，pcDNA1 VEGF-2HA转染的细胞分泌一种56kd和30kd的蛋白。56kd的蛋白而不是30kd的蛋白也能在细胞裂解液中检测到，但在对照中可被显著地检测到。这说明30kd的蛋白可能是56kd的蛋白切割产生的。既然HA-标签在VEGF-2的C-末端，30kd的蛋白一定有被切割的蛋白的C-末端部分，而切割蛋白的N-末端通过免疫沉淀是检测不到的。这些数据说明VEGF-2蛋白在哺乳细胞中被分泌加工。
实施例11
VEGF-2对血管内皮细胞的刺激效应
实验设计
VEGF-2在高度血管化的组织过量表达。因此检查到VEGF-2的作用是调控几种类型的内皮细胞的增殖。
内皮细胞增殖测定
为了估测生长因子的促有丝分裂活性，用电子偶联试剂PMS〔phenazine硫酸盐〕进行MTS〔3-(4，5-二甲基噻唑-2-y1)〕-5-(3-羧甲基苯)-2(4-磺基苯)2H-四唑)比色法(细胞滴定仪96AQ，Promega)。在加有0.1mL补充血清的培养基的96孔板〔5,000细胞/孔〕中培养细胞，使得吸附过夜。在0.5％的FBS中血清饥饿12个小时，在有或没有肝素条件(存在于0.5％的FBS中的bFGF，VEGF165VEGF-2)下培养48小时。每孔中加入20mgMTS/PMS混合物〔1∶0.05〕并在ELISA平板计数仪中检测490nm吸收值前继续于37℃培养1小时。减去来自对照孔的背景吸收值〔一些培养基，无细胞)，每种条件进行一组7个孔。见Leak等，体外细胞发育生物学，30A：512-518〔1994)。
结果
VEGF-2刺激人脐带血管内皮细胞〔HUVEC〕增殖并对皮肤微血管内皮细胞有轻微刺激作用〔图17和18〕。VEGF-2对子宫内膜和微血管内皮细胞〔图19〕的刺激作用有较多说明。子宫内膜细胞〔HEEC〕对VEGF-2显示出极大反应〔VEGF对微血管内皮细胞有96％的作用〕。微血管内皮细胞〔HMEC〕对VEGF-2的反应相对VEGF为73％。HUVEC和BAEC(牛主动脉内皮细胞)对VEGF-2的反应分别低10％和7％。VEGF-2蛋白的活性在不同纯化流程中随某批对HUVEC增殖的刺激作用比其它的有显著性增高而改变。
实施例12
抑制PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖
VEGF-2在血管平滑肌细胞中表达较高。平滑肌是血管疾病的重要治疗目标，例如再狭窄。为了评估VEGF-2对平滑肌细胞的潜在作用，检测了VEGF-2对人主动脉平滑肌细胞〔HAoSMC〕增殖的作用。
实验设计
HAoSMC的增殖可以测定，例如BrdUrd公司即可。简单地说用CRP或FITC-标记的AT2-3LP转染生长于4-载玻片空腔的亚汇合的静止的细胞。然后用10％的小牛血清和6mg/mlBrdUrd脉冲细胞。24小时后，用BrdUrd染色试剂盒〔Zymed实验室〕进行免疫细胞化学反应。简言之，放入变性溶液后用结合生物素的鼠抗BrdUrd抗体于4℃孵育2小时再用链球菌抗生物素蛋白-过氧化物酶和二氨基联苯胺孵育。用苏木精复染后，将细胞放于载片上进行显微检查。以BrdUrd为线索计算BrdUrd阳性的细胞占总细胞的百分数。另外，BrdUrd染色〔核〕的模拟检测和FITC吸收〔细胞质〕伴随亮视野照明和暗视野荧光照明作用进行。参照，Hayashida等，生物化学杂志6：271〔36〕：219859-21992〔1996〕。
结果
VEGF-2有抑制PDGF诱导增殖平滑肌细胞的作用，但不是通过胎牛血清〔FBS〕。〔图20〕
实施例13：刺激血管内皮迁移
内皮细胞迁移是血管形成的一个重要步骤。
实验设计
此实施例将用来分析VEGF-2刺激淋巴内皮细胞迁移的可能性。目前，无此模型的出版报告。然而，我们将有必要按下述步骤使一个血管内皮细胞迁移的模型适用于淋巴内皮细胞的使用：
内皮细胞迁移分析是通过一个48孔微量化学趋化空板进行的〔Neuroprobe有限公司，Cabin John，MD；Flk，W.，Goodwin，R.H.J.，和Leonard，E.J.“迅速准确测量淋巴细胞迁移的48孔微量化学趋化集合”免疫学方法杂志1980；33：239-247〕。室温用0.1％明胶覆盖孔径大小是8um的无聚乙烯吡咯烷聚合碳酸滤膜至少6小时，并于无菌条件干燥。在补充了0.25％的小牛血清白蛋白〔BSA〕的M199中稀释待测物品至合适浓度，取最终的稀释液25ul于改良的Boyden仪的低空腔中。洗亚汇合的，早传代的〔2-6〕HUVEC或BMEC培养物并在最短时间进行所需的胰酶消化使细胞分离。在低空腔和高空腔之间放入滤膜后，在高空腔中加入悬浮有2.5×105个细胞的50ul含1％FBS的M199。在5％的CO2增湿空腔中37℃孵育5小时使细胞发生迁移。孵育结束取出滤膜用橡皮淀埽刮滤膜上面的非迁移细胞。将滤膜与甲醇混合并用Giemsa溶液染色〔Diff-Quick，Baxter，McGraw Park，IL〕。根据每个孔中的三个随机大功率区〔40X〕数出的细胞数确定迁移，而且所有的组进行四次
结果
在用一个48孔微量化学趋化腔检测HUVEC迁移的分析中，VEGF-2能刺激HUVEC的迁移〔21〕。
实施例14：刺激内皮细胞产生含氮氧化物
血管内皮释放的含氮氧化物被认为是血管内皮松弛的介导物。在内皮细胞对VEGF-1的应答中表明VEGF-1可诱导产生含氮氧化物。因此，VEGF-2的活力可通过确定内皮细胞应答VEGF-2时产生的含氮氧化物进行分析。
实验设计
经过24小时饥饿检测生长于96孔板中的汇合细胞的含氮氧化物并接着曝露于各种水平的VEGF-1和VEGF-2中4小时。通过应用Griess试剂检测经含氮氧化物衍生的硝酸盐诱导后的总硝酸盐确定培养基中由还原酶生成的含氮氧化物。VEGF-2对含氮氧化物释放的影响用HUVEC检测。
简言之，从培养的HUVEC单层中释放的NO通过NO-特异性并与NO计量器相连的极谱电极得到检测〔Iso-NO，世界精密仪器有限公司〕〔11049〕。根据下列公式进行NO元件的标测：
2KNO2+2KI+2H2SO462NO+I2+2H2O+2K2SO4
通过向含KI和H2SO4的校订溶液中添加梯度浓度的KNO2〔0，5，10，25，50，100，250，和500nmol/L〕得到标准校订曲线。Iso-NO电极对NO的特异性预先通过对权威NO气体的测定得以确定〔1050〕。去除培养基并用Dulbecco′s磷酸缓冲液生理盐水洗HUVECs两次。将细胞浸于6孔板中5ml过滤的Krebs-Hensileit溶液里，并将细胞培养板放于载玻片加温器上〔Lab Line仪器有限公司〕以使温度保持37℃。在加入不同的条件前将NO感受器垂直插于孔中使电极头保持于液面下2mm。以S-亚硝基乙酰青霉酸衍胺〔SNAP〕为阳性对照。释放的NO量表示为picomoles每1×106个内皮细胞。每组所报道的值是四到六次测定的平均值〔细胞培养孔数〕。参照，Leak等，生物化学和生物物理研究对话217：96-105〔1995〕。
结果
VEGF-2刺激HUVEC释放的含氮氧化物〔图22〕的水平高于VEGF。这说明VEGF-2可修饰血管通透性及血管扩张。
实施例15：血管生成中VEGF-2对索形成的影响
血管生成中的另一个步骤是索形成，标志着内皮细胞的分化。本生物测定检测了体外培养时微血管内皮细胞形成毛细管样结构〔中空结构〕的能力。
实验设计
作为增殖细胞的〔传代2〕CADMEC〔微血管内皮细胞〕购自细胞应用有限公司并培养于细胞应用公司的CADMEC生长培养基中，第5次传代时使用。为了进行体外血管生成分析用细胞应用公司的贴附因子培养基〔200ml/孔〕37℃覆盖一48孔细胞培养板30分钟。以7,500个细胞每孔将CADMEC播种于被覆盖的孔中并用生长培养基培养过夜。用含对照缓冲液或HGS蛋白〔0.1到100ng/ml〕的细胞应用公司的索形成培养基替换生长培养基，再培养48小时。毛细管样索的数量和长度通过Boeckeler VIA-170图象分析仪定量。所有的分析都重复了三次。
以商业〔R&D〕VEGF〔50ng/ml〕为阳性对照。b-esteradiol(11ng/ml)用作阴性对照。适当的缓冲液〔无蛋白〕也可用作对照。
结果
已观察到VEGF2抑制索形成与刺激内皮细胞增殖的IFNα相似(图23)。抑制效应可能是同步排斥索形成的内皮增殖的另一效应。
实施例16：血管生成对小鸡绒毛膜尿囊膜的影响
小鸡绒毛膜尿囊膜〔CAM〕是一个检测血管生成的已建立的很好的系统。CAM血管生成是易见的易于定量的。VEGF-2刺激CAM血管生成的能力得到检测。
实验设计
胚胎
White Leghorn小鸡的受精卵和日本鹌鹑(Coturnix cotunix)孵育于37.8℃，80％的湿度。用下列方法研究16天的小鸡的CAM和13天的鹌鹑胚胎。
CAM分析
在生长的第4天，在小鸡蛋的壳上做一个窗户。检查胚胎看是否生长正常，用纤维带密封该蛋。继续培养到13天。将thermanox载玻片〔Nunc，Naperville，IL〕剪成直径5mm的片状。将无菌不含盐的生长因子溶解于无菌水中并用移液枪加约3.3mg/5ml于圆片上。晾干后，将转化的圆片敷于CAM上。3天后，将样品固定于3％戊二醛和2％甲醛中，并用0.12M二甲胂盐缓冲液轻洗。用照相显微镜〔Wild M18〕拍照并如上述将其包埋做成半切片或超薄切片。空运载圆片作对照。
结果：
本数据表明VEGF-2在CAM测定中可刺激血管发生的能力是未经处理的对照组的9倍。然而，这种刺激作用仅是VEGF刺激水平的45％(图24)
实施例17：采用基质胶植入物的小鼠的血管发生测定
实验设计
为建立一种血管发生的体内模型以检测蛋白活性，向小鼠和大鼠皮下植入含有20mg BSA(阴性对照)或1mg bFGF和0.5mg VEGF(阳性对照)的甲基纤维素板。
看上去似乎BSA板基本上无血管生成作用，而阳性对照板则表现出血管形成的迹象。第9天时，一只小鼠表现出明显的bFGF反应。
结果
观察估计两种VEGF蛋白均显示可将基质胶的细胞构成能力提高2倍。
