CN1355022A - 枸杞多糖在制备治疗脂肪肝药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了枸杞多糖在制备治疗脂肪肝药物中的新用途。枸杞多糖是中药枸杞中提取的有效成分,可明显降低高脂动物和高脂饮食脂肪肝动物模型中的脂质,对脂肪肝模型中的肝细胞有保护作用;枸杞多糖能够明显减轻四氯化碳所致鼠肝脂质过氧化损伤,降低丙二醛、甘油三酯和谷胱甘肽过氧化物酶的量,增加超氧化物歧化酶的量;并可明显改善脂肪肝患者的临床症状,降低血脂,使ALT和AST明显下降;枸杞多糖无毒性,临床使用安全方便。

Description

枸杞多糖在制备治疗脂肪肝药物中的应用

本发明涉及枸杞多糖(英文名称Lycium barbarum polysaccharides)的用途，尤其涉及枸杞多糖在制药领域中的用途。

枸杞多糖是植物枸杞(拉丁文名称为Lycium barbarum L)中的有效成分之一，是由6种单糖组成的杂多糖，并含有氮和多种氨基酸以及微量元素，采用HP公司5840A型气相色谱仪SP2100，弹性毛细管柱(0.2mm×12m)载气为高纯氮，程序生温160℃～200℃5min，内标肌醇六酰酯。结果如下表：

名称	保留时间		面积	相对浓度(μg/mg)
					标准品	样品
	鼠李糖	2.87					2.86	87	7.46
阿拉伯糖			2.99	2.98	2087	187.89
	木糖	3.07					3.07	136	9.21
甘露糖			5.16	5.16	108	8.77
	葡萄糖	5.29					5.29	714	46.95
半乳糖			5.60	5.60	983	64.67

其理化性质如下所示：

	溶解度	扫描岛津UV-250	超速离心日立282型	元素分析	比旋度	I2蒸汽
							枸杞多糖	易溶解于水、二甲亚砜，微溶于砒啶。	邻甲苯胺法在487nm和631nm处有两个最大吸收峰	转    速S60000rpmD70000rpm单一极峰	C％43.44H％5.80N％5.46	未测出	棕色

该数据摘自文献“宁夏枸杞研究，宁夏人民出版社，1998年3月”P.529

枸杞多糖可通过常规的提取方法从茄科植物枸杞的果实枸杞子中提取，为一种浅白色粉末状水溶性固体。

枸杞多糖具有较高的营养和保健作用。很多专利公开了有关枸杞营养品和保健品的技术。文献“宁夏枸杞研究，宁夏人民出版社，1998年3月”一书对枸杞从有效成分(包括多糖)的提取、制备到应用均作了详细的描述，而该枸杞多糖在制备治疗脂肪肝药物中的应用尚未见报道。

脂肪肝系由多种病因引起的肝脏脂肪变性，主要是中性脂肪三酯酰甘油(TG)在肝内沉积。据国外资料统计，脂肪肝及其相关疾病的发病率在逐年增加。一些脂肪肝病程较长的病人，可以并发脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。脂肪肝是少部分肝纤维化的早期表现，如能早期诊断和治疗，可以阻止其进一步发展，甚至使其逆转。目前的治疗包括：1、去除病因；2、调整饮食；3、运动治疗；4、药物治疗等。虽至今尚无防治脂肪肝的特效药物，而且许多降脂药物如应用不当可能促使血脂更集中于肝脏中代谢，并损害肝功能，但临床和实验研究表明，药物治疗对于促进肝内脂肪及其伴随炎症的消退，以及阻止其进一步发展有积极的意义。因此，积极寻找具有保肝、降血脂和抗脂肪肝的药物是十分必要的。

