CN1368899A - 治疗组合物的制备 - Google Patents
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Abstract
分子量不大于14KDa和基本上不大于8KDa的核苷酸和肽。该组合物具有一个吸收光谱,该吸收光谱在260nm/280nm处的典型吸光率为1.998,在260nm/230nm处为1.359。
Description
相关申请
本申请是申请人在1996年10月22日申请的未决申请序号08/735,236的部分继续申请。本文引用该申请序号08/735,236的全部内容作为参考。
发明背景
1.发明领域
本发明涉及一种改进的制备含有肽和核苷酸治疗组合物，如下文所定义的产品R1的方法。该产物R的组分分子量不大于14千道尔顿(KDa)。
2.相关技术的说明
由胨、肽、蛋白质和核酸组成的抗病毒剂的概念起源于1934年。经过几年的实验后，采用与胨组合的牛血清白蛋白和核糖核酸修饰该抗病毒剂以产生无毒、不具有过敏性并可与组织液和血清混溶的抗病毒生物剂。该制剂过去被描述为＂脂肽-核酸化合物＂并被Chemico Laboratories，Inc.注册为商标RETICULOSE，(Physician Desk Reference，p 651，1960)。RETICULOSE被报道为一种用于治疗各种人类病毒感染如流感、疱疹、甲肝和乙肝的抗病毒剂。随后认为RETICULOSE至少通过增加白细胞生成、抗体合成和增强吞噬作用而用作一种抗病毒剂。RETICULOSE最后于19641在一些文献中将产品R用作RETICULOSE的同义词。为本申请的目的，产品R和RETICULOSE代表两种不同的产品。年在美国销售。
RETICULOSE的制备方法被制造业作为商业秘密保密，直至美国专利5,849,196的授权，该专利公开了制备RETICULOSE的方法。
如在美国专利5,849,196中所公开的，用于制备RETICULOSE的原料由40-50％酪蛋白、1-10％血液白蛋白、15-40％牛肉胨，10-25％RNA和5-25％氢氧化钠组成，均为重量百分数。将这些原料悬浮在水中所得到的蛋白质(酪蛋白、胨和血液白蛋白)与水的重量比等于约4.3比约100。高压灭菌法处理该原料的混合物，然后过滤所得的溶液并将PH调节至约8.5，然后调节至7.8，接着再次过滤该中和的溶液。稀释该溶液，然后进一步将PH调节至约7.5。该方法得到分子量范围约为1-25KDa的肽和核酸的混合物。
如美国专利5,849,196所述，常规RETICULOSE组合物的超过15KDa以上的组分对病毒病如HIV、流感病毒、单纯疱疹病毒等的治疗更为有效。而范围约为1-15KDa的组分用作吞噬作用抑制剂。
但是，常规的方法存在许多缺点：1)该方法不确保每次制备产生具有相同比率的最终组分，从而这种产品是不可重复制备的；2)该常规方法产生宽范围的最终组分，这使得这种制备方法的质量控制非常困难(如果质量控制是可能的话)，因为太多的参数需要确定；3)较高分子量组分如25KDa组分，尤其是肽的存在，增大了过敏性或免疫反应的风险并使产品的稳定性较差。因此，期望获得一种避免现有的RETICULOSE的缺点同时保持其治疗特性的产品。
发明概述
因此，本发明的目的涉及一种新的治疗组合物，产品R。与RETICULOSE不同的是，产品R是可重复制备的，高稳定性的和非抗原性的。与RETICULOSE类似的是，产品R是治疗病毒感染如人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒、腺病毒和乳头状瘤病毒感染的宽范围的抗病毒剂。令人惊奇的是，产品R已被证明有效地促进产生趋化因子包括干扰素-γ、白细胞介素-6和白细胞介素-1(J.Investig Med 1996；44：347-351)，产生血红细胞(美国专利号5,807,839)、治疗基底细胞癌(美国专利号5,902,786)和治疗犬瘟热病毒感染(美国专利号5,807,840)。
