CN1345232A - 水凝胶颗粒制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了由活性组分与水凝胶载体结合而形成的新组合物。该组合物适用于高速透皮颗粒注射技术。本发明也提供了制备所述新组合物的方法。另外,本发明提供了将药理活性剂施用于受试者的方法。这些方法适用于药物、生物药剂、疫苗和诊断剂的给药。

Description

水凝胶颗粒制剂
技术领域
本发明主要涉及颗粒药物组合物。更具体而言，本发明涉及适宜于由无针注射器系统透皮颗粒给药的颗粒药物组合物，以及生产此组合物的方法。
发明背景
将药剂释放进入和穿透皮肤表面(透皮给药)较口服或非肠道给药技术具有许多优点。尤其是，透皮给药为替代传统给药系统提供了安全、方便和非侵害性的给药途径，该途径避免了与口服给药(如，吸收和代谢速度易变、胃肠道刺激和/或苦味或使人不愉快的药物味道)或非肠道给药(如，注射疼痛、引起接受治疗个体发生感染的风险，此污染或感染的风险是由保健人员对针管和使用过的针头的处理不当而引起的)有关的主要麻烦。
然而，尽管具有明确的优点，透皮给药仍存在诸多其自身固有的逻辑学问题。穿透完整无损皮肤的被动给药，必然地使得分子通透一系列结构不同的组织进行转运成为必需，以便药物进入血液或淋巴系统，所述组织包括角质层、有活力的表皮层、乳头状真皮层和毛细血管壁。因此，透皮给药系统必须能够克服各种类型组织带来的各种阻力。
为此，已经开发了大量的被动透皮给药的供选择的替代技术。这些替代技术包括使用透皮促进剂或“渗透增强剂”，以增加皮肤通透性，以及非化学模式如使用电离子渗入法、电穿孔或超声。可是，这些供选择的替代技术常常引发其自身独有的副作用，如皮肤刺激或者过敏。因此，能够利用传统的透皮给药方法安全和有效地给药的药剂的种类仍相当有限。
最近，公开了必需使用无针注射器以发射粉末(即含有颗粒的固体药物)进入和穿透完整无损皮肤的新透皮给药系统。特别是，Bellhouse等公开的5630796号美国专利描述了一种无针注射器，用该注射器释放在超声速气流中夹带的药物颗粒。该无针注射器用于粉末状药物化合物和组合物的透皮给药，将遗传物质释放到活细胞中(如基因治疗)或者将生物药剂释放到皮肤、肌肉、血液或淋巴中。无针注射器也可用于与手术联合而将药物和生物制剂释放到器官表面、实体瘤和/或释放到手术腔隙(如，肿瘤基部(tumor beds)或者切除肿瘤后留下的腔隙)中。理论上，差不多能够制备成基本上固体微粒形式的任何药物制剂均可以使用这样的装置进行给药。
水凝胶组合物是生物医学领域众所周知的，常常用作细胞和组织培养的基质、修复术的印模材料、伤口填塞材料，或者用作尺寸排阻色谱法或亲和色谱法中的固相材料。例如，无孔、变形的(deformed)和/或衍生化琼脂糖水凝胶组合物用于高效液相色谱法和亲和色谱法中(Li等(1990)制备生物化学(Preparative Biochem.)20：107-121)，而多孔琼脂糖水凝胶珠用作疏水相互作用色谱的载体(Gustavsson等(1999)J.Chromatography 830：275-284)。在药学领域，通常把水凝胶单体(天然的或合成的)加入到药物组合物中(与引发剂和，有时与交联剂一起加入)，然后使之聚合，从而将外来药物包封在水凝胶基质中。这些技术用于提供药物靶向或控释系统的微球载体系统。例如，交联水凝胶微球用于包封治疗糖尿病的小岛细胞(Lim等(1980)Science 210：908-910)或者包封产生抑制肿瘤物质的肿瘤细胞(美国专利5888497)，可生物降解的水凝胶微球则广泛用于包封各种药物组合物，最常见的是包封肽和蛋白(Wang等(1997)Pharm.Dev.and Technology 2：135-142)。在这些应用中，选择特定的水凝胶体系配制以长期包埋客体细胞或药物(如，提供靶向释放或持续释放或延迟释放药物代谢动力学)。
发明概述
本发明基于这样一个发现：药理活性剂可以与水凝胶颗粒结合形成透皮颗粒从而注射给受试者特别是人。组合物呈粉末形式，所含物质包括与水凝胶颗粒结合的适宜药理活性剂，其中构成粉末的颗粒的平均横断面直径为约0.1～250微米，优选约10～100微米，即颗粒的质均空气动力学直径为10～100μm。
发现组合物给药可以利用能够有效地将药物组合物直接注射进入或穿透皮肤、肌肉或组织(如穿透角质层或透过粘膜)的装置，从而避开有关屏障。一般而言，通过将瞬态超声速氦气喷射流中的颗粒的速度加速到100-3000米/秒，就能够达到所述目的。包含在水凝胶中的药理活性剂包括使接受者产生生化和生理效应的药物(即小的有机分子)、生物药物(即肽、大的蛋白和寡核苷酸)、传统的和DNA疫苗，以及基因治疗药物(gene therapies)。所述效应可以是例如预防接受治疗的人或动物患病或减轻疾病。本发明的优点包括容易加工、负载活性剂的量大和组合物中颗粒大小分布范围窄。
因此，本发明提供药理活性剂在制备用于经颗粒注射途径给药对受试者进行治疗的包含水凝胶的颗粒药物中的用途。
本发明也提供制备适于经颗粒注射给药粉末状药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)水凝胶颗粒与含有药理活性剂的含水组合物接触，从而将活性剂负载到颗粒中；
(b)任选地，在一个至少部分干燥的步骤中将负载了药理活性剂的水凝胶颗粒与含水组合物分离，并将分离出来的水凝胶颗粒与含有所述药理活性剂的含水组合物接触，以便使水凝胶颗粒进一步负载药理活性剂。
(c)如果已经进行了步骤(b)，则任选地重复所述步骤一次或多次，诸如1次至20次。
(d)在干燥步骤中将负载了活性剂的水凝胶颗粒与含水组合物分离；和
(e)得到适宜在透皮粉末注射装置中使用的所需的粉末组合物。
在本发明一个实施方案中，基本上由负载了编码抗原的表达基因构建体的水凝胶组成的颗粒药物可用作核苷酸经颗粒注射而给药于受试者。在另一实施方案中，基本上由负载了编码的抗原的水凝胶组成的颗粒药物可用作疫苗经颗粒注射而给药于受试者。
本发明的一个优点是，水凝胶颗粒可以用作外来(guest)药理活性剂的载体系统，从而方便了此类活性剂的高速颗粒注射给药操作。既然外来活性剂的释放通常取决于下述因素：水凝胶到达含水环境中的膨胀程度；结晶化活性剂的溶解度；水凝胶基质的交联度；活性剂自水凝胶基质的扩散度；水凝胶基质的降解等，那么对于每一个外来活性剂来说，将会轻易地制定出多种释放概貌(profile)。另外，将外来活性剂负载到水凝胶粒中的操作方法允许在负载昂贵的活性组分前预先计算出水凝胶载体的大小，由此避免了通常进行的调整颗粒尺寸操作带来的可能损失。
由于本文的公开，本发明的上述这些和其它目的、方面、实施方案和优点很容易地展示给了本领域技术人员。
附图简述
图1表示由实施例1中透皮颗粒注射(DPJ)给药后获得的平均(±S.E.)血浆胰岛素浓度对时间所作的曲线图，实施例1中的给药情况是：标准冻干制剂(■，287μg/kg)，琼脂糖珠制剂CG 0904(▲，353μg/kg)，琼脂糖珠制剂CG 0920(△，421μg/kg)，和安慰剂(□，0μg/kg)。胰岛素皮下给药(●，28.3μg/kg)以示对照。
图2和3表示实施例5中分别在4％和8％琼脂糖珠中负载胰岛素(◆)的百分数。也显示了理论上的负载百分数(■)。
优选实施方案详述
在详细描述本发明之前，应当懂得本发明不限于特别举例描述的水凝胶或药物粉末制剂或者加工参数，因而，这些方面当然可以不同。还应当懂得，本文所用术语是为描述本发明特定实施方案的目的，而不是旨在进行限定。
本文引证的所有出版物、专利和专利申请，无论是在前面还是下文提到的，均以其全部内容引作参考。
必须指出，除非另外明确声明，本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”或“该”的表述包括复数情况。举例来说，提到“一种颗粒”时包括两种或多种这种颗粒的混合物，提到“一种药物”时包括两种或多种此药物的混合物等。
A.定义
除非另外进行定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的那样的相同含义。下列术语定义如下。
在描述本发明时，将要使用到下面这些术语，其定义如下。
本文所用术语“粉末”，指基本上由能够使用无针注射器装置透皮给药的固体颗粒组成的组合物。构成粉末的颗粒的特征建立在许多参数的基础上，所述参数包括但不限于：平均颗粒大小、平均颗粒密度、颗粒形态学(如，颗粒空气动力学形状和颗粒表面特性)和颗粒穿透能量(P.E.)。
本发明粉末的平均颗粒大小可以差异很大，通常是0.1～250μm，例如10～100μm，更具代表性的是20～70μm。使用惯常技术如显微技术(利用该技术直接得到单个颗粒的大小而不必通过测定一组颗粒的尺寸经统计学处理来得到单个颗粒的大小)、气体吸收、渗透性或飞行时间，可以测定出用质均空气动力学直径(MMAD)表示的粉末平均颗粒大小。如果需要，可以使用自动颗粒大小计数仪(如Aerosizer Counter，Coulter Counter，HIAC Counter，或GelmanAutomatic Particle Counter)来确定平均颗粒大小。
