JP2003507021A - リコペンの製造方法 - Google Patents

リコペンの製造方法

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JP2003507021A JP2001516919A JP2001516919A JP2003507021A JP 2003507021 A JP2003507021 A JP 2003507021A JP 2001516919 A JP2001516919 A JP 2001516919A JP 2001516919 A JP2001516919 A JP 2001516919A JP 2003507021 A JP2003507021 A JP 2003507021A
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デ カストロ、アントニオ エストレッラ
デ ラ ヴィエヤ、アルフォンソ ジェイ コラドス
ベルナスコーニ、エルマンノ
モラレス、マニュエル エステバン
デ プラド、エミリアーノ ゴンザレス
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ビタテネ、ソシエダッド アノニマ
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Abstract

(57)【要約】 リコペンの製造方法。本発明は一般的に、天然生合成ソースに出発して、ケカビ目（Mucorales fungi）たとえばBlakeslea（イトエダカビ），Choanephora（コウガイケカビ）またはPhycomyces（ヒゲカビ）の深部培養から、カロテノイド、とくにリコペンを得る方法に関する。記載された方法によれば、回収工程の単純化および生成物の純度の増大を達成することができる。本発明の方法は、以下の工程からなる：1）天然の生合成ソース（たとえば、発酵培地）のアルコールでの直接処理および湿潤バイオマスの分離、2）精製バイオマスの乾燥プラス崩壊または分解による調整、3）リコペンの有機溶媒による固体−液体抽出、4）濃厚な抽出液の濃縮、5）アルコールの添加による沈殿／結晶化、6）ろ過、7）乾燥。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、生合成の天然のソースから出発する原理によって、リコペンを単離
および精製する新規な方法に関し、さらに具体的にはケカビ（Mucorales fungi
）目、たとえばBlakeslea（イトエダカビ），Choanephora（コウガイケカビ）ま
たはPhycomyces（ヒゲカビ）の深部培養からヒト消費のために結晶型で単離精製
する方法に関する。以前に記載された方法に比較して、回収過程を単純化し、生
成物の純度の増大を達成することができる抽出方法が記載されている。
【０００２】 （発明の背景） 果実および野菜中、天然に広く存在するカロテノイド色素は、多くの天然物質
、たとえばニンジン、コショウ、トマト、花またはある種の微生物に黄色から暗
赤色に及ぶ特徴的な色を与える。それらは2つのクラスに分類される。すなわち
、純粋な炭化水素たとえばβ−カロテン、α−カロテンまたはリコペンのような
化合物を包含するカロテン類、ならびに酸化機能を有するキサントフィル類（こ
のタイプの例にはアスタキサントリン、キャプサンチンまたはカンタキサンチン
がある）である。この2群の化合物は、それらの物理化学的性質に関して異なる
挙動および有機溶媒に対する異なる溶解性を示す。
【０００３】 これらの化合物はすべて、ヒト食事中で重要な役割を果たしていて、癌および
他のヒト疾患に対する予防のための抗酸化剤としておよびビタミンA前駆体とし
てのそれらの性質が広範囲に研究されてきた。さらに、それらの黄色から赤色の
色調により食品添加物およびマーガリン、バター、油、スープ、ソース等の着色
剤として使用されている（Ninetら, Microbial Technology 2nd Edn. Vol. 1, 5
29-544, 1979, Academic Press NY, Eds. Peppler HJ & Perlman D）。
