CN1370241A - 一种生产番茄红素的方法 - Google Patents

Abstract

一种获得番茄红素的方法。本发明涉及一种获得类胡萝卜素,特别是番茄红素的新过程,一般来说,从天然生物合成的原料,特别是指从毛霉目的真菌,例如Blakeslea,Choanephora或Phycomyces的深层培养基中进行提取。所描述的过程可能简化回收过程,并提高产物的纯度。它包含如下步骤:1)用醇对生物合成的天然原料(如发酵培养基)直接进行处理,并分离湿的纯化的生物质。2)通过干燥与裂解或降解,对纯化的生物质进行调理。3)用一种有机溶剂对番茄红素进行固相－液相萃取。4)浓缩富集提取液。5)加入醇进行沉淀/结晶。6)过滤。7)干燥。

Description

一种生产番茄红素的方法

发明领域

本发明涉及一种分离和纯化番茄红素的新方法，该番茄红素原则上是从生物合成的任何天然原料，更具体的说是从毛霉目的真菌，如Blaleslea，Choanephora或Phycomyces的深层培养物开始，以一种结晶形式供人体使用。本发明描述了一种提取方法，该方法可能简化回收过程并使前述方法所涉及的产物的纯度得到提高。

背景技术

类胡萝卜素类色素广泛存在于自然界的果实和蔬菜中，并赋予自然界中许多物质如胡萝卜、胡椒、番茄、花或某些特定的微生物由黄到暗红的特征颜色。它们可分为两类，纯碳水化合物，例如胡萝卜素，包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素或番茄红素等化合物；以及胡萝卜醇，它具有抗氧化功能，这种类型的例子有虾青素，辣椒红素或cantaxanthin(另一种虾青素)。这两组化合物因为物理化学性质以及在有机溶剂中溶解度不同而表现出不同的性质。

所有这些化合物在人类饮食方面均有重要作用，对它们可作为预防癌症和其他人类疾病的抗氧化剂以及可作为维生素A前体的性质，已进行了广泛研究。而且由于类胡萝卜素有由黄到红的不同着色，它们可用来作为食品添加剂及人造黄油、黄油、油料、汤、调料等的着色剂。(Ninet etal.Microbial Technology 2^nd Edn.Vol 1 529-544(1979)Academic Press NYEds Peppler HJ and Perlman D.)。

番茄红素是一种类胡萝卜素，它作为中间产物在β-胡萝卜素和胡萝卜醇的生物合成途径中产生，属于碳水化合物组的类胡萝卜素。其化学式是C₄₀H₅₆，分子量为536.85，分子式如下：

该化合物的性质已被广泛研究。它的抗氧化特性可描述为捕获人体中持续产生的自由基，因此它可应用于预防心血管疾病和某些类型的癌症如前列腺癌(Giovannucci等，J Nat.Cancer Inst.87：1767-1776(1995)；Stahl等，Arch Biochem.Biophys 336：1-9(1996)；Clinton等，Nutr.Rev.56：35-51(1998)，这在部分病人中产生需求的增加，因此厂家已开始尝试通过化学合成来制造番茄红素以满足这种需求。

番茄红素作为一种高纯度化合物，其生产在过去是与化学合成相连系的(US 5208381；US 5166445；US 4105855；US 2842599)，现在由于改进的途径是从天然原料开始并与特定萃取过程相结合，这种作为争论主题的生产过程证明是更有利的，并组成所谓的“天然途径”来获得这些产物。

通过所谓的“天然途径”，番茄红素可从植物产品，如番茄、胡萝卜、胡椒、植物油等开始来获得。因此，专利WO97/48287描述了一种制备富含番茄红素的油性树脂的方法，通过压榨使番茄成浆，用有机溶剂从浆中萃取番茄红素，随后通过蒸发除去溶剂，使得油性树脂中番茄红素的含量在2-10％。

通过相似的方法从植物和油中来获得富含一般意义上的类胡萝卜素和特定意义上的番茄红素的油性树脂在各种专利中都有描述，US 5245095和EP 580745用钙盐进行沉淀，US 5019668使用油的转酯作用和随后的蒸馏过程，WO 98/16363描述了番茄分馏的各种馏分，其中包括一种富含类胡萝卜素的油性树脂，PCT WO 90/08584描述了在超临界态用流动相萃取番茄红素的方法，尽管获得的提取物是各种类胡萝卜素的混合物，而且由于其低溶解性，萃取的产量也是很低的。