使用已知量化技术如氦测比重术等可以很容易地确定实际颗粒密度或“绝对密度”。或者，利用壳(“tap”)密度测量值来估测本发明粉末的密度。本发明粉末的壳密度一般为0.1～25g/cm3，优选0.8～1.5g/cm3。
壳密度信息在表述不规则大小和形状的物质的密度特征方面特别有用。壳密度是物质的质量除以其体积，其中体积包括它的小孔和小腔而不包括隙间空间。大量的壳密度测定方法为本领域技术人员所公知，包括蜡浸、水银置换、水吸收和表观比重技术。同样有大量可利用的测定壳密度的适宜装置，譬如，购自MicromeriticsInstrument Corp.的GeoPycTM Model 1360。药物组合物样本的绝对密度与壳密度之间的区别提供有关样本的总孔隙百分比和比孔容的信息。
使用标准光学显微镜可以很容易地测得颗粒形态学尤其是颗粒空气动力学形状。构成瞬间粉末的颗粒优选基本上呈球形或者至少基本上呈椭圆形空气动力学形状。也优选颗粒的轴比值为3或更小，从而避免存在杆状或针状颗粒。这些显微技术也可用于估测颗粒的表面特性，例如孔表面的大小和范围或孔隙度。
大量常用技术可用于确定颗粒穿透能量，例如金属化膜P.E.试验。金属化膜(如，125μm聚酯膜，在单面沉积了350厚的一层铝)用作基底，以约100～3000米/秒的初始速度从无针注射器(如授予Bellhouse等的美国专利5630796中描述的无针注射器)喷射出的粉末喷向该基底上。金属化膜放置在适宜的平面上，要使金属涂层面朝上。
负载了粉末的无针注射器经间隔物与膜接触，然后喷射。使用适宜溶剂把金属膜表面残留的粉末取走。接着，使用BioRad GS-700型显像密度计扫描金属膜，用带有SCSI界面并装有MultiAnalyst软件(BioRad)和Matlab软件(Release 5.1，The MathWorks，Inc.)的电脑读取密度计的读数。一个程序用于处理密度计扫描，所述扫描使用密度计透射比方法或者反射比方法。粉末的穿透能量应当等于或者好于相同大小再加工过的甘露糖醇颗粒(甘露糖醇颗粒是按照公开号为WO/97/48485国际申请中的方法进行冷冻干燥、压缩、打磨和过筛的，所述国际申请在此引入参考)的穿透能量。
术语“受试者”是指cordata亚门的任何成员，包括但不限于人和其他灵长类，其他灵长类包括非人灵长类如黑猩猩和其他无尾猿及猴类；农场饲养动物如牛、羊、猪、山羊和马；家养动物如狗和猫；实验室动物包括啮齿类如小鼠、大鼠和天竺鼠；鸟类，包括家养的、野生的和玩耍鸟类如小鸡、火鸡和其它鸡形目鸟、鸭、鹅等。该术语并不特指年龄。因此，成年和新生个体均包括在内。本文方法旨在用于任何上述脊椎动物，因为所有这些脊椎动物的免疫系统的活动是相似的。
术语“透皮给药”既包括透皮(“经皮”)给药也包括透粘膜给药，即穿过皮肤或粘膜组织给药。参见例如，Transdermal Drug Delivery：Developmental Issues and Research Initiatives，Hadgraft andGuy(编著)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled DrugDelivery：Fundamentals and Applications，Robinson and Lee(编著)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery ofDrugs，第1-3卷，Kydonieus and Berner(编著)，CRC出版社，(1987)。
B.总的方法
由此提供的药物含有平均直径约0.1～约250微米(μm)、优选约10～约100μm的固体颗粒，每一个颗粒包含与药理活性剂相结合的水凝胶结构，颗粒适宜于经颗粒注射透皮给药于受试者。在某些实施方案中，颗粒的大小是平均直径约20～约75μm，更优选约40～约60μm。颗粒的特征是足以承受从无针注射器释放出来后与靶位皮肤、组织或粘膜表面的弹道冲击，以及在给药装置内颗粒之间的相互作用。组合物呈粉末形式，因而可以批量生产、在容器中运输或为用于无针注射器给药装置即无针头注射器而按照单位剂量形式制备。适用于本发明的水凝胶
适用于本发明的水凝胶是那些对于用药个体而言可药用的水凝胶。水凝胶的无水形式应当在长时期内是稳定的。水凝胶可以是天然存在的(如琼脂糖和藻酸盐)或是合成制备的或者是改性的(如聚乙二醇PEG)。水凝胶是含有大分子三维网络使得它在有水存在时膨胀、缺水时(或通过减少水量)皱缩但不溶于水的物质。膨胀即吸收水分，是由于有亲水官能团附着于或分散于大分子网内的结果。相邻大分子之间的交联导致水凝胶的水不溶性。交联缘于化学键(即共价键合)或物理键(即范德华力、氢键、离子力等)。虽然有时在聚合物工业中把适用于本发明的大分子材料的干燥状态称作“干凝胶”而水合态称作“水凝胶”，但是为了本专利申请的目的，术语“水凝胶”是指无论无水还是水合的大分子材料。水凝胶最具特性之处在于无论是在脱水还是水合状态下材料保持常规形状。因此，如果水凝胶在脱水状态时大致呈球形，那么在水合状态时将呈球形。
通常，药理活性剂是这样与水凝胶结合的：活性剂水性扩散进入大分子网络中，然后干燥大分子材料，从而将活性剂固定和包裹于水凝胶中。活性剂与水凝胶的结合可以是均匀分散并彻底吸收在产生的水凝胶颗粒中，或者是部分分散于仅一部分水凝胶颗粒中。其它方式或者可供选用的方式是，药理活性剂与水凝胶的结合是由于在两个成份之间形成离子或共价键，活性剂主要地包含在水凝胶基质中或者与水凝胶结构的表面结合(如键合)。优选地，活性剂基本上完全吸收在水凝胶大分子网络中。活性剂与水凝胶的结合可以发生在水凝胶颗粒形成的过程中，或者可以发生在已经制备好颗粒之后。一旦水凝胶组合物给药进入皮肤或粘膜部位，则活性剂以一种或数种机制释放到动物的系统中。水凝胶一旦遇含水环境，那么大分子网络将会膨胀，由此而释放出活性剂，和/或如果大分子网络是生物降解性的，那么它将受侵蚀而释出化合物。因此，水凝胶可以是非生物降解性的(即转运型的和排泄型的)，或者是生物降解性的(即侵蚀型的)。侵蚀型水凝胶通常分为两种类型：(1)在交联点侵蚀，或(2)在骨架上侵蚀。
合成制备的水凝胶是如下制备的：将单体材料聚合形成骨架，用交联剂交联骨架。常用的水凝胶单体包括：乳酸、乙醇酸、丙烯酸、甲基丙烯酸(1-羟乙基)酯(HEMA)、甲基丙烯酸乙酯(EMA)、甲基丙烯酸丙二醇酯(PEMA)、丙烯酰胺(AAM)、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GDMA)、甲基丙烯酸乙二醇酯(GMA)、乙二醇、富马酸等。常用的交联剂包括二甲基丙烯酸四甘醇酯(TEGDMA)和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺。
一些合成水凝胶是由亲水乙烯基单体通过自由基聚合反应而形成的。起始步骤是产生自由基，通常通过加入偶氮类引发剂如2，2’-偶氮二(2-甲基丙腈)或过氧化物类引发剂如过氧化苯甲酰来产生。紫外线或者γ射线也可引发反应。自由基与乙烯基单体基团反应而导致链增长。正常状态下，反应混合物的一部分由提供交联度的双官能的乙烯基化合物组成。通常，通过把亲水和疏水乙烯单体共聚到凝胶中来控制凝胶的亲水性。通过交联程度、凝胶的水合程度和渗透性，来确定水凝胶的渗透性。
聚合混合物中使用的溶剂的量和类型对产生的凝胶的质量具有很大的影响。举例来说，聚(甲基丙烯酸羟乙基酯)或者聚(HEMA)，仅仅吸收35-40wt％的水，因而由含有大量水的聚合反应混合物制备的聚(HEMA)含有充水腔隙并且在外观上半透明或不透明。交联通常降低聚合物的吸水性。
也可在无水条件下制备水凝胶，然后用水或者用含有活性剂的浓缩水溶液进行平衡。必须注意避免在干燥状态下制备具有高交联度的高亲水性水凝胶，因为接下来用水平衡将会产生导致水凝胶结构机械性破裂的内部压力。水凝胶制备中应控制的其它参数是聚合温度和引发剂浓度。
侵蚀性水凝胶的实例包括由聚乙烯醇、甲基丙烯酸羟乙基酯、聚丙烯酸、聚氧乙烯、聚乳酸和乙醇酸共聚等制备的水凝胶。交联点处水解不稳定的侵蚀性水凝胶包括由N-乙烯基吡咯烷酮或丙烯酰胺与N，N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚制得的水凝胶。骨架处水解不稳定的侵蚀性水凝胶是通过将不饱和二元酸(例如，富马酸)与二醇(聚(乙二醇))缩合并且在自由基反应中与乙烯吡咯烷酮交联而制得。
有关合成水凝胶的其它探讨见：Richard Baker编写的“Controlled Release of Biologically Active Agents”，AWiley-Interscience Publication，John Wiley & Sons；第101-104页和第178-183页。该参考文献在此引入作为参考。
尽管水凝胶在药学、生物医学和生物工程学上有许多用途，但是却没有一种水凝胶是以本发明所描述的方式来使用的。有关水凝胶应用的探讨见下列出版物：
BIODEGRADABLE HYDROGELS FOR DRUG DELIVERY BIODEGRADABLE
HYDROGELS FOR DRUG DELIVERY，