另有30只小鼠被植入含有BSA，bFGF，和不同数量的VEGF-1，VEGF-2-B8以及VEGF-2-C4。每只小鼠均被植入两个完全相同的甲基纤维素板，而不是一个对照和一个实验板。
所有回收的板的样品经Von Willebrand因子免疫染色以检测板上内皮细胞的存在，flk-1和flk-2用于区分血管内皮细胞和淋巴内皮细胞。然而，最终的组织化学分析仍不能确定是否为血管形成还是淋巴管形成。
实施例18：兔下肢模型中局部缺血的急救
实验设计
为研究VEGF-2对局部缺血的体内效应，如前所述(Takeshita，S.etal.，美国病理学杂志，147：1649-1660(1995))采用手术方法除去一只股动脉以创建一个兔下肢局部缺血模型。切除股动脉导致血栓逆向增生并堵塞外部髂动脉。因此，流向局部缺血肢体的血流依赖于从内部髂动脉生成的侧肢血管(Takeshita，S.Et al，美国病理学杂志，147：1649-1660(1995))。有一个10天的间隔以允许兔子手术后的恢复和内源性的髂动脉的发育。术后10天(第0天)进行基线血管摄片后，按如前所述的方法(Riessen，R.et al.人类基因治疗.4：749-758(1993)；Leclerc，G.et al.临床研究杂志，90：936-944(1992))用一种水凝胶包被的气囊导管通过动脉基因转移技术将500mg裸露的VEGF-2表达质粒转染到局部缺血肢体的内部髂动脉中。当VEGF-2用于治疗时，一个500mg剂量的VEGF-2蛋白或对照在一分钟内通过一个输液导管被导入局部缺血肢体的内部髂动脉中。第30天，测量这些兔子的各种参数。
结果
VEGF-2蛋白(图25，顶部)和裸露的表达质粒(图25，中部)均可在局部缺血肢体重建下列参数。重建血流，引入500mg质粒后血管造影的值似乎比引入500mg蛋白的结果略高一些(图25，底部)。其重建程度可同另一个实验中VEGF的效果(数据未列出)相比较。血管扩张器无法达到同样的效果，暗示血流重建不仅仅是由于血管扩张器的效应造成的。
1.BP比率(图25a)
局部缺血肢体同正常肢体的收缩压的血压比值
2.血流量和血流量储备(图25b)
Resting FL：非扩张状态下的血流量
Max FL：完全扩张状态下的血流量(也是一种间接的血管容量的测量方法)
血流量储备反映为Max FL同resting FL的比值。
3.血管造影术评分(图25c)
由侧肢血管的血管造影测量得到。其数值为在一个重叠的晶格中有交叉的不透明动脉的环的百分数除以兔子后股长度(m)。
4.毛细血管密度
从后肢取得的组织切片中得到的侧副毛细血管数。
正如讨论过的那样，VEGF-2被处理成一个N-末端和一个C-末端片段并共纯化。N-末端片段含有完整的假定功能区并可能具有生物学活性。
实施例19：VEGF-2对血管舒张的效果
如前所述，VEGF-2能刺激释放NO，一种血管内皮舒张的介质。由于血管内皮的舒张在降低血压中非常重要，对VEGF-2对原发性高血压大鼠(SHR)血压的影响进行了检测。VEGF-2导致剂量依赖性的舒张压下降(图26a和b)。当用药剂量为300mg/kg时，随着VEGF-2剂量的增加舒张压稳定下降，达到统计学差异。在这个剂量上观察到的变化与采用乙酰胆碱(0.5mg/kg)无差异。同样也观测到平均动脉压(MAP)的下降(图26c和d)。VEGF-2(300mg/kg)和乙酰胆碱使这些SHR动物的MAP降到正常水平。
此外，将剂量增加(0，10，30，100，300以及900mg/kg)的B8，C5，及C4制备的的VEGF-2对13-14周的原发行高血压大鼠(SHR)给药。数据表示为平均值+/-SEM。用配对t-检验性统计学分析，显著性水准定义为p＜0.05对单独的缓冲液反应。
对VEGF-2(C5制备)的研究显示尽管它显著地降低血压，但即使用药剂量为900mg/kg时其反应的程度仍比不上VEGF-2(B8制备)。
对VEGF-2(C4制备)的研究显示这种CHO表达的蛋白其制备产量与C5的相似(例如统计学上显著但产量远低于B8的制备)(见图26-A-D)。
作为对照，由于VEGF-2的C4和C5批量制备产量较少但统计学意义上能显著改变血压，对另一种CHO-表达的蛋白质，M-CIF进行了实验。对M-CIF给药的剂量从10～900mg/kg未对舒张压产生显著改变，在剂量为100和900mg/kg时观察到平均动脉压有一个统计学上显著的较小降低但未发现剂量效应。结果提示C4和C5批量制备的VEGF-2所观察到的血压降低是特异性的，例如，与VEGF-2相关。
实施例20：大鼠皮瓣局部缺血模型
实验设计
评估参数包括皮肤血流量，皮肤温度和第八因子免疫组织化学或内皮碱性磷酸酶反应。用原位杂交研究VEGF-2在皮肤局部缺血时的表达。
该模型的研究被分为如下三个部分：
a)局部缺血的皮肤
b)局部缺血的皮肤伤口
c)正常伤口
实验方案包括：
a)培养一个3×4cm，单蒂具全皮层的随机皮瓣(动物下背上的肌皮瓣)。
b)在局部缺血的皮肤(皮瓣)上的一个切除性伤口(直径为4-6mm)。
c)对切除性伤口(伤后第0，1，2，3，4天)用VEGF-2按下列不同的用药剂量范围局部处理：1mg到100mg。
d)伤后第3，5，7，10，14，21天收集创伤组织行组织学，免疫组织化学及原位杂交分析。
实施例21：周围动脉疾病模型
采用VEGF-2的生血管疗法已被发展成为一种新型的治疗策略可在周围动脉疾病导致的局部缺血时恢复血流量。
实验设计
实验方案包括：
a)结扎一侧的股动脉以产生局部缺血的后肢肌肉，另一侧的后肢作为对照。
b)VEGF-2蛋白，剂量范围为20mg～500mg，静脉或肌内注射，每周3次(可以更多)，2～3周。
c)于股动脉被结扎1，2，3周后收集缺血肌肉组织行VEGF-2表达及组织学分析。对于另一边对侧后肢的正常肌肉也进行活组织切片检查。
实施例22：心肌局部缺血疾病模型
VEGF-2被评价为一种潜在的有丝分裂原，在冠状动脉闭塞后能刺激侧副血管的发育，重建新生血管。原位研究VEGF-2表达量的改变。
实验设计
实验方案包括：
a)通过左侧胸廓切开术暴露大鼠心脏。紧接着用一稀疏缝合封闭左冠状动脉并关闭胸廓。
b)VEGF-2蛋白，剂量范围为20mg～500mg，静脉或肌内注射，每周3次(可以更多)，2～3周。
c)术后30天，摘除心脏并横切，进行形态特征及原位分析
实施例23：大鼠角膜创伤愈合模型
该动物模型显示VEGF-2对新生血管生成的效果。
实验设计
该实验方案包括：
a)从角膜中心到基质层切开一个1～1.5长的切口。
b)面向眼的外角在切口唇下插入一隔片。
c)做成一个囊(其基底距眼的边缘为1～1.5mm)。
d)在囊中放入一药片，含有50mg～500mg VEGF-2。
e)VEGF-2治疗也可以以20mg～500mg的剂量(每日给药，共5天)局部应用于角膜伤口。
实施例24：糖尿病小鼠和糖皮质激素受损的创伤愈合模型实验设计
该实验方案包括：
A.糖尿病db+/db+小鼠模型。
为证明VEGF-2可加速愈合过程，采用遗传性糖尿病小鼠模型的伤口愈合。db+/db+小鼠的全皮层创伤愈合模型是一个被广泛了解，与临床相关并可繁殖的受损创伤愈合模型。糖尿病的创伤愈合依赖于肉芽组织的形成和上皮的再形成而不是收缩(Gartner，M.H.etal.，外科研究杂志.52：389(1992)；Greenhalgh，D.G.et al.，美国病理学杂志，136：1235(1990))。
糖尿病动物具有很多II型糖尿病典型的特征。纯合子(db+/db+)小鼠比其正常的同窝出生的杂合仔畜更为肥大。突变体糖尿病(db+/db+)小鼠在其4号染色体上有一个单独的常染色体隐性突变(db+)(Coleman et al.美国科学院研究进展，77：283-293(1982))。动物表现为多食，多饮，多尿。突变体糖尿病小鼠(db+/db+)血糖升高，胰岛素水平增加或正常，且细胞介导的免疫受抑制。(Mandel etal.，免疫学杂志，120：1375(1978)；Debray-Sachs，M.Et al.，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol)，51(1)：1-7(1983)；Leiter et al.，美国病理学杂志，114：46-55(1985))。周围神经病，心肌并发症，微血管损伤，基底膜增厚和肾小球滤过异常在这些动物中都被描述过。(Norido F.et al.，实验神经学，83(2)：221-232(1984)；Roberson et al，糖尿病29(1)：60-67(1980)；Giacomelli et al.，实验室研究.40(4)：460-473(1979)；Coleman，D.L.，糖尿病31(增刊，suppl)：1-6(1982)).这些纯合子糖尿病小鼠发展成类似于人II型糖尿病的对胰岛素有抵抗的高血糖症(Mandel et al.，免疫学杂志120：1375-1377(1978))。
在这些动物中观察到的这些特征提示在这一模型中的治疗可能与治疗人类糖尿病中观察到的相似(Greenhalgh，et al.，美国病理学杂志.136：1235-1246(1990))。
动物
遗传性糖尿病雌性C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠和它们的非糖尿病同窝出生杂合仔畜(db+/+m)被用于此研究中(Jackson实验室)。这些动物出生6周时购买，8周时开始用于实验。动物单独笼养并随意获取食物和水。所有的操作均使用无菌工具进行。实验依照人体基因组科学有限公司、社会公共机构动物饲养与应用委员会和实验室动物饲养与应用指南的规则和指南进行。
外科创伤
