ES2861529T3 - Métodos para la producción de carotenoides a partir de subproductos de fermentación - Google Patents

Abstract

Un método para extraer un carotenoide del aceite que contiene subproductos de la conversión fermentativa del almidón; en donde el subproducto se selecciona del grupo que consiste en grano húmedo de destilería (DWG), granos secos de destilería (DDG), solubles de destilería (DS), solubles secos de destilería (DDS), grano seco de destilería con solubles (DDGS) y mezclas de los mismos; que comprende las etapas de: i) Convertir el material que contiene almidón en azúcares fermentables ii) Fermentar los azúcares fermentables con un microorganismo iii) Separar el subproducto de dicha fermentación iv) Recuperar el aceite del subproducto v) Poner en contacto el aceite con un material de adsorción sólido vi) Separar el material de adsorción sólido que contiene el aceite vii) Extraer un carotenoide de dicho material de adsorción mediante el uso de terc-butilmetiléter.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la producción de carotenoides a partir de subproductos de fermentación

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a métodos para extraer carotenoides como p-caroteno o luteína del aceite que contiene subproductos de la conversión fermentativa del almidón, en particular de un proceso de fermentación de etanol, en donde el subproducto se selecciona del grupo que consiste en grano húmedo de destilería (DWG), granos secos de destilería (DDG), solubles de destilería (DS), solubles secos de destilería (DDS), grano seco de destilería con solubles (DDGS) y sus mezclas.

Antecedentes de la divulgación

Los carotenoides se sintetizan de novo en bacterias, algas, hongos y plantas. Los carotenoides son una clase de pigmentos naturales solubles en grasa que se encuentran principalmente en plantas, algas y bacterias fotosintéticas, donde desempeñan un papel fundamental en el proceso fotosintético. También se presentan en algunas bacterias, levaduras y mohos no fotosintéticos, donde pueden desempeñar una función protectora contra los daños de la luz y el oxígeno. Aunque los animales parecen ser incapaces de sintetizar carotenoides, muchos animales incorporan carotenoides de su dieta. Dentro de los animales, los carotenoides proporcionan una coloración brillante, sirven como antioxidantes, y pueden ser una fuente de actividad de vitamina A (Ong y Tee, 1992, Methods in Enzymology, Vol. 213, p. 142-167; Britton, The FASEB Journal, vol. 9, No 15, 1995).

Los carotenoides son responsables de muchos de los tonos rojos, naranjas y amarillos de las hojas, frutas, y flores de las plantas, así como también de los colores de algunas aves, insectos, peces, y crustáceos. Algunos ejemplos familiares de coloración de carotenoide son los naranjas de las zanahorias y los cítricos, los rojos de los pimientos y los tomates, y los rosados de los flamencos y el salmón (Pfander, 1992, Methods in Enzymology, Vol. 213, p. 3-13). Se sabe que existen unos 600 carotenoides diferentes de forma natural (Ong y Tee 1992), y se siguen identificando nuevos carotenoides (Mercadante, 1999, Pure and Applied Chemistry, Vol. 71, No. 12, p.2263-2272).

Los carotenoides se definen por su estructura química. La mayoría de los carotenoides se derivan de una cadena de polienos de 40 carbonos, que se podría considerar la cadena principal de la molécula. Esta cadena puede estar terminada por grupos terminales cíclicos (anillos) y se puede complementar con grupos funcionales que contienen oxígeno. Los carotenoides de hidrocarburos se conocen como carotenos, mientras que los derivados oxigenados de estos hidrocarburos se conocen como xantofilas. El betacaroteno, el principal carotenoide de las zanahorias, es un caroteno familiar, mientras que la luteína, el principal pigmento amarillo de los pétalos de caléndula, es una xantofila común.

La estructura de un carotenoide determina en última instancia qué funciones biológicas potenciales puede tener ese pigmento. El patrón distintivo de la alternancia de enlaces simples y dobles en la cadena principal poliénica de los carotenoides es lo que les permite absorber el exceso de energía de otras moléculas, mientras que la naturaleza de los grupos terminales específicos sobre carotenoides puede influir en su polaridad.

La importancia económica de los compuestos de caroteno en general y en particular del p-caroteno y la luteína ha aumentado de manera constante en los últimos tiempos. La industria ha intentado responder a la demanda estimulada, por un lado mediante la producción sintética de carotenoides y por otro lado mediante extracción y posteriormente al cristalizar carotenoides de fuentes naturales. Los consumidores de acuerdo con su actitud crítica actual hacia los productos sintéticos tienen una clara preferencia por el p-caroteno natural y la luteína.