Kinam Park，Waleed S.W.Shalaby，and Haesun Park(July 1993)
HYDROGELS：SPECIALTY PLASTICS FOR BIOMEDICAL AND PHARMACEUTICAL
APPLICATION
(Ringbou edition)(July 1990)
HYDROGELS AND BIODEGRADABLE POLYMERS  FOR BIOAPPLICANTS(ACS
SYMPOSIUM SERIES，627)(June 1996)
HYDROGELS IN MEDICINE AND PHARMACY：FUNDAMENTALS
Nikolaos Peppas
HYDROGELS IN MEDICINE AND PHARMACY：POLYMERS
Nikolaos Peppas(Editor)(February 1987)
HYDROGELS IN MEDICINE AND PHARMACY：PROPERTIES AND APPLICATIONS
Nikolaos Peppas(Editor)(June 1987)
适用于本发明的天然存在的水凝胶包括来源于自然界如植物、藻类、真菌、酵母、海洋无脊椎动物和节肢动物的各种多糖。代表性的实例包括琼脂糖、葡聚糖、壳多糖、基于纤维素的化合物、淀粉、衍生淀粉等等。这些多糖通常以重复的葡萄糖单元作为多糖骨架的主要部分。优选琼脂糖和葡聚糖。
琼脂糖是琼脂的中性胶凝部分，琼脂是由Rhodophyceae藻的琼脂细胞(agarocytes)提取的多糖复合物。主要的产琼脂的属是在太平洋和印度洋及日本海发现的Gelidium，Gracclaria，Acanthopeltis，Ceramium和Pterocladia。琼脂糖作为色谱树脂具有广泛的用途，因而在色谱柱中被广泛应用。可以商购得到各种来源、冠以不同商品名、直径严格控制在10～100μm的琼脂糖微细颗粒(珠)。如本文所用的，在正常生化意义上使用的术语“珠”是指小的、离散的水凝胶颗粒。适用于本发明的琼脂糖珠可以购自例如Sigma化学公司(St.Louis，MO)，Prometic Biosciences，Inc.(Montreal，Quebec，Canada)和Bio-Rad公司(Hercules，CA)的Bio-Gel A15M。或者，可以使用大量已知的技术来制备适宜的琼脂糖珠(如4％、6％、8％和更高w/v浓度的琼脂糖，交联或非交联的)。例如，用下述一些方法形成琼脂糖珠：将琼脂糖分散到“冰冻”乙醚中(Hjerten，S.(1964)Biochem.Biophys.Acta 79：393-398)，将琼脂糖加入到热的不含水溶剂中，在冷却形成凝胶之前进行乳化(美国专利5053332)，将热的琼脂糖溶液滴加到冷却的矿物油和水中(美国专利5053332)，将琼脂糖溶液滴到冷的疏水表面上(美国专利5053332)或者将琼脂糖溶液滴加到旋转盘上(美国专利4978069)。本文以后面这些“不含溶剂”的形成方法为优选。
葡聚糖是由在蔗糖基质上生长的细菌产生的多糖，含有主要为α-D(1→6)连接的D-葡萄糖单元骨架。数种生物产生葡聚糖，但是只有肠膜明串珠菌和L.Dextranicum(Lactobacteriaceac)已被商用。优选高分子量的天然葡聚糖。所有葡聚糖完全由α-D-吡喃葡萄糖单元构成。超过70000mw的高分子量葡聚糖的商品名包括葡聚糖70、Hyskon，Macrodex和葡聚糖75、Gentran 75。葡聚糖可被修饰而形成例如降胆葡胺，降胆葡胺也被称为环氧氯丙烷交联的氯化葡聚糖2-(二乙基氨基)乙基2-[[2-(二乙基氨基)乙基]-二乙铵]乙基醚盐酸盐。这是一个称作DEAE-Sephadex的离子交换树脂。
壳多糖是纤维素类生物聚合物，主要由直链的β-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(又称为N-乙酰基-D-葡糖胺)残基构成。已发现在真菌、酵母、海洋无脊椎动物和节肢动物中存在，是这些生物外骨骼中的主要成分。可以认为是纤维素的衍生物，其中的C-2羟基被乙酰氨基取代。去酰化壳多糖称为脱乙酰壳多糖，也适用。
用于色谱或作为离子交换材料的基于纤维素的材料，如DEAE-纤维素(二乙基氨基-乙基纤维素)和ECTEOLA-纤维素也适用。适用于本发明的药理活性剂
“药理活性剂”包括施用于生物体(人或动物受治疗者)时通过局部和/或全身作用产生所需的药理和/或生理效应的任何化合物或组合物。因此，该术语囊括了在传统上认为是药物、生物药剂(包括分子如肽、蛋白、核苷酸)、疫苗和基因治疗剂(如基因构建物)的那些化合物或化学品。
适用于本发明组合物的药理活性剂，包括作用于突触和神经效应器接点的药物(胆碱能激动剂、抗胆硷酯酶剂、阿托品、东茛菪硷和有关的抗毒蕈碱药、儿茶酚胺和拟交感神经药，以及肾上腺素受体拮抗剂)；作用于中枢神经系统的药物；自体有效物质(治疗炎症的药物)；影响肾功能和电解质代谢的药物；心血管药物；影响胃肠道功能的药物；肿瘤化疗药；作用于血液和造血器官的药物；和激素与激素拮抗剂。因此，适用于组合物的活性剂包括但不限于抗感染药物如抗生素和抗病毒剂；镇痛剂和止痛药复合剂；局麻药和全麻药；减肥剂；抗关节炎药；平喘药；抗惊厥药；抗抑郁药；抗组胺药；抗炎剂；防呕吐剂；抗偏头痛剂；抗肿瘤剂；止痒剂；抗精神病剂；退热剂；解痉药；心血管制剂(包括钙通道阻滞剂，β-受体阻断剂，β-受体激动剂和抗心律失常药)；抗高血压剂；利尿剂；血管扩张剂；中枢神经系统兴奋剂；咳嗽和感冒制剂；抗虫血剂；诊断剂；激素；骨生长刺激剂和骨再吸收抑制剂；免疫抑制剂；肌松剂；精神兴奋剂；镇静剂；镇定药；蛋白质、肽和其片段(无论是天然存在的还是化学合成的或者是重组产生的)；和核酸分子(两个或多个核苷酸的聚合形式，或者核糖核酸)(RNA)或脱氧核苷酸(DNA)，包括双链和单链分子及超螺旋或凝聚分子，基因构建体，表达载体，质粒，反义分子等。
适用于本发明的药物的特别实例，包括血管紧张素转氨酶(ACE)抑制剂、β-内酰胺抗生素和γ-氨基丁酸(GABA)类化合物。代表性的ACE抑制剂在Goodman and Gilman第八版第757-762页中有记载，在此将其引入作为参考。这些ACE抑制剂包括喹那普利、雷米普利、卡托普利、benzepril、福辛普利、赖诺普利、依那普利等及其可药用盐。β-内酰胺抗生素是以结构中有β-内酰胺环为特征的抗生素物质，在Goodman and Gilman第八版第1065-1097页中有描述，在此将其引入作为参考。这些β-内酰胺抗生素包括青霉素及其衍生物如阿莫西林与头孢菌素。GABA-类化合物也在Goodman and Gilman书中有记载。其它化合物包括钙通道阻断剂(如维拉帕米、硝苯地平、尼卡地平、尼莫地平和地尔硫卓)；支气管扩张药，如茶硷；食欲抑制剂，如盐酸苯丙醇胺；镇咳剂，如右甲吗南及其氢溴酸盐，那可丁，喷托维林柠檬酸盐，和盐酸氯苯达诺；抗组胺药，如特非那定、酒石酸苯茚胺、马来酸美吡拉敏、琥珀酸多西拉敏和柠檬酸苯托沙敏；减充血剂，如盐酸苯福林、盐酸苯丙醇胺、盐酸伪麻黄硷、盐酸氯苯那敏、盐酸伪麻黄硷、马来酸氯苯那敏、麻黄硷、苯福林、氯苯那敏、吡拉明、苯丙醇胺、右氯苯那敏、苯托沙敏、苯茚胺、羟甲唑啉、methscopalamine、伪麻黄硷、溴苯那敏、卡比沙明以及它们的可药用盐，如盐酸盐、马来酸盐和单宁酸盐等，β-肾上腺素能受体拮抗剂(如萘心安、纳多洛尔、噻吗洛尔、吲哚洛尔、拉贝洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、esniolol和醋丁洛尔)；麻醉性镇痛药，如吗啡；中枢神经系统(CNS)兴奋剂，如盐酸哌甲酯；抗精神病药或拟精神药物，如吩噻嗪、三环(trycyclic)类抗抑郁药和MAO抑制剂；苯二氮卓类药物，如阿普唑仑、地西泮等；和一些非甾类抗炎药(NSAIDs)，(如水杨酸酯、吡唑啉酮、吲哚美辛、舒林酸、fenamate、托美丁、丙酸衍生物)诸如水杨酸、阿斯匹林、水杨酸甲酯、二氟尼柳、水杨酰水杨酸、保泰松、吲哚美辛、羟布宗、阿扎丙宗、甲芬那酸、甲氯芬那酸钠、布洛芬、萘普生、萘普生钠、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、吡罗昔康、双氯芬酸、依托度酸、酮咯酸、醋氯芬酸、萘丁美酮等。
适用于本发明组合物和方法的另一类药理活性剂是抗原，即含有一个或多个将会刺激宿主免疫系统发生细胞性抗原-特异性免疫反应或体液抗体反应的表位的分子。因此，抗原包括蛋白质、多肽、抗原蛋白片段、寡糖、多糖等。抗原可以来自任何已知的病毒、细菌、寄生虫、植物、原虫或真菌，并可以是整个生物体或其致免疫部分如细胞壁成分。抗原也可来自肿瘤。表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸(如在DNA免疫法中应用的)也包括在抗原的限定范围之内。合成的抗原也包括在抗原的限定内，譬如，半抗原、多表位、侧接表位和其他重组物或者重组或合成的衍生抗原(Bergmann等(1993)Eur.J.Immunol.23：2777-2781；Bergmann等(1996)J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.And Cell Biol.75：402-408；Gardner等(1998)第12届世界AIDS大会，瑞士日内瓦(6月28日-7月3日，1998))。
