CN1414001A - 酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法 - Google Patents

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Abstract

一种酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法，把酶法降解多糖与膜分离相结合，通过选择不同的膜介质及膜的孔径大小，将中空纤维或平板膜超滤器与酶降解反应器相连接，对不同聚合度的低聚糖进行即时分离，超滤液再经纳滤器分离，除掉低活性的单糖、二糖和水等小分子化合物，得到不同聚合度的低聚糖。采用这种技术可生产多种不同系列及不同聚合度的低聚糖，无活性的单糖和二糖生成量低，较高聚合度的多糖可以实现再反应和分离连续操作。由于实现连续操作，酶可重复使用，提高降解酶的使用效率，适合于规模生产。

Description

酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法
技术领域
本发明属于一种调控低聚糖聚合度的方法，具体地说涉及一种酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法。
背景技术
低聚糖一般是指有2-10个单糖组成，并具有一定生理活性功能的功能分子。主要作用为：能促进双歧杆菌增殖，抑制肠道有害的生长，如低聚甘露糖等；具有抑制肿瘤生长，增强机体免疫力，降低血液中胆固醇的能力，如低聚氨基葡萄等；还具有阻碍病原菌的生长繁殖，增强植物对病虫害的防御能力，如低聚半乳糖等。因而被广泛用于医药、保健食品和农业中。低聚糖通常由自然界存在的多糖经降解而获得，目前主要采用酸降解、氧化降解和酶降解等方法。采用酸降解、氧化降解常获得较多单糖及聚合度较低的低聚糖如二糖。八十年代后国际上多采用酶降解多糖制备，有报道(JP，特开平5-68580)采用酶降解几丁聚糖与超滤器相配合，得到5-18糖的混合物，浓缩、冷冻干燥后，用甲醇处理，得到7-18糖的混合物；又有报道(JP，昭61-271296)将几丁聚糖用浓HCl水解，NaOH中和，并用活性碳处理、过滤，滤液用离子交换膜电渗析分离，得到1-7糖的纯品。这些方法常常遇到产物聚合度难以控制，酶及底物利用率低、如何降低产品中单糖和二糖含量等问题。低聚糖的分离提取通常采用活性炭、硅藻土、活性炭-氟镁石或离子交换膜电渗析技术。这些方法虽然可以实现活性壳寡糖的有效分离，但由于操作繁杂，污染严重，成本高而影响大规模生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法，采用这种技术可生产多种不同系列及不同聚合度的低聚糖，无活性的单糖和二糖生成量低，较高聚合度的低聚糖收率高，污染小，生产成本低，可以实现反应和分离连续操作，适合于规模生产，由于实现连续操作，酶可重复使用，提高降解酶的使用效率。
为实现上述目的，本发明提供的一种酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法，把酶法降解多糖与膜分离相结合，通过选择不同的膜介质及膜的孔径大小，将中空纤维或平板膜超滤器与酶降解反应器相连接，对不同聚合度的低聚糖进行即时分离，大于截留分子量的分子返回反应釜继续降解，超滤液再经纳滤器分离，除掉低活性的单糖、二糖和水等小分子化合物，得到不同聚合度的低聚糖。
具体方案是将多糖原料溶解成溶液，按0.5-3.0％(重量百分比)加入降解酶进行降解，本发明指的多糖原料降解包括果胶、卡拉胶、琼胶、褐藻胶、黄原胶、田菁胶、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等原料的生物降解，降解酶可以是几丁质酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、壳聚糖酶、果胶酶等中任选一种或几种，反应温度15-80℃，pH＝3.0-10.0，粘度下降至40-60％开始超滤；中空纤维、平板膜超滤器与酶降解反应器相连接，先将溶液泵入中空纤维、平板膜超滤器，对不同聚合度的低聚糖进行分离，膜的孔径以透过相应分子量的低聚糖为准则，但必须截留住酶分子，通常采用截流分子量为2,000-100,000的膜，小于截留分子量的部分透过膜，大于截留分子量的分子返回反应釜继续降解；超滤液泵入卷式平板膜纳滤器分离，纳米滤膜截流分子量为100-2,000，其选择原则以透过单糖、二糖和水为准，通常选用对MgSO4截留率为80-95％的膜；经以上步骤，除掉低活性的单糖、二糖和水等小分子化合物，得到不同聚合度的低聚糖。
本发明的反应分离耦合操作方式，可以是连续操作或间歇操作，原料补充方式可以是间歇补料，也可以是连续补料。间歇补料是在膜分离器排出一定量后，向反应釜中加入等体积的原料液，连续补料在膜分离器滤出的同时向反应釜中滴加原料液，但补加速率须与滤出速率相等。
本发明与现有的批次降解后层析分离比较，具有如下优点：
1、本发明采用酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合可以使产生的低聚糖及时分离，有效地阻止其进一步降解。
2、降解酶可连续重复使用，提高了酶的使用效率。
3、通过选择不同孔径的膜的调控操作条件可以获得不同聚合度的低聚糖。
4、本发明过程简捷，减少了分离过程引起的污染，提高了分离效率，过程可连续进行，有利于实现工业化生产。
附图说明
图1是本发明主要工艺流程图。
具体实施方式
下面给出本发明的实施例，并结合附图对本发明作详细描述，除有特殊说明外，所述浓度均为重量百分比。