【０００４】 リコペンは、炭化水素カロテノイドに属するβ−カロテンおよびキサントフィル
スの生合成経路における中間体として産生されるカロテノイドの１種である。そ
の実験式はC40H56, その分子量は536.85であり、以下の分子式を有する。
【０００５】
【０００６】 この化合物の性質は広範に検討されている。すなわち、その抗酸化性は、ヒト生
体内で絶えず産生されている遊離ラジカルの捕獲、ならびに心脈管系疾患および
一部のタイプの癌たとえば前立腺癌の予防へのその適用（Giovannucciら, J. Na
t. Cancer Inst. 87: 1767-1776, 1995; Stahlら, Arch. Biochem. Biophys. 33
6: 1-9, 1996; Clintonら, Nutr. Rev. 56: 35-51, 1998）が報告されている。
これにより、消費者の側からの要求が増大して、したがって、工業界側は化学合
成によりリコペンを製造することによってこの要求を満たすことを試みてきた。
【０００７】 高純度化合物としてのリコペンの製造は過去には化学合成によっている（US 5
208381; US 5166445; US 4105855; US 2842599）。これらの方法は、天然起源の
ソースに出発し特異的な抽出過程を組み合わせた別経路がさらに有利であり、こ
れらの物質を得るためのいわゆる「天然経路」を構成すると考えられることから
、現在、討議の主題になっている。
【０００８】 いわゆる「天然経路」によって、リコペンは植物製品たとえばトマト、ニンジ
ン、コショウ、植物油等に出発して得ることができる。たとえば、WO97/48287に
はトマトからのリコペンに富んだ油性樹脂の製造方法が記載されている。すなわ
ち、トマトをどろどろの果肉が得られるまで潰し、有機溶媒で果肉からリコペン
を抽出し、ついで溶媒を蒸発させて除去すると、リコペン含量２〜10％の範囲の
油性樹脂が得られる。
【０００９】 一般にカロテノイドとくにリコペンに富む油性樹脂を、とくに植物および油脂
から得る同様の方法は、カルシウム塩での沈殿による方法が様々な特許、US 524
5095およびEP 580745に、油脂によるエステル交換ついで蒸留による方法を使用
するUS 5019668に記載され、WO95/16363にはトマトをカロテノイドに富む油性樹
脂を包含する様々な分画に分画化する方法が、PST WO90/08584には超臨界状態で
液体を用いるリコペンの抽出方法が記載されているが、得られる抽出液は様々な
カロテノイドの混合物であり、抽出の収率はその低い溶解度のためにきわめて低
い。
【００１０】 これらのすべての場合、これらの天然産物におけるリコペンの低濃度、および
この化合物のある種のオルガネラたとえばクロロプラストまたはクロモプラスト
における細胞内分布により、リコペンに富んだ油性樹脂もしくは脱水生成物が様
々な量の他のカロテノイドまたは非カロテノイド化合物とともに産生するので、
得られる抽出収率および生成物の純度は低い。多くの場合、記載された抽出方法
は、溶媒による抽出を容易にするため、粉砕および押し出しによる果肉の調製な
らびにリコペンに富む細胞中含有物の放出がまず要求される。最後に、これらの
特許に記載された大部分の方法では、有機溶媒の使用が必要であり、これが得ら
れる油性樹脂中に痕跡として残留するように思われる。
【００１１】 同様に、特許IL 107999にはトマトのどろどろの果肉に出発するリコペンにき
わめて富んだ油性樹脂の製造が記載されているが、前述の場合と全く同様に、高
純度のリコペン結晶は得られず、リコペンに富んだ脂質濃縮物が得られるのみで
ある。
【００１２】 他方、WO97/15554には、リコペンを包含するニンジンおよびトマトに出発して
植物起源のカロテノイドを、クロロプラストおよびクロモプラストの単離、つい
で様々な構造のタンパク質に連結したリコペンの放出を可能にするペクチンおよ
び／またはプロテアーゼのようなタンパク質を加水分解する酵素による上記オル
ガネラの消化が記載されている。ついで、低分子量化合物のアルカリ処理および