El p-caroteno por ejemplo es un precursor de la vitamina A y por tanto un componente importante en aplicaciones de alimentos, de pienso y de cosméticas. Además, sirve como sustancia pigmentante en muchos campos, como, por ejemplo, en la industria de bebidas. Se ha demostrado científicamente que los cristales de carotenoides puros derivados de las flores de caléndula, que comprenden predominantemente xantofilas como luteína, zeaxantina y criptoxantina y niveles bajos de betacaroteno reducen el riesgo de degeneración macular relacionada con la edad (Referencia: Moeller SM, Jacques PF, Blumberg JB " The potential role of dietary Xanthophylls in cataract and age related macular degeneration," Journal of the American College of Nutrition, 2000; 19: 522S-527S), control sobre el colesterol LDL (Referencia: Chopra M., Thurnham DI, "Effect of Lutein on oxidation of low density lipoproteins (LDL) in vitro", Proceedings of the Nutrition Society, 1994; 53: 1993, # 18A.), prevención de enfermedades coronarias (Referencia: Howard AN, Williams NR, Palmer CR, Cambou JP, Evans AE, Foote JW, y otros, "Do hydroxycarotenoids prevent coronary heart disease?" A comparison between Belfast and Toulouse, "International Journal of Vitamin and Nutrition Research, 1996; 66: 113-118) y barrido de radicales libres y potenciador de la inmunidad (Referencia: Chew BP, Wong MW, Wong TS, "Effects of Lutein from Marigold extract on immunity and growth of mammary tumors in mice," Anticancer Research, 1996; 16: 3689-3694). La luteína, (beta-e-caroteno-3-3'-diol) y la zeaxantina (beta-beta-caroteno-3-3'-diol) pertenecen al grupo de las xantofilas de la familia de los carotenoides con grupos hidroxilo altamente reactivos que no pueden ser sintetizados por humanos y animales.

Mientras que hasta hace poco sólo las fuentes naturales de p-caroteno "clásicas", como por ejemplo zanahorias o algas, estaban disponibles para procesos de aislamiento comerciales, los enfoques biotecnológicos innovadores han explotado hoy en día una fuente profunda considerablemente más adecuada mediante el uso de métodos fermentativos. La fermentación de determinados hongos filamentosos ha permitido alcanzar una concentración de hasta más del 5 % en peso de p-caroteno en la biomasa de fermentación seca; por lo tanto la concentración de pcaroteno es aproximadamente diez veces mayor que en las fuentes naturales tradicionales.

En general, la inducción de la cristalización de p-caroteno mediante la adición de solventes conduce invariablemente a altos rendimientos, sin embargo, es necesario añadir grandes cantidades de solvente como se describe para npropanol, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Núm. 1,988,031 con el fin de obtener un rendimiento satisfactorio. Cuando se extrae de materiales naturales mediante el uso de solventes orgánicos como, por ejemplo, éter de petróleo (véanse las patentes estadounidenses núm. 1,967,121 y 1,998,031), generalmente existe el problema de que, debido a la baja solubilidad del p-caroteno, y en particular en el caso de altas concentraciones de p-caroteno, se debe seleccionar una cantidad extremadamente grande de solvente que, sin embargo, a su vez, afecta considerable y negativamente el rendimiento espacio-tiempo.

Recientemente, se han descrito varios procesos en los que el p-caroteno se extrae de materiales naturales mediante el uso de dióxido de carbono supercrítico a presiones de proceso muy altas (patente de Estados Unidos núm.

4,400,398). A pesar de los buenos resultados de extracción una desventaja general de este proceso de extracción de gas es la complicada implementación técnica de la alta presión requerida, que generalmente es más costosa que los procesos que operan a presión normal.

La patente de Estados Unidos núm. 5,382,714 informa que la oleorresina de caléndula saponificada de Kemin Industries (Des Moines, lowa) que contiene luteína libre es el material de partida preferido para el aislamiento de luteína pura. La etapa de saponificación implica un alto porcentaje de propilenglicol y el tiempo de saponificación se realiza por un período mínimo de tres horas al someter el producto a calor durante un período prolongado, lo que también aumenta el tiempo de proceso.

El documento EP 611071 A1 describe un método para extraer carotenoides del aceite, en donde un aceite se trata con una arcilla tal como bentonita. Además, Kaito Boki: "Bleaches of Alkali refined vegetable oils with clay minerals", Journal of the American Oil Chemistry Society, Springer DE, vol. 69, no.3, 1 Marzo 1992, enseña la absorción de carotenoides en minerales arcillosos como la bentonita. Singh y otros, 1998 describe un método para extraer aceites de DDGS con etanol.

En el marco de la unificación de la legislación alimentaria en la Unión europea, en enero de 1995 se presentó a la comisión un borrador de una directriz para establecer criterios específicos de pureza para los colorantes, que se pueden utilizar en los alimentos. En este documento se proponen los solventes acetona, metiletilcetona, metanol, etanol, propan-2-ol, hexano, diclorometano y dióxido de carbono para la extracción de carotenos naturales. Sin embargo, con la excepción del diclorometano, estos solventes son menos adecuados para la extracción económica de materiales naturales en los que el p-caroteno se presenta en altas concentraciones debido a su baja capacidad de disolución del p-caroteno. Por otro lado, una industria alimentaria con visión de futuro se debería abstener en el uso de diclorometano por razones ecológicas y relacionadas con el consumidor.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar métodos novedosos para aislar carotenos, en particular p-caroteno y/o luteína, de nuevas fuentes naturales y en particular de materiales naturales sólidos que eviten las desventajas de los procesos conocidos, en particular para el uso como ingredientes de alimento para animales.