肥胖、酒精中毒、糖尿病、高脂血症、药物中毒等均可引起脂肪肝。然而，迄今为止，脂肪肝的发病机理尚未明确。目前研究认为脂质代谢异常、氧应激及脂质过氧化、激素、细胞因子、肝筛改变、缺氧和肝微循环异常等参与脂肪肝的发生发展。其中起关键作用是脂质代谢异常，包括输送入肝内游离脂肪酸(FFA)增多；肝内FFA合成增多或碳水化合物合成TG增多、FFA在线粒体内β氧化减少和极低密度脂蛋白(VLDL)合成或分泌障碍。VLDL合成或分泌需三磷酸腺苷(ATP)提供能量。线粒体是细胞内能量代谢和脂肪代谢的重要场所。维持线粒体的正常生理功能对脂质正常代谢具有重要的意义。由于线粒体DNA(mtDNA)缺乏组蛋白及非组蛋白保护，缺乏修复功能，易受细胞内氧自由基等侵袭。抗氧化剂可抑制氧自由基的脂质过氧化，目前一些已被用于试验动物和人类酒精性肝病及部分非酒精性脂肪肝的治疗。

本发明的目的在于提供枸杞多糖的新用途，即在制药中的新用途，具体地说是提供枸杞多糖在制备治疗脂肪肝药物中的应用。

本发明的构思是这样的：

中药是药学的宝库。但目前所用的中药多为单味或多味中药复方煎制的汤剂或乙醇提取物，或丸剂，其有效成分不十分明确。近年来，研究发现中药枸杞的有效成分之一——枸杞多糖具有免疫调节、抗疲劳、抗氧化、护肝、降血脂、降肝TG等作用，提示枸杞多糖可能是一种很有前途的防治脂肪肝的药物。枸杞多糖尚具有抗氧化保护作用，且其保护作用是通过抗自由基损伤来完成的。因此，枸杞多糖可在制备治疗脂肪肝的药物中得到应用。

为了更好地理解本发明的实质，以下将用枸杞多糖的毒理、药理和临床试验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。

采用文献“宁夏枸杞研究，宁夏人民出版社，1998年3月”报道的方法提取枸杞多糖。用无热源去离子的纯净蒸馏水将枸杞多糖溶解，消毒配制成100mg/ml/支或200mg/2ml/支的注射剂备用；或采用常规的方法将枸杞多糖制成50mg/囊的胶囊备用；也可以采用本领域技术人员公知的方法将提取的枸杞多糖压片，制成50mg/粒的片剂备用。

具体实验和临床结果分述如下：一.动物实验：一)小鼠口服枸杞多糖的急性毒性试验：1.小鼠口服枸杞多糖急性毒性实验

昆明种小鼠一次灌胃，根据预试验，最高剂量定为1500mg/kg，以80％的比例递减，即为1200、960、768、614mg/kg 5个剂量组，连续观察14天。给药组小鼠无死亡，另一组用水为对照物，比较各组体重变化并剖检其内脏有无异常变化，结果显示，给药组与对照组均无显著差异。2.小鼠肌肉注射枸杞多糖急性毒性试验

昆明种小鼠肌肉注射枸杞多糖的急性毒性进行检验，注射量为1000mg/kg。结果显示，小鼠无死亡，各组织器官未发现病理变化。

上述结果说明枸杞多糖无毒性，临床使用安全。二)枸杞多糖对家兔血脂的影响：1材料：

1)实验动物：新西兰纯种大白兔，体重1500±10克，均为雄性，购自上海陈行实验用兔繁殖饲养场。

2)实验试剂：四氧嘧啶(alloxan)为美国Sigma公司产品，血清甘油三酯、高密度脂蛋白和总胆固醇测定试剂盒，购自上海名典生物工程公司。

3)枸杞多糖：上述的枸杞多糖胶囊，50mg/囊。2.方法：

1)动物模型建立：24只新西兰纯种大白兔用四氧嘧啶(180mg/kg)对大白兔做耳静脉注射。72小时后采血，血清呈乳糜状，此状可维持10天以上，胆固醇和甘油三酯维持在高水平。