创伤方案按照前面提到的方法实施(Tsuboi，T.And Rifkn，D.B.，实验医学杂志172：245-251(1990))。简要地，在创伤当天，腹膜内注射溶解在去离子水中的三溴乙醇，2，2，2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇使动物麻痹。将动物背脊剃毛并用70％乙醇溶液和碘酒洗涤皮肤。手术区域在创伤前用灭菌纱布擦干。用一Keyes组织穿孔器生成一个8mm的全皮层伤口。创伤后立即轻轻牵引周围皮肤以排除伤口扩张。在之后的实验中伤口保持开放。创伤当天开始连续5天进行局部治疗处理。治疗前，用灭菌的生理盐水和纱布棉拭子轻轻地清洁伤口。
手术当天及此后每隔两天观察检测伤口并在固定距离照相。第1-5天和第8天每天测量以判定伤口闭合。用校准的詹氏侧径器水平和垂直方向测量伤口。当观察不到肉芽组织且伤口被连续的上皮覆盖时认为伤口已愈合。
VEGF-2按一定范围的不同剂量给药，在赋形剂中每天每磅从4mg到500mg，共八天。赋形剂对照组则接受50ml赋形剂溶液。
第8天动物被腹膜注射戊巴比妥钠(300mg；/kg)。收集伤口及其周围皮肤用于组织学和免疫组织化学分析。组织样品置于活组织检查纱布间，放入有10％中性缓冲的福尔马林的组织盒中用于进一步的处理。
实验设计
三组动物每组10只(5只糖尿病和5只非糖尿病对照)用于评估：1)赋形剂安慰剂对照组，2)VEGF-2。
创伤面积的测量和闭合
通过测量伤口区域垂直轴和水平轴得到的总面积以分析创伤的闭合程度。再根据确定起始(第0天)和治疗后的(第8天)创伤面积的差异估计收缩程度。第1天的创伤面积为64mm2，即皮肤穿孔器对应的尺寸。根据下面公式进行计算：
[第8天开放面积]-[第1天开放面积]/[第1天开放面积]
组织学
样品固定于10％缓冲福尔马林中，石蜡包埋块被垂直切开到伤口表面(5mm)并用切片机切割。对剖开的伤口横截面进行常规的苏木精-伊红(H&E)染色。对伤口进行组织学检察以评估经KGF-2处理后，被修复的皮肤愈合过程及形态学上的外观是否有改变。评估包括确定细胞积聚，炎症细胞，毛细血管，成纤维细胞，上皮重新形成和表皮成熟的现象的存在(Greenhalgh，D.G.et al.，美国病理学杂志136：1235(1990))。由一个不知情的观察者采用透镜经校准的测微计测量。
免疫组织化学
上皮重新形成
采用ABC Elite检测系统对组织切片用多克隆兔抗人角蛋白抗体进行免疫组织化学染色。人皮肤用作阳性组织对照，非免疫IgG用作阴性对照。用校准镜头的测微计通过评估伤口的上皮重新形成的程度以判断角化细胞的生长。
细胞增殖标记
用ABC Elite检测系统的抗-PCNA抗体(1∶50)来表示皮肤样品中的增殖细胞核抗原/细胞周期蛋白(PCNA)。人结肠癌作为阳性组织对照而人大脑组织作为阴性组织对照。每一个样品包括一个未加一抗用非免疫的小鼠IgG代替的切片。将这些切片排序，基于增殖程度分为8类，较低等级一边表现有轻微的增殖，到更高等级表现为强烈的增殖。
统计学分析
采用非配对t检验对实验数据进行分析。P值小于0.05被认为具有显著性。
B.类固醇损害的大鼠模型
各种体内和体外系统已经充分证明类固醇对创伤愈合的抑制作用(Wahl，S.M.糖皮质激素和伤口愈合，抗炎症的类固醇作用：基础与临床方面。280-302(1989)；Wahl，S.M.et al.，免疫学杂志115：476-481(1975)；Werb，Z.et al.实验医学杂志147：1684-1694(1978))。糖皮质激素阻碍创伤愈合主要是通过抑制血管生成，降低血管渗透性(Ebert，R.H.，et al.，内科医学年鉴37：701-705(1952))，成纤维细胞增殖及胶原合成(Beck，L.S.et al.，生长因子5：295-304(1991)；Haynes，B.F.et al.，临床研究杂志61：703-797(1978))和产生瞬时诱导的循环单核细胞(Haynes，B.F.，et al.，临床研究杂志61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，“糖皮质激素和伤口愈合”，抗炎症的类固醇作用：基础与临床方面。学院出版社，纽约，280-302(1989))对受损的创伤愈合进行类固醇全身给药在大鼠中是一个比较常规的现象(Beck，L.S.et al.，生长因子5：295-304(1991)；Haynes，B.F.，et al.，临床研究杂志。61：703-797(1978)；wahl，S.M.，“糖皮质激素和伤口愈合”，抗炎症的类固醇作用：基础与临床方面。学院出版社，纽约，280-302(1989)；Pierce，G.G.etal.，美国科学院研究进展86：2229-2233(1989))。
为表明VEGF-2能加速愈合过程，对经过系统给药甲基强的松导致创伤受损的大鼠的全皮层切除皮肤创伤多次局部应用VEGF-2的效果进行评估。
动物
在本例中应用重约250～300g的年轻成年雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River实验室)。动物8星期大时购买，开始实验时为9星期。大鼠的愈合反应由于在受伤时甲基强的松(17mg/kg/只)的系统性给药而受损。动物单独笼养并随意获取食物、饮水。所有操作均用无菌技术完成。实验依照人类基因组科学公司、社会公共机构动物饲养与应用委员会和实验室动物饲养与应用指南的规则和指南进行。
外科创伤
创伤方案按照上面的A节中的方法。创伤当天，肌内注射氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)使动物麻醉。将动物背部区域剃毛并用70％乙醇和碘溶液清洗皮肤。手术区域在创伤前用无菌纱布擦干。用Keyes组织穿孔器生成一个8mm的全皮层的伤口。在试验中伤口保持开放。待测物质的应用从创伤当天开始随着甲基强的松的给药后即进行局部用药，每天一次，连续7天。处理前，用无菌生理盐水和纱布棉拭清洁伤口。
在创伤当天和治疗结束时观察检测伤口并在固定距离照相。第1-5天和第8天每天测量以判定伤口闭合。用校准的詹氏侧径器水平和垂直方向测量伤口。当观察不到肉芽组织且伤口被连续的上皮覆盖时认为伤口已愈合。
VEGF-2按一定范围的不同剂量给药，在赋形剂中每天每磅从4mg到500mg，共八天。赋形剂对照组则接受50ml赋形剂溶液。
第8天动物被腹膜注射戊巴比妥钠(300mg/kg)。收集伤口及其周围皮肤用于组织学和免疫组织化学分析。组织样品置于活组织检查纱布间，放入有10％中性缓冲的福尔马林的组织盒中用于进一步的处理。
实验设计
四组动物每组10只(5只加甲基强的松和5只无糖皮质激素)用于评估：1)不治疗组，2)赋形剂安慰剂对照组，3)VEGF-2治疗组。
创伤面积的测量和闭合
通过测量伤口区域垂直轴和水平轴得到的总面积以分析创伤的闭合程度。再根据确定起始(第0天)和治疗后的(第8天)创伤面积的差异估计收缩程度。第1天的创伤面积为64mm2，即皮肤穿孔器对应的尺寸。根据下面公式进行计算：
[第8天开放面积]-[第1天开放面积]/[第1天开放面积]
组织学
样品固定于10％缓冲福尔马林中，石蜡包埋块被垂直切开到伤口表面(5mm)并用切片机切割。对剖开的伤口横截面进行常规的苏木精-伊红(H&E)染色。对伤口进行组织学检察以评估经KGF-2处理后，被修复的皮肤愈合过程及形态学上的外观是否有改变。由一个不知情的观察者采用透镜经校准的测微计测量以判定创伤间隙的距离。
统计学分析
采用非配对t检验对实验数据进行分析。P值小于0.05被认为具有显著性。
实施例25：特异的多肽片断以产生VEGF-2单克隆抗体
构建了四种特异的肽(被设计为SP-40，SP-41，SP-42，SP-43)。这些肽将被用于产生单克隆抗体以分析VEGF-2。肽如下所示：
1.“SP-40”：MTVLYPEYWKMY(SEQ ID NO：18的70～81位氨基酸)
2.“SP-41”：KSIDNEWRKTQSMPREV(SEQ ID NO：18的120～136位氨基酸(注意在131位的C→S突变))
3.“SP-42”：MSKLDVYRQVHSIIRR(SEQ ID NO：18的212～227位氨基酸)
4.“SP-43”：MFSSDAGDDSTDGFHDI(SEQ ID NO：18的263～279位氨基酸)
实施例26：淋巴水肿动物模型
本实验研究的目的是创建一个适当且连续的淋巴水肿模型来检验在大鼠后肢中VEGF-2对淋巴管发生及淋巴循环系统重建的治疗作用。其效果根据测量被感染后肢肿胀的体积，对其淋巴脉管系统数量的量化，总血浆蛋白和组织病理学来衡量。急性淋巴水肿被观察7～10天。可能更重要的是，水肿的慢性发展应被观察多达3～4星期。
试验过程
手术开始前，抽取血样进行蛋白质浓度分析。重约～350g的雄性大鼠以戊巴比妥给药。随后，右腿从膝部到髋部剃毛。被剃毛部位用蘸了70％乙醇的纱布擦洗。抽取血样行血清总蛋白检测。标记2个测量标准(踵部向上约0.5cm，后肢中部)后，在向后肢注射染料前，进行其周长和体积测量。左右两肢的真皮内背均注射0.05ml 1％埃文思蓝(Evan’s Blue)。向肢内注射染料后，再进行周长和体积的测量。
以膝关节为标志，在腿的中部进行圆周状的腹股沟切开以对股骨的血管进行定位。用镊子和止血钳解剖并分离皮瓣。股骨的血管定位后，顺着血管分布且在其之下的淋巴管也被定位。再将该区域的主要淋巴管电凝结或缝合结扎。
借助于显微镜，腿后部的肌肉(在半肌腱和内收肌附近)被直接切开。腘淋巴结即被定位。再将两个近侧和两个远侧淋巴管以及腘淋巴结末梢血供给通过缝合而结扎。再切除结缔组织以除去腘淋巴结和与其相随的脂肪组织。
小心看护以控制任何由此操作导致的少量出血。淋巴被堵塞后，用液体皮肤(Vetbond)(AJ Buck)封闭皮瓣。分开的皮肤边缘被封闭到下面的肌肉组织中，沿腿留下一个约0.5cm的间隙。如有必要，也可通过缝合将皮肤锚定于在下面的肌肉上。
为避免感染，动物分笼单独饲养(无垫层)。对恢复之中的动物每天检查至最适水肿峰值，其通常发生于第5～7天。接着观察到平台期的水肿峰值为评价淋巴水肿的强度，我们在手术前及其后的7天每天测量每只后肢的2个指定部位的圆周长及体积。同时也研究了血浆蛋白质对淋巴水肿的影响以及判定蛋白质分析是否是一种有效的测试手段。对照及水肿后肢的重量在两个部位进行评估。以盲法进行分析。