Resumen de la divulgación

La presente invención se refiere a un método para extraer un carotenoide de un aceite que contiene subproductos de la conversión fermentativa de almidón; donde el subproducto se selecciona del grupo que consiste en un grano húmedo de destilería (DWG), los granos secos de destilería (DDG), los solubles de destilería (DS), los solubles secos de destilería (DDS), un grano seco de destilería con solubles (DDGS) y mezclas de los mismos; que comprende las etapas de:

i) Convertir el material que contiene almidón en azúcares fermentables

ii) Fermentar los azúcares fermentables con un microorganismo

iii) Separar el subproducto de dicha fermentación

iv) Recuperar el aceite del subproducto

v) Poner en contacto el aceite con un material de adsorción sólido

vi) Separar el material de adsorción sólido que contiene el aceite

vii) Extraer un carotenoide de dicho material de adsorción mediante el uso de terc-butilmetiléter.

El método descrito anteriormente puede comprender además la introducción de dicho carotenoide extraído como ingrediente en el alimento para animales.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra esquemáticamente un proceso de producción de etanol.

La Figura 2 es una curva de calibración que representa los grados de absorbancia a 447 nm.

La Figura 3 es un diagrama que muestra los resultados de la extracción con n-hexano de diferentes materiales de adsorción.

Descripción detallada de la divulgación

El objeto de la presente invención es proporcionar nuevos métodos para aislar carotenoides, en particular pcaroteno y/o luteína, a partir de nuevas fuentes naturales.

Los productos de fermentación, como el etanol, se producen primero al degradar el material que contiene almidón en azúcares fermentables mediante licuefacción y sacarificación y luego al convertir los azúcares directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado mediante el uso un organismo fermentador. Los productos de fermentación líquidos como el etanol se recuperan del mosto fermentado (a menudo denominado "cerveza" o "mosto de cerveza"), por ejemplo, mediante destilación, que separa el producto de fermentación deseado de otros líquidos y/o sólidos. La fracción restante, denominada "vinaza completa", se deshidrata y se separa en una fase sólida y una líquida, por ejemplo, mediante centrifugación. La fase sólida se denomina "torta húmeda" (o "granos húmedos" o "WDG") y la fase líquida (sobrenadante) se denomina "destilación fina". La torta húmeda deshidratada se seca para proporcionar "granos secos de destilería" (DDG) que se usan como nutriente en la alimentación animal. La vinaza fina se evapora típicamente para proporcionar condensado y jarabe (o "vinaza espesa") o alternativamente se puede reciclar directamente al tanque de lechada como "retroceso". El condensado se puede enviar a un metanizador antes de que se descargue o se puede reciclar al tanque de lechada. El jarabe que consiste principalmente en dextrinas límite y azúcares no fermentables se puede mezclar en DDG o se agrega a la torta húmeda antes de secar para producir DDGS (Granos Secos de Destilería con Solubles).

Es conocido el uso comercial de los diversos subproductos y residuos derivados de los procesos de fermentación como el proceso de producción de etanol. Se sabe que los residuos o subproductos de destilería, así como los subproductos de la fabricación de cereales y otras industrias alimentarias, tienen cierto valor como fuentes de proteínas y energía para la alimentación animal. Además, el aceite de los subproductos como el aceite de DDGS se puede recuperar como un subproducto separado para su uso en la producción de biodiésel o se buscan otros productos biorrenovables. El color de los subproductos se originó a partir del carotenoide en la materia prima básica como el maíz. Por ejemplo, los DDGS tienen un color amarillo que se origina a partir de carotenoides en el maíz. El subproducto se selecciona del grupo que consiste en un grano húmedo de destilería (DWG), los granos secos de destilería (DDG), los solubles de destilería (DS), los solubles secos de destilería (DDS), un grano seco de destilería con solubles (DDGS) y mezclas de los mismos. Por ejemplo, aunque aquí se hace referencia a DDGS como subproducto con respecto a los métodos y materiales descritos, se debe entender que, por ejemplo, también se podrían usar granos secos de destilería (DDG). En particular, los DDG retienen un contenido de aceite significativo, y en realizaciones de los procesos y métodos descritos en la presente divulgación, los DDG se pueden usar en lugar de los DDGS.

Se conocen en la técnica métodos para deshidratar la vinaza y para extraer aceite que surge de un proceso de fermentación. Estos métodos incluyen decantar o separar toda la vinaza en la torta húmeda y la vinaza fina. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Núm. 6,433,146, 7,601,858 y 7,608,729, y la publicación de solicitud de Estados Unidos Núm. 2010/0058649. Además, la vinaza fina se puede evaporar o condensar en jarabe o vinaza espesa de la que se puede extraer el aceite mediante el uso de centrifugación, filtrado, calor, alta temperatura, presión aumentada o una combinación de los mismos. Otra forma de extraer aceite es reducir el pH de la vinaza fina o el jarabe. El uso de tensioactivos para romper emulsiones también mejora la extracción de aceite. Otros métodos para extraer aceite de maíz crudo a partir de DDGS de maíz se analizan en Singh y otros, "Extraction of Oil From Corn Distillers Dried Grains with Solubles", Transactions of the ASAE 41 (6), 1775-1777 (1998).