2)动物模型分组及给药方法：24只新西兰纯种大白兔随机分成生理盐水对照组和枸杞多糖处理组，每组12只，枸杞多糖处理组用枸杞多糖250mg/kg体重剂量灌胃，生理盐水对照组用生理盐水灌胃，连续10天。

3)血清甘油三酯、高密度脂蛋白和总胆固醇测定：在处理前、处理后3天及结束后分别自实验兔(空腹)的耳静脉采血，测定血清甘油三酯、高密度脂蛋白和总胆固醇；生理盐水对照组同时采血测定血清甘油三酯、高密度脂蛋白和总胆固醇。

4)统计学处理：各组间实验数据的比较用t检验，P＜0.05为有显著差异。3.结果：

枸杞多糖处理前、处理后3天及结束后(10天)新西兰大白兔血清甘油三酯、高密度脂蛋白和总胆固醇的结果见表1。表1枸杞多糖对高脂血症兔血清甘油三酯、高密度脂蛋白和总胆固醇的影响(mmol/L)

	甘油三酯	高密度脂蛋白	总胆固醇
				枸杞多糖处理前	1.42±0.38	1.06±0.36	1.42±0.43
对照组(处理前)	1.39±0.46	1.11±0.42	1.51±0.52
				枸杞多糖处理后3天	4.36±0.82	0.55±0.31	8.91±0.95
对照组(处理后3天)	4.42±0.73	0.51±0.35	9.38±1.06
				枸杞多糖处理结束后	2.61±0.54**ΔΔ	0.88±0.38*Δ	4.61±0.86**ΔΔ
对照组(处理结束后)	4.09±0.67	0.61±0.32	7.90±0.93

注：处理结束后，与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；处理结束后，与处理后3天比较^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01；处理前两组间未见显著差异。

从表1可见，枸杞多糖能显著降低高脂血症兔血清中的甘油三酯和总胆固醇量。三)枸杞多糖对新西兰大白兔高脂饮食脂肪肝形成的影响：1.材料：

1)实验动物：新西兰纯种大白兔，体重1500±10克，均为雄性，购自上海陈行实验用兔繁殖饲养场。

2)实验试剂：血清甘油三酯、高密度脂蛋白和总胆固醇测定试剂合购自上海名典生物工程公司；胆固醇购自上海生物化学试剂总公司；丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白及白蛋白测定试剂合购自上海生物制品研究所临床诊断试剂实验中心。

3)枸杞多糖：枸杞多糖胶囊，50mg/囊。2.方法：

1)动物模型建立：18只新西兰纯种大白兔正常喂养1周后，随机分为三组，每组6只。正常组喂普通饲料；模型组为高脂饮食饲料喂养，即普通饲料基础上加1％胆固醇和10％猪油；枸杞多糖治疗组在高脂饲料喂养的同时分别给予枸杞多糖250mg/ml体重灌胃，每日一次。实验动物自由饮水和进食，分笼饲养于20±2明暗各12小时的清洁级动物实验室内。实验第10周后隔夜禁食，次日在2.5％戊巴比妥钠静脉麻醉下，从心脏采血后处死并取出肝脏，按常规制备血清、肝组织匀浆和肝组织石蜡切片。

2)观察指标及测定方法：

(1)血清生化测定：血清ALT、AST、总蛋白、白蛋白、甘油三酯和总胆固醇测定按试剂盒推荐的方法进行。

(2)肝匀浆生化测定：肝组织脂质测定为取1克肝组织匀浆，用氯仿∶乙醇(2∶1体积比)液抽提脂质，即上清可溶部分，按试剂盒的方法分别测定甘油三酯和总胆固醇。3.结果：

造模4周时，高脂造模组大白兔血脂即已升高，至造模结束时血清甘油三酯和总胆固醇均显著高于正常组(P分别＜0.05和0.01)，血清高密度脂蛋白和肝功能转氨酶呈升高趋势，但与正常组相比无显著差异。枸杞多糖组血甘油三酯和总胆固醇显著下降，与高脂模型组相比有显著差异(P＜0.01)，肝功能有明显改善。详见表2和3。

