CN1360847A - 小球藻提取液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小球藻提取液的制备方法。小球藻细胞悬浮液经温育处理后加入果胶酶、纤维素酶和蛋白酶,再保温处理。酶解提取液中富含小球藻生长因子、多种氨基酸、多糖和核酸类物质,且工艺流程简单,无需特殊设备,成本低,提取效率高。
Description
本发明涉及一种小球藻提取液的制备方法。
小球藻，又称绿藻，是一种单细胞藻类，含有独特成份细胞生长促进因子(C.G.F.)和丰富的营养成分。由于小球藻细胞壁坚固，难于破解，所以多种营养成份不易为人所吸收。1989年8月23日公开的CN1034860A专利申请说明书阐述了一种小球藻制得提取物的方法，它主要操作是向小球藻加水于100℃下加热及分离不溶性物质诸步骤以得到作为滤出液的提取物。这种提取液中只含有10％左右的蛋白质、10％左右的糖和约4.5mg/ml的核酸，小球藻中大量的营养成分还没有充分分解及提取。
本发明的目的就是提供一种小球藻提取液的制备方法，它能有效地分解出小球藻中含有的、容易被人体吸收的C.G.F.和多种氨基酸、多糖、核酸类等物质，且有效成份含量高。
为达到上述目的，本发明采用如下方法来制备小球藻提取液：
A、小球藻细胞加水配制成细胞悬浮液，60～99℃保温1～5小时，离心或抽滤得初次清液和初次沉淀物，初次清液于4～10℃暂存；
B、初次沉淀物再加水配制成细胞悬浮液，50～99℃保温；
C、加入纤维素酶和果胶酶，50～60℃保温1～2小时；
D、加入蛋白酶，50～60℃继续保温1～5小时，离心或抽滤得二次沉淀物和二次清液；
E、把初次清液与二次清液混合，经浓缩、保温、消毒、冷却，得小球藻酶解提取液母液。
为了节省酶的用量，降低工艺成本，可在加入上述酶之前，调节反应物适当的酸碱度，并向反应缸中加入发芽种子匀浆物过滤液。发芽种子可以是豆芽或麦芽。
发明人选用蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，采用上述制备方法，经过检测分析证明，小球藻提取液中含高达19种氨基酸，其中包括8种人体必需氨基酸，浓缩前氨基酸总含量为1.85mg/ml左右，酸性多糖含量为1.7～2.3mg/ml，核酸类物质含量为8.2～8.4mg/ml。
表1是对本方法制备的小球藻酶解提取液中游离氨基酸的检测结果。
| 游离氨基酸名称 | 测定结果(mg/ml) | 游离氨基酸名称 | 测定结果(mg/ml) |
| 天冬氨酸(Asp) | 0.051 | 精氨酸(Arg) | 0.111 |
| 谷氨酸(Glu) | 0.322 | 酪氨酸(Tyr) | 0.045 |
| 天冬酰胺(Asn) | 0.022 | 缬氨酸(Val) | 0.074 |
| 丝氨酸(Ser) | 0.045 | 蛋氨酸(Met) | 0.046 |
| 谷氨酰胺(Gln) | 0.032 | 色氨酸(Trp) | 0.016 |
| 甘氨酸(Gly) | 0.056 | 苯丙氨酸(Phe) | 0.083 |
| 苏氨酸(Thr) | 0.066 | 异亮氨酸(Ile) | 0.032 |
| 组氨酸(His) | 0.016 | 亮氨酸(Leu) | 0.146 |
| 丙氨酸(Ala) | 0.416 | 赖氨酸(Lys) | 0.162 |
| 脯氨酸(Pro) | 0.108 | ||
| 以上氨基酸总量 | 1.85 | ||
| 分析方法 | OPA-HPLC法 |