因此，当抗原与本发明水凝胶结合时，可以看作是“疫苗组合物”，疫苗组合物包括含有抗原的任何药物组合物，此组合物可用于预防或治疗受治疗者的疾病或病症。该术语既涵盖子单元疫苗组合物也涵盖含有完整的杀死、减毒或灭活的细菌、病毒、寄生虫或其它微生物的组合物，所述子单元疫苗组合物中的子单元是指从自然状态下与抗原有关的完整生物中分离或分泌的抗原。疫苗也包括能够进一步增强疫苗效力的细胞因子。
本发明使用的病毒疫苗组合物包括但不限于那些含有或衍生自下列病毒的疫苗：小RNA病毒(Picornavirdae)(如脊髓灰质炎病毒等)；杯状病毒(Caliciviridae)；披膜病毒(Togaviridae)(如风疹病毒、登革热病毒等)；黄病毒(Flaviviridae)；冠状病毒(Coronaviridae)；呼肠病毒(Reoviridae)；弹状病毒(Rhabdoviridae)(如狂犬病病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒等)；正粘病毒(Orthomyxoviridae)(如感冒病毒A、B、C型等)；布尼亚病毒(Bunyaviridae)；沙粒病毒；逆转录病毒(Retroviradae)(如HTLV-I；HTLV-II；HIV-1和HIV-2)；除此之外，还有类人猿免疫缺陷病毒(SIV)。另外，病毒抗原可来自乳头状瘤病毒(如HPV)；疱疹病毒；肝炎病毒(如HPV)；疱疹病毒；肝炎病毒如A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、δD型肝炎病毒(HDV)、E型肝炎病毒(HEV)和G型肝炎病毒(HGV)和蜱-生大脑炎病毒。参见例如，第3版病毒学(Virology)(W.K.Joklik编著，1988年)；第2版基础病毒学(Fundamental Virology)(B.N.Fields和D.M.Knipe编著，1991年)，书中描述了这些和其他一些病毒。本发明细菌疫苗组合物包括但不限于那些含有或得自引起白喉、霍乱、结核、破伤风、百日咳脑膜炎的生物体的疫苗组合物，和含有或得自其他病原体包括A、B和C型脑膜炎双球菌、B型嗜血流感杆菌(HIB)和幽门螺旋杆菌的疫苗组合物。抗寄生虫疫苗组合物包括那些得自引起疟疾、Lyme疾病的生物体的疫苗组合物。
适用于本发明的核苷酸序列包括任何治疗相关的核苷酸序列。因此，本发明可用于释放一种或多种编码靶细胞基因组中缺陷蛋白或缺失蛋白的基因，或者一种或多种编码具有所需生物学或治疗学作用(如抗病毒作用)的非-天然蛋白质的基因。本发明也用于释放能够提供免疫性的核苷酸序列，例如用作引起受治疗者体液和/或细胞免疫反应的致免疫序列，或者与具有反义或核酶功能的分子相应的序列。
可被释放给药的适宜基因包括那些用于治疗下列疾病的基因：炎性疾病、自身免疫病、慢性和感染性疾病，包括如AIDS、肿瘤、神经疾病、心血管系统疾病、高胆固醇血症；各种血液病，包括各种贫血、地中海贫血和血友病；遗传缺陷如囊性纤维变性、高歇氏病(家族性脾性贫血)、腺苷脱氨酶(ADA)缺陷、肺气肿等。适用于反义肿瘤治疗和适宜于病毒疾病治疗的大量反义寡核苷酸(如mRNA平移起始位点(AUG密码子)周围序列的短核苷酸互补链已在本领域的文献中作了描述。参见例如，Han等(1991)Proc，Natl.Acad.Sci.USA 88：4313；Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90：543；Helene等(1990)Biochem.Biophys.Acta.1049：99；Agarwal等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7079；和Heikkila等(1987)Nature 328：445。适用于本发明的大量核酶也已被描述。参见例如，Chec等(1992)J.Biol.Chem.267：17479和授予Goldberg等人的美国专利5225347。
举例来说，在治疗实体瘤的方法中，将下列基因释放到肿瘤部位或附近进行表达：编码毒性肽(即化疗剂如篦麻蛋白、白喉毒素和眼镜蛇毒素)的基因、肿瘤抑制基因如p53、编码与转化致癌基因反义的mRNA序列的基因、抗肿瘤多肽如肿瘤坏死因子(TNF)和其它细胞因子，或者转化致癌基因的转显性(transdominant)阴性突变体。
类似地，也可施用编码已知具有抗病毒和/或抗菌活性或者刺激宿主免疫系统的肽的基因。这样，编码各种不同细胞因子(或其功能片断)如白细胞介素、干扰素和集落刺激因子的基因，可适用于本发明。大量的此类物质的基因序列是已知的。
为了治疗遗传性疾病，可以将已知在特定疾病中缺失的基因的相应的功能基因施用于受治疗者。本发明也适宜于反义治疗，例如，将能够与特定互补序列杂交的寡核苷酸释放(给药)从而抑制这些序列的转录和/或翻译。由此，将编码特定疾病进展所必要的蛋白质的DNA或RNA作为目标，从而阻断疾病进展。反义治疗和能够特异地并可预见性地与特定核苷酸靶序列结合以便抑制或调节致病基因表达的大量寡核苷酸是已知的而且本领域技术人员可以很方便地得到。Uhlmann等(1990)Chem Rev.90：543，Neckers等(1992)Crit.Rev.Oncogenesis 3：175；Simons等(1992)Nature 359：67；Bayever等(1992)Antisense Res.Dev.2：109；Whitesell等(1991)Antisense Res.Dev.1：343；Cook等(1991)Anti-Cancer DrugDesign 6：585；Eguchi等(1991)Annu.Rev.Biochem.60：631。因此，本发明提供能够选择性地与宿主细胞的靶序列结合的反义寡核苷酸在反义治疗中的应用。其它可考虑的组合物
本发明组合物是含有用于对受治疗者高速透皮给药的适宜大小水凝胶颗粒的粉末，所述透皮给药通常穿过角质层或透过粘膜。粉末一般为可流动的。形成可流动粉末的颗粒的质均空气动力学直径为约0.1～250μm，优选大于约20μm但小于约100μm，特别是小于75μm。更优选，大部分颗粒在约40-60μm范围内。粉末颗粒的壳密度通常为0.1～25g/cm3，优选0.8～1.5g/cm3。虽然在显微镜下观察时单个颗粒的形状可以有差异，优选形状接近球形，但是也可以是椭圆形、不规则状和/或环形。水凝胶使其本身形成近乎球形的颗粒，颗粒表面可以规则或不规则。水凝胶也可使其本身形成含有与水凝胶结合的活性剂的均匀密度颗粒，所述结合是活性剂吸收在整个水凝胶中或者仅仅与水凝胶颗粒表面结合。
由于可得到的水凝胶的广泛选择性，一个指定组合物中活性剂的含量可依水凝胶的吸水量的多少而异。譬如，高度水溶性、高活性的活性剂可与吸水力较小的水凝胶结合(因为需要浓度低)，而需要较高浓度的低活性活性剂则应当与吸水性强的水凝胶结合。因此，尽管本发明组合物中活性剂的代表性含量范围为约0.3wt％～约70wt％，如约10wt％～60wt％或者约20wt％～约55wt％，但是本发明组合物中活性剂的含量范围可以是约0.1wt％～约80wt％和更高。实际含量取决于活性剂的活性、所需的剂量，和本领域技术人员在阅读本发明说明书基础上轻易地领会的其它变量。
对于本发明水凝胶组合物，活性剂与颗粒大小在约10～100μm范围的水合(如给药到进入活组织后发生水合)水凝胶颗粒的解离通常在0.1～1.0秒。为了所有实用的目的，透皮给药后近乎瞬时水合的水凝胶颗粒，其活性剂立即释放。该特性使得本发明组合物对于需要立即释放药代动力学的透皮粉末注射技术而言特别理想。然而，在某些实施方案中，可以通过改变化学和/或物理性水吸收和活性剂溶解速度来提供持续或延迟释放特性的水凝胶组合物。
因此，在一些组合物中，水凝胶组合物中掺入亲水性或两亲性试剂以便减缓干燥颗粒的水合速度和/或减缓活性剂从颗粒释放的速度。可使用类似的技术在水凝胶颗粒外面进行包衣以便取得类似效果。例如，将亲脂试剂加入到水凝胶内部和/或外部以减少活性剂直接暴露于靶部位的吸水环境，而且也降低了加工过程中活性剂降解(如，由于与加工溶剂接触而降解)的发生率。另外，此类试剂的加入进一步减慢水吸收进入颗粒的速度，显著减缓活性剂自水凝胶载体的溶解速度。由于活性剂自水性氛围(hydrospher)溶出的步骤分两步(即吸收水/颗粒水合与膨胀，接着活性剂溶解和自颗粒扩散)，因而对于阻断或干预活性剂释放的途径来说就有两次机会。
