CN1380414A - 重组人ⅱ型胶原功能性多肽cⅱ250－270及其制备方法和用途 - Google Patents

重组人ⅱ型胶原功能性多肽cⅱ250－270及其制备方法和用途 Download PDF

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本发明涉及重组人II型胶原功能性多肽250－270及其制备方法和用途,本发明首次利用DNA合成、重组DNA等基因工程的方法成功构建了含有人II型胶原功能性多肽CII250－270多聚基因片段的重组质粒和表达质粒,优化表达条件并在原核细胞中融合表达目的蛋白。动物实验表明口服或鼻饲此多肽可抑制RA动物模型多关节炎的发生、发展,体外可活化类风湿关节炎(RA)患者特异性T细胞、促使其增殖、分化并分泌相应的细胞因子,提示其具有活化特异性T细胞的特性。本发明多肽体内应用能诱导特异性免疫耐受、防治类风湿性关节炎。

Description

重组人II型胶原功能性多肽CII250-270及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及重组人II型胶原功能性多肽CII250-270及其制备方法和用途。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumtoid arthritis，RA)在我国成人中的发病率约0.3％，其临床特点为累及到周身关节的增殖性和侵蚀性滑膜炎，呈进行性病变终生反复不断。被认为是类似“局限性恶性肿瘤”的增生性和破坏性病变，自发性缓解极为罕见。晚期由于关节软骨及骨的损伤而导致关节强直、畸形和功能障碍，病变亦可侵犯浆膜、心肺、动脉、神经、眼等结缔组织。其致病机理虽未完全阐明，但人的Th1细胞识别软骨的II、IX和XI型胶原以及其它的软骨和软骨细胞的抗原成分是RA发病机理的重要因素。粘膜耐受是近年来免疫学界研究的一个活跃领域。粘膜耐受是指经口或鼻给予抗原引起的特异性免疫低反应状态。近年来采用口服自身抗原诱导免疫耐受已成功地治疗多种动物实验性自身免疫性疾病。人类口服耐受现象也得到证实，对多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、葡萄膜炎和I型糖尿病临床实验的初步结果提示，口服耐受简便易行、安全，很可能成为治疗自身免疫性疾病、变态反应和抑制器官移植排斥反应的重要手段。II型胶原蛋白(type IIcollagen，CII)是软骨的细胞外基质的重要成分，RA患者体内可检测到针对CII的特异性抗体和细胞免疫反应，用CII配合不完全福氏佐剂在动物体内可诱发胶原蛋白性关节炎，而口服CII诱导的免疫耐受可以抑制大鼠佐剂性关节炎的发生、发展，表明CII是诱发类风湿性关节炎的重要抗原之一。由于在人类基因组中，CII250-270片段的基因分布在两个外显子(exon21、exon22)上，故无法直接从基因组中获得目的基因。而CII一般只在软骨中表达，更新周期长、mRNA水平低且难于提取，使得通过mRNA反转录获取目的基因的方法难于实行。II型胶原蛋白由3条多肽链三股螺旋结构域，α链上有特异的氨基酸序列(Gly-X-Y)，在组成上具有高含量的甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、赖氨酸(Lys)，广泛的翻译后修饰并形成许多超分子结构，以上特点使得其在原核生物中表达十分困难。因此，在研究CII免疫活性时大多使用化学合成的多肽或其CB(BrCN裂解甲硫氨酸)片段。以往的研究表明，CII的免疫原性主要存在于其CB5、CB7、CB8、CB9、CB10、CB11和CB12片段，而对异源性CII反应性最强的T细胞表位位于CB11片段上的CII260-270(IAGFKGEQGPK)。近年来的研究证明，化学合成的包含该片段的较大片段如CII250-270较小片段多肽具有更强的免疫活性和耐受原性，比CII蛋白具有更高的特异性和安全性。实验研究表明化学合成的CII250-270在体外可刺激RA患者外周血单个核细胞(PBMC)和滑液单个核细胞(SFMC)中特异性T细胞的活化，促进其增值并分泌相应的细胞因子(INF-γ)，大鼠口服人II型胶原(human type IIcollagen，HuCII)的免疫活性多肽HuCII 250-270减少了Th1细胞的增殖，对胶原诱导性关节炎(CIA)具有明显的抑制作用；临床研究证实大剂量、长时间鼻伺化学合成的CII256-270可以通过旁观者抑制作用限制RA的发病。化学合成的多肽并没有进行过翻译后的修饰，且都是单链，但这并未影响其免疫活性，这就为重组表达的CII片段可能也具有同样的免疫活性提供了理论依据，化学合成多肽技术复杂、代价昂贵、产量少，无法满足基础和临床应用的需要，这使得在原核系统中表达胶原蛋白片段的研究具有潜在的价值。