本发明的另一目的涉及一种改进的制备新治疗组合物产品R的方法。根据该改进方法的产品R包括产生新的UV吸收光谱和新的分子量分布型的新组合物。特别是，产品R包括分子量不大于14Kda的分子。
本发明的进一步的目的是根据化学和物理方法定义产品R的组分。
由以下结合附图讨论的详细说明可以明显地看出本发明的其它目的和特征。但是，应该理解附图仅意在例举而不是定义本发明的界限，应该参照所附的权利要求来确定本发明的界限。应该进一步理解这些附图没有必要绘出刻度，而且除非另指，它们仅意在概念性地说明上述的结构和过程。
附图的简要说明
在这些图中：
图1显示了产品R的典型的紫外吸收谱图；
图2显示了由反相HPLC分析得到的产品R的典型色谱图；
图3显示了产品R的BioGel P-2分部分离谱图；
图4显示了在16％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上解析的BioGel P-2分部分离谱图的分部I组分。
图5显示了在16％SDS-PAGE上分离的产品R的两种主要肽组分的相对质量(Mr.)；
图6为16％SDS-PAGE，它表示产品R上的各种分解代谢酶的作用；
图7为流式细胞仪直方图，它表示产品R对葡聚糖-FITC吞噬作用的影响；
图8流式细胞仪直方图，它表示产品R对葡聚糖-BoDipyFL吞噬作用的影响。
本发明优选实施方案的详细说明
制备产品R
一般来说，根据以下方式制备产品R。
首先，将原料酪蛋白、牛肉胨、RNA、BSA和氢氧化钠以以下的重量百分比悬浮在适量的蒸馏水中：35-50％(酪蛋白)，15-40％(牛肉胨)，10-25％(RNA)，1-10％(BSA)和5-25％(氢氧化钠)。所有的原料通常是现存的，或者可由本领域技术人员容易地制备。虽然任何RNA都适于本发明的目的，但优选植物RNA，最优选酵母RNA。按重量计算，总蛋白质对蒸馏水体积的比率一般约为1.5-2.5比约100，优选为约2.2比约100。这意味着每1.5-2.5克的总蛋白质悬浮在约100毫升的蒸馏水中。
所有这些原料一般是可商购得到的或可由本领域技术人员容易地制备。
然后在约5-15lbs.，优选8-10lbs.的压力下，在约150-300°F，优选约200-230°F范围的高温下，将以上制备的悬浮液高压灭菌约2-10小时，优选大于3小时。本领域技术人员已知，在该条件下RNA可以完全水解成核苷酸。在高压灭菌之后，将溶液冷却至室温，然后在3-8℃的温度下保持至少12小时以沉淀出不溶成分。或者，可以将该冷却的溶液在8℃以下离心除去沉淀。
然后通过2微米和0.45微米的过滤器在惰性气体如氮或氩下，以大约1-6psi的压力过滤所得的溶液。以类似地方式通过热原截留过滤器，优选0.2微米的过滤器再次过滤该溶液。
在以上的过滤之后，可以再次在3-8℃下冷却该溶液至少约12小时并以与以上相同的方式再次过滤。
然后采用本领域技术人员已知的方法如Kjeldahl法，J.G.C.D.Kjeldahl，Z.Anal.Chem.，Vol.22，p366(1883)，及其改进方法，分析所得滤液的总氮含量。然后在此分析的基础上，用冷却的蒸馏水稀释该滤液至具有优选的范围为165-210mg/ml的总氮含量的适宜体积。
然后用HCl将该稀释溶液的PH调节至生理学上可接受的PH，优选至约7.3-7.6，接着在上述的惰性气体下通过0.2微米的过滤器再次过滤该稀释溶液。
如此制备的产品R基本上含有核苷酸、核苷和来自RNA完全水解的低分子量游离核酸碱基以及来自蛋白质部分水解的小肽。蛋白质的碱水解也可以产生游离氨基酸。
已认识到采用过滤技术实质上可以除去细菌和其它具有与细菌具有类似大小或更大的粒子。因此，不管制造商或其制作材料，任何过滤器都适于该目的。该方法中所用的过滤器对于本领域技术人员来说是可广泛地获得。
然后在惰性气体下将最终的滤液装入并密封至适宜的小瓶，如2ml或10ml玻璃瓶。将装满的小瓶作最后的高压灭菌，然后准备应用。
如美国专利号5,807,839，5,807,840和5,902,786所述，在应用中，将产品R肠道外或局部给予需要的患者，本文全部引用该专利的内容作为参考。
产品R的表征