在所有这些例子中，由于番茄红素在这些天然产物中的低含量和该化合物在一定器官如叶绿体或成色素细胞中的胞内分布，萃取的产量和获得的产物纯度是低的，因为富含番茄红素的油性树脂或脱水的未加工材料的生产伴随着不同含量的其它类胡萝卜素或非胡萝卜素化合物。在大多数情况下，所描述的萃取方法均需要压挤水果作为预处理，以利于溶剂萃取和释放富含番茄红素的细胞内容物。最后一点，在这些专利所描述的大多数过程中都需要使用有机溶剂，并有痕量残存在获得的油性树脂中。

同样，专利IL 107999描述了从番茄浆开始生产特别富含番茄红素的油性树脂的方法，虽然如前述例子一样，没有获得高纯度的番茄红素晶体，但浓缩了富含番茄红素的脂类。

另一方面，专利WO 97/15554描述了从胡萝卜和番茄中提取植物来源的类胡萝卜素包括番茄红素的方法，通过分离叶绿体和成色素细胞，利用蛋白水解酶如果胶和/或蛋白酶消化上述器官，释放与各种结构蛋白相连的番茄红素。通过随后的碱处理和低分子量的醇混合物萃取，可能获得产量和纯度大于油性树脂的番茄红素提取物，尽管没有获得纯的番茄红素晶体，但得到了富含番茄红素的粗提取物。

另外，在专利EP 608027 A2中，通过分离番茄红素以结晶形式存在的番茄成色素细胞，获得浓缩的番茄红素提取物。这些从番茄成色素细胞中得到的富含番茄红素的提取物可不经随后的番茄红素晶体的提取直接用作着色剂，这避免了提取过程中番茄红素颜色的改变，而且不需要使用有机溶剂。根据该专利描述的方法，不可能获得适于食品或药剂成分的以结晶形式存在的纯的番茄红素，而仅可以以脱水、冻干或冷冻的形式用作食物着色剂。

番茄红素的另一个重要来源是富含类胡萝卜素的Dulaniella型的某些微藻。已描述了从这些生物中提取类胡萝卜素特别是番茄红素的多种不同方法，例如在US 5378369，US 4713398和US 4680314中，通过有机溶剂(氯甲酸，碳水化合物等)或食用油DE4342798进行萃取。在PCT WO98/08584中描述了一种不同的过程，番茄红素提取物是用CO₂在超临界态获得，但这样得到的提取物中番茄红素的纯度很低。

番茄红素可通过在液体培养基中发酵Mucorales真菌如Phycomyces，Blaleslea或Choanephora而获得，与从植物产物或藻类生产番茄红素的方法相比，这种方法的有利之处在于该化合物具有高的浓度，在一些情况下相对干生物质而言可达到5％(重量)以上(高于从最好的植物中获得的浓度)，而且利用传统的突变技术或应用分子生物学的新技术得到这些微生物的高产菌株，通过生物技术的发展，对这些微生物进行遗传操作，有可能提高番茄红素的含量和产量及删除其它结构相关的类胡萝卜素产物。

如上所述，从天然原料中制备高纯度结晶番茄红素一般需要一个用有机溶剂或流动相在超临界态进行萃取的过程，然后进行各种附加的纯化阶段如层析、吸附和洗脱过程以及沉淀或结晶阶段，如专利US 3369974，EP818255和EP242148所述。在大多数情况下，当不进行随后的纯化阶段时，可通过蒸发溶剂直接从提取物进行结晶，直到超过溶解度为止，这样得到的产物纯度很低，需对获得的低溶解度的番茄红素进行随后的重结晶过程，因此在重结晶阶段需要大量的溶剂，并伴有相当大的产量损失(NL 6411184，US 4439629)。

专利申请WO 96/13178描述了制备稳定于可食用的液体培养基中的结晶番茄红素浓缩物的方法，在该液体中番茄红素是不溶的，例如乙二醇，乙醇或甘油，通过研磨得到大小在1-3微米悬浮在液体培养基中的番茄红素晶体。

此外，专利申请WO 98/43620描述了从一种油性树脂中分离番茄红素晶体的方法，通过一个在高温下对各种甘油三酯和磷酸盐进行皂化的过程，随后用水进行洗脱，获得纯度在75-95％的番茄红素晶体。最近在国际申请WO 98/03480中描述了制备高纯度的β-胡萝卜素晶体的相似方法，通过用水、低分子量的醇或丙酮进行洗脱，但没有描述通过相似的方法来生产高纯度番茄红素晶体的应用。

发明概述

本发明涉及一种生产纯度提高的结晶番茄红素的方法，一般来说是从天然生物合成的原料，具体说是从发酵培养基开始，使用被认为是天然的溶剂进行生产。另一方面，天然溶剂是指那些毒物学上无害的和/或包括在ICH(国际协调会议)类3中的溶剂。