               表2血清脂质的变化(mg/dl)

组别	例数	甘油三酯	总胆固醇	高密度脂蛋白
					正常组	6	31.6±10.3	29.3±6.1	24.3±2.5
高脂模型组	6	49.8±15.3	1015.7±162.1	35.6±17.8
					枸杞多糖组	6	32.0±12.5*	52.2±9.6**	34.8±7.2

注：与高脂模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

               表3肝功能的变化

组别	例数	ALT(U/L)	AST(U/L)	白蛋白(g/L)	白/球
						正常组	6	21.3±7.6	12.9±2.6	32.5±2.8	1.48±0.31
高脂模型组	6	30.5±12.3	16.7±7.6	35.6±4.5	1.35±0.43
						枸杞多糖组	6	22.9±11.8**	13.6±6.6*	34.1±3.7	1.47±0.57

注：与高脂模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

与正常组相比，高脂模型组肝匀浆甘油三酯轻度增加(P＜0.05)，而总胆固醇显著增加(P＜0.01)；枸杞多糖组与高脂模型组相比，甘油三酯和总胆固醇均下降(P分别＜0.05和0.01)。详见表4。

表4肝匀浆甘油三酯和总胆固醇的变化

组别	例数	甘油三酯	总胆固醇
				正常组	6	14.2±5.3	4.3±2.6
高脂模型组	6	23.5±6.7	38.7±7.5
				枸杞多糖组	6	15.8±5.9*	12.9±3.9**

注：与高脂模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

光镜显示，高脂模型组所有动物出现中度左右的脂肪肝，表现为肝细胞脂肪变性、气球样变和局灶性坏死，伴有轻至中度的静脉周围和窦周纤维化。与模型组相比，枸杞多糖组肝脂肪变、气球样变及局灶性坏死较高脂模型组明显减轻；正常组未见异常改变。四)枸杞多糖对四氯化碳损伤大鼠肝脏的影响：1.材料与方法

1)实验动物：Wistar雄性大鼠，体重200～250克，购自中国科学院上海实验动物中心。普通饲料喂养，自由进食。

2)实验试剂：丙二醛(MDA)、甘油三酯、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒购自上海名典生物工程公司；胆固醇购自上海生物化学试剂总公司。

3)实验方法：64只Wistar大鼠正常喂养1周后，随机分为四组，I组：16只正常对照组；II组：16只四氯化碳(CCl₄)组(40％CCl₄花生油溶液皮下注射，首次0.5ml/100g体重，以后0.2ml/100g体重，每周2次，共6周12次)；III组：16只四氯化碳处理后同时用枸杞多糖低剂量(250mg/kg体重)处理；IV组：16只四氯化碳处理后同时用枸杞多糖高剂量(500mg/kg体重)处理。实验动物自由饮水和进食，饲养于20±2℃明暗各12小时的清洁级动物实验室内。III和IV组每天分别用250mg/kg体重和500mg/kg体重枸杞多糖灌胃，I和II组每天用等量的生理盐水灌胃，6周后处死，每只大鼠各取2克肝组织做肝匀浆，分别测定丙二醛(MDA)、甘油三酯、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，测定按试剂盒推荐的方法进行，其余肝组织标本固定做石蜡切片。2.结果：

1).枸杞多糖对四氯化碳损伤大鼠肝脏的影响：枸杞多糖对四氯化碳损伤大鼠肝脏丙二醛(MDA)和甘油三酯的影响见表5。

表5枸杞多糖对四氯化碳损伤大鼠肝脏丙二醛(MDA)和甘油三酯的影响

组别	例数	丙二醛(nmol/mg蛋白)	甘油三酯(mmol/L)
				正常对照组	16	3.67±1.52	0.85±0.26
四氯化碳损伤组	16	9.18±2.16	1.39±0.31
				枸杞多糖低剂量组	16	5.07±1.85**	1.03±0.32*
枸杞多糖高剂量组	16	5.23±1.91**	1.11±0.29*