圆周长测定：短暂的气体麻醉以防止后肢移动，用布卷尺测量后肢周长。由两个人均在踝骨和后肢进行测量，然后将两人的读数平均。对对照组和水肿后肢均进行读数。
体积测定：手术当天，将动物用戊巴比妥麻醉并在术前进行测量。对每天的体积测量，动物用三氟溴氯乙烷短暂麻醉(快速固定和快速恢复)，两条腿均被剃毛并用防水记号笔在腿上同等地做标记。首先将腿浸在水中，然后将其浸入仪器中，到每一个被标记的部位时用Buxcoedema软件(Chen/Victor)进行测量。一个人纪录数据，另一人将后肢浸至标记的区域。
血浆蛋白测量：在术前血液被抽出，离心并分离血清，再对总蛋白和Ca2+进行比较。
后肢重量比较：抽血后，准备对动物做组织收集。用quillitine将后肢切除，然后实验及对照的后肢在结扎处被切下并称重。第二次称重是在胫骨跟骨的关节脱落时称量其脚爪。
组织学标本：位于膝(腿弯部)后区域的横肌被解剖并被排列放置于充满冷冻凝胶(freezeGel)的金属模中，浸入冰冷的甲基丁烷中，放入标记的样品袋中置于-80EC中直至进行切片。切片时，将肌肉置于荧光显微镜下观察淋巴管。其他的免疫/组织学方法正在评价之中。
实施例27
用基因治疗产生VEGF-2多肽的治疗方法-体内法
本发明的另一方面是采用体内基因治疗方法治疗紊乱，疾病和病情。该基因疗法牵涉到向动物体内注射包含有与启动子相连可被控制的VEGF-2的裸露的核酸(DNA，RNA和反义DNA或RNA)以增加VEGF-2的表达。这类基因治疗和转移技术及方法已经为本领域所熟知，例如，WO90/11092，WO98/11779；U.S.Patent Nos.5693622，5705151，5580859；Tabata H.et al.(1997)心血管研究35(3)：470-479，Chao，J et al.(1997)药理学研究35(6)：517-522，Wolff，J.A.(1997)神经肌肉失调(Neuromuscul.Disord.)7(5)：314-318，Schwartz，B.et al.(1996)基因治疗3(5)：405-411，Tsurumi，Y.et al.(1996)循环94(12)：3281-3290(文献列于此处可供参考)。
可采用任何一种将注射用物质导入动物细胞的方法将VEGF-2多核苷酸构建物转入动物体内，例如注射至组织间质间隙(心脏，肌肉，皮肤，肺，肝脏，肠及类似的部位)。也可将VEGF-2多核苷酸构建物直接导入动脉。VEGF-2多核苷酸构建物可溶于药用液体或液相载体中后被导入。
术语“裸露的”多核苷酸，DNA或RNA，是指特定序列，它不带有任何帮助、促进和便于其进入细胞的运送载体，包括病毒序列，病毒颗粒，脂质体形成，Lipofectin脂质体和其它类似的沉淀试剂。然而，VEGF-2多核苷酸也可以在脂质体形成中被转运(例如在Abdallah B.et al.(1995)纽约科学院年报772：126-139及AbdallahB.et al.(1995)生物的细胞85(1)：1-7中所述)，该脂质体可以用熟悉本领域的人所熟悉的方法来制备。
本基因治疗方法中采用的VEGF-2载体构建体是一种比较理想的产物，它既不会整合到宿主的基因组中也不含有可自身复制的序列。与其他的基因治疗技术不同，将裸露的核酸序列导入至靶细胞中的一个主要优点在于细胞中多核苷酸合成的暂时性。研究表明非复制型DNA序列可被导入至细胞中并提供长达6个月的目的多肽的合成。
优选地，VEGF-2构建物包含可操纵地插入pVGI.1质粒中的一个VEGF-2多核苷酸，如图30所示。其序列示于图31A-G的PVGI.1质粒构建物，是在2000年7月3日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，马纳萨斯州大学道，VA20110-2209，邮编10801，保藏号为PTA-2185。此VEGF-2多核苷酸载体构建物可通过本领域已知的和上述方法导入组织中，优选通过用裸多核苷酸直接注射进行治疗。这种治疗性应用包括在治疗一些疾病和病变中促进血管生成，如上述“治疗用途”章节所述。此构建体优选的用途包括治疗急性肢体局部和冠心病。
VEGF-2构建物可被导入至动物体内的组织间质间隙中，包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝脏、脾脏、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨骼、软骨、胰腺、肾脏、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、直肠、神经系统、眼、腺以及结缔组织。组织间质间隙包括细胞间液、器官组织的网状纤维中的粘多糖基质、脉管壁或房室壁中的弹性纤维、纤维组织中的胶原纤维，在套有肌肉细胞的结缔组织或骨骼腔隙中的相同类型的基质。在有血液占据的循环系统和有淋巴液占据的淋巴系统的管道空间也是类似的。它们可通过注射被方便地导入至包含有这些细胞的组织中。尽管可导入至未分化或较不完全分化的细胞中并表达，如血干细胞或皮肤成纤维细胞，但最好是将其导入至分化的持续性非分裂细胞中并在其中表达。比较适合的是将它们直接注射至动脉中。
对于裸露的多核苷酸注射，DNA或RNA的有效剂量范围是从约0.05g/kg体重到50mg/kg体重。比较适宜的剂量范围是约0.005mg/kg到20mg/kg，更好的是从约0.05mg/kg到5mg/kg。当然，只要操作人员的常规技术允许，剂量范围可依照注射的组织部位不同而变化。核酸序列的合适及有效剂量可容易地根据常规操作的用量并依据治疗情况和给药方式来确定。首选的给药方式是通过非肠胃途径注射至组织间质间隙，或直接注射至动脉中。然而，也可采用其它的非肠胃途径，如吸入气溶胶制剂特别是用于给药至肺或支气管组织、咽喉和鼻黏膜。此外，也可通过血管成形术过程中采用的导管将裸露的VEGF-2构建物导入动脉中。
注射的VEGF-2多核苷酸构建物在体内动脉的剂量反应效果受下列因素决定。按照标准的重组DNA方法学制备适当的产生编码VEGF-2 mRNA的模板DNA。
模板DNA，可以是环状的也可是线性的，可以以裸露的DNA形式或与脂质体复合使用。随即可向兔子动脉注射各种不同剂量的模板DNA。
按实施例18中描述的那样通过手术方法诱导后肢局部缺血。紧接着，通过一个小的皮肤切口用3ml的注射器和2号针头向位于内收肌(2处)、中部大肌群(medial large muscles)(2处)和半膜肌(一处)共五个不同部位直接注射编码VEGF-2的质粒DNA。再用4.0号的尼龙线缝合伤口。
其治疗后肢局部缺血的能力是根据检测由被处理的后肢而得到的光学显微镜切片中的毛细血管的数目，并同后肢局部缺血但未经处理的兔子相比较，测量腓肠血压，以及动脉内多普勒导向导线测量的流量值(Takeshita et al.，临床研究杂志，93：662-670(1994)而决定的。对兔子的上述实验结果可用来推断在人和其他动物使用VEGF-2多核苷酸裸露DNA时适宜的剂量和其它的治疗参数。
实施例28：利用基因治疗-体外法的治疗方法
基因治疗的一种方法是将可以表达VDGF-2多核苷酸的成纤维细胞移植到病人身上。通常情况下，通过皮肤或组织检查从个体取得成纤维细胞。目的组织被置于组织培养基中并被分割成小块。小块的组织被置于组织培养瓶的潮湿表面上，每瓶中大约放置10块。将瓶子上下颠倒，密闭后置于室温过夜。室温下24小时后，将瓶子反转，组织块仍固定在培养瓶的底部并加入新鲜的培养基(例如，Ham F12培养基，含10％胎牛血清，青霉素及链霉素)再将培养瓶在37℃下温育大约一个星期。
这时，加入新鲜培养基，随后每隔几天即更换培养基。再培养大约两个星期后，产生一单层的成纤维细胞。该单层细胞经胰蛋白酶作用后被剥落至更大的培养瓶中。
PMV-7(Kirschmeier，P.T.，et al.，DNA，7：219-25(1988))，其两侧有莫洛氏肉瘤病毒的长末端重复序列，被EcoR I及Hind III消化后再用牛肠磷酸酶处理。线性化的载体在琼脂糖胶上分离并用玻璃珠进行纯化。
利用实施例1中分别对应于其5’和3’末端序列的第4组PCR引物可以扩增出编码VEGF-2的cDNA。最好是5’端引物含有一个EcoR I位点而3’端引物含有一个Hind III位点。在T4连接酶存在的情况下，将等量的莫洛氏鼠肉瘤病毒的线性化主链同扩增的EcoR I，Hind III片段加在一起。最终的混合物被保持在适于这两个片段连接的条件下。再将连接混合物用于转化细菌HB101，再铺板至含有卡那霉素的琼脂平板上培养以确证载体中含有正确插入的VEGF-2。
双亲性的pA317或GP+am12包装细胞在含有10％胎牛血清(CS)青霉素和链霉素的DMEM培养基中被培养至汇合密度。再将含有VEGF-2基因的MSV载体加入到培养基中，包装细胞即被该载体转导(transduced)。现在包装细胞可产生带有VEGF-2基因的有感染性的病毒颗粒(包装病毒现在被称为生产细胞)。
向被转导的生产细胞中加入新鲜的培养基，接着，从10cm培养皿的汇合细胞培养中收获培养基。用过的培养基，其中含有具感染性的病毒颗粒，经微孔过滤器过滤以除去分离的生产细胞后再将该培养基用于感染成纤维细胞。除去培养至亚汇合密度的成纤维细胞培养板中的培养基，立即代之以来自于生产细胞的培养基。除去该培养基后再换成新鲜的培养基。如果病毒滴度较高，则事实上所有的成纤维细胞都会被感染，无须进行选择。如果病毒滴度非常低，则必须用一种带有选择性标记如新霉素或组氨酸的逆转录载体。一旦成纤维细胞被有效地感染，及对成纤维细胞进行分析以确定VEGF-2蛋白是否被合成。
被处理的成纤维细胞即可单独亦可在cytodex3微载体珠上生长至汇合程度时被移植到宿主。
实施例29：利用同源重组基因治疗的治疗方法