能够减慢本发明水凝胶水合和溶解动力学的疏水性试剂的实例是脂肪酸和其可药用盐(如硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸锌、棕榈酸和棕榈酸钠)。其它适宜的试剂包括两性表面活性剂(甘油酯等)或聚合物(如聚乳酸乙醇酸Polylactic glycolic acid(PLGA)、聚原酸酯)。淀粉也适于此类目的，半混溶溶剂(即与水部分混溶的溶剂)如甘油三乙酸酯可以加入到水凝胶颗粒中以起到溶解屏障的作用。这些溶剂可进一步用于负载疏水性活性剂到水凝胶颗粒中而不会将活性剂带入到水凝胶结构的亲水环境。为了将此类试剂掺入本发明水凝胶颗粒中，适宜的方法是可以使用能溶解疏水试剂的有机或醇基溶剂，然后按照足以完全润湿颗粒表面的溶剂与颗粒比而将干燥水凝胶颗粒(珠)置于溶剂中。接着可以使用额外的溶剂以构建厚的包衣。吸收进入或在水凝胶颗粒表面的疏水试剂的最后含量取决于包衣剂在溶剂中的浓度、水凝胶在溶剂中呈现的膨胀程度和溶剂与水凝胶的比例。
在某些其它的实施方案中，使用标准化学过程可将水凝胶衍生化以在颗粒内或在颗粒表面提供有吸引力并足以与外来活性剂结合的位点(如，与外来活性剂离子相互作用的位点)。或者，可以提供水凝胶聚合物缀合物，其中外来活性剂与水凝胶化学性键合(如共价键)，以便改变释放特征(药代动力学)或者使特定活性剂与水凝胶释放平台(delivery platform)结合。在这方面，许多蛋白质-聚合物缀合物在本领域是已知的并且已被充分表征(参见例如，Burnham.N.(1994)Am.J.Hosp.Pharm.51：210-218)，因而适用于本发明组合物。
为了将蛋白质(和肽)类外来活性剂与本发明描述的水凝胶(聚合物)颗粒联接的目的，常常优选特定蛋白质-聚合物缀合键是生物可降解性的以便以控时方式或以对一定生理条件反应的方式自水凝胶释放蛋白类外来活性剂。这样一类生物降解性键是蛋白质与聚合物(水凝胶)之间的化学键呈水解降解性联接。正如为本领域普通技术人员所领会的那样，通过阅读本发明说明书，适用于本发明的蛋白质与聚合物之间的普通化学联接，包括与氨基酸侧链(如赖氨酸的ε-氨基)和蛋白质的α-氨基(酰胺、硫脲、烷基胺和氨基甲酸乙酯联接)、游离半胱氨酸残基的巯基(硫醚联接)以及天门冬氨酸和谷氨酸的羧酸基团(酰胺和烷基胺)的反应联接。参见例如，Duncan等(1994)Adv.Polym.Sci.57：53-101和Brinkley，M.(1992)Bioconjugate Chem.3：2-13。与琥珀酸酯(如N-羟基琥珀酰胺)产生的酰胺联接是众所周知的并且具有所预期的水解不稳定性(Lomants等(1976)J.Mol.Biol.104：243-248)，与琥珀酸酯(如琥珀酰亚氨基琥珀酸酯)形成的蛋白质-聚合物缀合物在生理条件下是可降解的(Dreborg等(1990)Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.6：315-365；Zalipsky等(1992)Biotechnol.Appl.Biochem.15：100-114)。另外，巯基缀合物在生理还原条件下是可降解的，使得蛋白质-聚合物连接呈可逆性(Woghiren等(1993)Bioconjugate Chem.4：314-318)，酶降解性连接已被描述，其中通过短肽序列将蛋白或药物连接于聚合物载体上(Kopecek等(1981)Makromol.Chem.182：799-807)。
本发明组合物也可含有可药用赋形剂如粘合剂、载体、稳定剂、助流剂、抗氧剂、PH调节剂、抗刺激剂等。此类“赋形剂”一般指基本上无毒并且不与组合物中其它组分发生有害相互作用的惰性物质。特定赋形剂的含量比例取决于使用赋形剂的目的和赋形剂的特性。载体如葡聚糖可使用任意适宜含量例如可以占颗粒重量的10～75％，例如20～70重量％或30～60重量％。
也起到肽稳定剂作用的适宜载体的实例包括药学级葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等。因此，载体可以是糖类如单糖、二糖或糖醇。其它载体包括淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)，和它们的混合物。也可以使用带电磷脂和/或去污剂。适宜的带电磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱(卵磷脂)等。代表性的去污剂是非离子、阴离子、阳离子或两亲表面活性剂。适宜表面活性剂的实例包括例如Tergitol和Triton表面活性剂(Union Carbide Chemicalsand Plastics，Danbury，CT)，聚氧乙烯山梨醇如TWEEN表面活性剂(Atlas Chemical Industries，Wilmington，DE)，聚氧乙烯醚如Brij，可药用脂肪酸酯如月桂基硫酸酯或其盐(SDS)，以及类似材料。
为协助用本发明方法制备的颗粒组合物的释放特征而使用皮肤穿透增强剂是适宜的。本文所用的“穿透增强剂”或“通透增强剂”是增加皮肤对药理活性剂的通透性，即为了增加药物穿透皮肤和进入血流的速度。利用本领域公知的扩散池仪器，通过测量活性剂通过动物或人皮肤的扩散速度，可以观察到使用此类穿透增强剂的通透增强效果。穿透增强剂可用于改善透皮给药特性，并提供所需的治疗或预防效果。本文使用的穿透增强剂的“有效”量是指通过本发明方法提供释放活性剂所需皮肤通透性增强和相应地所需穿透深度、给药速度和活性物的量的量。制备方法
本发明的另一方面是制备适宜于使用高速颗粒注射技术对受治疗者透皮给药的粉末组合物的方法。广义上讲，该方法涉及将药理活性剂负载到水凝胶颗粒上。形成的水凝胶颗粒已经与活性剂结合并且具有用无针注射器直接注射的适宜的物理和功能特性。可以预先制成水凝胶颗粒，然后向颗粒中加入活性剂，或者将水凝胶材料与活性剂结合而形成组合物，然后在原位由组合物制成适宜大小的颗粒。在一优选的方案中，该方法包括：
—制备预水凝胶颗粒混合物，
—颗粒与含有药理活性剂的含水组合物(例如，活性剂溶解和/或悬浮于其中)混合足够时间，以使得活性剂与水凝胶颗粒密切结合而掺入其中(例如，水凝胶可以膨胀并将活性剂掺入进来)，和
—在一个干燥步骤中从含水组合物中分离水凝胶颗粒(例如，使用适宜的干燥方法从悬浮液中去除水和其它溶剂)得到粉末状药物组合物。该药物组合物含有已经掺入了活性剂的基本上呈固态的水凝胶颗粒，并适宜在透皮粉末注射装置中使用。
优选地，粉末的每一个颗粒具有10～100μm的MMAD。可以使用任何适宜的干燥方法，例如喷雾-干燥、冷冻干燥、喷雾-冷冻干燥、空气-干燥、真空干燥等。然而，冷冻干燥和喷雾干燥是优选的方法。在一个特定方法中，在预水凝胶颗粒仍处于干燥状态时与含水组合物结合。在另一个方法中，预水凝胶颗粒在润湿、膨胀前状态时与含水组合物结合。
本发明组合物的制备方法可以如下完成：首先形成所需尺寸的水凝胶珠，然后通过使珠粒与活性剂混合物的含水溶液接触足够时间而将活性剂与水凝胶珠结合(如将活性剂吸收进入水凝胶内和/或吸收在水凝胶表面)。前面已经讨论过制备琼脂糖珠的途径。可使用这些和其它本领域技术人员已知的方法由其它水凝胶材料来制备珠粒。珠粒干燥时可被粉碎成本发明组合物所需大小的颗粒。
另一优选方面，该方法包括：
—制备预-水凝胶颗粒的混合物，
—将水凝胶颗粒在含有药理活性剂的含水组合物中悬浮足够时间以使得颗粒膨胀而把活性剂掺入进来，和
—在干燥步骤中除去悬浮液中的水和其它溶剂，得到粉末状药物组合物。粉末状组合物含有已经掺入了活性剂的水凝胶颗粒，方法是如此进行的以至于所述粉末组合物中水凝胶颗粒的质均空气动力学直径是10-100μm。通过选择适宜尺寸范围的预-水凝胶颗粒能够很容易地控制组合物中水凝胶颗粒的直径。
还有另一优选的方面，该方法包括：
—制备预-水凝胶颗粒的混合物，
—将水凝胶颗粒与含有药理活性剂的含水组合物(如将活性剂溶解或悬浮在含水组合物中)结合足够时间以使得活性剂与水凝胶颗粒紧密结合从而把活性剂掺入进去，和
—在至少一个部分干燥步骤中从含水溶液中分离水凝胶颗粒(如，从颗粒中去除水和其它溶剂)，得到掺入了活性剂的初步负载的水凝胶颗粒，
—使初步负载的水凝胶颗粒与含有药理活性剂的相同或其它含水组合物接触足够时间，以便进一步使活性剂与水凝胶颗粒紧密结合而掺入其中，
—使用至少部分干燥方法从含水组合物中分离水凝胶颗粒，得到掺入了活性剂的二级负载的水凝胶颗粒。可以按照与初级负载颗粒相同的方式反复处理该二级负载颗粒，直至在水凝胶颗粒中负载了所需的活性剂，或者达到了每个颗粒基于干重计负载了可承载的最大量的活性剂。在任何情况下，进行的最后的干燥步骤是为了完成提供适宜于经颗粒注射装置透皮给药的颗粒。这里同样适宜应用任何干燥方法。对于反复负载步骤之间的干燥，部分干燥(和优选颗粒至少部分塌陷)可以使用溶剂如丙酮或空气-干燥方法来完成。最后的干燥步骤，仍旧优选冷冻-干燥和喷雾干燥。
另一优选方面，该方法包括：
—形成含有药理活性剂和水凝胶的含水药物制剂，水凝胶在制剂中的含量为约0.1～10wt％，和
—干燥制剂得到含有质均空气动力学直径约10-100μm颗粒的粉末状药物组合物。
根据本发明方法，把水凝胶包含在一种颗粒制剂中而制备出适宜于从无针注射装置释放的颗粒。水凝胶在最终制剂中的含量为约0.1～95wt％。活性剂在最终制剂中的含量为约0.1～85wt％。
在水凝胶单体和外来物质在组合物中结合继而在原位制成颗粒的那些方法中，接下来大量的任何常规制粒技术均可实现提供适宜于颗粒注射技术的颗粒，所述制粒技术例如喷雾干燥、挤压切裁和干燥(spherunization)、品种颗粒流化床包衣、凝聚、收集和干燥、湿法制粒和研磨、固体或大颗粒研磨、无定形固体沉淀、流化床制粒、蒸发或空气干燥然后研磨、喷雾或熔化冷却或造粒、喷雾冷冻-干燥、压缩(即造粒和研磨)，等等。