注：与四氯化碳对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表5可见，低剂量和高剂量枸杞多糖均能明显减轻四氯化碳所致鼠肝脂质过氧化损伤，降低丙二醛和甘油三酯的量。

2)枸杞多糖对四氯化碳损伤大鼠肝脏中抗氧化酶活性的影响，枸杞多糖对四氯化碳损伤大鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响见表6。

表6.枸杞多糖对四氯化碳损伤大鼠肝脏中抗氧化酶活性的影响

组别	例数	SOD(μg/mg蛋白)	GSH-Px(μg/mg蛋白)
				正常对照组	16	1.17±0.22	14.54±2.26
四氯化碳损伤组	16	0.98±0.16	14.99±2.41
				枸杞多糖低剂量组	16	1.33±0.34*	11.06±2.39*
枸杞多糖高剂量组	16	1.56±0.31**	11.11±2.37

注：与四氯化碳对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表6可见，与正常大鼠比较，四氯化碳大鼠肝中SOD活性明显下降；服用枸杞多糖高和低剂量组大鼠，SOD活性均高于正常对照组及四氯化碳组，且与剂量有一定的关系，即随着剂量增加，其活性亦增加。与四氯化碳组相比，在枸杞多糖低剂量组GSH-Px降低，统计学有显著差异，高剂量组可见GSH-Px降低，但统计学未见差异。

3)肝组织学检查：光镜检查示四氯化碳组大鼠肝细胞呈脂肪变性，小灶性坏死，门脉区及坏死区纤维组织大量增生，大部分纤维组织已互相连接，可见假小叶形成，间质有大量炎性细胞浸润。而在枸杞多糖高剂量组和低剂量组仅见大鼠肝细胞部分脂肪变性，少量的肝细胞点状坏死，纤维组织增生不明显。二.临床试验：

枸杞多糖对脂肪肝患者血脂及生化指标的影响：一)病例与方法：

1.病例：选择脂肪肝患者60例，其中男性26例，女性34例，年龄40-60岁，平均年龄51.3岁，入选标准如下：1)伴有脂肪肝相关的常见疾病，如肥胖、糖尿病和高脂血症；2)可无症状、无明确的腹部不适或者有右季肋部疼痛、疲倦或不适；3)体征可有肝肿大；4)B超显示脂肪肝的影象学变化；5)实验室检查可见血清ALT和AST升高2～3倍，血脂升高，血清AKP正常或轻度升高，白蛋白、凝血酶原时间、胆红素正常。

2.试验药物：枸杞多糖50mg/胶囊。

3.试验方法：60例脂肪肝患者入选后，每例患者口服枸杞多糖，每日三次，每次100毫克，连续服用12周，在服枸杞多糖时，停服一切降血脂药物。

4.观察指标：每例脂肪肝患者于治疗前及治疗结束后空腹采血，用全自动生化分析仪测定血中的甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、ALT、AST、白蛋白和胆红素。

5.统计学处理：试验中各指标测定值为平均值±标准差，显著性检验用T检验。二)结果：

1.脂肪肝患者枸杞多糖治疗前后临床症状的变化：

脂肪肝患者经枸杞多糖治疗后，患者自觉症状明显改善，腹部不适、右季肋部疼痛、疲倦或不适等症状明显减轻或消失。

2.脂肪肝患者枸杞多糖治疗前后血脂的变化：

脂肪肝患者枸杞多糖治疗前后血脂的变化见表7。

表7脂肪肝患者枸杞多糖治疗前后血脂的变化

	例数	甘油三酯(mmol/L)	总胆固醇(mmol/L)	高密度脂蛋白(mmol/L)
					枸杞多糖治疗前	60	2.59±2.31	5.63±3.42	1.21±0.32
枸杞多糖治疗后	60	2.16±2.67**	4.65±3.11**	1.57±0.46**