依照本发明的另一种基因治疗的方法包括将内源性的VEGF-2序列通过所描述过的同源重组法与一个启动子相连，如公布于1997年7月24日的美国专利第5641670号；发表于1996年9月26日的国际公告第WO 96/29411号；公布于1994年8月4日的国际公告第WO 94/12650号；Koller et a1.，美国科学院研究进展，86：8932-8935(1989)；Zijlstra et al.，自然，342：435-438(1989)。该方法涉及到一个存在于靶细胞中但不表达或表达水平低于预期目标的基因的激活，
多核苷酸构建物被构建成含有一个启动子和及其周围的靶序列，该序列与内源性VEGF-2的5’非编码序列同源。该靶序列距VEGF-2的5’末端近得足以使得在同源重组过程中该启动子序列同此内源性序列相连。该启动子和靶序列可用PCR进行扩增。最好是被扩增的启动子在其5’和3’端具有独特的限制性酶切位点。且第一个靶序列的3’端含有与被扩增的启动子5’端相同的限制性酶切位点，第2个靶序列的5’端含有与被扩增的启动子3’端相同的限制性酶切位点。
用适当的限制性内切酶消化扩增的启动子及靶序列并随之用牛肠磷酸酶处理。在T4DNA连接酶存在的情况下将消化后的启动子和靶序列加在一起。最终的混合物被保持在适于这两个片段连接的条件下。产物通过琼脂糖凝胶电泳进行大小分离并经酚抽提和乙醇沉淀进行纯化。
在本实施例中，多核苷酸构建产物通过电穿孔以裸多核苷酸的形式被导入细胞中。然而，该多核苷酸构建产物也可以用转染辅助试剂被引入到细胞中，如脂质体、病毒序列、病毒颗粒、沉淀剂等。这些转移方法在本领域中为人所熟知。
一旦细胞被转染，即会发生同源重组，可使启动子被连接到内源的VEGF-2序列。这导致VEGF-2在细胞中的表达。可通过免疫染色或其它本领域中所熟知的方法来检测表达。
成纤维细胞是从个体通过皮肤或组织检查而得到的。最终的组织被置于DMEM+10％胎牛血清中。指数生长及早静止相的成纤维细胞经胰蛋白酶消化并用培养基从塑料表面上冲洗下来。取一定量的细胞悬浮液用于计数，其余的细胞用于离心。吸去上清，在5ml电穿孔缓冲液(20mM HEPES，pH7.3，137mM NaCl，5mM KCl，O.7mMNa2HPO4，6mM葡萄糖)中重悬沉淀。将细胞离心，吸去上清，将细胞重悬于含有1mg/ml乙酰牛血清白蛋白的电穿孔缓冲液中。最终的细胞悬浮液中含有大约3×106细胞/ml。悬浮后立即进行电穿孔。
按标准方法制备质粒DNA。为构建靶定到VEGF-2位点的质粒，用Hind III消化质粒pUC18(MBI Fermentas，Amherst，NY)。CMV启动子通过PCR方法进行扩增，其5’末端有一Xba I位点而3’端有一BamH I位点。通过PCR扩增出两个VEGF-2非编码序列：一个VEGF-2非编码序列(VEGF-2片段1)扩增时其5’端有一个HindIII位点而3’端有一个Xba I位点；另一个VEGF-2非编码序列(VEGF-2片段2)扩增时其5’端有一BamH I位点而3’端有一HindIII位点。CMV启动子和VEGF-2片段经适当的酶消化后(CMV启动子-Xba I和BamH I；VEGF-2片段1-Xba I；VEGF-2片段2-BamHI)在一起连接。最终的连接产物经Hind III处理后与Hind III消化的pUC18质粒连接。
质粒DNA被加到一个O.4cm电极间隔的无菌电转杯(Bio-Rad)中。DNA终浓度一般至少为120μm/ml。再向杯中加入O.5ml细胞悬液(含有约1.5×106个细胞)，将细胞悬液和DNA溶液轻轻混匀。用一Gene-Pulser仪(Bio-Rad)进行电穿孔。电容及电压分别设定在960μF和250～300V。当电压增加时，细胞存活下降，存活细胞中导入DNA稳定插入到基因组的细胞百分数显著增加。在这些给定的参数条件下，应观察到约为14～20毫秒的脉冲时间。
电穿孔后的细胞在室温放置约5分钟后，将杯中的混和液轻轻的用一无菌的移液管移走。将细胞直接加入到一个1Ocm皿中的10ml预热培养基(DMEM，含有15％胎牛血清)中并在37℃下温育。第二天，吸去培养基代之以10ml新鲜培养基并再温育16～24小时。
被处理的成纤维细胞即可单独亦可在cytodex3微载体珠上生长至汇合程度时被注射到宿主体内。
实施例30：VEGF-2转基因动物
VEGF-2多肽也可在转基因动物中被表达。任何一种动物，包括但不仅限于，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、母牛及非人的灵长类如狒狒、猴子和黑猩猩可用于构建转基因动物。在一个特殊的实施例中，作为一个基因治疗方案的一部分，本文所描述的或其它本领域中熟知的技术被用于在人体中表达本发明的多肽。
任何本领域中熟知的技术均可用于将转基因(例如，本发明中的多核苷酸)引入动物体内以产生转基因动物的始祖系。这些技术包括但不仅限于，前核微注射(Paterson et al.，应用微生物技术，40：691-698(1994)；Carver et al.，生物技术(纽约，NY)11：1263-1270(1993)；Wright et al.，生物技术(纽约，NY)9：830-834(1991)；Hoppe et al.，美国专利第4873191号(1989))；逆转录病毒介导的将基因转移至干细胞系(Van der Putten et al.，美国科学院研究进展，82：6164～6152(1985))胚囊或胚胎；基因靶向至胚胎干细胞中(Thompson et al.，细胞，56：313～321(1989))；细胞或胚胎的电穿孔(Lo，1983，分子细胞生物学，3：1803～1814(1983))；用基因枪将本发明中的多核苷酸导入法(见例，Ulmer et al.，科学，259：1745(1993))；将核酸构建产物导入胚胎多能干细胞并将干细胞转回至胚囊中；精子介导的基因转移(Lavitrano et al.，细胞，57：717～723(1989))；等等。对这类技术的回顾，参见Gordon，“转基因动物”国际细胞学综述115：171～229(1989)，附此可供参考。
任何本领域中熟知的技术均可用于产生含有本发明的多核苷酸的转基因克隆，例如，将来自于被培养诱导至静止期的胚胎，胎儿，或成熟细胞的细胞核移植入去核的卵母细胞中(Campell et al.，自然，380：64～66(1996)；Wilmut et al.，自然385：810～813(1997))。
本发明提供了所有细胞均携带有转移基因的转基因动物，也有部分而不是全部细胞携带有转移基因的动物，例如镶嵌型和嵌合体动物。转移基因可以以单个转移基因的形式也可以多拷贝的形式如在多联体中头-头串联或头-尾串联形式被整合。转移基因也可按下面的方法被选择性地引入特定的细胞类型中并被激活，例如：Lasko等的讲义(Lasko et al.，美国科学院研究进展89：6232～6236(1992))。这种细胞类型特异性激活所需的调控序列视目的特定细胞类型而定并可见于本领域的常用技术中。当希望该多核苷酸转移基因被整合入染色体的内源基因位点时，推荐采用基因导向技术。
简单地说，当类似的技术被应用时，为通过与染色体序列的同源重组而整合入并破坏内源基因核苷酸序列的功能，设计了含有与内源基因同源的核苷酸序列的载体。转移基因可按照下面的方法被选择性地引入一种特定的细胞类型，从而仅在该类型细胞中使内源性基因失活，例如Gu的讲义(Gu et al.，科学，265：103-106(1994))。这种细胞类型特异性的失活所需的调控序列视目的特定细胞类型而定并可见于本领域的常用技术中。
一旦产生出转基因动物，可用标准技术来测定重组基因的表达。起始检测可通过Southern印迹斑点杂交分析和PCR技术来分析动物组织以确定发生了转移基因的整合。转基因动物组织中转移基因的mRNA表达水平可用下列技术确定，这些技术包括但不仅限于，对来自于动物的组织样品的Northern印迹杂交分析，原位杂交分析，逆转录-PCR(rt-PCR)。转基因的基因表达组织样品也可用特异性的转移基因产物的抗体进行免疫细胞化学或免疫组化分析。
一旦产生了原始的动物模型，即可进行繁殖、自交、远系繁殖或杂交以产生特定动物的克隆系。类似的繁殖策略包括但不仅限于，将原始动物模型同超过一种整合位点的动物进行远系杂交以建立不同的种系；不同种系的自交以产生复合的转基因动物，由于每个转移基因表达的添加效应可更高水平地表达转移基因；杂合转基因动物之间的杂交以产生给定位点上的杂合动物不但可以增加表达也可以避免进行DNA分析来筛选动物；不同种系之间的杂交以产生复合的杂合系和纯合系；繁殖动物以将转移基因置于一个独特的适用于目的实验模型的背景中。
本发明的转基因动物的应用包括但不仅限于，用于阐述VEGF-2多肽生物功能的动物模型系统，研究与VEGF-2表达异常相关的病情和/或病症，以及筛查能有效改善这些病情和/或病症的化合物。
实施例31：VEGF-2敲除动物
也可以通过利用靶向同源重组的方法失活或“敲除”VEGF-2基因和/或其启动子来降低内源性VEGF-2基因的表达(例如，见Smithies et al.，自然，217：230～234(1985)；Thomas & Capecchi，细胞，51：503～512(1987)；Thompson et al.，细胞，5：313-321(1989)；各文献附此可供参考)。例如，可采用本发明中的一个突变，无功能的多核苷酸(或一个完全无关的DNA序列)其两侧同与内源性多核苷酸序列同源的DNA相连(可以是基因的编码区或调控区域)，带有或不带有选择性标记和/或阴性选择标记，来转染胞内可表达本发明多肽的细胞。在另一个实施例中，采用本领域熟知的技术来产生含有但不表达目的基因的敲除细胞。通过靶向同源重组的DNA构建产物插入导致靶基因的失活。这些方法特别适用于研究及农业领域，在这些领域中胚胎干细胞可被用于产生带有失活靶基因的动物后代(例如，见Thomas & Capecchi 1987以及Thompson 1989，supra)。然而，如果利用适当的本领域技术中所常见的病毒载体将重组DNA构建产物在体内引导或导向至所需位点，可将此方法进行常规改进以用于人体。