紫外吸收光谱：图1为在1cm通路长度的石英微比色杯(100μl容量)中，采用Shimadzu型UV1201 UV-VIS分光光度计测得的产品R的典型的紫外吸收光谱。用蒸馏水稀释产品R 100倍。在220-320nm之间记录光谱，该光谱表明最大吸收在260nm处而最小在235nm处。260nm处的吸光率(A)相对于280nm处的吸光率的比率为1.998(±10％)，而在260nm处的A相对于230nm处的A的比率为1.359(±10％)。
HPLC谱图：图2是由采用Hewlett Packard 1100 HPLC体系(HewlettPackard Co.)的反相HPLC分析得到产品R的典型的色谱图，该HewlettPackard 1100 HPLC体系包括一个二元泵(G1312A型)、一个二极管阵列检测器(G1315A型)、一个柱恒温器(G1316A型)、一个恒温自动进样器(G1329A型)、一个样品恒温器和一个真空脱气器(G 1322A型)、和一个具有一个大小为250×10mm的ID和孔径为120A的不锈钢YMC-填充ODS-AQS-5μM柱(YMC，Inc.3223 Burnt Mill Dr.，Wilmington，NC 28403)。流动相由0.1M醋酸：三乙胺组成，其制备如下：将6.0ml的冰醋酸溶于1000mlHPLC等级的水中。用三乙胺滴定该搅拌的醋酸溶液至PH为4.8。室温下将该溶液平衡过夜，然后通过0.45μM孔径和52mm直径的过滤器过滤。如果需要，在使用前加入三乙胺将该溶液的PH再次调节到PH4.8。用设置于HPLC流动体系内部的真空脱气器将该流动相脱气。通过自动进样器将8μl的产品R试样注入到每次注入的温度设定在30℃的柱中。然后在92-102巴的泵压下，用0.1M醋酸：三乙胺流动相(PH4.8)，以每分钟1ml的速率从该柱中等度洗脱该试样。以160分钟每一试样跑色谱图(在260nm处的UV吸光度)并通过二极管阵列检测器收集数据，然后采用Hewlett-Packard HPLC ChemStation软件分析。产生解析图，采用SigmaPlot程序进行统计分析。在这些条件下的反相HPLC得到13个特征峰：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和M，每一个峰具有特征性的UV吸收谱图(没有显示数据)。
BioGel P-2凝胶过滤谱图：图3显示了产品R在大小为2.6cm×55cm填充尺寸的BioGel P-2(Bio-Rad Laboratories Inc.)柱上的分部分离谱图。在将产品R装上柱以后，用0.1×PBS，优选不含钙离子(Ca++)和镁离子(Mg++)的DULBECCO′s PBS，以0.5毫升每分的速率洗脱该柱。1×PBS含有1.47mM的KH2PO4、2.67mM KCl，138mM NaCl和8.1mM Na2HPO47H2O。该洗脱剂经过与REC 101图表记录仪相连并配置一个254nm滤光器的＂UvcordSII＂监测器，并在＂Frac 200＂分部收集器上以12分钟每一分部收集。在这种条件下的凝胶过滤色谱法得到9个分部：I、Ia、II、IIa、IIb、III、IIIa、IV和IVa。
将各个单独的峰与已知的核苷酸比较，在相同或非常接近体积的各分部中洗脱的核苷和游离核酸碱基如表I所示。具有相当值的已知化合物如注释栏上所示。
表I峰 实验值 注释
λmax λmin A260/A280 A260/A230峰I -275nm -255nm 0.976 0.300 大部分的肽和肽结合
物峰Ia -260nm -240nm 1.636 0.943 核蛋白和/肽核酸峰Is -270nm -245nm 1.258 0.939 主要组分为CMP峰IIα -260nm -230nm 2.893 3.12 主要组分为AMP、
UMP峰IIβ -250nm -225nm 1.509 1.988 主要组分为GMP峰IIa -250nm -230nm 1.257 1.176 混合组分峰Iib -270nm -250nm 1.142 0.941 主要组分为胞苷峰II1 260nm -230nm 2.695 3.664 主要组分为尿苷峰IlIa -260nm -225nm 5.15 4.24 主要组分为尿嘧啶、