发明内容：
本发明的目的是提供一种重组人II型胶原功能性多肽CII250-270及其制备方法和用途，该方法获得的多肽产物活性高、表达量大。
本发明的技术解决方案是：重组人II型胶原功能性多肽CII250-270，其核苷酸序列为：5’-GCG AAT TCA TGG GAT CCG AAG ACA TGG GTC CGA AAG GTC AGA CCG GTA AACCGG GTA TCG CTG GTT TCA AAG GTG AAC AGG GTC CGA AAA TGG·ACA GAT CTTAAG TCG ACG C-3’。
重组人II型胶原功能性多肽CII250-270制备方法，包括以下步骤：
(1)、化学合成的人CII250-270基因核心片段的DNA单链摸板序列、PCR引物序列及PCR产物序列及其表达产物
①模板序列(69-mer)
5’ ATGGGTCCGAAAGGTCAGACCGGTAAACCGGGTATCGCTGGTTTCAAAGGT
          pbs
  GAACAGGGTCCGAAAATG 3’
          pbs
②PCR引物序
   P1(41-mer)
    5’GC GAATTCATG GGATCCGAAGAC ATGGGTCCGAAAGGTCAG 3’
           EcoR I     BamH I                pbs
   P2(38-mer)
    5’GC GTCGACTTA AGATCTGTC CATTTTCGGACCCTGTTC  3’
           Sal I     Bg1 II            pbs
③PCR产物序列(112 bp)5’-GC GAATTCATG GGATCCGAAGACATGGGTCCGAAAGGTCAGACCGGTAAACCGGGT
    EcoR I    BamH IATCGCTGGTTTCAAAGGTGAACAGGGTCCGAAAATGGAC AGATCTTAA GTCGACGC-3’
                                     Bg1 II     Sal I
(2)利用同裂酶BamH I和Bg1 II位点将单聚基因片段连接成2聚目的基因片段，逐级放大，构建并筛选了含有人II型胶原功能性多肽CII250-270的2、4、6聚基因片段的重组质粒PUC19和表达质粒PGEX-4T-1、PGEX-4T-3、pBV220、PKKH。
(3)在原核生物大肠杆菌细胞中融合表达6聚目的基因，筛选工程菌(BL21、E.coliDH5a、YK537、71/18、TG1、XL1-Blue)、选择诱导方式(温度、IPTG(0.1～1.0mmol/L)、优化表达条件(培养温度：30℃～3℃；培养基：LB、2YTG；诱导时间1～6h)，
(4)亲和层析柱对表达产物进行分离、纯化，检测分子量的大小为43KD，纯度为90％以上。
本发明采用DNA重组技术生产的多肽产品可以很好的解决背景技术中化学合成存在的问题，本发明利用基因工程的方法对人II型胶原蛋白的功能性多肽CII250-270进行重组、表达、分离、纯化。经进一步的验证：纯化产物在体外可特异性活化RA患者外周血和滑液中的T淋巴细胞、促使其增殖分化并分泌TH1样细胞因子，体内实验表明其可以抑制大鼠胶原诱导性关节炎的发生、发展，具有预期的免疫学和生物学活性，口服或鼻饲给药可通过肠相关淋巴组织诱导特异性免疫耐受，极具有新药开发的前景。
附图说明
图1为表达产物的电泳扫描
具体实施方式：
1、本发明以化学合成的三条寡核苷酸链为摸板和引物，通过PCR获得含有单聚CII250-270片段的目的基因。为了能在原核系统中成功表达，在基因水平选用E.coli基因组中出现频率高的密码子(偏爱密码子)对可能影响表达的因素进行优化，同时优化目的基因序列以提高表达效率。CII250-270片段是典型的胶原序列，由7个Gly-X-Y的重复序列组成，其中Gly占1/3、Pro和Lys占1/3、其它氨基酸占1/3。在21肽中酸性氨基酸只有1个而碱性氨基酸有4个，使的整个21肽表现为明显的碱性，另外21肽中只有9种氨基酸，在组份上严重失衡。因此，在构建目的基因时在其周围添加三个酸性氨基酸使整个多肽呈现为中性，同时也增加了氨基酸的种类。基因测序表明得到的目的基因序列和设计的完全相同。本发明的制备方法如下：