在本发明的其它实施例中，将经遗传改造以表达本发明的多肽的细胞或经遗传改造后不表达本发明多肽的细胞(例如，敲除)经体内法导入患者。这类细胞可来源于患者(如，动物，包括人)或一个MHC相容的供体且能包括但不仅限于成纤维细胞、骨髓细胞、血细胞(例如，淋巴细胞)、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞等。采用重组DNA技术将本发明多肽的编码序列引入细胞内，也可以破坏编码序列和/或内源的与本发明多肽相联系的调控序列对细胞进行遗传改造，例如，通过转导(用病毒载体，最好是将转移基因整合至细胞基因组的载体)或转染过程，包括但不仅限于，利用质粒、粘粒、酵母人工染色体(YACs)、裸露的DNA、电穿孔、脂质体等。本发明多肽可被置于强的基本或可诱导启动子或启动子/增强子的控制之下以进行表达，最好是分泌VEGF-2多肽。表达且最好能分泌本发明多肽的经改造的细胞可被系统地引入病人体内，例如，在循环系统中或腹膜内。
另一种选择是，可将细胞混入基质中并移植到机体内，例如，经遗传改造的成纤维细胞能作为皮肤移植物的一部分被移植到体内；经遗传改造的内皮细胞可作为淋巴管或血管移植物的一部分被移植。(见，例如，Anderson et al.，美国专利第5399349号；及Mulligan& Wilson，美国专利第5460959号；各文献附此可供参考)
当被引入细胞为非自体型或非MHC相容细胞时，可用熟知的能防止宿主发展对导入细胞的免疫反应的技术将其引入。例如，可将细胞引入到一个胶囊的形态中，该形态可允许同直接接触的胞外环境进行成分交换，但不会使被引入的细胞被宿主的免疫系统所识别。本发明中的敲除动物的用途包括但不仅限于，用于阐明VEGF-2多肽生物学功能的动物模型系统，研究同VEGF-2表达异常相关的病情和/或病症，以及筛选可有效地改善这类病情和/或病症的化合物。
根据上文所述，本发明还可能有许多改进和变化，此外，在后续的权利要求的范围内，本发明可以以不同于特定描述的方式来实施。
本文中公开的所有引用的出版物(包括专利、专利申请、期刊文章、实验手册、书或者其他文献)均被附此以供参考。序列表
                        序列表<110>人体基因组科学有限公司<120>血管内皮生长因子-2<130>PF112P6PCT<150>60/223,276<151>2000-08-04<160>36<170>patentIn version 3.0<210>1<211>1674<212>DNA<213>homo sapiens<400>1gtccttccac catgcactcg ctgggcttct tctctgtggc gtgttctctg ctcgccgctg      60cgctgctccc gggtcctcgc gaggcgcccg ccgccgccgc cgccttcgag tccggactcg     120acctctcgga cgcggagccc gacgcgggcg aggccacggc ttatgcaagc aaagatctgg     180aggagcagtt acggtctgtg tccagtgtag atgaactcat gactgtactc tacccagaat     240attggaaaat gtacaagtgt cagctaagga aaggaggctg gcaacataac agagaacagg     300ccaacctcaa ctcaaggaca gaagagacta taaaatttgc tgcagcacat tataatacag     360agatcttgaa aagtattgat aatgagtgga gaaagactca atgcatgcca cgggaggtgt     420gtatagatgt ggggaaggag tttggagtcg cgacaaacac cttctttaaa cctccatgtg     480tgtccgtcta cagatgtggg ggttgctgca atagtgaggg gctgcagtgc atgaacacca     540gcacgagcta cctcagcaag acgttatttg aaattacagt gcctctctct caaggcccca     600aaccagtaac aatcagtttt gccaatcaca cttcctgccg atgcatgtct aaactggatg     660tttacagaca agttcattcc attattagac gttccctgcc agcaacacta ccacagtgtc     720aggcagcgaa caagacctgc cccaccaatt acatgtggaa taatcacatc tgcagatgcc     780tggctcagga agattttatg ttttcctcgg atgctggaga tgactcaaca gatggattcc     840atgacatctg tggaccaaac aaggagctgg atgaagagac ctgtcagtgt gtctgcagag     900cggggcttcg gcctgccagc tgtggacccc acaaagaact agacagaaac tcatgccagt     960gtgtctgtaa aaacaaactc ttccccagcc aatgtggggc caaccgagaa tttgatgaaa    1020acacatgcca gtgtgtatgt aaaagaacct gccccagaaa tcaaccccta aatcctggaa    1080aatgtgcctg tgaatgtaca gaaagtccac agaaatgctt gttaaaagga aagaagttcc    1140accaccaaac atgcagctgt tacagacggc catgtacgaa ccgccagaag gcttgtgagc    1200caggattttc atatagtgaa gaagtgtgtc gttgtgtccc ttcatattgg caaagaccac    1260aaatgagcta agattgtact gttttccagt tcatcgattt tctattatgg aaaactgtgt    1320tgccacagta gaactgtctg tgaacagaga gacccttgtg ggtccatgct aacaaagaca    1380aaagtctgtc tttcctgaac catgtggata actttacaga aatggactgg agctcatctg    1440caaaaggcct cttgtaaaga ctggttttct gccaatgacc aaacagccaa gattttcctc    1500ttgtgatttc tttaaaagaa tgactatata atttatttcc actaaaaata ttgtttctgc    1560attcattttt atagcaacaa caattggtaa aactcactgt gatcaatatt tttatatcat    1620gcaaaatatg tttaaaataa aatgaaaatt gtatttataa aaaaaaaaaa aaaa          1674<210>2<211>419<212>PRT<213>homo sapiens<400>2Met His Ser Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1               5                   10                  15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe
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130                 135                 140Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys145                 150                 155                 160Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu
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            85                  90                  95Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser Cys Arg Cys Met Ser Lys
