CN1370830A - 一种枯草杆菌及采用该菌种发酵生产d－核糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGNCC No.0695及采用该菌种发酵生产D－核糖的方法。该方法包括先培养枯草芽孢杆菌CGNCC0695,然后再将该培养物在发酵培养基中发酵培养,从发酵产物中采用常规的方法收集D－核糖晶体。本发明菌种葡萄糖酸激酶的活力为0.233U/mg蛋白,远高于母株0.051U/mg蛋白,采用该菌种发酵生产D－核糖,发酵周期短,D－核糖的产量可达75g/L以上,残糖可降至0.5%以下,为一种具有较高应用价值的发酵生产D－核糖的方法。
Description
技术领域
本发明属于生化工程领域，涉及一种枯草杆菌(Bacillus subtilis)及应用该菌种发酵生产D-核糖的方法。
背景技术
D-核糖及其衍生物作为RNA及其构件的重要的组成部分，广泛存在于自然界。D-核糖还是核苷酸及某些辅酶、维生素的组成部分，同时还以脂多糖成份存在。
D-核糖具有很高的实际应用价值。在食品工业，D-核糖可作为调味品、调味香精等风味物质的合成原料，如5’-IMP、5’-GMP等；在医药工业，是合成核黄素VB2的重要原料，同时随着核酸药物的发展，D-核糖作为合成抗病毒、抗肿瘤的核酸药物的原料，其作用将日益突出。D-核糖本身可用于辅助治疗运动引起的肌肉酸痛、腺苷酸脱氨酶缺陷造成的肌肉僵硬以及细胞内缺乏磷酸化酶造成的MC Ardle’s病等。另外，还发现D-核糖可提高体内ATP水平，对心肌局部缺血、抗疲劳、耐缺氧具有保健作用。
D-核糖的制备方法可分为三类：
一种是从天然物质中分离，即先提取核糖核酸，然后降解为核苷或核苷酸，再进一步分解生成D-核糖。此方法由于收率低，成本高，不适合于大规模工业化生产。
二是利用呋喃、葡萄糖等化学合成，其中包括使用水银电极的工艺过程，由于存在水银污染的公害，面临着严峻的环境挑战。
三是利用微生物发酵法生产，这是目前最有效、最经济的方法。该法以葡萄糖等为原料，采用转酮醇酶缺陷型枯草杆菌突变株，在合适的工艺条件下，将葡萄糖转化为核糖。该法效率高，成本低，具有工业化生产的潜力。
许多文献和专利均公开了利用微生物发酵法生产D-核糖的工艺。
Simonart与Godin首次报道了用微生物来生产D-核糖。随后经过多年努力，研究者们才发现转酮醇酶缺陷型突变株的枯草杆菌能大量积累D-核糖。其中显野等人使用枯草芽孢杆菌突变株RX13为生产菌株，D-葡萄糖(200g/L)为碳源，玉米浆(3g/L)为主要氮源，并添加其他必要成分，36.5℃恒温振荡培养四天，最终产量达118.8g/L。De Wulf等人采用加大通风量(3vvm)，提高转速(1000rpm)，使溶氧提高到70％，D-核糖产量可达40g/L。
上述的报道均采用高浓度葡萄糖为碳源，其缺陷是残糖高，给后提取带来很大困难，尤其是D-核糖结晶要求极高，杂质含量要极低才能顺利结晶析出。另外，发酵周期较长，一般需要96小时甚至120小时。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是公开一种芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；
本发明需要解决的技术问题之二是提供一种采用上述菌种发酵生产D-核糖的方法，以克服现有技术存在的残糖高、给后提取带来困难、发酵周期较长的缺陷。
本发明使用的微生物：
用于生产本发明所说的D-核糖的是一种属于一种芽孢杆菌属(Bacillus)的菌种，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QG2107即为具有这种生产能力的菌种，以下简称QG2107。该菌种原始菌种为ATCC31951。经对ATCC31951长期深冻，紫外线照射，γ射线辐射，化学试剂处理(如硫酸二乙醋、亚硝酸、N-甲基-硝基-N-亚硝基胍等)，超声波等诱变处理，即可获得所说的QG2107。该菌种已于2002年1月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为：CGNCC No.0695
QG2107菌种具有如下特征：