アルコール混合物での抽出により、油性樹脂よりも大きな収率および純度のリコ
ペン抽出物を得ることができるが、リコペンの精製結晶ではなく、リコペンに富
んだ粗製の抽出物が得られるにすぎない。
【００１３】 さらに特許EP 608027 A2には、リコペンの濃縮抽出液を、リコペンが結晶型で
存在するトマトのクロモプラストの単離によって得る方法が記載されている。ト
マトクロモプラストからのこれらのリコペンに富んだ抽出液は、ついでリコペン
結晶を抽出することなくそのまま使用して、抽出時にリコペンの色調の変化を回
避し、有機溶媒の使用を不必要にする。その特許に記載された方法によれば、食
品または医薬組成物への使用に適当な結晶型での純粋なリコペンを得ることは不
可能であり、脱水型、凍結乾燥型または凍結型の食品着色剤が得られるにすぎな
い。
【００１４】 リコペンの他の重要なソースは、カロテノイドに富むドラニエラ型のある種の
微生物藻類である。これらの生物体から、カロテノイドおよびとくにリコペンを
抽出する様々な方法、たとえば、有機溶媒（クロロカルボン酸エステル、炭化水
素等）での抽出がUS 5378369, US4713398およびUS4680314に、食用油での抽出が
DE 4342798に記載されている。別の方法がPST WO98/08584に記載されていてこの
方法ではリコペン抽出液は超臨界状態においてCO2を用いて得られるが、得られ
た抽出液はリコペンに関しては純度が低い。
【００１５】 リコペンは液体培地中発酵により、ある種のケカビ、たとえば Phycomyces, B
lakesleaまたはChoanephoraから得ることが可能であり、植物産物または藻類か
らのリコペンの製造に比較して、これらは場合により、乾燥バイオマスの量に対
して5重量％以上の高濃度な利点（最善の植物品種から得られるよりも高濃度）
ならびに古典的な突然変異誘発またはこれらの微生物の遺伝子操作によってリコ
ペンの濃度および産生を増加させると同時に他の構造的に類似するカロテノイド
を消失させることを可能にする分子生物学的な新技術の適用のいずれかによるこ
れら微生物の過剰産生株のバイオテクノロジー的な開発の可能性に比較して利点
を有する。
【００１６】 天然のソースから高純度の結晶性リコペンの製造には一般的に、既に述べたよ
うに超臨界状態における有機溶媒または液体での抽出工程、ついで様々な付加的
精製工程たとえばクロマトグラフィー、吸着および溶出方法、ならびにたとえば
特許US 3369974, EP 818255およびEP 242148に記載されているような、沈殿また
は結晶化の工程を要求する。これらの続く精製工程を使用しないで、結晶化を溶
媒が生成物の溶解度を越えるまで蒸発させることにより抽出液から直接行う場合
には大抵の場合、得られた生成物の純度はきわめて低く、ついで、得られたリコ
ペンの再結晶過程の実施を必要とし、生成物の低い溶解度のために、再結晶工程
を実施するには大量の溶媒を必要とし、同時に収率にもかなりの低下がある（NL
6411184, US 4439629）。
【００１７】 特許出願WO96/13178には、リコペンが不溶性の、たとえばエチレングリコール
、エタノールまたはグリセロールのような食品に適合性のある液体メジウム中で
安定化された結晶性リコペンの濃縮物を、液体メジウムに懸濁して１〜３μmに
微粉化することによって小サイズのリコペン結晶を得る製法が記載されている。
【００１８】 さらに、特許出願WO98/43620には、油性樹脂から、各種トリグリセライドおよ
びホスホン酸エステルの高温での鹸化、ついで水による希釈でリコペン結晶を単
離し、純度75〜95％の純度のリコペン結晶を得る方法が記載されている。最近、
国際特許出願WO98/03480に類似の方法が、水、低分子量アルコールまたはアセト
ンで洗浄することによって高純度のβ−カロテン結晶を製造する方法について記
載されているが、類似の方法による高純度のリコペン結晶の製造へのその応用は
記載されていない。
【００１９】 （発明の開示） 本発明は一般的に、天然の生合成ソースから出発して高純度の結晶性リコペン
の製造に関し、さらに具体的には発酵培地から、天然ソースとみなされる溶媒を