        100                 105                 110Leu<210>19<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(30)<223>含有NdeI位点的5′PCR寡核苷酸引物.<400>19gcagcacata tgacagaaga gactataaaa                                      30<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(30)<223>含有Asp 718位点的3′PCR寡核苷酸引物.<400>20gcagcaggta cctcacagtt tagacatgca                                       30<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(30)<223>含有Asp 718I位点的5′PCR寡核苷酸引物.<400>21gcagcaggta  cctcaacgtc taataatgga                                      30<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(30)<223>含有BamHI位点的5’PCR寡核苷酸引物.<400>22gcagcaggat cccacagaag agactataaa                                       30<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><22l>primer_bind<222>(1)..(30)<223>含有XbaI位点的3’PCR寡核苷酸引物.<400>23gcagcatcta gatcacagtt tagacatgca                                       30<210>24<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><221>protein_bind<222>(1)..(39)<223>含有BamHI位点的5’PCR寡核苷酸引物.<400>24gcagcaggat cccacagaag agactataaa atttgctgc                             39<210>25<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(36)<223>含有XbaI位点的3′PCR寡核苷酸引物.<400>25gcagcatcta gatcaacgtc taataatgga atgaac                              36<210>26<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(55)<223>含有Klenow补平的BamHI位点的5′PCR寡核苷酸引物<400>26gatcgatcca tcatgcactc gctgggcttc ttctctgtgg cgtgttctct  gctcg        55<210>27<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(39)<223>含有BamHI位点的3′PCR寡核苷酸引物.<400>27gcagggtacg gatcctagat  tagctcattt  gtggtcttt                         39<210>28<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(39)<223>5′PCR寡核苷酸引物.<400>28gactggatcc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc                           39<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(35)<223>3′PCR寡核苷酸引物.<400>29gactggtacc ttatcacata aaatcttcct gagcc                               35<210>30<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(39)<223>5′PCR寡核苷酸引物.<400>30gactggatcc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc                           39<210>31<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(3 4)<223>3′PCR寡核苷酸引物.<400>31gactggtacc ttatcagtct agttctttgt gggg                                34<210>32<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(39)<223>5′PCR寡核苷酸引物.<400>32gactggatcc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc                            39<210>33<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(37)<223>3′PCR寡核苷酸引物.<400>33gactggtacc tcattactgt ggactttctg tacattc                             37<210>34<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(38)<223>含有BamHI位点的5′PCR寡核苷酸引物.<400>34gcagcaggat ccacagaaga gactataaaa tttgctgc                              38<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><221>primer_bind<222>(1)..(36)<223>含有XbaI位点的3′PCR寡核苷酸引物.<400>35cgtcgttcta gatcacagtt tagacatgca tcggca                                36<210>36<211>5283<212>DNA<213>homo sapiens<400>36aagcttgacc ttatgcgact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat      60taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg     120gggatttcca agtctccacc ccactgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca     180acgagacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtagggc     240aacatgctta tgtaacggtg agttagcaac atgccttata aggagagaaa aagcaccgtg     300catgccgatt ggtgggagta aggtggtatg atcgtggtat gatcgtgcct tgttaggaag     360gcaacagacg ggtctaacac ggattggacg aaccactgaa ttccgcattg cagagatatt     420gtatttaagt gcccagctcg atacaataaa cgccatttga ccattcacca cattggtgtg     480cacctgggtt gggatcgatc catcatgcac tcgctgggct tcttctctgt ggcgtgttct     540ctgctcgccg ctgcgctgct cccgggtcct cgcgaggcgc ccgccgccgc cgccgccttc     600gagtccggac tcgacctctc ggacgcggag cccgacgcgg gtgaggccac ggcttatgca     660agcaaagatc tggaggagca gttacggtct gtgtccagtg tagatgaact catgactgta     720ctctacccag aatattggaa aatgtacaag tgtcagctaa ggaaaggagg ctggcaacat     780aacagagaac aggccaacct caactcaagg acagaagaga ctataaaatt tgctgcagca     840cattataata cagagatctt gaaaagtatt gataatgagt ggagaaagac tcaatgcatg     900ccacgggagg tgtgtataga tgtggggaag gagtttggag tcgcgacaaa caccttcttt     960aaacctccat gtgtgtccgt ctacagatgt gggggttgct gcaatagtga ggggctgcag    1020tgcatgaaca ccagcacgag ctacctcagc aagacgttat ttgaaattac agtgcctctc    1080tctcaaggcc ccaaaccagt aacaatcagt tttgccaatc acacttcctg ccgatgcatg    1140tctaaactgg atgtttacag acaagttcat tccattatta gacgttccct gccagcaaca    1200ctaccacagt gtcaggcagc gaacaagacc tgccccacca attacatgtg gaataatcac    1260atctgcagat gcctggctca ggaagatttt atgttttcct cggatgctgg agatgactca    1320acagatggat tccatgacat ctgtggacca aacaaggagc tggatgaaga gacctgtcag    1380tgtgtctgca gagcggggct tcggcctgcc agctgtggac cccacaaaga actagacaga    1440aactcatgcc agtgtgtctg taaaaacaaa ctcttcccca gccaatgtgg ggccaaccga    1500gaatttgatg aaaacacatg ccagtgtgta tgtaaaagaa cctgccccag aaatcaaccc    1560ctaaatcctg gaaaatgtgc ctgtgaatgt acagaaagtc cacagaaatg cttgttaaaa    1620ggaaagaagt tccaccacca aacatgcagc tgttacagac ggccatgta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(PCT细则13之二)PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号97149加拿大