一般来说，该过程由以下阶段组成：

1)从天然生物合成的原料(例如发酵培养基)中进行湿生物质(wetbiomass)的分离。

2)通过用乙醇处理对湿生物质进行纯化。

3)从乙醇中分离纯化的生物质。

4)通过干燥加上其裂解或降解对纯化的生物质进行调理(conditioning)。

5)使用有机溶剂进行番茄红素的固相-液相萃取。

6)对富集的提取物进行浓缩。

7)加入醇类进行沉淀/结晶。

8)过滤。

9)干燥。

此处所描述的方法可使我们回收到纯度为90％以上的结晶番茄红素，优选可达到95％以上，更优选可达到98％以上。发明的详细描述

由于在发酵过程中生物合成的类胡萝卜素组分的胞内特性，从通用方法所制备的培养基中进行的回收过程包括从培养基中分离生物质的过程，其目的是消除或降低在无生物质培养基中的损失。

该分离方法通过以下所建立的方法进行：A)过滤，使用过滤器通过常规技术进行过滤，过滤器可以是带状过滤器，旋转过滤器，压滤等，在其中由过滤棉构成一个屏障，可对生物质进行分离，只允许无生物质的液体通过。或B)离心，利用培养基和生物质(通常密度更大)的密度不同，使用机器如离心机，玻璃瓶或其他同样的机器进行离心，其中重相被浓缩，并与含有尽可能少生物质的液相分离。本发明的其中一个目的是降低损失，优化各个阶段的特征以获得最大量的具最高含量干残余物的生物质，并除去大部分含有最少活性物质的发酵培养基。

由于湿菌丝含有发酵所产生的95％以上的类胡萝卜素，更好时达到97％，最好可达到99％以上。从而水相中类胡萝卜素的含量低于5％，更好时低于3％，最好时低于1％。

该菌丝的湿固体可通过随后的阶段进行番茄红素的分离，但发现由于发酵的缘故，它仍然含有相当高百分比的亲脂成分，在15-20％之间(脂肪酸和油)，这会在随后的纯化阶段中产生问题，因此我们在此处介绍生物质的纯化过程。

该纯化过程包括用大量的醇重悬生物质：该醇可以是甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇或其它番茄红素在其中的溶解度很低的醇类，以合适的比例使液体组分达到最大纯化。也就是说，重悬湿菌丝所用的醇量可在1ml/g与10ml/g湿菌丝之间变动。重悬温度可在室温与醇的沸点之间变动，接触时间可在5分钟到24小时之间变动。这样制备的醇重悬液通过过滤或离心，可使滤液或澄清液中的固体含量实际为零。这样得到的包含各种比例醇和水的湿菌丝中含有93％以上的发酵产生的类胡萝卜素，更好时可达95％以上，最好时可达97％以上。

这样产生的培养基残存物和醇的混合物中，类胡萝卜素的含量低于2％，更好时可低于1％。根据所用培养基的特性使用不同量的醇，通过这种醇处理，可能除去大量醇溶的亲脂性物质。进行这种预处理是非常重要的，可使我们获得高纯度的结晶终产物。另外，从最初的湿菌丝中除去不同比例的水可使干燥过程大为便利。

作为将生物质的分离与随后利用重悬进行纯化这两个阶段组合的可选择的方案，可以考虑使培养基与醇的直接混合物中测定的体积比接近1∶1，并维持最小接触时间，使得到的纯化效果与描述的两阶段方法相当，从而使该过程通过删除固相-液相分离操作而得到简化。

事实上，类胡萝卜素产物是胞内产物，这意味着纯化的生物质需通过干燥与研磨，干燥与裂解，或者生物质的直接裂解进行调理，从而提高与溶剂的混合及利于溶剂的萃取。

将脱水的/纯化的菌丝进行干燥。可通过一般的烤炉或连续过程进行干燥。干燥温度可在室温和150℃之间变动，最好不要超过60℃，更不要低于50℃。干燥时间根据所用的温度可在1小时到72小时之间变动。由于大气氧的氧化，这些类胡萝卜素可能发生分解，因此建议干燥操作在氮气或者至少在真空中这样的无氧环境中进行。

为了使溶剂更好的接触所要萃取的类胡萝卜素，首先需要进行菌丝裂解，以使接触面积达到最大。干燥破碎菌丝的最适颗粒大小必须小于3毫米，小于1毫米更好，最好小于0.5毫米。