1.菌体形态：
(1)细胞尺寸：0.7～0.8×2～3μm，呈短杆状，单生，成对；
(2)无荚膜；
(3)周生鞭毛，运动；
(4)不产生芽孢；
(5)肉汤琼脂培养：菌落圆或不规则；表面色暗；不透明，不闪光，扩张，污白色或微带黄色；
(6)DHL琼脂培养：不生长；
(7)MacConkey’s琼脂培养：不生长；
(8)甘露酵琼脂培养：良好，白色菌落，表面不皱；
2.生理特性
(1)革兰氏染色阳性；
(2)VP试验：阳性
(3)明胶试验：液化；
(4)牛奶试验：石蕊酸性，胨化牛奶；
(5)还原硝酸盐：阳性；
(6)脱氮反应：阴性；
(7)MR试验：阴性；
(8)不产生吲哚；
(9)不产生硫化氢；
(10)可利用柠檬酸；
(11)生长范围：pH4-9，最适6.5-7.2；
温度：25-45℃，最适34-36℃
(12)可同化糖类：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、蔗糖、麦芽糖、糊精、可溶性淀粉、废糖蜜等；
(13)可利用氮源：硫酸铵，硝酸铵、尿素、干酵母、牛肉膏、蛋白胨、酷蛋白水解物等。
3.遗传标志
(1)转酮醇酶缺陷型：需莽草酸才能生长；
(2)氨基酸缺陷：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸；
(3)糖代谢特征：葡萄糖酸激酶的活力比原始菌种高出近5倍。
根据文献“伯杰系统菌学手册”(Brrgey’s Manual of Systematic Bacteriology)提供的鉴定方法和试验结果表明，QG2107菌种属于芽孢杆菌类群，但与原芽孢杆菌及文献报道的菌种有明显不同。其主要不同之处在于该菌种葡萄糖酸激酶的活力为0.233U/mg蛋白，远高于母株(0.051U/mg蛋白)。
通过常规的发酵，可以培养上述的QG2107菌种，并利用其生产D-核糖，简述如下：
所说的枯草芽孢杆菌QG2107是以碳源、氮源、无机盐以及必要的维生素等有机营养素加以培养。所说的碳源可以采用葡萄糖、淀粉水解糖、淀粉、糖蜜、蔗糖、山梨醇等；所说的氮源可以采用尿素、氨水、硫酸氨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆、玉米粉、蛋白胨、大豆水解液等；所说的无机盐可以采用磷酸盐、锰盐和钾盐，所说的维生素为VB、VB6。其培养方法在许多文献上都有阐述，此处不再赘述。
在无菌室中，从试管斜面上刮一环QG2107菌苔，接入种子培养基，于28～34℃振荡培养16～24小时，然后移入发酵培养基，于28～36℃振荡培养或发酵罐培养48～72小时，接种量为1-10％V/V，即每升发酵培养基接种子液10～100ml，一般采用5％。发酵完成后，采用常规的方法从发酵产物中收集D-核糖，如可以采用如下的步骤：经灭活，去葡萄糖，脱色，去杂质离子，可以得到纯净无色的糖浆(电导率小于100μs)，经直接结晶可得到白色固体D-核糖晶体。
所采用的发酵培养基中葡萄糖含量为100g/l，葡萄糖酸钙含量为100g/l，D-核糖的产量可达75g/L以上，残糖可降至0.5％以下，发酵周期也缩短为60小时。
由上述公开的技术方案可见，本发明菌种葡萄糖酸激酶的活力为0.233U/mg蛋白，远高于母株0.051U/mg蛋白，采用该菌种发酵生产D-核糖，发酵周期短，D-核糖的产量可达75g/L以上，残糖可降至0.5％以下，为一种具有较高应用价值的发酵生产D-核糖的方法。
分析方法：
本发明D-核糖的分析法采用HPLC法，具体条件如下：
泵：Shimadzu Model LC-10ATVP
柱：Spherisorb NH2(4.6×200mm)
流动相∶乙腈∶水＝75∶25(V∶V)
流速：1ml/min
柱温：25℃
检测器：示差检测器
葡萄糖酸激酶的活力测定参见文献(Vivas EI.J.Basic Microbiol.，1994，16(2)：117-122)
具体实施方式
实施例1