申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威
申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚
申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰
申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国
申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦
申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典
申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰
申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明
(PCT细则13之二)PCT/RO/134表(1992年7月)ATCC保藏号75698加拿大
申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威
申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚
申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰
申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国
申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦
申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典
申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起16个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰
申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。关于微生物保藏的说明
(PCT细则13之二)
A.对说明书第            页，第         行所述的微生物的说明。
B.保藏事项                                              其它保藏在补充页中口
保藏单位名称美国典型培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号(20110-2209)
保藏日期2000年7月3日 保藏编号PTA-2185
C.补充说明(必要时)                                       本栏有补充页口
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
欧洲对于欧洲专利指定，保藏微生物的样品仅在欧洲专利授权公告时或申请被驳回、撤回或视为撤回时才提供，这种样品仅提供给需要样品的人指明的专家(EPC第28款(4))。
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
PCT/RO/134表(2001年1月)ATCC保藏号PTA-2185加拿大
申请人请求专利局长仅当基于一项申请的加拿大专利被授权时或者该申请被驳回或放弃或不再恢复或被撤回时，才授权将该申请中提及的保藏的生物材料的样品提供给由局长指明的独立专家，申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局。挪威
申请人在此请求仅当申请被公开(由挪威专利局)或最终由挪威专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据挪威专利法第22款和33(3)款公开时递交到挪威专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是挪威专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。澳大利亚
申请人在此指出微生物样品仅在专利授权前或在专利申请被放弃、拒绝或撤回前提供给在本发明中没有利益的熟练技术人员(澳大利亚专利法3.25(3)款)。芬兰
申请人在此请求仅当申请被公开(由国家专利局)或最终由国家专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。联合王国
申请人在此请求仅向专家提供微生物样品。申请人必须在国际申请公布的技术准备完成之前以书面声明形式通知国际局有关此项请求。丹麦
申请人在此请求仅当申请被公开(由丹麦专利局)或最终由丹麦专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应由申请人在不迟于根据丹麦专利法第22款和33(3)款公开时递交到丹麦专利局。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是丹麦专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。瑞典
申请人在此请求仅当申请被公开(由瑞典专利局)或最终由瑞典专利局决定不予公开时，才向本领域专家提供样品。此项请求应在优先权日起1 6个月内递交到国际局(最好用PCT申请人指南卷I附件Z中的表格PCT/RO/134)。如果申请人递交了这种请求，第三方提出的要求提供样品的请求需指明所使用的专家。专家可以是瑞典专利局认可的专家名单上的任何人或个案中申请人同意的任何人。荷兰
申请人请求仅当荷兰专利被授权时或者该申请被拒绝或撤回或失效时，才能根据专利法31F(1)款将样品提供给专家。此项请求必须由申请人在根据荷兰王国专利法第22C款或25款公开前递交到荷兰工业产权局，以两者中较早日为准。

Claims (18)

1.一种分离的核酸分子，其包含图31所示的pVGI.1表达载体构建体。
2.一种包含权利要求1的分离的核酸分子的组合物。
3.一种产生宿主细胞的方法，包括用权利要求1的核酸分子转导，转化或转染宿主细胞。
4.通过权利要求3的方法产生的宿主细胞。
5.一种包含权利要求1的核酸分子的宿主细胞。
6.一种治疗患者的方法，包括为患者施用权利要求1的核酸分子。
7.权利要求6的方法，其中所述患者患有慢性肢体局部缺血。
8.权利要求6的方法，其中所述患者患有心肌缺血。
9.权利要求6的方法，其中所述患者患有选自以下一组的疾病或失调：
a.自身免疫疾病；
b.过敏反应或症状；
c.器官排斥；
d.炎症；
e.过度增殖性疾病；
f.病毒感染所致疾病；
g.细菌感染所致疾病；
h.真菌感染所致疾病；
i.寄生虫感染所致疾病；
j.心血管疾病；
k.心律失常；
l.心瓣膜疾病；
m.心肌病；
    n.心肌缺血；
    o.动脉瘤；
    p.动脉闭合疾病；
    q.脑血管疾病；
    r.栓塞；及
    s.缺血。
10.一种分离的核酸分子，其包含ATCC保藏号PTA-2185所包含的pVGI.1表达载体构建体。
11.一种包含权利要求10的分离的核酸分子的组合物。
12.一种产生宿主细胞的方法，包括用权利要求10的核酸分子转导，转化或转染宿主细胞。
13.通过权利要求12的方法产生的宿主细胞。
14.一种包含权利要求10的核酸分子的宿主细胞。
15.一种治疗患者的方法，包括为患者施用权利要求10的核酸分子。
16.权利要求15的方法，其中所述患者患有慢性肢体局部缺血。
17.权利要求15的方法，其中所述患者患有心肌缺血。
18.权利要求15的方法，其中所述患者患有选自以下一组的疾病或失调：
    a.自身免疫疾病；
    b.过敏反应或症状；
    c.器官排斥；
    d.炎症；
    e.过度增殖性疾病；
    f.病毒感染所致疾病；
    g.细菌感染所致疾病；
    h.真菌感染所致疾病；
    i.寄生虫感染所致疾病；
    j.心血管疾病；
    k.心律失常；
    l.心瓣膜疾病；
    m.心肌病；
    n.心肌缺血；
    o.动脉瘤；
    p.动脉闭合疾病；
    q.脑血管疾病；
    r.栓塞；及
    s.缺血。
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