(1)、化学合成的人CII250-270基因核心片段的DNA单链摸板序列、PCR引物序列及PCR产物序列及其表达产物
①模板序列(69-mer)
5’ ATGGGTCCGAAAGGTCAGACCGGTAAACCGGGTATCGCTGGTTTCAAAGGT
          pbs
  GAACAGGGTCCGAAAATG 3’
          pbs
②PCR引物
     P1(41-mer)
5’GC GAATTCATG GGATCCGAAGAC ATGGGTCCGAAAGGTCAG 3’
       EcoR I     BamH I               pbs
P2(38-mer)
5’GC GTCGACTTA AGATCTGTC CATTTTCGGACCCTGTTC 3’
       Sal I     Bg1 II              pbs
③PCR产物单聚目的基因片段(112 bp)5’-GC GAATTCATG GGATCCGAAGACATGGGTCCGAAAGGTCAGACCGGTAAACCGGG
    EcoR I     BamH ITATCGCTGGTTTCAAAGGTGAACAGGGTCCGAAAATGGAC AGATCTTAA GTCGACGC-3’
                                       Bg1 II    Sal I
(2)利用同裂酶BamH I和Bg1 II位点将单聚基因片段连接成2聚目的基因片段，中间插入几个连接碱基，表达相应的连接氨基酸。逐级放大，成功构建并筛选了含有人II型胶原功能性多肽CII250-270的2、4、6聚基因片段的重组质粒PUC19和表达质粒PGEX-4T-1、PGEX-4T-3、pBV220、PKKH，酶切测序与预期相符。
(3)在原核生物大肠杆菌细胞中融合表达6聚目的基因。筛选工程菌(BL21、E.coliDH5a、YK537、71/18、TG1、XL1-Blue)、选择诱导方式(温度、IPTG(0.1～1.0mmol/L)、优化表达条件(培养温度：30℃～37℃；培养基：LB、2YTG；诱导时间1～6h)，使其表达量达到30％，可溶性大于80％。
(4)用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行分离、纯化。纯化的表达产物的鉴定(12％SDS-PAGE)参见图1，其中，1为未经纯化的表达产物rhCII250-270/pGEX-4T-1；2为蛋白marker；3-5为经1、2、3次过柱纯化后的产物；6为非纯化样品。经12％SDS-PAGE凝胶电泳分析，大小约为43KD(附图1)，与预期相符(6×rh CII250-270约为17KD；GST 26 KD)，SDS-PAGE凝胶薄层扫描，纯度为92％，浓度为2.1mg/ml。
2、体外功能初步验证：6×rh CII250-270(100ug/ml)刺激3d后RA患者PBMC和SFMC T细胞中BrdU的掺入率、早期活化指标CD69+的表达率与胞内细胞因子INF-γ+的分泌量与对照组(GST蛋白组)相比均显著升高(附表1)，表明其具有活化RA患者特异性T细胞的特性，具有预期的免疫学活性。附表1不同刺激物对RA患者PBMC、SFMC中T细胞的活化作用  (n＝9)
                  CD69+细胞比例               BrDU+细胞比例刺激物(100ug/ml)
               PBMC(％)       SFMC(％)         PBMC(％)      SFMC(％)PBS             0.23±0.14     0.26±0.16       0.89±0.32    0.76±0.56GST             1.02±0.48     1.25±0.23       2.73±1.08    2.95±0.89rh C II 250-270  18.05±4.34a  25.17±4.89ab   1.07±5.16a  15.45±6.01ab合成C II 250-270 21.46±4.67a  28.34±6.75ab   16.56±3.98a 22.44±4.82abVs control  aP＜0.01；Vs PBMC组 bP＜0.01
3、动物体内功能实验：口服或鼻饲6×rh C II 250-270多肽1mg/d，30d可明显下调CIA诱导组大鼠Th1细胞的增殖及细胞因子的分泌，并明显减轻多关节炎症状和炎症关节组织的病理改变(附表2)。附表2 rh C II 250-270灌胃对AA大鼠继发型关节炎和晚期肢体的影响