腺苷峰IV -260nm -225nm 5.406 3.892 主要组分为腺嘌呤峰Iva -245nm -225nm 1.016 1.285 主要组分为鸟嘌呤
然后浓缩这些分部并在16％凝胶上用SDS-PAGE(参见后面)分析。如图4所示，该凝胶的银染色证明只有分部I表现出基本的两个表观分子量为4.3KDa、5.2KDa的可被银染色的谱带和较小的7.6KDa谱带。
相对质量(Mr.)：图5表示在16％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上解析的，并采用来自‘Silverxpress’染色试剂盒，根据制造商建议的方案进行银染色的产品R的两种主要肽组分的相对质量(分子量测量)。将产品R解析成两个主要的分子量约为4.3和5.2KDa的可被银染色的谱带。而且较小的分子量约为7.6KDa的可被银染色的组分在超载的SDS-PAGE凝胶上是可见的，且其中可能存在痕量的其它分子量范围约为5KDa到14KDa的可被银染色的肽。考马斯蓝，一种通用的蛋白质染料，对4.3KDa谱带的染色非常差。这三个谱带，4.3KDa、5.2KDa和7.6KDa，构成了大于约90％以上的肽。因此，产品R基本上由分子量在8KDa以下的分子组成。
表II表示5.2KDa和4.3KDa组分的氨基酸组成。在PE Bio-体系420的分析仪上，采用标准酚异亚硫氰酸盐(PTIC)化学进行自动水解，从而对5.2KDa谱带(试样A)和4.3KDa谱带(试样B)进行氨基酸分析。
表II氨基酸 试样A(-5.2kDa) 试样B(-4.3kDa)
Mol.％ Mol.％天门冬氨酸 9.92 8.95谷氨酸 19.27 17.30丝氨酸 1.03 1.23甘氨酸 5.74 13.87组氨酸 2.58 3.11精氨酸 0.69 0.52苏氨酸 0.73 1.78丙氨酸 5.49 8.19脯氨酸 13.05 15.28酪氨酸 4.39 3.37缬氨酸 9.95 5.39甲硫氨酸 2.92 2.21异亮氨酸 5.47 3.45亮氨酸 10.99 4.37苯丙氨酸 3.27 1.45赖氨酸 5.12 9.53
肽的生物化学性质：采用各种分解代谢酶分析产品R的可被银染色的肽组分的某些生物化学性质，如以下所述：
用蛋白酶K(ICN Biochemicals)处理：蛋白酶K是一种可断裂脂肪氨基酸、芳香氨基酸和疏水氨基酸的C-末端肽键的非特异性广谱蛋白酶。它可以在1小时内完全降解浓度为50μg/ml的血清肽。40℃下在含有10mMTris-HCl，pH7.6、0.5％的SDS、1mM CaCl2、100μg/ml的蛋白酶K的反应缓冲剂中温育产品R样品30分钟，然后如上述在16％凝胶上进行SDS-PAGE。在这些条件下，产品R的银染色并不表现出显著的变化。但是，当蛋白酶K的量增加到800μg/ml而温育的时间延长到1小时时，5.2KDa谱带消失但4.3KDa的谱带没有显著变化。
用胰蛋白酶(Boehringer Mannheim，USA)处理：胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，它在pH7.5-9.0处特异性地断裂C末端的赖氨酸和精氨酸的肽键。25℃下在含有100mM Tris-HCl，pH8.0、0.1％SDS和250μg/ml的测序等级的胰蛋白酶的反应缓冲剂中温育产品R试样19小时，然后在16％的凝胶上进行SDS-PAGE。虽然在该反应条件下血清蛋白将分解成小于4.3KDa的肽，但胰蛋白酶没有影响产品R的可被银染色的组分。