发明人通过微生物常规检测法，研究了本方法制成的小球藻提取液对乳酸菌生长的促进作用。结果表明，添加了小球藻提取液的奶粉-豆乳培养基(添加量为1％)和马铃薯-奶粉培养基(添加量为2％)中，嗜热链球菌活菌数比对照分别增加了72.7％和228.6％，保加利亚乳酸杆菌的增加率则为185.7％和100％；于4℃下存放七日后，嗜热链球菌活菌数减少率分别为36.8％和43.5％(对照组为86.4％和64.3％)，而保加利亚乳酸杆菌的减少率则为25％和90.4％(对照组为65.7％和92.3％)。可见，本方法制成的小球藻提取液有显著增加乳酸菌数目和延长活菌的存活时间的功能，对乳酸菌的生长起一定的促进效应，证明小球藻提取液具有丰富的活性组份和营养成分，且易为人体吸收，是具有食疗作用的保健佳品。本发明的小球藻提取液的制备方法，工艺流程简单，无需特殊设备，成本低，提取效率高。
实施例1：用干藻粉加水按1∶10比例配制细胞悬浮液，并用盐酸调PH值至5.5左右，慢速搅拌，95℃保温2小时，保温后离心或抽滤得初次清液和初次沉淀，分别计量。将初次沉淀物重新放入反应缸内，待酶解。将初次清液放入冷库于4～10℃暂存。在放有初次沉淀的反应缸内加水，再次配制成细胞悬浮液，加水量为第一次加水量的60％，并同时加入氢氧化钠溶液，调PH值到12左右，65℃保温2小时后，加入50％醋酸溶液，调PH到5.5左右，即加入绿豆芽匀浆物过滤液(每10公斤干藻粉用350克左右绿豆种子)，慢速搅拌，55℃保温1小时。按10公斤干藻粉加3克酶计，称取纤维素酶、果胶酶，分别溶于柠檬酸缓冲液中，再加入反应缸中，慢速搅拌，55℃继续保温1小时。按10公斤干藻粉加1克酶计，称取木瓜蛋白酶，溶于少量柠檬酸缓冲液中，慢速搅拌，60℃保温1小时，离心或抽滤得二次沉淀物和二次清液。将初次清液和二次清液混合，浓缩、分装，85℃两次保温各20分钟，再冷至室温，放冷库或阴凉处存放。此产品即为小球藻酶解提取液母液。
上述绿豆芽匀浆物过滤液的制备方法如下：取绿豆种子，浸水5～8小时，把种子平铺在细布上；加水微微浸过种子，放30～32℃过夜；第二天，把发芽种子水洗，沥干；加入与发芽种子重量等同的柠檬酸缓冲液；打碎发芽种子，匀浆，用纱布压滤得乳白色溶液；滤渣再用少量柠檬酸缓冲液调匀，搅拌，再压滤。把两次滤液合并，即得。
实施例2：用干藻粉加水按1∶8比例配制细胞悬浮液，并用盐酸调PH值至5.8，慢速搅拌，60℃保温5小时，保温后离心或抽滤得初次清液和初次沉淀物，分别计量。将初次沉淀物重新放入反应缸内，待酶解。将初次清液放入冷库于4～10℃暂存。在放有初次沉淀物的反应缸内加水，再次配制成细胞悬浮液，加水量约为第一次加水量的70％，并同时加入氢氧化钠溶液，调PH值到10左右，55℃保温3小时后，加入50％醋酸溶液，调PH到5.5左右，即加入绿豆芽匀浆物过滤液，每10公斤干藻粉用400克左右绿豆种子，慢速搅拌，60℃保温1小时。按10公斤干藻粉加4克酶计，称取纤维素酶、果胶酶，分别溶于柠檬酸缓冲液中，再加入反应缸中，慢速搅拌，60℃继续保温1小时。按10公斤干藻粉加1克酶计，称取蛋白酶，溶于少量柠檬酸缓冲液中，慢速搅拌，55℃保温3小时，离心或抽滤得二次沉淀物和二次清液。将初次清液和二次清液混合，浓缩、分装，90℃两次保温各20分钟，冷至室温，放冷库或阴凉处存放。此产品即为小球藻酶解提取液母液。
实施例3：用干藻粉加水按1∶10比例配制细胞悬浮液，99℃保温1小时，保温后离心或抽滤得初次清液和初次沉淀物，分别计量。将初次沉淀物重新放入反应缸内，待酶解。将初次清液放入冷库于4～10℃暂存。在放有初次沉淀的反应缸内加水，再次配制成细胞悬浮液，加水量为第一次加水量的70％，并同时加入氢氧化钠溶液，调PH值到11，55℃保温3小时后，加入50％醋酸溶液，调PH到6，即加入麦芽匀浆物过滤液，每10公斤干藻粉用300克左右麦种子，慢速搅拌，60℃保温2小时。按10公斤干藻粉加2克酶计，称取纤维素酶、果胶酶，分别溶于醋酸缓冲液中，再加入反应缸中，慢速搅拌，60℃继续保温2小时。按10公斤干藻粉加1克酶计，称取蛋白酶，溶于少量醋酸缓冲液中，慢速搅拌，60℃保温3小时，离心得二次沉淀物和二次清液。将初次清液和二次清液等量混合，浓缩、分装，85℃两次保温各20分钟，冷至室温，放冷库或阴凉处存放。此产品即为小球藻酶解提取液母液。