使用する結晶性リコペンの製造に関する。天然溶媒とみなされるものには、一方
では毒性学的に無害な溶媒および／またはICH（ハーモニゼーションの国際会議
）のクラス３に包含される溶媒がある。
【００２０】 一般的に本発明の方法は、以下の各工程： 1）天然の生合成ソース（たとえば、発酵培地）からの湿潤バイオマスの分離
、 2）湿潤バイオマスのアルコール処理による精製、 3）精製バイオマスのアルコールからの分離、 4）精製バイオマスの乾燥プラス崩壊または分解による調整、 5）リコペンの有機溶媒による固体−液体抽出、 6）濃厚な抽出液の濃縮、 7）アルコールの添加による沈殿／結晶化、 8）ろ過、 9）乾燥 から構成される。
【００２１】 本明細書に記載の方法によれば、純度90％以上、好ましくは95％以上、さらに
好ましくは98％以上の結晶性リコペンの回収を可能にする。
【００２２】 （発明の詳細な説明） 発酵により生合成されたカロテノイド成分の細胞内における特徴により、通常
の方法に従い製造された培養培地からの回収方法にはバイオマスを含まない培地
中へのロスを消失または減少させるための培地からのバイオマスの分離が包含さ
れる。
【００２３】 この分離は、確立された方法により、A）フィルター、たとえばバンドフィル
ター、ロータリーフィルター、プレスフィルター等の通常の技術を使用し、フィ
ルタークロスによって構築されたバリヤーがバイオマスを分離し、バイオマスを
含まない液相は通過させるろ過、またはB）培地とバイオマス（通常、こちらの
方が多い）の間の密度差を利用して、重い相を濃縮し、可能な限り少量のバイオ
マスを伴う液相から分離する機械たとえば遠心分離器、デカンター等が使用され
る遠心分離により行われる。乾燥残留物の含量が最も高いバイオマスを得て、活
性物質の最低量を含む発酵培地の大部分を除去するように、それぞれの相のロス
を減少させ、それらの相の性質を至適化することが本発明の一つの目的である。
【００２４】 得られる湿潤した菌糸体は発酵によって産生したカロテノイドの95％以上、好
ましくは97％以上、さらに好ましくは99％以上を含有する。水相におけるカロテ
ノイド含量はしたがって、５％未満、好ましくは３％未満、さらに好ましくは１
％未満である。
【００２５】 菌糸体のこの湿潤した固体は次の工程によりリコペンの分離が可能な状態には
あるが、発酵に関連して、次の工程で精製に問題を生じる親油性成分の比較的高
率、15〜20％（脂肪酸および油脂）が依然として存在し、これが、この時点で、
本発明者らにバイオマスの精製工程を挿入させることになった。
【００２６】 この精製工程は、ある量のアルコール：メタノール、エタノール、プロパノー
ル、イソプロパノール、またはリコペンの溶解度がきわめて低い任意の他のアル
コール中にバイオマスを、液体成分の最大精製を与えるのに適当な比率で再懸濁
することを包含する。すなわち、湿潤した菌糸体1 gあたり1 mL〜10 mL量のアル
コールに再懸濁する。再懸濁液の温度は室温からアルコールの沸点までの温度で
変動させることができる。接触時間は５分〜24時間とする。このようにして調製
されたアルコール性再懸濁液を、ろ液または澄明化した液体中の固体含量が実質
的に０になるようにろ過または遠心分離する。アルコールおよび水を様々な比率
で含有する、得られた湿潤菌糸体は発酵で生成したカロテノイド93％以上、好ま
しくは95％以上、さらに好ましくは97％以上を含有する。
【００２７】 得られたアルコールと培養培地残留物の混合物中におけるカロテノイドの含量
は２％未満、好ましくは１％未満である。アルコールとのこの処理により、使用
された培養培地の性質に依存して様々な量の多くのアルコール可溶性親油性物質
を除去することが可能であって、前精製の実施はきわめて重要であり、それによ
り高純度の結晶性最終産物の取得が可能になる。さらに、乾燥過程は最初の湿潤
菌糸体から様々な比率の水を除去することによって著しく容易になる。
【００２８】 バイオマスの分離およびついで再懸濁によるその精製の２工程を組み合わせた
別法として、培養培地をアルコールと１：１に近い容量比で直接混合し、最小限
