CN1391614A - 提高微生物发酵方法中重组蛋白质产量的方法 - Google Patents

提高微生物发酵方法中重组蛋白质产量的方法 Download PDF

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Abstract

在补料分批发酵中利用现有技术方法生产重组蛋白质时，往往在诱导重组产物合成之后，导致培养物中无质粒细胞的过度生长，从而引起目的产物产量的降低。因此可以通过以一种恒定的简单方式降低或提高培养物中碳源/能源的浓度来实现重组蛋白质产率的提高。通过改变含有碳源/能源的补料溶液的加料速率即可产生这种波动现象。这种方法适用于所有用限制碳源的补料分批培养方法培养的微生物。

Description

提高微生物发酵方法中重组蛋白质产量的方法
在细菌中工业规模生产重组蛋白质是在发酵罐中进行的。同用摇瓶的实验室规模的实验相比，产量的提高可以通过增加单位体积中细胞量的方法来实现。补料分批技术可以达到很高的细胞密度。这是基于生长限制性的加入营养物质，一般是限制碳源/能源。(例如Riesenberg D.and Guthke，R.，1999，App.Microbiol.Biotechnol.51，422-430)。对于利用大肠杆菌的方法来说，通常是限制葡萄糖或甘油。或者，依所用的微生物和方法的不同，也可以限制其他底物，例如糖蜜，淀粉，蛋白胨，乳糖，甲醇和乙酸。高浓度的培养溶液可以连续加入，并有可能利用多种函数去详细描述一段时间内底物的加入情况，或是线性增加和减少。多种函数经常在同一种方法中互相结合使用。可以选择性的以脉冲方式或隔一定时间间隔加入营养性溶液，而养分的消耗或者养分量的降低低于作为下一次加样标志的某一给定浓度。(例如，Terasawa等，1990，EP0397097A1)。底物溶液的加入也可以通过其它参数来调节。溶解氧(DO-stat)，pH值(pH-stat)或者在线测得的排出废气中二氧化碳和氧气的浓度(例如Kerns等，Acta Biotechnol。8，285-289)都可以作为控制数据，以指导周期性地加入营养性溶液。这样作，底物浓度就在限制性和非限制的浓度之间变化。Chen等(1997，Biotechnol。 Bioeng。56，23-31)测量到，当高浓度的培养基周期性的加入补料分批培养物时，质粒的稳定性增加了。但在这些方法中，一个周期可以持续几分钟或者几小时，这些不利于产物的形成。
基因表达的标准载体是质粒，它们除了有复制起点之外，通常还含有编码目的蛋白质的DNA序列(产物基因)，以及用来保证质粒在培养繁殖时保持稳定性的选择性标志。产物基因的表达通常由调节序列控制，特别是由可调节的启动子控制。产物基因的表达由诸如化学诱导物(底物，底物类似物)，培养温度或其它培养条件(pH值，盐浓度，底物浓度)的改变等因素所激活。值得一提的是，也可以通过改变限制性底物，或者用乳糖诱导tac启动子以及将葡萄糖培养改为用乳糖培养等方式来实现诱导(Neubauer等，1992，Appl.Microbiol.Biotechnol.36，739-744)。那些能使宿主细胞对某种抗生素产生抗性的基因可作为选择性标记，以使质粒在宿主细胞中维持稳定。然后在生产重组蛋白质的培养物中加入相应的抗生素来杀死或抑制那些无质粒细胞的生长，因为这些无质粒细胞没有携带抗性基因。通常使用的抗性基因/抗生素组合有β-内酰胺酶/氨苄青霉素，氯霉素乙酰转移酶/氯霉素，四环素抗性(tet)操纵子/四环素，以及卡那霉素抗性基因/卡那霉素。
某些这类抗性体系有个缺点，那就是抗生素被抗性基因灭活，例如氨苄青霉素和氯霉素(例如Kemp G.W.and Britz M.L.，1987Biotechnol.Techniques 1，157-162)。这种灭活所造成的后果是使培养体系中无质粒细胞的繁殖失去了阻碍。另外，那些引起抗性的蛋白质在制备性培养物中会释放入培养基，从而加速抗生素的降解。在这些情况下，总培养体系中无质粒细胞的比例会升高。再者，由于成本的原因，或者由于后续清除过程所造成的附加费用(其中残留的微量抗生素或它的失活型必须除去)，在许多工业方法中，是不使用抗生素的。同时，在这些方法中，一定比例的无质粒细胞会出现。