用糜蛋白酶(BoehringerMannheim，USA)处理：糜蛋白酶是一种特异性地水解C末端酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的肽键的丝氨酸蛋白酶。它还以较小的速率断裂C末端的亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的肽键。25℃下在含有100mM Tris-HCl，pH7.6、10mM CaCl2和250μg/ml的测序等级的糜蛋白酶的反应缓冲剂中温育产品R19小时，然后在16％的凝胶上进行SDS-PAGE。糜蛋白酶处理显著地降低了5.2KDa和7.6KDa谱带的强度但对4.3KDa谱带没有明显作用。
用链霉蛋白酶(BoehringerMannheim，USA)处理：链霉蛋白酶是一种非特异性的蛋白酶，作用于天然和变性蛋白质。它基本上将所有的蛋白质分解成其各个单独的氨基酸。该制剂含有各种类型的内肽酶如丝氨酸和金属蛋白酶、外肽酶如羧基肽酶、中性蛋白酶和中性磷酸酶与碱性磷酸酶。40℃下在含有100mM Tris-HCl，pH7.4、10mM CaCl2、0.1％SDS和2mg/ml来自S.griseus的链霉蛋白酶的反应缓冲剂中温育产品R试样75分钟，然后在16％的凝胶上进行SDS-PAGE。所有可被银染色的组分在链霉蛋白酶的这种处理之后消失。
用N-糖苷酶F(Boehringer Mannheim，USA)处理：N-糖苷酶F断裂所有类型的结合N-聚糖的天冬酰胺，如果氨基和羧基存在于肽键上且该低聚糖具有壳二糖核单位的最小长度。37℃下在含有0.4×Dulbecco′s PBS(其中1×PBS含有1.47mM KH2PO4、2.67mM KCl、138mM NaCl和8.1mMNa2PO4 7H2O)、0.1％SDS、0.5％NP4O和50单位/ml的重组N-糖苷酶F的反应缓冲剂中温育产品R试样4小时，并在16％的凝胶上进行SDS-PAGE。N-糖苷酶F的处理不改变任何产品R在16％SDS凝胶上的谱带的强度。对N-糖苷酶F的抗性表明缺乏在糖蛋白上常见的结合N-聚糖的天冬酰胺。
用核糖核酸酶A(ICN Biochemicals，USA)处理：核糖核酸酶A是一种作用于单链RNA的嘧啶特异性内核糖核酸酶。37℃下在含有10mMTris-HCl，pH7.4、3mM MgCl2和1mg/ml的牛胰腺核糖核酸酶A的反应缓冲剂中温育产品R试样1小时，并在16％的凝胶上进行SDS-PAGE。核糖核酸酶A不改变任何由16％SDS-PAGE凝胶解析的产品R的谱带的强度。对核糖核酸酶A的抗性排除了该肽上结合RNA片断的可能性。
用磷酸酶(LifeTechnologies，USA)处理：牛胸腺碱性磷酸酶(CIAP)是一种从DNA、RNA和核苷酸上水解5’-磷酸酯基的磷酸单酯酶。37℃下在由酶的制造商提供的反应缓冲液和200单位/ml CIAP中温育产品R试样大约1小时，并在16％的凝胶上进行SDS-PAGE。CIAP没有改变任何由SDS-PAGE解析的产品R的谱带的强度。
在下表III中总结了上述的异化酶处理，处理结果如图5所示，其中＂-＂代表基本不改变可染色谱带，而＂+＂代表基本上改变可染色谱带。
表III酶 产品R的肽组分的酶敏感度(SDS-PAGE)
4.3KDa 5.2KDa 7.6KDa蛋白酶K(100μg/ml) - +/- ？*(800μg/ml) - + ？*胰蛋白酶(250μg/ml) - - -糜蛋白酶(250pg/ml) - + +链霉蛋白酶(2mg/ml) + + +N-糖苷酶F(50单位/ml) - - -核糖核酸酶A(1mg/ml) - - -碱性磷酸酶(200单位/ml) - - -
*由于在该区域存在酶片断因而该谱带不能被清楚地识别。
这些酶消化图谱的复杂性表明产品R的肽组分可能与其它分子如单核苷酸和/或糖类结合，或分子内/分子间交联。
RNA凝胶电泳：核酸的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳都不产生任何可被溴化乙锭染色的谱带，表明在产品R中没有RNA片断。
产品R对吞噬作用的影响：