Después de desengrasar los subproductos, los carotenoides de los materiales que contienen almidón se componen principalmente en el aceite. Sorprendentemente, los inventores encontraron que con materiales de adsorción sólidos como bentonita o sílice el carotenoide se puede extraer fácilmente del aceite, en particular directamente en la planta de producción de etanol y luego se extrae del material de adsorción para su posterior procesamiento o uso del material de adsorción que comprende carotenoides, en particular p-caroteno y/o luteína unidos al material de adsorción, en particular la bentonita que se puede usar directamente como ingrediente de alimento animal.

Además de las ventajas de las propiedades de adsorción de los carotenoides a la bentonita u otros materiales de adsorción y, por tanto, su nuevo valor generado en la nutrición animal, existen varios efectos técnicos adicionales. Después de la extracción de los carotenoides, el aceite tiene una mayor calidad y pureza, procesado directamente en la propia planta de fermentación. Esto da como resultado una calidad mejorada del aceite DDGS y, por lo tanto, un precio más alto que estas empresas pueden exigir. Sin embargo una calidad mejorada puede generar nuevos mercados para un aceite de maíz puro y barato, como nutrición y alimentos para animales, cosméticos y atención médica, procesos de producción de biodiésel optimizados/-mejorados y muchos más.

Como se mencionó anteriormente, se pueden extraer cantidades comercialmente valiosas de aceite de los subproductos como el DDG y los DDGS mediante el uso de un proceso de extracción por solvente. A partir del aceite extraído con solvente, los carotenoides se pueden extraer mediante métodos de acuerdo con las reivindicaciones y luego el aceite se puede procesar adicionalmente para proporcionar, por ejemplo, aceite de calidad alimentaria, como aceite de maíz de calidad alimentaria, donde los DDG y los DDGS se derivan de una biorrefinería de etanol que usa grano de maíz como biomasa. Alternativamente, el aceite extraído de los subproductos como DDG y DDGS se puede someter a un proceso de transesterificación para producir biodiesel y glicerina.

Los materiales de adsorción sólidos de acuerdo con la presente divulgación pueden ser un silicato tal como bentonita, bentonita cálcica, bentonita sódica, perlita, verxita o zeolita. La bentonita es un mineral natural que consiste principalmente en el silicato de aluminio de tres capas, montmorillonita. Puede contener calcio o sodio como ion predominante disponible o de intercambio. La bentonita se usa normalmente o está destinada para su uso en piensos para animales no medicinales como agente antiaglomerante o coadyuvante de granulación.

La bentonita es un filosilicato de aluminio absorbente, arcilla esencialmente impura que consiste principalmente en montmorillonita. Como se mencionó anteriormente, existen diferentes tipos de bentonita, cada una con el nombre del elemento dominante respectivo, como potasio (K), sodio (Na), calcio (Ca) y aluminio (Al). La bentonita generalmente se forma a partir de la intemperie de las cenizas volcánicas, con mayor frecuencia en presencia de agua. Sin embargo, el término bentonita, así como una arcilla similar llamada tonsteína, se ha usado para describir lechos de arcilla de origen incierto. Para fines industriales, existen dos clases principales de bentonita: bentonita de sodio y bentonita de calcio. En estratigrafía y tefrocronología, los lechos de caída de cenizas completamente desvitrificados (vidrio volcánico degradado) se conocen comúnmente como K-bentonitas cuando la especie de arcilla dominante es la ilita. Otras especies de arcilla comunes, y en ocasiones dominantes, son la montmorillonita y la caolinita. Las arcillas dominadas por caolinita se conocen comúnmente como tonsteínas y generalmente se asocian con el carbón. Una de las ventajas de la bentoita es que se puede usar como aditivo en la alimentación animal, ya que no es tóxico o tiene un efecto secundario no deseado para los animales. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Núm.

5,149,549 enseña el uso de una arcilla de montmorillonita, particularmente una arcilla de bentonita, mezclada con alimentos para animales como aglutinante de micotoxinas. La patente de Estados Unidos Núm. 5,165,946 enseña el uso de una arcilla de montmorillonita en combinación con un secuestrante adecuado, particularmente sales de fosfato y polifosfato, como aglutinante de micotoxinas. La Patente de Estados Unidos Núm. 5,639,492 refina aún más la técnica, al enseñar el uso de arcilla de bentonita cálcica activada con ácido mezclada con alimentos para animales para reducir los efectos de la contaminación por micotoxinas.

Como se mencionó anteriormente, los carotenoides son nutrientes ejemplares y altamente beneficiosos de los que los alimentos para animales a menudo carecen de forma natural. Los carotenoides son pigmentos orgánicos tetraterpenoides que se encuentran naturalmente en los cloroplastos y cromoplastos de ciertas plantas y ciertas bacterias. Los carotenoides pueden funcionar como anticancerígenos, inmunomoduladores, colorantes naturales y estabilizadores de la membrana celular. Aunque la mayoría de los animales son incapaces de producir carotenoides, los animales generalmente pueden asimilar los carotenoides ingeridos y emplearlos de diversas formas en el metabolismo. Por lo tanto, los animales deben obtener estos carotenoides deseados a través de su dieta.