尽管在生长期，无质粒细胞通常只占有一点点生长优势，但在许多情况下，当产物开始形成后，含有质粒的生产细胞(producing cell)的生长速率开始降低，从而导致培养体系中无质粒细胞群体的过度生长。无质粒细胞积累的缺点是会降低产物占总细胞量的相对比例；而且依所选用的分解和清除方法的不同，将造成这些发酵后步骤更加困难。
在构建载体时，是有可能限制这些不利影响的，例如通过挑选抗性基因，使用替代的不依赖抗生素的稳定性体系(Molin andGerdes，WO84/01172)，或者使用那些分解比较慢的改性抗生素；但是这些有问题的抗性仍在使用。再者，没有一个替代体系是无限稳定的；只能在某一时间跨度内维持稳定性。
在专利权力要求1中所述的发明是基于如下问题，即在补料分批发酵中，特别是在工业应用中，在诱导重组产物合成后，抑制无质粒细胞的过度生长，而不对产物形成产生不利影响。
在专利权利要求1中所列的特征是通过以一种周期性的波动方式增加或减少碳源/能源的浓度来解决这个问题的。这可以通过改变含有碳源/能源的培养溶液的添加速度来实现，例如对添加培养溶液的泵进行相应的程序化控制。这导致了一些连续的时期，在这些时期中，细胞要么只有有限量的底物可以利用，或者就根本没有。
迄今为止有些观点认为在重组产物生产过程中，波动式的加料方式会对产物形成产生不利影响，与这些观点相反，有针对性的波动加料方式令人惊讶的对产物的产量产生了积极的影响，这种加料方式每个周期的最大时间为四分钟，一个周期里面单个时段的持续时间最大为两分钟。周期时间大约在一分钟(30秒钟加料，30秒钟暂停)能达到特别好的效果。
这种方法主要适用于所有利用生长限制性方法生产重组产物的方法中，在这些方法中重组产物是在限制碳源的条件下诱导形成的，这种方法的优点在于：一.没有必要向发酵培养基中添加任何其它物质；二.它不依赖于所用的表达体系；三.它对产物的形成没有不利影响。这种方法特别适合于补料分批方式，其中糖类，如葡萄糖，乳糖，阿拉伯糖或半乳糖，或者其它有机碳源，如甲醇，甘油，糖蜜或淀粉作为限制性营养成分加入培养体系中。这种方法不依赖于培养基，在无机盐培养基和复合培养基中都能使用。
这种方法并不仅限于以大肠杆菌(Escherichia coli)为宿主；它也可以应用于所有用限制碳源的分批加料方式培养的微生物中，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，巴斯德毕赤酵母( Pichia pastoris)。它也不依赖于诱导系统。但是当使用tac启动子时，这种方法特别有效。
当基因产物的表达得到强烈诱导，以及同不经诱导的培养体系相比，生产细胞的生长受到不利影响时，这种方法特别有效。另外，在那些生产时间特别长的方法中，例如在周质中表达重组蛋白质或者产物形成期涉及温度改变时，这种方法也是有效的。操作方法菌株和质粒
大肠杆菌K-12 RB791(F-，IN(rmD-rmE)1，λ-，lacIqLg；大肠杆菌保存中心，New Haven，USA)用作宿主。这个菌株用质粒pKK177glucC(Kopetzki等，1989a)转化。该质粒带有一个在tac启动子控制下的来自酿酒酵母的α-葡糖苷酶基因。还带有β-内酰胺酶基因作为选择性标记。另外，还用了第二个体系，在这个体系中除了用质粒pKK177glucC转化之外，还用带有dnaY基因(Minor-tRNA argU，AGA/AGG)的质粒pUBS520(Brinkmann等，1989)进行了转化。培养基和发酵条件