可通过具旋转或固定零件的机械系统，如锤，筛等对干物质进行有效研磨，通过旋转柱的互相挤压或在喷射磨粉机的快速(瞬时的)干燥系统中进行，在那里湿产物在高温下被加入到气体回流中，通过滞留时间达到最小的方式使液体组分中的内容物达到气化，并根据密度的不同，将产物运输到气旋中进行回收。

在干燥和运送过程中，由于颗粒对壁的撞击，也有一个匀化效应。

可以用各种有机溶剂从上述调理的菌丝中提取番茄红素。本发明涉及所谓天然的食品级溶剂，如酰基酯，最好使用乙酸乙酯、乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯和乙酸异丁酯，它们既对类胡萝卜素组分有高溶解度，同时与属于ICH的3类溶剂相容。这些溶剂在国家和商业水平上，在制药和食品部门(RDL12/04/90和RDL16/10/96)都是允许的。

萃取温度在室温和溶剂的沸点之间变动，最好在50℃和80℃之间。萃取时间对溶解并不重要，可在1秒到1小时之间，优选在1分钟到15分钟之间。所用溶剂的量根据温度和菌丝中类胡萝卜素的丰度在5ml/g和20ml/g之间变动。萃取次数在1到3之间变动。萃取的类胡萝卜素的量大于85％，更好时大于90％，最好时大于95％。

一旦获得富含类胡萝卜素的提取物后，必须将它浓缩到一定体积。浓缩后类胡萝卜素在溶剂中的终浓度在10和40g/l之间变动。浓缩温度必须低于80℃，低于70℃更好，最好低于50℃。浓缩时间必须少于1小时，少于30分钟更好，最好是少于15分钟。

一旦提取物浓缩到所需体积，需要加入使类胡萝卜素不溶的试剂，具体是指醇类，更具体是指甲醇、乙醇、异丙醇等或其它番茄红素的溶解度在其中很低的醇类，从而使结晶番茄红素的产量得到较大提高。加入的醇类也有一个纯化效应，使产物比未加醇类时更纯。结晶时间在15分钟到24小时之间变动，在1小时到12小时之间更好，最好在3小时到8小时之间。结晶温度必须低于25℃，最好低于5℃。

可通过过滤或离心从母液中分离晶体，除去浸泡晶体的母液，并用同样的使晶体不溶的醇类进行洗涤。

获得的晶体在真空中室温下至少干燥1小时，直到残余溶剂的含量符合前面提到的通过立法规定的说明书中的最大含量。对番茄红素而言，规定其在干燥中的损失小于0.5％。

通过上述方法得到的晶体纯度大于95％，β-胡萝卜素含量低于3％，其它类胡萝卜素的含量低于2％。含量的测定是将晶体溶在正己烷(E1％1cm＝3450)中，利用分光光度法，在472nm处测定其吸收值。

获得的结晶产物可进行加工和销售，或以配方制剂组分的形式进行加工和销售，其中在该制剂中番茄红素的重量比在1至85％之间，其任选与各种不同酸度的赋形剂或化合物混合，如豆油、玉米油、橄榄油等，优选新鲜的或非常新鲜的橄榄油，并且任选加入维生素E型的抗氧化剂。

本发明中的方法特别适合于从微生物来源中回收结晶番茄红素，藻类、真菌或酵母更好，最好是毛霉目的真菌，特别是B.trispora。

通过本发明中的方法获得的晶体所达到的高纯度以及对所谓的天然溶剂的使用，使这些晶体可用于食品、制药或化妆品工业。

实施例1

收获3升培养基，其生物合成途径在番茄红素水平被中断。培养基的浓度是每升中含1.4g番茄红素。在布氏漏斗(用磁漏斗支撑一圆形滤纸或用纸板作为滤膜)中通过过滤回收培养基中的生物质，得到880克湿生物质。该湿生物质重悬在5.2升的恒沸异丙醇85/15中，搅拌30分钟。纯化的生物质再用布氏漏斗进行回收。

该生物质于低于45℃真空干燥18小时，直到残余溶剂的含量为1-2％。从而获得150克干燥的纯生物质，其番茄红素含量相当于2.75％的浓度。

干燥的生物质用具1毫米狭缝的锤式研磨机进行研磨，并进行调理，这样得到的固体具有同样的特定强度，可用溶剂进行萃取。

在70℃将150克磨碎的生物质与1500毫升乙酸异丁酯混合，搅拌5分钟。用滤盘通过过滤从富集溶剂中分离处理过的生物质。然后用300毫升热的乙酸异丁酯在同一个滤盘中洗涤处理过的生物质，并合并这两个溶剂。所有这些富含乙酸异丁酯的溶剂在真空中浓缩，保持温度低于45℃，直到体积减少至200毫升，以使番茄红素部分结晶。为了完成结晶并获得更纯的番茄红素，需加入600毫升异丙醇。该混合物在氮气下于0-5℃的范围内搅拌3小时。用布氏漏斗进行过滤，并在布氏漏斗中用25毫升异丙醇洗涤晶体。收集晶体并进行干燥，得到3.3克纯度为94％的番茄红素晶体。