El término "carotenoides" como se usa en este documento incluye beta-caroteno y luteína, que son nutrientes fortalecedores deseables ya que la mayoría de los animales son generalmente incapaces de sintetizar estos materiales. Es importante destacar que los carotenoides producidos son mezclas naturales de estereoisómeros de los carotenoides individuales, a diferencia de un isómero único que se produce más comúnmente con carotenoides sintetizados artificialmente.

La invención se refiere a un método para extraer un carotenoide de un aceite que contiene subproductos de la conversión fermentativa del almidón; donde el subproducto se selecciona del grupo que consiste en grano húmedo de destilería (DWG), granos secos de destilería (DDG), solubles de destilería (DS), solubles secos de destilería (DDS), grano seco de destilería con solubles (DDGS) y mezclas de los mismos; que comprende las etapas de: i) Convertir el material que contiene almidón en azúcares fermentables

ii) Fermentar los azúcares fermentables con un microorganismo

iii) Separar el subproducto de dicha fermentación

iv) Recuperar el aceite del subproducto

v) Poner en contacto el aceite con un material de adsorción sólido

vi) Separar el material de adsorción sólido que contiene el aceite

vii) Extraer un carotenoide de dicho material de adsorción mediante el uso de terc-butilmetiléter.

La conversión de material que contiene almidón en azúcares fermentables puede incluir licuefacción y sacarificación. La licuefacción se puede llevar a cabo en presencia de una alfa-amilasa, preferentemente una alfa-amilasa bacteriana o alfa-amilasa fúngica ácida. En una modalidad, se añade una pululanasa, isoamilasa y/o fitasa durante la licuefacción. El organismo fermentador es preferentemente una levadura, por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae. Los organismos de fermentación adecuados pueden ser cualquier organismo, incluidos los organismos bacterianos y fúngicos, adecuados para su uso en un proceso de fermentación y capaces de producir un producto de fermentación deseado. El organismo fermentador puede ser un organismo fermentador C6 o C5, o una combinación de los mismos. Los organismos fermentadores de C5 y C6 son bien conocidos en la técnica. Los organismos de fermentación adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares fermentables, tales como arabinosa, fructosa, galactosa, glucosa, maltosa, manosa y/o xilosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado.

Como se mencionó anteriormente, el organismo de fermentación es preferentemente levadura, por ejemplo, una cepa de Soccharomyces cerevisiae o Soccharomyces diastaticus. En una forma de realización ventajosa se usa una cepa de levadura de Soccharomyces diastaticus (SIHA Amyloferm®, E. Begerow GmbH & Co, Langenlonsheim, Alemania) ya que su actividad exoamilasa puede dividir almidón líquido y también dextrina, maltosa y melibiosa. La licuefacción se puede llevar a cabo como un proceso de suspensión caliente de tres pasos. La suspensión se calienta entre 60-95 °C, preferentemente 80-85 °C, y se añade una alfa-amilasa para iniciar la licuefacción (adelgazamiento). Luego, la suspensión se puede cocinar a chorro a una temperatura entre 95-140 °C, preferentemente a 105-125 °C, alrededor de un 1-15 minutos, preferentemente alrededor de unos 3-10 minutos, especialmente alrededor de unos 5 minutos. La suspensión se enfría a 60-95 °C y se agrega más alfa-amilasa para completar la hidrólisis (licuefacción secundaria). El proceso de licuefacción se lleva a cabo habitualmente a un pH de 4,0 a 6,5, en particular a un pH de 4,5 a 6. La sacarificación se puede llevar a cabo mediante el uso de condiciones bien conocidas en la técnica con una enzima sacarificante, por ejemplo, beta-amilasa, glucoamilasa o amilasa maltogénica, y opcionalmente una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa. Por ejemplo, un proceso de sacarificación completo puede durar entre aproximadamente 24 y aproximadamente 72 horas, sin embargo, es común realizar una presecarificación durante típicamente 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, típicamente alrededor de 60 °C, seguida de sacarificación completa durante la fermentación en un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (proceso SSF). La sacarificación se lleva a cabo típicamente a una temperatura de 20-75 °C, preferentemente de 40-70 °C, típicamente alrededor de 60 °C, y a un pH entre 4 y 5, normalmente alrededor de un pH de 4,5.

El proceso más usado para producir un producto de fermentación, especialmente etanol, es el proceso de sacarificación y fermentación simultáneas (SSF), en el que no hay una etapa de retención para la sacarificación, lo que significa que un organismo fermentador, como una levadura, y una enzima (s), si se incluye la (s) hemicelulasa (s) y/o endoglucanasa (s), se pueden agregar juntas. La SSF se lleva a cabo típicamente a una temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, de 30 °C a 34 °C, preferentemente alrededor de 32 °C. En una modalidad, la fermentación se lleva a cabo durante 6 a 120 horas, en particular de 24 a 96 horas.