颗粒一旦制成，可以使用下述方法来进行评定。颗粒的表征方法
用于从无针注射器透皮释放(颗粒注射)的颗粒的表征较传统的药学产品有着不同的需要。大多数标准固体剂型把最大的关注放在容易溶解方面。举例来说，在片剂的制备中，密度和颗粒大小或形态学并不起重要作用，只要流程特性可以接受则通常不考虑对于测定颗粒注射动量而言是一个重要参数的单个颗粒密度。然而，对于为颗粒直接注射制备的颗粒组合物，单个颗粒密度则是至关重要的并由此常常要使用到多种表征方法。进行绝对和理论密度测定，绝对和理论密度与释放、效力有关。有许多可利用的方法，如填塞密度(或者传统轻击(light tap)或者仪器方法)、壳密度和梯度浮选值。其它，可使用与单个颗粒密度相关的直接方法。这些方法包括测量表面积或空隙体积，例如使用BET的标准测量法和水银注入密度计。
众所周知，颗粒的另一关键特征-颗粒大小的测定受到方法学的显著影响。API Aerosizer(Amherst Process Instruments，Hadley，MA)是超声速飞行时间测定仪，其中的测量模式与高能氦喷射颗粒注射技术的原理极为相似。然而，由该设备得到的数据，必须用包括计算机辅助成像分析技术的光学显微镜进行放大。此信息还得与无溶剂悬浮激光衍射方法学、光遮蔽技术和库尔特Counter体积测定结果相比较。后面一些技术对于评价通过透皮颗粒注射给药所用的瞬时高能加速器之前和之后的颗粒特别有力。正如下面所描述的那样，金属化膜或刚性泡沫靶反映出注射后粉末能量的某些定量信息。与颗粒注射方法直接有关的定量技术，是测定通过无针注射装置之前和之后颗粒大小分布及颗粒微-硬度值(即，对着硬表面注射时的冲击强度)。其它技术包括直接颗粒压痕技术(即Nano Indenter II，MTSSytems Corp，Oak Ridge，TN or Micro Hardness Tester，AntonPaar GmbH，Graz，澳大利亚)，该技术中，在一个光学显微镜平台上用探头测量对单个颗粒施力的效果。
本文所述水凝胶颗粒组合物的特性的其它实验，包括使用全厚度人皮和Franz-型扩散细胞的离体皮肤穿透试验，用于测定释放并且对药物溶解和转运提供指导。一个与使用生物性靶的金属化膜能量测试相类似的方法是，给药后利用穿越-表皮的水损失(tran-epidermal water loss(TEWL))在皮肤上进行离体测定。在制备过程中，以及在给药前、后使用光学显微镜和扫描电镜(SEM)研究颗粒，以测定颗粒的起始形态学和/或在瞬时高能量载气流中的变化。
既然无针颗粒注射通常需要密集颗粒，因而能够引起萎缩或塌陷的颗粒制剂和/或干燥条件是优选的。理想的情况是，赋形剂的Tg’值(玻璃化温度)小于初始干燥温度以使得颗粒塌陷从而产生密集颗粒。使用在一定水量或pH或温度时易于塌陷的水凝胶，和选择适宜的赋形剂成分，将极大地促进适宜于无针注射器应用的密集颗粒的制备。治疗
本发明的另一方面，提供对需要治疗的受治疗者释放药理活性剂(药物、疫苗、诊断剂等)的方法。广义上可将该方法描述为：利用高速、直接透皮给药(典型的是穿透皮肤表面(如穿透角质层)或进入粘膜表面)向受治疗者释放药理活性剂的方法，其中活性剂与适宜于此高速释放的合适大小的水凝胶颗粒结合。更具体而言，该方法包括：制备含有平均直径约0.1～约250μm、优选约10-100μm的固体颗粒的药物组合物，其中每一颗粒包含已经结合有药理活性剂的水凝胶，加速所述颗粒至高速度，和将所述加速后的颗粒向受治疗者的靶皮肤处释放。
另一描述本发明方法的方式，称本方法是诊断、治疗或预防受治疗者病症的方法，该方法通过用无针注射器向需要治疗的受治疗者施用药物组合物。这里所用的术语“治疗”包括下述任何含义：预防感染或再感染；减轻或消除症状；和减少或完全清除病原。治疗可以是预防性(感染前)有效或治疗性(感染后)有效的。
通过高速释放，利用在预定区域皮肤或粘膜组织处的瞬时氦气喷射能量，将组合物对动物给药，优选进入靶部位的皮肤或粘膜。“预定区域”是指完整无损的活皮肤或粘膜组织的确定区域。这样的区域通常在约0.3cm2～约10cm2范围。然而，本领域技术人员将领会到，组合物给药高速颗粒释放所针对的靶组织的面积可以有显著的不同，取决于装置结构、剂量等。注射速度一般为100～3000米/秒，如200～2000米/秒。
如本文中讨论的那样，适用于本发明方法的无针注射器的详细描述可见于现有技术。这些装置称做无针注射装置，其中代表性的是皮肤用PowderJect无针注射器装置和口腔用PowderJect无针注射器装置(PowderJect Technologies Limited，英国牛津)。使用这些装置，把治疗有效量的药理活性剂释放给受治疗者。治疗有效量是产生所需的药理效应所需的量。该有效量将依被释放的活性剂的相对活性而异，通过基于被释放化合物的已知活性的临床试验很容易决定有效量。“Physicians Desk Reference”和“Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics”两本书对于决定所需剂量是非常有用的。
在Bellhouse等共同拥有的美国专利5630796中首先描述了释放颗粒用无针注射器装置，在此将其引入作为参考。尽管目前有大量专用仪器配置可以得到，此类装置通常是笔-状设备，带有自顶端向底部线性级移动的贮气瓶，一个颗粒贮盒或包装盒，和与消音介质相连的超声速喷嘴。将适当的粉末(在本发明情况下，指含水凝胶颗粒的粉末)装在适宜容器中，所述容器如将两个可破裂聚合物膜热-封成垫环(washer)-状间隔区形成独立的密封单元而构成的贮盒。可选择膜材料以获得特异开启模式和指令超声速气流引发状态的爆发压力。在操作中，驱动装置将压缩气从贮气瓶释放到装置内的一个膨胀室中。释放的气体与颗粒贮盒接触，当建立起足够压力时，突然突破贮盒膜而把颗粒扫荡入超声速喷嘴处，用于随后进行释放。喷嘴被设计成为获得释放定量颗粒到预定区域靶表面所需的特定气体速度和气流型。消音器用于减弱膜破裂产生的噪音。
在共同拥有的国际申请WO96/20022中描述了释放颗粒的第二种无针注射器装置。该释放系统也使用压缩气源的能量来加速和释放粉末组合物；然而，它不同于美国专利5630796，它使用冲击波代替气流来加速颗粒。更具体而言，在挠性穹顶背后由冲击波产生的即时压力升高冲击穹顶背部，引起挠性穹顶朝着靶表面方向突然外翻。突然外翻以足够速度即冲力发射粉末组合物(组合物设置在穹顶的外面)穿透靶组织如口腔粘膜。粉末组合物在接近全穹顶外翻时释放。穹顶也起到完全容纳高压气流的作用，从而使得高压气流不接触到组织。由于在释放操作过程中不释放气体，所以该系统本身就特别安静。此设计可在其它封闭式或其它敏感性应用中使用，如把颗粒释放到最小侵害性手术位点。
在本发明的另一方面，单剂量或多剂量容器，其中盛有可在使用前包装的本发明水凝胶颗粒，可包括密封的装有构成适宜剂量的适宜量颗粒的贮存箱。颗粒组合物可以以无菌制剂形式进行包装，因此把密封容器设计成保持制剂的无菌性，直至在本发明方法中使用。如果需要，容器可以适应在前面提到的无针注射器系统中直接使用。
因此，本发明粉末可以按照为无针注射器释放用的独立单位剂量形式进行包装。本文所用的“单位剂量”，是指含有治疗有效量本发明粉末的剂量容器(receptacle)。剂量容器通常安装在无针注射器装置内以使得能够从装置中透皮释放。这样的剂量容器可以是胶囊、箔小袋、小囊、贮囊或其它类似物。
装有颗粒包装物的容器可进一步贴上确定组合物和提供相关剂量信息的标签。另外，容器还要贴上政府机构如食品和药物管理局指定形式的注意事项，在注意事项中指出容器中装有的用于对人给药的水凝胶组合物的制造、使用或销售得到联邦法律的许可。
对具有尺寸大约范围在0.1～250μm、优选约10-70μm的水凝胶颗粒从上述提到的无针注射器系统的释放进行了实践，大于约250μm的颗粒也可从此装置释放，上限是颗粒大小在靶表面处对细胞造成事与愿违的损伤的那个点。释出的颗粒将会穿透靶皮肤的实际距离取决于颗粒大小(如，假定为大致球形颗粒几何体时名义上的颗粒直径)、颗粒密度、颗粒冲击皮表时的最初速度、和靶皮肤组织的密度及运动粘度。在这方面，无针注射所用的最适颗粒密度一般为约0.1～25g/cm3，优选约0.9～1.5g/cm3，和注射速度一般为约100～3000米/秒。使用适当的气压，平均直径为10-70μm的颗粒可被加速而以达到驱动气流的超声速的速度通过喷嘴。
如果需要，这些无针注射器系统可被制成预先装载含有适宜剂量本发明水凝胶颗粒的状态。装载状态的注射器可包装在密封容器中，再给容器贴上前述的标识。
为了表征无针注射器装置的性能，已经开发了大量新的测试方法，或者建立了大量改良的测试方法。这些测试的范围包括粉末组合物的特性、气流和颗粒加速的评定、对人造靶或生物靶的冲击力和整个系统性能的测定。下述测试中的一个、数个或全部被用于评价本发明水凝胶组合物使用无针注射器系统的物理和功能适合性。对人造膜靶作用的评定