实施例4：用干藻粉加水按1∶10比例配制细胞悬浮液，95℃保温5小时，保温后离心或抽滤得初次清液和初次沉淀物，分别计量。将初次沉淀重新放入反应缸内，待酶解。将初次清液放入冷库于4～10℃暂存。在放有初次沉淀的反应缸内加水，再次配制成细胞悬浮液，加水量为第一次加水量的60％，并同时加入氢氧化钠溶液，调PH值到10，70℃保温2小时后，加入50％醋酸溶液，调PH到5.5，即加入绿豆芽匀浆物过滤液，每10公斤干藻粉用300～400克绿豆种子，慢速搅拌，60℃保温2小时。按10公斤干藻粉加10克酶计，称取纤维素酶、果胶酶，分别溶于柠檬酸缓冲液中，再加入反应缸中，慢速搅拌，50℃继续保温2小时。按10公斤干藻粉加5克酶计，称取蛋白酶，溶于少量柠檬酸缓冲液中，慢速搅拌，55℃保温4小时，离心得二次沉淀物和二次清液。将初次清液和二次清液混合，浓缩、分装，85℃两次保温各20分钟，冷至室温，放冷库或阴凉处存放。此产品即为小球藻酶解提取液母液。
Claims (9)
1、一种小球藻提取液的制备方法，其特征在于依次包括如下步骤：
A、小球藻细胞加水配制成细胞悬浮液，60～99℃保温1～5小时，离心或抽滤得初次清液和初次沉淀物，初次清液于4～10℃暂存；
B、初次沉淀物再加水配制成细胞悬浮液，50～99℃保温；
C、加入纤维素酶和果胶酶，50～60℃保温1～2小时；
D、加入蛋白酶，50～60℃继续保温1～5小时，离心或抽滤得二次沉淀物和二次清液；
E、把初次清液与二次清液混合，经浓缩、保温、消毒、冷却，得小球藻酶解提取液母液。
2、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤B中配制成细胞悬浮液后，加碱调控PH值至10～12，55～70℃保温2～3小时，然后加酸调控PH至5～6；
3、根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：步骤A中保温之前加酸调PH值至5～6。
4、根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：步骤A中保温温度为95℃。
5、根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：步骤B与C之间还有如下操作：加入发芽种子匀浆物过滤液，50～60℃保温1～2小时。
6、根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于：所述发芽种子为豆芽或麦芽。
7、根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于：所述小球藻细胞是小球藻干藻粉。
8、根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于：每10公斤小球藻干粉加用300～400克绿豆种子。
9、根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于：每10公斤小球藻干藻粉加1～10克纤维素酶、1～10克果胶酶和1～5克蛋白酶，所用的酶事先溶于柠檬酸缓冲液中。
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