La materia prima para producir el producto de fermentación puede ser cualquier material que contenga almidón o almidón y azúcar, preferentemente almidón o material vegetal que contenga almidón y azúcar, se incluye: caña de azúcar, tubérculos, raíces, grano integral; y cualquier combinación de los mismos.

El material que contiene almidón se puede obtener a partir de cereales. El material que contiene almidón adecuado incluye maíz (choclo), trigo, cebada, yuca, sorgo, centeno, triticale o cualquier combinación de los mismos.

El maíz es la materia prima preferida, especialmente cuando el producto de fermentación es etanol. El material que contiene almidón también puede consistir en o comprender, por ejemplo, una corriente secundaria del procesamiento de almidón, por ejemplo, corrientes de proceso que contienen carbohidratos C6 que pueden no ser adecuadas para la producción de jarabes. Los componentes de la cerveza incluyen componentes de fibra, cáscara, germen, aceite y proteínas de la materia prima que contiene almidón, así como también almidón sin fermentar, levaduras, paredes celulares de la levadura y sus residuos. La producción de un producto de fermentación se divide típicamente en las siguientes etapas principales del proceso: a) Reducción del tamaño de partícula del material que contiene almidón, por ejemplo, mediante molienda en seco o en húmedo; b) Cocinar el material que contiene almidón en una suspensión acuosa para gelatinizar el almidón, c) Licuar el material que contiene almidón gelatinizado con el fin de descomponer el almidón (por hidrólisis) en maltodextrinas (dextrinas); d) Sacarificar las maltodextrinas (dextrinas) para producir azúcares de bajo peso molecular (por ejemplo, DP1-2) que pueden ser metabolizados por un organismo fermentador; e) Fermentar el material sacarificado mediante el uso de un organismo de fermentación adecuado al convertir directa o indirectamente azúcares de bajo peso molecular en el producto de fermentación que se desea; f) Recuperar el producto de fermentación, por ejemplo, mediante destilación con el fin de separar el producto de fermentación del mosto de fermentación.

El término "producto de fermentación" significa un producto producido mediante un proceso que incluye una etapa de fermentación mediante el uso de un organismo fermentador. Los productos de fermentación incluyen alcoholes (por ejemplo, arabinitol, n-butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etilenglicol, 1,3-propanodiol [propilenglicol], butanodiol, glicerina, sorbitol y xilitol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico, y ácido xilónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina y treonina); un alcano (por ejemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano y dodecano), un cicloalcano (por ejemplo, ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano y ciclooctano), un alqueno (por ejemplo, penteno, hexeno, heptano y octeno); isopreno; policétido; gases (por ejemplo, metano, hidrógeno (H2), dióxido de carbono (CO2), y monóxido de carbono (CO)); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, betacaroteno); y hormonas. En una modalidad preferida, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol de combustible; etanol para beber, es decir, bebidas espirituosas neutras potables; o etanol industrial o productos usados en la industria del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino), industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos comprenden ales, stout, porters, lagers, bitters, licores de malta, happoshu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de calorías o cerveza ligera. Los procesos de fermentación preferidos incluyen procesos de fermentación de alcohol. En una modalidad, el producto de fermentación es etanol, que se puede usar como etanol de combustible o como etanol potable.

Una vez finalizado el proceso de fermentación, el material restante se considera la vinaza completa. Como se usa en la siguiente divulgación, el término "vinaza completa" incluye el material que permanece al final del proceso de fermentación tanto antes como después de la recuperación del producto de fermentación, por ejemplo, etanol. El producto de fermentación se puede recuperar opcionalmente mediante cualquier método conocido en la técnica. Toda la vinaza se puede separar o dividir en una fase sólida y líquida mediante uno o más métodos para separar la vinaza fina de la torta húmeda. Tales métodos incluyen, por ejemplo, centrifugación y decantación. El producto de fermentación se puede recuperar opcionalmente antes o después de que toda la vinaza se separe en una fase sólida y líquida.

El producto de fermentación se puede recuperar del medio de fermentación mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero no se limitan a, cromatografía, procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, destilación o extracción. Por ejemplo, el alcohol se separa del material celulósico fermentado y se purifica mediante métodos convencionales de destilación como se mencionó anteriormente. Se puede obtener etanol con una pureza de hasta aproximadamente el 96 % en volumen, que se puede usar como, por ejemplo, etanol de combustible, etanol para beber, es decir, alcoholes neutrales potables o etanol industrial.