注：与治疗前比较，^**P＜0.01。

脂肪肝患者经枸杞多糖治疗后，其血脂均比治疗前明显下降(P＜0.01)。

3.脂肪肝患者枸杞多糖治疗前后血清生化指标的变化：脂肪肝患者枸杞多糖治疗前后血清白蛋白、胆红素等指标未见异常变化，而血清ALT和AST的变化见表8。表8脂肪肝患者枸杞多糖治疗前后血清ALT和AST的变化

	例数	ALT	AST
				枸杞多糖治疗前	60	80.74±35.92	58.36±33.29
枸杞多糖治疗后	60	51.61±36.87**	52.56±37.18*

  注：与枸杞多糖治疗前比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表8可见，脂肪肝患者经枸杞多糖治疗后，ALT和AST有明显的下降。

由上述公开的毒性试验、药理试验和临床试验可见：

1)枸杞多糖可明显降低高脂动物和高脂饮食脂肪肝动物模型中的脂质，

对脂肪肝模型中的肝细胞有保护作用；

2)枸杞多糖能够明显减轻四氯化碳所致鼠肝脂质过氧化损伤，降低丙二

醛、甘油三酯和谷胱甘肽过氧化物酶的量，增加超氧化物歧化酶的量，

并使组织学明显改善；

3)临床研究显示，枸杞多糖可明显改善脂肪肝患者的临床症状，降低血

脂，使ALT和AST明显下降；

4)枸杞多糖无毒性，临床使用安全方便。

附：枸杞多糖含量的测定：

1标准曲线的绘制：①标准溶液配制，精密称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖100mg，置于100ml的容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，从中吸取10ml于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度。②硫酸蒽酮液配制，称取50mg蒽酮，加入25ml蒸馏水，再加75ml浓硫酸，摇匀。③标准曲线的绘制，精密吸取标准溶液0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml，0.7ml，分置于具塞试管中，各加蒸馏水至1.0ml，在冰浴中迅速滴加4.0ml硫酸蒽酮液，摇匀，放置5min，制沸水浴中加热10min，取出静置40min，另以蒸馏水1.0ml，加硫酸蒽酮液同上操作，作为空白。于620nm处测定吸收度，绘制标准曲线，回归方程为A＝4.169×10^-4+0.583C，r＝0.9998。

2样品测定：称取105℃干燥恒重的枸杞多糖100克，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，从中吸取10ml置于100ml容量瓶中，加水定容至刻度，精密吸取0.2ml，再加入蒸馏水0.8ml，按标准曲线制作法操作，测定吸收度，即可测得样品中多糖含量。

                     实施例1

将粉碎的宁夏枸杞100克置于提取器中，依次用石油醚400毫升、乙醚400毫升、80％的乙醇400毫升回流提取4小时，残渣干燥后，再用400毫升水回流提取4小时，浓缩至200毫升，加入活性炭脱色，过滤，滤液加入95％的乙醇使溶液的醇含量为80％，静置，过滤，残渣用乙醚、无水乙醇洗涤，得枸杞多糖，60℃干燥，备用。

                      实施例2

用1000ml无热源去离子的纯净蒸馏水将100g实施例1的枸杞多糖溶解，混合均匀，消毒配制成200mg/2ml/支的注射剂，装瓶制成品。

                      实施例3

按本领域技术人员公知的方法制备枸杞多糖胶囊，以淀粉为填充剂，以8％淀粉浆为粘合剂，制成颗粒，然后装胶囊，制成的胶囊的规格为50mg/囊。配方如下：

枸杞        100克

淀粉         85克

淀粉浆8％    适量。

                  实施例4

按本领域技术人员公知的方法制备枸杞多糖片剂1000片。

配方如下：

枸杞多糖    50克    淀粉          20克

微晶纤维素  35克    羧甲基淀粉钠   8克

乳糖        30克    硬脂酸镁     0.9克

10％淀粉浆  适量。

Claims (1)

1.枸杞多糖在制备治疗脂肪肝药物中的应用。