实施例2

培养500升发酵培养基，直接与500升含水共沸异丙醇(异丙醇/水为85/15)混合。搅拌30分钟后，在滤压下通过过滤从液体中分离生物质。大约可收集到130千克湿的纯化的生物质。

该生物质在烤炉中真空干燥18小时，直到残余溶剂的含量为1-2％。干燥温度低于45℃，时间为12-24小时。从而获得30千克生物质，其番茄红素含量相当于3％的特定浓度，尽管其纯度稍低，但实际上与实施例1相同。

干燥的生物质用具1毫米狭缝的锤式研磨机进行研磨，并进行调理，这样得到的固体具有同样的特定浓度，可用溶剂进行萃取。

在70℃将30千克磨碎的固体与350升乙酸异丁酯混合，搅拌15分钟。用滤盘通过过滤从富集溶剂中分离处理过的生物质。然后用100升热的乙酸异丁酯在同一个滤盘中洗涤处理过的生物质，滤液与前面的溶剂混合。所有这些富含乙酸异丁酯的溶剂在真空中浓缩，保持温度低于45℃，直到体积减少至65升，以使番茄红素部分结晶。为了完成番茄红素的结晶，需加入180升异丙醇。该混合物冷至0-5℃时搅拌3小时。用布氏漏斗进行过滤，收集番茄红素晶体并进行干燥，根据分光光度的测定，得到500克纯度为94％的产物。

Claims (11)

1.一种从任何生物合成的天然原料中获得番茄红素的方法，其特征在于包含如下步骤：

●直接用醇类处理生物合成的天然原料，并分离湿的纯化的生物质；

●通过干燥与裂解或降解，对湿的纯化的生物质进行调理；

●用有机溶剂对纯化的生物质中含有的番茄红素进行固相-液相萃取；

●浓缩富含番茄红素的提取物；

●加入醇，从浓缩的提取物中沉淀/结晶番茄红素；

●过滤；

●干燥。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于生物合成的天然原料是微生物的发酵培养基。

3.按照权利要求1和2中任何一个的方法，其特征在于获得的结晶番茄红素产物的含量大于95％，β-胡萝卜素的含量低于3％，其它类胡萝卜素的含量低于2％，其中含量的测定是在472nm(E1％1cm丙酮中3450)通过分光光度法测定其吸收值进行的。

4.按照权利要求1-3中任何一个的方法，其特征在于生物质的纯化是在醇∶生物质的比例为1∶1到10∶1之间进行的。

5.按照权利要求1-4中任何一个的方法，其特征在于醇可在0℃与该醇的沸点之间的温度范围内使用，优选在10℃-50℃之间，更优选在室温与40℃之间。

6.按照权利要求1中的方法，其特征在于固相-液相萃取阶段所用的溶剂为酯类溶剂，最好是乙酸乙酯、乙酸丙酯，乙酸异丙酯，乙酸丁酯或乙酸异丁酯。

7.按照权利要求6中的方法，其特征在于根据生物质的重量，使用了10至20倍体积的溶剂，优选10至15倍体积的溶剂。

8.按照权利要求6和7中任何一个的方法，其特征在于溶剂在接近其沸点的温度使用，优选在40℃和80℃之间，更优选在60℃至70℃之间。

9.按照权利要求6至8中任何一个的方法，其特征在于溶剂使用的方式是其与番茄红素的接触时间少于10分钟。

10.按照权利要求1中的方法，其特征在于萃取后浓缩产物的沉淀是通过加入对番茄红素溶解度低的化合物如甲醇、乙醇或异丙醇而进行，并且在该化合物中与番茄红素伴生的亲脂性物质是可溶的。

11.按照权利要求1中的方法，根据该方法获得的产物可以以结晶形式进行加工和销售，或以配方制剂组分的形式进行加工和销售，其中在该制剂中番茄红素的重量比在1至85％之间，优选在15至50％之间，其任选与各种不同酸度的赋形剂或化合物混合，如豆油、玉米油、橄榄油等，优选新鲜的或非常新鲜的橄榄油，并且任选加入维生素E型的抗氧化剂。