El subproducto acuoso (vinaza entera) del proceso de destilación se puede separar en dos fracciones, por ejemplo, por centrifugación: grano húmedo (fase sólida) y vinaza fina (sobrenadante). En otra modalidad, los métodos de la divulgación comprenden además la separación de toda la vinaza producida por destilación en grano húmedo y vinaza fina; y reciclar la vinaza fina al material que contiene almidón antes de la licuefacción. En una modalidad, la vinaza fina se recicla a la lechada de grano entero molido. La fracción de grano húmedo se puede secar, típicamente en un secador de tambor. El producto seco se conoce como granos secos de destilería, y se puede usar como se mencionó anteriormente como alimento para animales de alta calidad. La fracción de vinaza delgada se puede evaporar al proporcionar dos fracciones (ver la Figura 1 y la Figura 2), (i) una fracción de condensado de 4-6 % DS (principalmente de almidón, proteínas y componentes de la pared celular), y (ii) una fracción de jarabe, que consiste principalmente en dextrinas límite y azúcares no fermentables, que se puede introducir en un secador junto con los granos húmedos (de la etapa de separación de la vinaza entera) para obtener un producto que se denomina grano seco de destilería con solubles, que también se puede usar como alimento para animales. Vinaza fina es el término usado para el sobrenadante de la centrifugación de toda la vinaza. Normalmente, la vinaza fina contiene de 4-6 % de DS (principalmente almidón y proteínas) y tiene una temperatura de aproximadamente 60-90 °C. La vinaza fina puede que no se recicle, pero la corriente de condensado de vinaza fina evaporada se recicla a la suspensión que contiene el grano entero molido para ser cocido a chorro.

El experto conoce bien más detalles sobre cómo llevar a cabo la licuefacción, sacarificación, fermentación, destilación y recuperación de etanol.

Después de la separación de un subproducto, el subproducto se puede desaceitar si el subproducto no es el aceite en sí. Como se mencionó anteriormente, se conocen en la técnica métodos para extraer aceite del proceso, en particular de los subproductos de fermentación. Por ejemplo, la vinaza fina se puede evaporar o condensar en jarabe o vinaza espesa de la que se puede extraer el aceite al usar la centrifugación, el filtrado, calor, la alta temperatura, el aumento de presión, o una combinación de los mismos.

Después de recuperar el aceite del subproducto, el aceite se pone en contacto con un material de adsorción sólido como se describió anteriormente y se puede incubar durante un tiempo suficiente. Después de la incubación, se separa el material de adsorción sólido que contiene el aceite.

Para la extracción del carotenoide del material de adsorción sólido preparado como se describe aquí, se usa tercbutilmetiléter. El solvente puede ser de calidad alimentaria, admisible tanto para aplicaciones farmacéuticas como alimentarias. El disolvente se puede recuperar y reusar.

El material de adsorción sólido, en particular bentonita, también se puede usar directamente como aditivo de alimentos para animales que comprende carotenoides muy puros. La bentonita no es tóxica y los carotenoides unidos son digeribles y usables para los animales (ver Ejemplo C).

Ejemplos

A) Preparación de aceite de DDGS para la adsorción de luteína

El aceite crudo se obtuvo como subproducto de una Planta de Etanol. El primer paso fue eliminar las impurezas solubles en agua, por ejemplo, lecitina, ácidos grasos libres para la reducción de la mucosidad mediante diferentes etapas de lavado (100 ml de H3PO4 al 10 %/ Aceite l DD^g S, 3 x 100 ml de agua corriente fresca/ aceite l DDGS, agua destilada). Las fases se separaron al almacenar el matraz a 90 °C durante una hora, la fase orgánica se trató adicionalmente y la fase acuosa se descartó. El aceite se calentó hasta 150 °C al vacío durante varias horas para eliminar las impurezas residuales y para la clarificación final. El aceite de DDGS aclarado se almacenó a 4 °C. B) Adsorción de luteína por bentonitas y otros materiales de adsorción potenciales

Se pesaron cantidades definidas (por ejemplo, 50 mg, 100 mg, 200 mg) de material de adsorción/ml de aceite de DDGS en un matraz de fondo redondo de 10 ml. Se agregaron 5 ml de aceite DDGS. Se aplicó un vacío de al menos 5 mbar al matraz. La muestra se equilibró durante al menos 5 min hasta que se atenuó la actividad inicial de formación de burbujas. El matraz se incubó adicionalmente al vacío a 120 °C durante 1 hora. El producto oleoso que se recibe se filtró a través de un filtro grueso para eliminar el material de adsorción cargado de la fase oleosa.

La adsorción restante del aceite se determinó con un lector de microplacas Tecan M1000 a A=447 nm para evaluar la capacidad de absorción de la absorbancia usada. Las diluciones se realizaron mediante el uso de un aceite de maíz purificado disponible comercialmente. Los valores típicos de las adsorciones de carotenoides residuales, dependiendo de los materiales de adsorción, se pueden encontrar en la tabla 1. La Tabla 1 muestra los valores normalizados típicos de la adsorción restante después de la adsorción de carotenoides. La adsorción corregida representa el valor del carotenoide extraído total relacionado con la materia prima.

Tabla 1: Valores normalizados típicos de adsorción restante después de la adsorción de carotenoides

El material de adsorción cargado se extendió sobre papel de filtro y se secó a 90 °C en un secador de armario durante 48 h.

La curva de calibración en la Figura 1 representa el grado de absorbancia a 447 nm con el aumento de la masa de bentonita usada por mililitro de aceite de DDGS usado (ver también la Tabla 2).