の接触時間維持し、２工程法について記載した効果と均等な精製効果を達成して
この固体−液体分離操作を消失させることによる単純化が考慮される。
【００２９】 カロテノイド産物が細胞内に存在するという事実は、精製されたバイオマスが
バイオマスの乾燥プラス粉砕、乾燥プラス崩壊または直接崩壊のいずれかによる
調整を要求することを意味し、それによって溶媒との混合が促進され、溶媒抽出
が容易になる。
【００３０】 脱水／精製菌糸体は乾燥される。乾燥は通常のバッチまたは連続過程によって
行うことができる。乾燥温度は室温から150℃までの温度で変動させることがで
きるが、好ましくは60℃を越えてはならず、さらに好ましくは50℃以下でなけれ
ばならない。乾燥時間は使用した温度に依存し、1〜72時間とすることができる
。これらのカロテノイドの空気中酸素による酸化の可能性があるので、この乾燥
操作は酸素の不存在下に、窒素中または少なくとも真空で実施することが薦めら
れる。
【００３１】 抽出されるカロテノイドへの溶媒の良好な接近性を得るには、接触面積を最大
にするために菌糸体の分解操作が前もって要求される。乾燥され、破壊された菌
糸体の至適な粒子サイズは３mm未満、好ましくは１mm未満、さらに好ましくは0.
5 mm未満でなければならない。
【００３２】 粉砕は乾燥生成物に対して回転または固定部分を有する機械的システム、すな
わちハンマー、篩等を用いて回転シリンダーを通して互いに圧縮させるかまたは
ジェットミル中の急速（即時）乾燥システムにより、この場合、湿潤生成物を高
温気体の循環流中に供給して、滞在時間を最小にして液体成分内容物の蒸発を達
成し、密度差により生成物をサイクロンに輸送して回収する。
【００３３】 乾燥および輸送時に、粒子が壁に衝突して均一化も行われる。
【００３４】 様々な有機溶媒が、上述の調整菌糸体からのリコペンの抽出に使用できる。本
発明は、天然溶媒とみなされる食品用等級の溶媒、たとえばアシルエステル、好
ましくは酢酸エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルおよびイソブチルの使用
に関し、これはカロテノイド成分の合理的な高い溶解度と、ICHのクラス３に包
含される溶媒としての適合性を兼ね備えている。これらの溶媒は全国的および地
域社会的の両レベルにおいて、医薬および食品セクターで承認されている（RDL
12/04/90 およびRDL 16/10/96）。
【００３５】 抽出温度は室温から溶媒の沸点の間、好ましくは50℃〜80℃で変動させること
ができる。抽出時間は溶解に必要な最小時間、１秒〜１時間、好ましくは１分〜
15分である。使用される溶媒の量は温度および菌糸体のカロテノイドの濃度に依
存し、５mL/g〜20 mL/gで変動する。抽出回数は１〜３回である。抽出されるカ
ロテノイドの量は85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上で
ある。
【００３６】 カロテノイドに富んだ抽出液が得られたならば、それをある容量にまで濃縮し
なければならない。濃縮後の溶媒中カロテノイドの最終濃度は10〜40 g/Lを変動
する。濃縮温度は80℃未満、好ましくは70℃未満、さらに好ましくは50℃未満で
なければならない。濃縮時間は１時間未満、好ましくは30分未満、さらに好まし
くは15分未満でなければならない。
【００３７】 抽出液が要求容量に濃縮されたならば、カロテノイドを不溶性にする物質を加
える必要がある。具体的にはアルコールを、さらに具体的にはメタノール、エタ
ノール、イソプロピルアルコール等、またはリコペンの溶解度がきわめて低く、
結晶性リコペンの収率をかなり増大させる任意の他のアルコールを加える。アル
コールの添加も精製効果を有し、アルコールを加えない場合よりも純粋な生成物
を与える。結晶化時間は15分〜24時間の間で変動し、好ましくは１〜12時間、さ
らに好ましくは３〜８時間である。結晶化温度は25℃未満、好ましくは5℃未満
としなければならない。
【００３８】 結晶は母液からろ過または遠心分離によって、結晶が浸漬された母液を除去し