实施例1：在酶降解反应器1中将0.5％壳聚糖溶解于pH5.6、浓度为0.05M的醋酸钠缓冲液中，过滤除渣，加入1％壳聚糖酶为降解酶，反应温度35℃，反应时间4小时，降解壳聚糖，待溶液粘度下降至40-60％即可进行超滤。中空纤维膜超滤器卷式平板膜纳滤器组装为一个膜组件2并通过输液泵3与酶降解反应器1相连接，将不同聚合度的寡聚糖进行分离，中空纤维超滤膜表面积为2m2，切割分子量为2,000-10,000，小于截留分子量的部分透过膜，得到超滤液，大于截留分子量的分子经控制阀4返回酶降解反应器1继续降解。本例采用连续补料方式。经中空纤维超滤膜得到的超滤液再泵入2英寸卷式平板膜纳滤器分离，其膜面积0.5m2，截流分子量为100-2,000，除掉低活性的单糖、二糖和大量水，得到聚合度为3-20的壳寡糖，并由产物收集器5收集。
实施例2：将2％果胶溶于20L的水溶液中，加入3.0％的果胶酶，反应温度50℃，反应时间1小时，pH3.0，平板膜超滤器超滤，采用间歇补料，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-20的果胶寡聚糖。
实施例3：3％的卡拉胶水溶液中加入0.5％脂肪酶，反应温度80℃，pH10，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-18的卡拉胶寡聚糖。
实施例4：琼胶水溶液中加入几丁质酶，反应温度15℃，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-18的琼胶寡聚糖。
实施例5：胶水溶液中加入溶菌酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-18的褐藻寡聚糖
实施例6：黄原胶水溶液中加入菠萝蛋白酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-18的黄原胶寡聚糖。
实施例7：田菁胶水溶液中加入纤维素酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-18的田菁胶寡聚糖。
实施例8：葡聚糖水溶液中加入果胶酶与菠萝素酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-20的葡聚寡聚糖
实施例9：糖水溶液中加入纤维素酶与溶菌酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-20的木聚寡聚糖。
实施例10：甘露聚糖水溶液中加入果胶酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-20的甘露寡聚糖。
实施例11：肝素水溶液中加入果胶酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-18的肝素寡聚糖。
实施例12：硫酸多糖水溶液中加入果胶酶，其余操作同实施例1，得到聚合度为3-18的硫酸寡聚糖。
实施例13：壳聚糖的酶降解反应
将1％的壳聚糖溶于pH＝5.6，0.05M的醋酸缓冲液中，按酶∶底物＝1∶20加入酶，在45℃下反应，以反应液粘度下降的百分率表征各种酶的降解活性。用平氏粘度计测定初始和降解12小时后反应液通过测量段的下降时间t0、t1，则壳聚糖粘度下降的百分率为t0-t1/t0。
表1：各种酶降解壳聚糖活性：
    所用酶 粘度下降百分率(％)
    脂肪酶纤维素酶壳聚糖酶菠萝蛋白酶溶菌酶     70.475.394.690.480.2
实施例14：间歇补料与连续补料实验
反应总体积20L，试验条件与实施例1相同，投料1小时后开始超滤，同时以等速连续补加原料和醋酸，超滤滤出液60L，经过纳滤得浓缩液1.8L，在间歇补料与连续补料中，不同聚合度壳聚糖所占比例如表2所示，连续补料使3-4糖相对量降低，而6-8糖相对量增加。
表2：间歇补料与连续补料中，3-10糖的相对量
    聚合度     相对含量(％)间歇补料  连续补料
    3糖     41.3    32.0
    4糖     23.3    20.8
    5糖     15.0    14.9
    6糖     12.1    16.5
    7糖     4.0     6.0
    8糖     2.4     4.4
    9糖     1.1     3.1
    10糖     0.8     2.3

Claims (4)

1、一种酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法，包括如下步骤：
将多糖原料溶解成溶液，加入0.5-3.0％(重量百分比)降解酶，反应温度15-80℃，pH＝3.0-10.0，中空纤维、平板膜超滤器与酶降解反应器相连接进行分离，其超滤器截流分子量为2,000-100,000，大于截留分子量的分子返回反应釜继续降解，超滤液再经卷式平板膜纳滤器分离，纳米滤膜截流分子量为100-2,000，得到聚合度3-20的低聚糖。
2、根据权利要求1所述的酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法，其特征在于，其中多糖降解指包括果胶、卡拉胶、琼胶、褐藻胶、黄原胶、田菁胶、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等原料的生物降解。
3、根据权利要求1所述的酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法，其特征在于，其中降解酶可以是几丁质酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、壳聚糖酶、果胶酶等中任选一种或几种。
4、根据权利要求1所述的酶法制备不同聚合度低聚糖的调控方法，其特征在于，降解液粘度下降至40-60％开始超滤。
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