Tabla 2: Concentración de bentonita

C) Ensayo in vitro para la liberación de carotenoides unidos a materiales de adsorción

Para garantizar la digestibilidad y usabilidad de la luteína, unida a los materiales de adsorción apropiados, se realizó un ensayo in vitro con muestras de muestras cargadas de luteína.

Por esta razón, se incubaron 2,5 g de material de adsorción cargado con luteína con 10,25 ml de HCl de 115 mM durante 30 minutos. Se añadió 1 ml de una solución de HCl de 115 mM/Pepsina (6000 U/ml) y después de otros 30 minutos se añadió 3,5 ml de agua destilada. 30 minutos, la reacción se neutralizó con 1,4 ml de una solución de NaOH de 0,39 M. Después de otro tiempo de incubación de 30 minutos, se añadieron 0,84 ml de una solución de Pancreación de 16 mg/ml en NaHCO3 de 1 M, que incluía sales biliares de 10 mM. 5 horas después, se detuvo la reacción al enfriar la mezcla de reacción hasta 4 °C. Todas las etapas de incubación se realizaron a 40 °C en una incubadora con agitación a 150 rpm. Como control negativo se tomó a lo largo del procedimiento una alícuota con ácido y una base pero sin enzimas. Un segundo control negativo fue la incubación de 2,5 g de material de adsorción en agua destilada.

D) Determinación de la luteína re-purgable mediante determinación de liposolubles (Ejemplo de Referencia)

Para la determinación del aceite de luteína liberado del material de adsorción la mezcla de reacción enfriada se centrifugó a 3800 x g durante 30 min. Las muestras se recubrieron con 5 ml de n-hexano con cuidado para obtener la luteína liberada de la superficie. La fase de n-hexano se recogió en un matraz prepesado, el procedimiento se repitió dos veces. Después de evaporar las fases de hexano recolectadas con un evaporador rotatorio a 80 °C y a 200 mbar durante 10 minutos los matraces se incubaron durante 24 h a 90 °C en una cámara de calor para equilibrar antes de pesar.

Con los datos recibidos de la digestión in vitro (ver Tabla 3) se pudo demostrar que la luteína, unida a los materiales de adsorción puede ser desorbida durante el proceso de digestión en animales y por lo tanto estos materiales de adsorción de calidad alimentaria son una buena fuente de suministro de carotenoides en nutrición animal. En la Tabla 3, la abreviatura "c" significa control sin sales biliares o enzimas y "w" significa control sin sales biliares o enzimas, sin ácido o base. La Tabla 2 y la Figura 3 muestran los resultados de la extracción con n-Hexano de diferentes materiales de adsorción, en particular el comportamiento de desorción de la luteína de los materiales de adsorción durante la digestión in vitro.

Tabla 2: Resultados de la extracción n-Hexano de diferentes materiales de adsorción.

Los datos mostrados en la Tabla 3 y la Figura 3 demuestran que los carotenoides unidos a bentonitas se pueden liberar durante una digestión in vitro. La comparación con las muestras de control (c & w) muestran que el proceso de desorción puede ser apoyado por enzimas. Además la liberación de carotenoides puede ser apoyada por el cambio del valor de pH. Finalmente, se puede observar que el proceso de secado después de la etapa de adsorción parece tener una gran influencia sobre la capacidad de desorción de los carotenoides del material de adsorción. Las anomalías en la disminución de la desorción de carotenoides en el conjunto de datos 4, 4c y 4w son causadas por la carga inconsistente del material de adsorción húmedo.

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un método para extraer un carotenoide del aceite que contiene subproductos de la conversión fermentativa del almidón; en donde el subproducto se selecciona del grupo que consiste en grano húmedo de destilería (DWG), granos secos de destilería (DDG), solubles de destilería (DS), solubles secos de destilería (DDS), grano seco de destilería con solubles (DDGS) y mezclas de los mismos; que comprende las etapas de: i) Convertir el material que contiene almidón en azúcares fermentables

   ii) Fermentar los azúcares fermentables con un microorganismo

   iii) Separar el subproducto de dicha fermentación

   iv) Recuperar el aceite del subproducto

   v) Poner en contacto el aceite con un material de adsorción sólido

   vi) Separar el material de adsorción sólido que contiene el aceite

   vii) Extraer un carotenoide de dicho material de adsorción mediante el uso de terc-butilmetiléter.
2. 2. El método de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1, en donde el carotenoide a extraer es un pcaroteno.
3. 3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el carotenoide a extraer es luteína.
4. 4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el subproducto es DDGS.
5. 5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el proceso de producción por fermentación es un proceso de producción de etanol.
6. 6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el material que contiene almidón se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, cebada, triticale, yuca, sorgo, centeno o cualquier combinación de los mismos.
7. 7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el material que contiene almidón es maíz.
8. 8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el material de adsorción sólido es sílice o bentonita.
9. 9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el material de adsorción sólido es bentonita.
10. 10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el agente de extracción orgánico líquido es un terc-butilmetiléter de calidad alimentaria.
11. 11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el método comprende además introducir dicho carotenoide extraído como ingrediente en el alimento para animales.