                    伴关节炎肢体总数   平均炎症关节数    晚期肢体畸形      病程组别         大鼠只数
                    全组肢体总数  ％       x±s          大鼠只数   ％       d对照组(PBS)        10     36/40      90.0     30±5            10/10    100.0  107±13GST              30     106/120    88.3     29±6            29/30    96.7   106±11rh C II 250-270    30     78/120     65.0a   22±4a         16/30    53.3a  59±9a合成C II 250-270   30     74/120     61.7a   19±6a         14/30    46.7a  60±6aVs control aP＜0.01

Claims (5)

1、重组人II型胶原功能性多肽CII250-270，其特征在于：其核苷酸序列为：5’-GCG AAT TCA TGG GAT CCG AAG ACA TGG GTC CGA AAG GTC AGA CCG GTA AACCGG GTA TCG CTG GTT TCA AAG GTG AAC AGG GTC CGA AAA TGG ACA GAT CTTAAG TCG ACG C-3’。
2、重组人II型胶原功能性多肽CII250-270制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、化学合成的人CII250-270基因核心片段的DNA单链摸板序列、PCR引物序列及PCR产物序列及其表达产物
①模板序列(69-mer)
5’ ATGGGTCCGAAAGGTCAGACCGGTAAACCGGGTATCGCTGGTTTCAAAGGT
          pbs
  GAACAGGGTCCGAAAATG 3’
          pbs
②PCR引物序
  P1(41-mer)
   5’GC GAATTCATG GGATCCGAAGAC ATGGGTCCGAAAGGTCAG 3’
          EcoR I     BamH I                pbs
  P2(38-mer)
   5’GC GTCGACTTA AGATCTGTC CATTTTCGGACCCTGTTC 3’
          Sal I     Bg1 II            pbs
③PCR产物序列(112 bp)5’-GC GAATTCATG GGATCCGAAGACATGGGTCCGAAAGGTCAGACCGGTAAACCGGGT
    EcoR I    BamH IATCGCTGGTTTCAAAGGTGAACAGGGTCCGAAAATGGAC AGATCTTAA GTCGACGC-3’
                                     Bg1 II     Sal I
(2)利用同裂酶BamH I和Bg1II位点将单聚基因片段连接成2聚目的基因片段，逐级放大，构建并筛选了含有人II型胶原功能性多肽CII250-270的2、4、6聚基因片段的重组质粒PUC19和表达质粒PGEX-4T-1、PGEX-4T-3、pBV220、PKKH，
(3)在原核生物大肠杆菌细胞中融合表达6聚目的基因，筛选工程菌(BL21、E.coliDH5a、YK537、71/18、TG1、XL1-Blue)、选择诱导方式(温度、IPTG(0.1～1.0mmol/L)、优化表达条件(培养温度：30℃～37℃；培养基：LB、2YTG；诱导时间1～6h)，
(4)亲和层析柱对表达产物进行分离、纯化，检测分子量的大小为43KD，纯度为90％以上。
3、如权利要求1所述的重组人II型胶原功能性多肽CII250-270，其特征在于：作为制备特异性T细胞活化剂、单克隆抗体的应用。
4、如权利要求1所述的重组人II型胶原功能性多肽CII250-270，其特征在于：作为制备类风湿性关节炎动物模型抗原的应用。
5、如权利要求1所述的重组人II型胶原功能性多肽CII250-270，其特征在于：作为制备抗类风湿性关节炎、骨关节炎药物的应用。
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