将枯草芽孢杆菌ATCC31951从斜面上刮下一环，接种于种子培养基(培养基1的组分和含量：10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，5g/LNaCl，121℃灭菌20min)，于34℃振荡培养24小时，离心收集细胞，并用生理盐水洗涤2次，再悬浮于生理盐水中，并调整细胞浓度为108个/ml左右，紫外照射若干时间，涂布于平板上(培养基1)，32℃培养2天。取单菌落分别点于基本培养基上(培养基2：葡萄糖5.0g/L，硫酸铵2.0g/L，柠檬酸钠1.0g/L，磷酸氢二钾6.0g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，硫酸镁0.2g/L)与补充培养基(培养基3：培养基2加入50μg/L的莽草酸)。筛选在补充培养基上生长良好，而在基本培养基上不生长的菌落。经进一步鉴定，最后得到一株突变株QG2107。对QG2107和原亲株ATCC31951进行比较，结果见表1。
表1
| 葡萄糖酸激酶(U/mg蛋白) | |
| ATCC31951 | 0.051 |
| QG2107 | 0.233 |
实施例2
将QG2107和ATCC31951分别接种于培养基1和培养基4(培养基1添加10g/L的葡萄酸钠)。于34℃培养20小时。取出离心，洗涤，破壁，取上清液测定基中葡萄糖酸激酶的活力。结果见表2。
| 葡萄糖酸激酶(U/mg蛋白) | ||
| ATCC31951 | 培养基1 | 0.051 |
| 培养基4 | 0.062 | |
| QG2107 | 培养基1 | 0.233 |
| 培养基4 | 0.396 |
实施例3
将QG2107和ATCC31951分别接种于培养基1中(每250ml三角瓶装液30ml)。然后吸取1.5ml分别移到发酵培养基5(D-葡萄糖200g/L，玉米浆22.0g/L，硫酸锰0.5g/L，硫酸铵5.0g/L，碳酸钙20.0g/L)和培养基6(D-葡萄糖100g/L，葡萄糖酸钙100g/L，玉米浆22.0g/L，硫酸锰0.5g/L，硫酸铵5.0g/L)，于36℃振荡培养60小时，测定D-核糖的量，结果见表3。
表3
实施例4
| ATCC31951 | QG9704 | |||
| 时间 | 培养基5 | 培养基6 | 培养基5 | 培养基6 |
| 24h | 7g/L | 8.1g/L | 9.8g/L | 19g/L |
| 48h | 12g/L | 16.5g/L | 14g/L | 49.7g/L |
| 60h | 16g/L | 21.1g/L | 19g/L | 65g/L |
将QG9704接种于培养基1中，34，34℃振荡培养20小时，将其移7L小型玻璃发酵罐中，装液量5L(培养基6)，加入0.03％(v/v)泡敌，接种量5％，通气量1vvm，转速500r/min，37℃培养60小时，并测定D-核糖。结果见表4。
表4
| 时间(h) | D-核糖 |
| 24 | 25.66 |
| 48 | 57.3 |
| 60 | 75 |
Claims (5)
1.一种枯草芽孢杆菌CGNCC0695。
2.一种以枯草芽孢杆菌CGNCC0695为菌种生产D-核糖的方法，其特征在于，该方法包括先培养枯草芽孢杆菌CGNCC0695，然后再将该培养物在发酵培养基中发酵培养，从发酵产物中采用常规的方法收集D-核糖晶体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养的温度为28～36℃，振荡培养或发酵罐培养48～72小时，接种量为1-10％V/V。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，接种量为5％V/V。
5.如权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于，所采用的发酵培养基中葡萄糖含量为100g/l，葡萄糖酸钙含量为100g/l。
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| CN101292026B (zh) * | 2005-09-09 | 2013-04-24 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 新颖的基因gms 08 |
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