、それらを不溶性にしたのと同じアルコールで洗浄して分離することが可能であ
る。
【００３９】 得られた結晶は真空中、室温で、少なくとも1時間、残留溶媒含量が前述の法
規によって規定された最大濃度のスペックに合致するまで乾燥する。リコペンの
場合には乾燥減量＜0.5％として規定されている。
【００４０】 上述の方法によって得られる結晶の純度は、ｎ−へキサンに溶解した（E 1％
1 cm＝3450）472 nmにおける吸収の分光光度法での測定により定量して、95％以
上であり、β−カロテンの含量は３％未満、他のカロテノイドの含量は２％未満
である。
【００４１】 得られた結晶性生成物はそのまま、または様々な賦形剤または化合物この場合
は様々な程度および純度の大豆油、トーモロコシ油、オリーブ油等とリコペンを
比率１〜85％に混合し、さらにトコフェロール型の抗酸化剤を加えた組成物の部
分を形成させて取り扱いまたは市販することができる。
【００４２】 本発明の方法はとくに、微生物ソース、好ましくは藻類、カビまたは酵母から
、さらに好ましくはケカビ目のカビから、さらに好ましくはB. trisporaから結
晶性リコペンを回収するのに適している。
【００４３】 本発明の方法によって達成される異例の純度および天然溶媒とみなされる溶媒
の使用は、これらの結晶が食品、医薬または化粧品工業において使用できること
を意味する。
【００４４】 （実施例） 実施例１ 生合成経路がリコペンのレベルで中断される生合成方法に相当する、発酵培地
3 Lを収穫する。培養培地の濃度は1 Lあたりリコペン1.4 gである。この培地の
バイオマスをブフナーろ斗（フィルター膜として機能する紙またはボール紙のデ
ィスクを支持する陶器製のフィルター）でろ過して回収し、880 gの湿潤バイオ
マスが得られる。湿潤バイオマスをイソプロパノール85/15の共沸混合物5.2 Lに
再懸濁し、30分間攪拌する。精製されたバイオマスを回収のためにブフナーろ斗
に戻す。
【００４５】 このバイオマスを乾燥器中真空下に45℃未満の温度で18時間、残留した溶媒の
含量が１〜２％のオーダーに低下するまで乾燥する。リコペンの含量が2.75％に
相当する、乾燥した精製バイオマス150 gが得られる。
【００４６】 乾燥バイオマスを1 mmの篩付きのハンマーミル中で粉砕して、同じ特異的な濃
度を有し、溶媒抽出が可能なように調整された固体を得る。
【００４７】 抽出は1500 mLの酢酸イソブチルと粉砕バイオマス150 gを70℃で混合し、これ
を5分間攪拌することにより行う。消費されたバイオマスを濃厚な溶媒からフィ
ルタープレートを通してろ過して分離する。消費されたバイオマスを、同じフィ
ルター上で300 mLの熱酢酸イソブチルで洗浄し、２種の溶媒を混合する。濃厚な
酢酸ブチルすべてを真空下、温度を45℃に保ちながら、容量が200 mLに低下する
まで濃縮すると、リコペンが一部結晶化してくる。結晶化を完結させて純粋なリ
コペンを得るため、600 mLのイソプロパノールを加える。混合物を窒素下、０〜
５℃の範囲で３時間攪拌する。それをブフナーろ斗に通してろ過し、結晶をブフ
ナーろ斗上25 mLのイソプロパノールで洗浄する。結晶を集め、乾燥すると純度9
4％のリコペン結晶3.3 gが得られる。
【００４８】 実施例２ 500 Lのオーダーの一定量の発酵培地を培養する。それを水85-15との共沸イソ
プロパノール500 Lと直接混合する。30分間攪拌したのち、バイオマスをフィル
タープレス上でろ過して液体から分離する。約130 kgの湿潤した精製バイオマス
が収集される。
【００４９】 このバイオマスを乾燥器中真空下に、残留溶媒の含量が１〜２％のオーダーに
低下するまで乾燥する。温度45℃未満、時間は12〜24時間のオーダーとする。バ
イオマス30 kgが得られ、これは３％の特異的な濃度に相当するリコペン含量お
よび実施例１におけるのと実質的に等しいが、若干低い純度を有する。
【００５０】 乾燥バイオマスを1 mmの篩付きのハンマーミル中で粉砕して、同じ特異的濃度
を有し、溶媒抽出が可能なように調整された固体を得る。抽出は350 Lの酢酸イ
ソブチルと粉砕固体30 kgを70℃で混合し、これを15分間攪拌することにより行