图7和8为代表与细胞相关的流式细胞计数直方图，它表示在产品R处理的24小时和8天后，产品R分别对葡聚糖-FITC或葡聚糖-BoDipyFL的作用。采用人类单核细胞系，U937测试产品R对吞噬作用的影响。在葡聚糖-FITC测试24小时前，或葡聚糖-BoBipyFl测试的8天前，在含有5％产品R或作为对照的5％的PBS的培养基中培养U937细胞24小时。为了测定吞噬作用，37℃下如图5所示连续地用吞噬细胞标记如荧光标记的葡聚糖-FITC培养细胞5、15、30和45分钟，或如图6所示用葡聚糖-BoDipyFL培养5、15、25和40分钟。在吞噬细胞摄入之后，基本上根据Sallusto，F.等人(1995)，J.Exp.Med.，182：389-400所述的方法采用流式细胞计数分析法监测与细胞有关的荧光的数量，本文引用该文献全部作为参考。在这些测试中，已从实验试样中扣除背景值，并采用二碘化丙锭排除法从这些数据中排除死细胞。
图7和8分别表示PBS对照(紫色)、产品R处理(绿色)和结合到细胞上的背景葡聚糖(黑色)的荧光对数对细胞数量的覆盖图。紫色谱图(PBS对照)基本上与绿色谱图(产品R)的每一时间点重叠，表明产品R不抑制人类单核细胞的吞噬作用。
产品R的其它生物学功能：已在以下文献中描述了产品R其它的某些已知生物学功能：美国专利号5,807,840，5,807,839和5,902,786；美国专利申请号08/838,077，08/838,069，08/835,793，08/835,794，08/833,950，08/837,992，08/837,988，08/838,070，08/839,651，08/835,796，08/964,250，08/964,427，08/923,516，08/923,343，08/922,888，09/189,172，09/007,565，09/316,624，09/316,374，09/257,739和Hirschman等人，J.Investig.Med.1996；44：347-351的出版物。
本文引用这些专利、专利申请和出版物的全部作为参考。
结论：
因此确定了根据本发明所述的方法制备的产品R的组合物包含分子量不大于14KDa，主要为不大于8KDa的核苷酸和肽。产品R的肽组分是不均匀分布的，并且一般位于两个主要的分子量为4.3KDa、5.2KDa的可被银染色的谱带和较小的7.6KDa谱带处。
产品R的UV吸收光谱表明最大吸收在260nm处，而最小在235nm处，且在260nm处的吸光率相对于280nm处的吸光率的特征性比率为1.998，而在260nm处的吸光率相对于230nm处的吸光率的特征性比率为1.359。
如图2所示，产品R的HPLC谱图包括分部A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和M。
如图3所示，产品R的BioGel P-2凝胶过滤谱图包括分部I、Ia、II、IIa、IIb、III、IIIa、IV和IVa。
常规Reticulose组合物与产品R的比较
如表5所示，比较根据本发明教导制备的产品R的组合物与常规Reticulose组合物的分子量(MW)和在230nm、260nm和280nm波长处的紫外(UV)吸收率(A)。虽然已报道Reticulose的分子量小于15KDa的组分抑制吞噬作用，但本申请证明了产品R并不抑制吞噬作用。
表IV
MW UV I/PH*
A260/280 A260/230产品R ＜14Kda 1.998 1.359 无Reticulose 1-25Kda 2.839 1.198 有
*分子量小于15Kda的分子对吞噬作用的抑制。
因此，产品R基本上不同于Reticulose之处在于其组成和生物学功能。
表V是用于制备本发明治疗组合物产品R和常规组合物Reticulose的原料的相对量的比较。
表V
10升中用于最初反应的原料 Reticulose 产品R
酪蛋白 250克 140克
牛肉胨 150克 68.4克
血清白蛋白 15克 13克
RNA 80克 88克
NaOH 75克 66克
大约221克蛋白质用于制备产品R的最初反应，而大约415克用于制备Reticulose。因此，用于Reticulose制备的最初蛋白质浓度为用于产品R制备的2倍。
以下的实施例仅用于例举制备产品R的方法，不应将其认为是对本发明的限定。