同时测量粉末注射系统多方面的功能性试验被称为“金属化膜”或“穿透能”(PE)试验。试验是基于颗粒对塑料膜基质支撑的精制薄金属层的损害的定量评定。损害与颗粒的动能和某些其它特性有关。试验中反应(即膜损害/破裂)越高，装置给予颗粒的能量越高。电阻变化测定或者成像密度计，以反射或透射模式，在可控性和可重复性实验中提供了评价装置或制剂性能的可靠方法。
已经证实，膜实验-床对所有重要设备参数的颗粒释放变量敏感而对气体不敏感，所述参数包括压力、剂量、颗粒大小分布和材料等。涂在125μm聚酯支撑物上厚约350埃的铝目前被用于测定在最高达60巴压力时操作的设备。对工程泡沫靶的冲击作用的评定
评定通过无针注射装置释放时颗粒性能的另一方法是精确计量对刚性聚甲亚胺泡沫(Rohacell 5 IIG，密度52kg/m3，Rohm TechInc.，Malden，MA)的冲击作用。该实验的实验设置类似于在金属化膜实验中所使用的。使用精度卡钳测量穿透的深度。对于每一个实验，精制甘露醇标准品作为对照，所有其它参数如装置压力、颗粒大小范围等保持恒定。数据也显示该方法对颗粒大小和压力的变化敏感。在临床前试验中，精制甘露醇标准品作为药物赋形剂已被证明能够释放系列浓度，因此，进行泡沫穿透实验相关性能测定具有体内实验的实用性基础。可以预期，大有前途的粉末在临床前或临床研究中显示出与甘露醇相等或较之更好穿透性的适宜性能。此简单、快速实验作为评价粉末的相关方法是很有意义的，而且不要孤立地去考虑。颗粒磨损试验
颗粒性能的另一标志，是测试各种待测组合物承受与高速颗粒注射技术有关的力的能力，所述力即：静止状态的颗粒与突然、高速气流接触的力、粉末穿经无针注射器时颗粒与颗粒冲击产生的力、和粉末穿经装置时颗粒与装置碰撞产生的力。因此，设计了简单的颗粒磨损试验，用于测定在起始组合物中和在已经由无针注射器装置释放出来的组合物中的颗粒大小分布变化。
该实验这样进行：按前述方法把颗粒组合物装入无针注射器，然后把装载物从装置卸入盛有载体流体的烧瓶中，在所述载体流体中颗粒组合物不溶解(例如矿物油、硅油等)。接着收集载体流体，使用适宜的颗粒粒度测定设备如AccuSizer780型光学粒度计，测算起始组合物中和释放后组合物中颗粒大小分布。实验证明，由装置释放后质均直径(用AccuSizer设备测定的)减少小于约50％，更优选小于20约％的组合物必定适宜在本发明所述无针注射器系统中应用。向离体人皮肤释放和透皮性水损失
对更接近于可能实际应用的组合物性能试验，可将候选颗粒组合物注射入生皮的(dermatomed)、全厚度人类皮肤样品中。同样的皮肤样品在注射后可置于盛有32℃水、生理盐水或缓冲液的改进的Franz扩散池中。添加剂如表面活性剂可用于阻止粘结到扩散池上。可进行两种测量以确定制剂进入皮肤的性能。
通过测定物理作用，例如颗粒注射对皮肤屏障功能的影响可测定透皮水损失(TEWL)。测量在平衡状态下(约1小时)用TewameterTM 210(Courage & Khazaka，Koln，Ger)放置在扩散池盖的顶部就象一个约12mm的灯罩。较大颗粒和较高注射压力在体外产生成比例较高的TEWL值并且与体内结果相关联。随颗粒大小和氦气压力的不同体外颗粒注射的TEWL值从约7升高到27(g/m2h)。无颗粒的氦气注射无效果。在体内，如通过TEWL值在约1小时恢复到注射前的值所表明的，对大多粉末尺寸皮肤屏障性能很快恢复正常。对于53-75μm的最大颗粒，皮肤样品在1小时恢复50％并至24小时完全恢复。向离体人类皮肤释放和药物扩散速率
为了测定制剂的体外性能，按照预定时间间隔通过用全部或等分部分置换Franz细胞收集器溶液收集待测组合物的活性(外来)化合物，用于HPLC或其它适宜分析技术进行的化学分析。浓度数据用于制作释放概貌曲线和计算稳态通透速度。该项技术可用于筛选制剂，在进行体内研究前较早指出药物与皮肤结合、药物溶解性、颗粒穿透角质层的效力等。
这些和其它定性和定量试验用于评定本发明水凝胶组合物在高速颗粒注射装置中使用的物理和功能适合性。尽管并非必要，但是优选水凝胶组合物具有下述特性：基本球形(如，纵横比尽可能接近1)；光滑表面；具有高的活性剂负载容量(如，高达80％或90％的负载率)；颗粒磨损实验检测，颗粒尺寸减小小于20％；壳密度尽可能接近组分的真密度(例如大于约8.0g/ml)；和具有窄的颗粒大小分布的约20～50μm的MMAD。组合物可以是自由流动的(例如，在50％相对湿度存储8小时后自由流动；和在40％相对湿度下存储24小时后自由流动)。所有这些标准均可使用上面已经描述过的方法予以评定，并且在下列出版物中描述了更详细的内容，在此将这些出版物引入参考：Etzler等(1995)Part.Part.Syst.Charact.12：217；Ghadiri等(1992)IFPRI Final Report，FRR 16-03 University ofSurrey，UK；Bellhouse等(1997)“Needleless delivery of drugsin dry powder form，using shock waves and supersonic gas flow，”Plenary Lecture 6，21st International Symposium on Shock Waves，澳大利亚；和Kwon等(1998)Pharm.Sci.supple.1(1)，103。
下面提供的实施例进一步阐述本发明的细节，但是并不意味着以任何方式对发明的范围进行限定。
C.实验
下面是实现本发明方法的特定实施方案的实施例。提供实施例只是为了例举说明的目的，而不是旨在以任何方式限定本发明范围。
已经作了相当的努力来确保所用的的各种数字(如用量、温度等)的精确性，但是一些实验误差和偏差可能在所难免。
实施例1
本实施例的目的是评价本发明负载了胰岛素的粉末状琼脂糖珠组合物的胰岛素释放性能，并通过对小鼠高速透皮给药比较施用(皮下注射)标准冻干的胰岛素和琼脂糖珠胰岛素粉末制剂后胰岛素的相对生物利用度。全部研究均是使用透皮Powder Ject无针注射器装置(Power Ject Technologies，Limited，Oxford，UK)将1mg粉末状胰岛素制剂施用于麻醉大鼠(每个制剂给药4-6只大鼠)。本发明两种琼脂糖珠组合物与标准冻干的胰岛素粉末制剂进行比较。每种剂量的组合物给药后，定期采集动脉血液样本，测定胰岛素和葡萄糖的浓度。透皮颗粒注射给药后的胰岛素药代动力学和葡萄糖动态变化与皮下注射制剂后观察到的情况进行比较。
整个研究中使用配有多孔消音器套的12°圆锥形喷嘴(出口内径11.7mm)、5ml气筒和0.5ml破裂室的单相1临床PowderJect无针注射器。气体释放压维持恒定在60巴。
I.胰岛素制剂
使用无针注射器装置将粉末状琼脂糖珠和标准冻干胰岛素制剂进行给药。新鲜配制皮下注射用的胰岛素溶液。
A.标准冻干制剂
在填充赋形剂磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合物(理论pH 7.7)中含有0和100μg/mg人胰岛素(26.9U/mg，Diosynth BV，5340 BH Oss，Netherlands)的冻干粉末制剂如下制备：使用雕工压床(carverpress)以15000 1bs/平方英尺压45秒，将粉末压成3个圆盘，每一个圆盘0.3-0.4g。然后，在杵臼中研磨圆盘得到微细白色粉末。约1g粉末过筛(Fritsch Analysette 28声波筛)3种尺寸即38μm、53μm和75μm的筛网。过筛程序是0-40％振幅4分钟，40％振幅5分钟和40-0％振幅1分钟(时间共计10分钟)。筛后级分分装于气密聚丙烯瓶(Nalgene)中，2-8℃贮存。
B.本发明琼脂糖组合物
由PowderJect Technologies Limited提供用猪胰岛素(25.6U/mg，Diosynth BV，5340 BH Oss，Netherlands)生产的粉末状琼脂糖珠制剂。本研究中包括两种制剂，标额的胰岛素含量均为每mg约100μg猪胰岛素(表1)。每种制剂，均是通过在100μg/ml胰岛素溶液中水合干琼脂糖珠并且把珠粒进行干燥使珠粒负载上胰岛素而制得的。
表1-本研究中使用的琼脂糖珠胰岛素制剂
批号 标额的含量(w/w)
CG 0904 猪胰岛素13％，葡聚糖63％，琼脂糖24％
CG 0920 猪胰岛素10％，琼脂糖90％
C.皮下注射用胰岛素溶液
称重10mg 1％w/w(标额的)粉末状胰岛素的磷酸缓冲粉末状制剂后装入2ml玻璃标准烧瓶中。给药当天，用生理盐水补足体积，轻轻混合直至完全溶解。0.2ml的剂量体积含有标额10μg的胰岛素。
II.制备药物贮盒
在5位小数的天平上精确称量粉末状制剂(IA和IB部分)，分成7份1mg(±10％)的研究药物贮盒(Plasro 2)，贮盒中盛有20μm聚碳酸酯膜。记录每个贮盒实际皮重。然后，贮盒于2-8℃贮存，避免物理运动直至使用。发射前使装有药物的贮盒达到室温。
III.试验动物准备和剂量
通过腹腔注射新鲜配制的FFM混合物(Hypnovel，Hypnorm和WFI，体积比为1∶1∶2)而将重300g±10％的SD大鼠(Charles River)麻醉。用大剪刀和一次性高质量的剃刀在距大鼠腹中线1cm的右下腹部仔细剃刮一片(约9cm2)皮肤。用棉拭子清洗并轻擦该部位。手术分离右侧颈动脉，插入聚乙烯套管。通过一个三通将套管与盛有肝素化生理盐水(10U/ml)的注射器连接。