う。消費されたバイオマスを濃厚な溶媒からフィルタープレートを通してろ過し
て分離する。消費されたバイオマスを、同じフィルター上で100 Lの熱酢酸イソ
ブチルで洗浄する。ろ液を前の溶媒と混合する。濃厚な酢酸ブチルすべてを真空
下、温度を45℃に保ちながら、容量が65 Lに低下するまで濃縮すると、リコペン
が一部結晶化してくる。リコペンの結晶化を完結させるために、180 Lのイソプ
ロパノールを加える。混合物を０〜５℃に冷却しながら３時間攪拌する。それを
ブフナーろ斗でろ過し、リコペンの結晶を集め、乾燥する。分光光度法により94
％の純度を有する生成物500 gが得られる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年９月２８日（２００１．９．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】 この精製工程は、ある量のアルコール：メタノール、エタノール、プロパノー
ル、イソプロパノール、またはリコペンの溶解度がきわめて低い任意の他のアル
コール中にバイオマスを、液体成分の最大精製を与えるのに適当な比率で再懸濁
することを包含する。すなわち、湿潤した菌糸体1 gあたり1 mL〜10 mL量のアル
コールに再懸濁する。再懸濁液の温度は０℃からアルコールの沸点までの温度で
変動させることができる。接触時間は５分〜24時間とする。このようにして調製
されたアルコール性再懸濁液を、ろ液または澄明化した液体中の固体含量が実質
的に０になるようにろ過または遠心分離する。アルコールおよび水を様々な比率
で含有する、得られた湿潤菌糸体は発酵で生成したカロテノイド93%以上、好ま
しくは95％以上、さらに好ましくは97％以上を含有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】 得られたアルコールと培養培地残留物の混合物中におけるカロテノイドの含量
は2％未満、好ましくは1％未満である。アルコールとのこの処理により、使用さ
れた培養培地の性質に依存して様々な量の多くのアルコール可溶性親油性物質を
除去することが可能であって、前精製の実施はきわめて重要であり、それにより
高純度の結晶性最終産物の取得が可能になる。さらに、乾燥過程は最初の正味の
菌糸体から様々な比率の水を除去することによって著しく容易になる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】 バイオマスの分離およびついで再懸濁によるその精製の２工程を組み合わせた
別法として、培養培地をアルコールと１：１〜１０：１の容量比で直接混合し、
最小限の接触時間維持し、２工程法について記載した効果と均等な精製効果を達
成してこの固体−液体分離操作を消失させることによる単純化が考慮される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】 抽出温度は室温から溶媒の沸点の間、好ましくは40℃〜80℃で変動させること
ができる。抽出時間は溶解に必要な最小時間、１秒〜１時間、好ましくは１分〜
15分、さらに好ましくは10分未満である。使用される溶媒の量は温度および菌糸
体のカロテノイドの濃度に依存し、5 mL/g〜20 mL/gで変動する。抽出回数は１
〜３回である。抽出されるカロテノイドの量は85％以上、好ましくは90％以上、
さらに好ましくは95％以上である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】 得られた結晶性生成物はそのまま、または様々な賦形剤または化合物この場合
は様々な程度および純度の大豆油、トーモロコシ油、オリーブ油等とリコペンを
比率１〜85w/w％、好ましくは15〜50w/w％に混合し、さらにトコフェロール型の