实施例
在约3-7℃下，在适宜的容器中，将约35.0g酪蛋白、约17.1g牛肉胨、约22.0g核酸(酵母RNA)，约3.25g牛血清白蛋白悬浮在约2.5升的注射USP用水中，并轻轻地搅拌直至所有的成分被适当地湿润。搅拌时小心地加入约16.5g的氢氧化钠(试剂等级ACS)，并继续搅拌直至氢氧化钠完全溶解。在约9lbs的压力和200-230°F下高压灭菌一段时间直至RNA被完全消化，例如4小时。在些期间结束时，终止高压灭菌并使反应烧瓶和内含物缓慢冷却至室温。然后在3～8℃冷却至少6小时。通过2微米和0.45微米的过滤器，采用惰性气体如氮或氩在低压(1-6psi)下过滤所得的溶液。以类似地方式通过0.2微米的热原截留过滤器再次过滤该溶液。对所得的滤液抽样并用于总氮分析。然后计算以确定加至滤液中的冷却的注射用水的数量，以得到一种氮含量约在165-210mg/100ml之间，而最终体积约为5升的稀释的滤液。然后用浓HCl(试剂级ACS)或1.0标准NaOH调节PH至约7.3-7.6的范围。然后在低压下通过0.2微米的含惰性气体的过滤器再次过滤该稀释溶液。接着惰性气体环境下将该最终滤液注入并密封至2ml玻璃安瓿中。收集这些安瓿并在240°F和14-16磅压力作最终的高压灭菌大约30分钟。在灭菌循环后，冷却并洗涤含产品R的安瓿。
将所有的数量加减15％的变化以作PH、体积和分析调节。
因此，虽然已表明、描述和指明了应用于优选的实施方案的本发明的基本的新特征，但应该理解本领域技术人员在不背离本发明的实质的情况下可以对所示的装置的和操作的形式及其细节作各种删减、替换和变化。例如，显然所有基本上以相同的方式完成基本上相同的功能以实现相同的结果的要素和/或方法步骤的组合是在本发明的范围之内的。
而且，应该认识到可以将在本发明的任何公开方式或实施方案中所显示和/或描述的结构和/或要素和/或方法步骤作为设计选择的常规因素而结合到任何其它公开或描述或建议的方式和实施方案中。因此，仅通过所附的权利要求的范围来表示对本发明的限定。
Claims (11)
1.一种吸收波长230nm，260nm和280nm处的光而导致在260nm/280nm吸收率约为1.998和260nm/230nm吸收率约为1.359的肽核苷酸组合物，包含来自植物RNA的核苷酸分子和来自酪蛋白、牛肉胨与牛血清白蛋白的混合物的肽的分子，这些分子具有不均匀分布的分子量。
2.权利要求1的组合物，其中所述核苷酸为单核苷酸。
3.权利要求1的组合物，其中所述分子具有范围为0到基本上不大于14Kda的不均匀分布的分子量。
4.权利要求1的组合物，其中该分子的不均匀分布的分子量范围为0到基本上不大于8KDa。
5.权利要求1的组合物，其中所述分子具有基本上集中在基本上为5.2KDa和4.3KDa处的分子量。
6.一种肽核苷酸组合物的制备方法，该肽核苷酸组合物吸收波长230nm，260nm和280nm处的光而导致260nm/280nm吸收率约为1.998和260nm/230nm吸收率约为1.359，所述组合物含有不均匀分布的分子量的核苷酸和肽分子，包括下述步骤：
a.形成包括由酪蛋白、牛肉胨和牛血清白蛋白组成的蛋白质组合物、植物RNA和在水中的碱的混合物，其中所述蛋白质组合物与水的重量比范围约为1.5/100至2.5/100；
b.在高温和高压下处理该混合物以形成一种溶液和不溶成分；
c.除去该不溶成分；
d.用水稀释该溶液；和
e.进行步骤b、c和d后，调节所述溶液的PH至生理学上可接受的PH。
7.权利要求6的方法，其中该蛋白质组合物与水的重量比约为2.2/100。
8.权利要求6的方法，其中该所述核苷酸为单核苷酸。
9.权利要求6的方法，其中所述分子具有范围为0到基本上不大于14KDa的不均匀分布的分子量。
10.权利要求6的方法，其中所述分子具有范围为0到基本上不大于8Kda的不均匀分布的分子量。
11.权利要求6的方法，其中所述分子具有基本上集中在基本上为5.2KDa和4.3KDa处的分子量。
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