在所有培养中都使用了葡萄糖—铵—矿物盐培养基(Teich等，1998，J.Biotechnol.64，197-210)。葡萄糖的起始浓度是5克/升。添加溶液含有葡萄糖200克/千克，微量元素溶液(Holme等，1970)10毫升/升，但不含MgSO4，其它成分和浓度与上述培养中所用培养基一样(唯一不同：(NH4)2SO42.0克/升)。在培养过程中加入10毫升1MMgSO4，OD500＝9。在制备性培养物和发酵介质中都加入氨苄青霉素(100毫克/升)和卡那霉素(10毫克/升)。聚丙二醇2000(50％)作为消泡剂使用。
在37℃下摇床培养的发酵无机盐培养基体系作为发酵接种物。所有发酵在61 Biostat ED生物反应器中进行，初始容积为4升，温度35℃。培养体系以分批培养开始。在这个阶段，通气速率和搅拌以一种级联的方式调节，以使DOT值维持在至少20％。在分批阶段末期，停止用DOT值控制，将通气速率和搅拌速度设定在2vvm或800转/分钟。利用25％的氨水溶液将pH值调节在7.0。在分批阶段的末期，细胞密度达到大约2克DCW/升(OD500＝9)时，添料泵开始以53.2克/小时(2.6克葡萄糖/升/小时)的恒定速率运作。在所有培养体系中，所加入的葡萄糖总量是一样的，并不依所用的加料方式而不同。检验了三种不同的加料方法：(A)持续加料(受控制的培养)，(B)以一分钟为周期的间歇性加料方式(30秒加料，30秒停止)，(C)以四分钟为周期的间歇性加料方式(2分钟加料，2分钟停止)。在加料开始3小时后加入1mM IPTG以诱导α-葡糖苷酶基因的表达，在诱导之后大约20小时的时间跨度内追踪产物的形成。分析方法
通过在500nm下测量光密度值(OD500)来追踪细胞生长。显微镜下细胞计数在计数室(深0.02mm)里进行，测定细胞干重(DCW)(见Teich等，1998，J.Biotechnol.64，197-210)。将稀释的样品涂在含有营养成分的琼脂平板上，孵育至少三天，从而确定菌落形成单位(cfu)的数目。然后用复制铺板技术，将这些平板影印到选择性琼脂上，以测定质粒稳定性。DCW，OD500和细胞计数之间的关系描述如下：1克/升DCW对应于OD500为4.5±0.1和细胞计数为1.8×109/毫升。葡萄糖浓度用商业的酶试剂盒测定。
通过将总细胞样品在SDS凝胶上(积层胶5％，分离胶7％)分离来测定α-葡糖苷酶的浓度。扫描产物的电泳条带，通过同凝胶上不同浓度的标准产物蛋白比较，进行量化，从而得出表达量。结果
大肠杆菌RB791 pKK177glucC和大肠杆菌RB791 pKK177glucCpUBS520用限制葡萄糖的分批补料方式培养在搅拌反应器中。在第一个分批阶段之后，开始恒定地加料，加料开始之后三小时，加入1mMIPTG诱导α-葡糖苷酶基因的表达。诱导之后α-葡糖苷酶的浓度增加，大约在诱导之后5小时，每个细胞的该酶比浓度达到最大值，接着随着培养时间增加，浓度开始下降(见图1c)。α-葡糖苷酶比浓度的降低是由于培养体系中无质粒细胞的过度生长引起的。由于α-葡糖苷酶的形成不利于生产细胞的生长，同时也抑制了生产细胞对葡萄糖的吸收，因此那些无质粒细胞就在诱导之后获得了巨大的生长优势。这也导致了培养基中葡萄糖的积累。培养体系中那些不含有产物基因的细胞并不受诱导物IPTG的影响，同时由于有大量的葡萄糖可以利用，这些细胞却可以毫无限制的继续生长。
如果葡萄糖溶液不是连续的加入，而是以周期大约为一分钟(见材料和方法)的短脉冲方式加入，所引起的α-葡糖苷酶的积累与诱导之后恒定加料的方法相似。但是，依赖于脉冲时间的长短，该方法却能防止培养体系中无质粒细胞的过度生长(见图1d)。这种能抑制无质粒细胞的积极效果不仅在图1所示的强表达体系中十分明显，而且在用大肠杆菌RB791 pKK177glucC体系表达α-葡糖苷酶的弱表达体系中也很明显(图2，表1)。再者，脉冲加料方式对这两种体系在诱导之后的合成速率都有轻微的积极作用，对于第一种体系，该方式还可以稍微增加产物的稳定性，使其中超过90％的产物以包涵体的形式存在。限定周期时间是一个十分重要的因素。在所示的两个实施例中，将周期时间延至4分钟会引起产物量的降低，从而降低产量(见图1，2和表1)。在这种情况下培养物中无质粒细胞的过度生长减少了，然而，较长的周期时间也会导致产物合成的减少，或者增加了产物的降解。