抗酸化剤を加えた組成物の部分を形成させて取り扱いまたは市販することができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベルナスコーニ、エルマンノ スペイン国 レオン、アベニダ デ アン ティバイオティコス、59／61 (72)発明者 エステバン モラレス、マニュエル スペイン国 レオン、アベニダ デ アン ティバイオティコス、59／61 (72)発明者 ゴンザレス デ プラド、エミリアーノ スペイン国 レオン、アベニダ デ アン ティバイオティコス、59／61 Ｆターム(参考） 4B064 AH01 CA05 CE08 CE15 CE16 4C076 CC03 DD59 EE53 4C206 AA04 BA02 MA03 MA05 NA20 ZC37 ZC41

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生合成の天然ソースからリコペンを得る方法において、以下
    の工程： 生合成天然ソースのアルコールによる直接処理および湿潤した精製バイオマス
    の分離、 湿潤した精製バイオマスの乾燥プラス崩壊または分解による調整、 精製バイオマスに含まれるリコペンの有機溶媒による固体−液体抽出、 リコペンに富んだ抽出液の濃縮、 アルコールの添加による濃縮抽出液からのリコペンの沈殿／結晶化、 ろ過、 乾燥 を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 生合成天然ソースは微生物発酵培地である「請求項１」記載
    の方法。
  3. 【請求項３】 結晶性リコペン生成物は、472 nmにおける吸収の測定による
    分光光度法（アセトン 3450中E1％ 1 cm）で確立されたその含量が95％以上、β
    −カロテンの含量が3％未満、他のカロテノイドの含量が2％未満であることを特
    徴とする「請求項１および２」のいずれかに記載の方法。
  4. 【請求項４】 バイオマスはアルコール：バイオマスの比が1：1〜10：1の
    オーダーであることを特徴とする「請求項１〜３」のいずれか一つに記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 アルコールは、０℃からそのそれぞれの沸点に相当する温度
    まで、好ましくは10〜50℃、さらに好ましくは室温から40℃までの温度で使用す
    ることを特徴とする「請求項１〜４」のいずれか一つに記載の方法。
  6. 【請求項６】 エステル型の溶媒、好ましくは酢酸エチル、酢酸プロピル、
    酢酸イソプロピル、酢酸ブチルまたは酢酸イソブチルを固体−液体抽出の工程で
    使用する「請求項１」記載の方法。
  7. 【請求項７】 バイオマスの重量に対して10〜20容量のオーダーの溶媒量、
    好ましくは10〜15容量／重量を使用する「請求項６」記載の方法。
  8. 【請求項８】 溶媒はその沸点に近い温度で、好ましくは40〜80℃、さらに
    好ましくは60〜70℃で使用する「請求項６および７」のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 溶媒はリコペンとの接触時間が10分未満となるように使用す
    る「請求項６〜８」のいずれかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 抽出後の濃縮生成物の沈殿はリコペンの溶解度が低い化合
    物たとえば、メタノール、エタノールまたはイソプロパノール、およびリコペン
    を溶存させる親油性特徴を有する物質の添加によって行う「請求項１」記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 得られた生成物はそのまま結晶の形態としてまたはリコペ
    ンの比率を1〜85％、好ましくは15〜50w/w％として任意に様々な賦形剤もしくは
    化合物たとえば様々な酸度を有する大豆油、トーモロコシ油およびオリーブ油、
    好ましくは１回の圧搾により得られたもしくはそれをさらに精製したオリーブ油
    、ならびに任意にトコフェロール型の抗酸化剤と混合してなる製剤の部分を形成
    させて処理および市販できる「請求項１」記載の方法。
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