表1：用限制葡萄糖的补料分批培养方式培养大肠杆菌RB791pKK177glucC(含有或不含有质粒PUBS520)，培养体系的生产能力和无质粒细胞的过度生长情况。
在补料分批发酵过程中所加入的底物类型 α-糖苷酶的产量(毫克/克生物量) 无质粒细胞(％，占总细胞)
诱导后3小时 诱导后20小时 诱导后3小时 诱导后20小时
RB791 pKK177glucCpUBS520
恒定加料 37  30  2  72
周期1分钟 38  24  1  16
周期4分钟 37  6  2.5  60
RB791 pKK177glucC
周期1分钟 10  9  10  10
周期4分钟 6  4.6  15  6.7
附图说明：图1：使用大肠杆菌RB791 pKK177glucC pUBS520的补料分批发酵，并用1mM IPTG诱导。持续性(a-c；空心图标：未经诱导；实心图标：经过诱导)和周期性(d-f)(▲：周期为1分钟；：周期为4分钟)加入葡萄糖底物溶液的对比。(a，d)细胞量(DCW)，(b，e)葡萄糖浓度，(c，f)产物形成(毫克α-葡糖苷酶/克细胞干重)。所示的数据表示两个连续加料的发酵实验以及周期性加料的发酵实验各一个。加入底物溶液的开始时间(-----)，加料开始3小时后用IPTG诱导(----)。图2：使用大肠杆菌RB791 pKK177glucC进行补料分批发酵，并用1mMIPTG诱导。持续性(a-c；空心图标：未经诱导；实心图标：经过诱导)和周期性(d-f)(▲：周期为1分钟；：周期为4分钟)加入葡萄糖底物溶液的对比。(a，d)细胞量(DCW)，(b，e)葡萄糖浓度，(c，f)产物形成(毫克α-葡糖苷酶/克细胞干重)。进一步的解释参见图1。
图3：表示在周期1分钟的发酵中泵筒示意图。图示为发酵过程的一部分，表示了溶解氧的反应(DOT，％，---u----)和泵的开关(0＝关，1＝开，----)。

Claims (9)

1.提高微生物发酵工艺中重组蛋白质产率的方法，其特征在于以短周期波动性的降低或增加培养物中碳源/能源的浓度。
2.根据权利要求1中所述方法，其特征在于所述波动是通过改变含有碳源/能源的补料溶液的添加速率来实现的。
3.根据权利要求1和2中所述方法，其特征在于一个周期的最大持续时间为4分钟，一个周期中单个时段的持续时间最长为2分钟。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于单个周期的持续时间为1分钟，单个周期中单个时段的持续时间最长为总周期时间的75％。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于向培养体系中添加碳源/能源，使得只在发酵工艺的某些时段中周期性改变底物溶液的添加速率。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于加料速率通过周期性的加入和停止加入补料溶液的方式来控制。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于葡萄糖，甘油，乳糖，半乳糖，甲醇，乙酸，糖蜜或淀粉被用作碳源/能源。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于依所用的启动子不同，将IPTG或吲哚丙烯酸(IAA)，或乳糖，阿拉伯糖，半乳糖，或甲醇(如果还未用作能源)加入培养体系以诱导重组产物的形成。
9.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于在诱导重组产物形成时，改变温度。
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