每45分钟或根据需要腹腔注射0.5ml FFM混合物来维持麻醉。试验期间，使用K-Temp直肠探头和恒温器控制的加热垫保持直肠温度为35-38℃。
手术后，在给药前使大鼠至少平衡15分钟。
A.皮下给药
用带26G针头的1ml注射器在鼠左下腹皮肤褶处对麻醉的大鼠给药(0.2ml，IC部分)。6只大鼠均接受皮下注射。
B.透皮颗粒注射(DPJ)给药
将药盒(IB部分)装入1相临床无针注射器(PowderJect，1.1部分)中。然后按一致的操作立即在大鼠腹部剃刮过皮毛的皮肤表面驱动装载后的装置。每种制剂使用4只或5只大鼠进行评价。
IV.血液样本
于给药前、给药后10、20、40、60、120和240分钟通过动脉插管采集血液样本装入1ml一次性的注射器中。在每份样本之前，使各个注射器中抽入0.25ml盐水(和一些血液)，将该体积的溶液立即返还给大鼠以减小试验期间血容量的下降。
立即将血液样本转入肝素化的1.5ml聚丙烯离心管中，在微型离心机上离心(9000rpm，2分钟)。移出血浆，贮于2-8℃，用于接下来的分析，要在采集后7天内进行分析。
V.血浆样本分析
用放免分析试剂盒(Coat-a-Count，DPC，Los Angeles，CA90045)分析每份样本中胰岛素的浓度。按照制造商的说明书使用试剂盒，但作了以下一些改进：
用空白、去胰岛素大鼠血浆与制备制剂(1.2部分)所用相同的胰岛素(猪或人)原液新鲜配制标准品(0.1，0.3，1，3，10，20，40和80ng/ml)。
温育期间保持在2-8℃以抑制由大鼠血清组分催化的辐射分解。
在这些条件下，浓度为0.3、5和40ng/ml时的变异系数分别为12％、4％和8％。在贮于2-8℃长达1周的对照样本中未检测到降解。
VI.胰岛素制剂分析
A.胰岛素含量
在稳定性缓冲液(pH 8.0的磷酸缓冲液中Tween20 0.002％，硫柳汞(thiomersal)0.25mg/ml和EDTA四钠盐0.1mg/ml)中精确地重新配制粉末状胰岛素制剂，使得标额的胰岛素浓度在0.1-1mg/ml的范围。立即将这些溶液转移至HPLC自动进样器小瓶中，于6℃贮存至分析时，贮存之后不超过72小时进行分析。
使用装有Genesis弹药柱(cartridge column)(15em，C18，4gm，300)的Hewlett Packard 1100 HPLC系统，按照前面已经描述的方法学(L.J.Janis等1996)进行分析。从主要降解和聚集产物可以很好地断定胰岛素峰值。
用峰面积对由新鲜配制的浓度范围在0.1-1mg/ml的标准胰岛素溶液(与用于制剂的批次相同)所作出的标准曲线可以计算出样本胰岛素浓度。标准曲线呈线性(r2＞0.999)，先前的工作显示：在这些条件下，标额浓度为1.5μg/ml时，变异系数和精确度分别为1.7％和2.3％。
被分析的每种粉末状制剂的含量用μg/ml胰岛素表示。
B.颗粒大小范围分析
使用配有Dry Powder Dispersion System的Amherst ProcessInstruments Aerosizer LD，按照标准程序，分析每种粉末状制剂样本的颗粒大小分布范围。用几何直径分析体积分布数据。
VII.药代动力学分析
从测得的每个时间点的原始浓度减去给药前样本(t＝0)表观浓度计算出给药后的净血浆胰岛素浓度。
A.剂量(X0)的计算
用测得的粉末状制剂的胰岛素含量(μg/ml)乘以称取到单个贮盒中的制剂的质量(mg)，计算出对每只大鼠经DPJ给药的胰岛素剂量。
用测得的粉末状制剂(IC部分)的胰岛素含量(μg/ml)乘以所称重的粉末质量(mg)，再除以重新配制后的体积(ml)，然后再乘以0.2ml(给药时的注射体积)，计算出对每只大鼠皮下给药的胰岛素剂量。
为了计算药代动力学的目的，剂量用μg/kg体重表示。
B.计算血浆胰岛素浓度对时间所作的曲线下面积(AUC)
按照0～240分钟的梯形法则，从净胰岛素浓度对时间曲线计算每只大鼠的净AUC。
C.计算相对生物利用度
用下面的标准方程式计算经DPJ给药相对于皮下给药的胰岛素相对生物利用度(BArel)： BA rel = Net AU C DPJ / X 0 DPJ Net AU C sc / X 0 sc
VIII.结果
每种制剂的相关药学特征示于表2。值得注意的是，由标额胰岛素含量测得的多达24％(CG 0904)胰岛素浓度的变化，其导致经DPJ给药的胰岛素剂量从287到421μg/kg。
表2
    制剂   标额胰岛素浓度(μg/mg)   测得的胰岛素浓度(μg/mg)   平均X0(μg/mg)                 颗粒大小测定
  Dp(μm)   D10-D90(μm)    ？？精细(＜25μm)
  皮下给药     NA     8.7*     28.3     NA     NA      NA
  标准冻干品
  安慰剂     0     0     0     NA     NA      NA
  10％w/w胰岛素     100     88.3     287     41    30-57      3.3
  琼脂糖珠
  CG 0904     130     99     353     55    44-68      0.3
  CG 0920     100     122     421     44    30-62      3.6
*-测得的SC给药的重配粉末的胰岛素浓度NA-不适用(not applicable)
这里没有显示每只大鼠的原放免分析和血浆浓度数据。用DPJ将四种粉末状制剂给药后的平均净血浆胰岛素浓度对时间的曲线，与皮下给药后的比较示于图1。接受安慰剂的大鼠组，其表观基底血浆胰岛素浓度在整个采血期间保持恒定。该数据作为麻醉大鼠模型在试验期间生理稳定性的指征。对于所有DPJ和皮下注射组来说，达到最大血浆浓度的平均时间(Tmax)在10～30分钟(表3)。
标准冻干粉末制剂给药后的最大血浆胰岛素浓度(Cmax)为9.3ng/ml，而琼脂糖制剂CG0920(胰岛素/琼脂糖)则为14ng/ml，琼脂糖制剂CG0904(胰岛素/葡聚糖/琼脂糖)则为26ng/ml。所有试验组，其血浆胰岛素浓度恢复至基底水平均需4小时。
经DPJ给药后的胰岛素的净AUC数据和计算出的平均相对生物利用度(BArel)示于表3。标准冻干粉末制剂的BArel为15.6％。除外较高的Cmax，未观测到琼脂糖制剂CG0920(胰岛素/琼脂糖)在胰岛素释放方面的任何改善。但是，琼脂糖制剂CG0904(胰岛素/葡聚糖/琼脂糖)的BArel为34％，大于观测到的标准粉末制剂的2倍。用变异系数(CV)作指标，测定比较了这一制剂与皮下给药的动物间变异(分别为19％和24％)。
表3-经DPJ(标准和琼脂糖珠制剂)给药与皮下给药的药代动力学参数比较
    制剂/途径     X0(μg/kg)   Tmax(分)    Cmax(ng/ml)   净AUC(ng.min/ml)     BArel(CV，％)
    皮下(n＝6)   28.3±2.7   10±0   4.56±1.69   425±102   100％(24)
 标准(DPJ，n＝6)   287±17   30±0   9.28±1.90   674±226   15.6％(34)
 CG 0904(DPJ，n＝5)   353±13   22±11   25.8±4.8   1800±341   34.0％(19)
 CG 0920(DPJ，n＝5)   429±35   18±4   14.0±10.3   675±338   10.5％(50)
所有数据均用均值±SD表示。
试验证实：本发明琼脂糖珠制剂能够有效地将胰岛素释放入体循环。由于琼脂糖不溶于水，而琼脂糖占制剂重量的约90％，因此曾预计CG 0920的吸收时间长。但是情况并非如此，尽管较低BArel和观测到较大变异性的血浆胰岛素浓度提示：一旦将制剂施用于皮肤的话，负载胰岛素的释放将会易变并且不会有效。
与琼脂制剂CG 0904有关的胰岛素释放的显著改善，最初被认为是较大颗粒尺寸。因而，最初认为颗粒大小与增加BA相关。现已确定：向珠粒中加入葡聚糖预防干燥期间的塌陷由此而使得颗粒性能得以改善。
实施例2
该实施例是本发明的组合物及其制备方法。特定活性剂(外来活性剂)是乳酸脱氢酶(LDH)，水凝胶是琼脂糖(Bio-Gel A15M)。
乳酸脱氢酶(LDH)购自Sigma化学品公司(L 1254；Lot96H9568)。具有MMAD为20-150μm的粉末状Bio-Gel A15M购自Bio-Rad(Cat.No.151-1050)。使用端点比色测定法(Sigma No.500)测定LDH活性。所有其它试剂购自Fisher Scientific并且是ACS-级或更好。
用水洗涤Bio-Gel A15M树脂以除去防腐剂，然后倾入一次性的1×10cm柱中，使终体积约5ml。用含有5％(w/v)甘露醇pH 6的柠檬酸钠溶液5ml平衡该柱。将LDH以2mg/ml的终浓度溶解于相同的缓冲液中。将5ml溶液样本负载到柱中并使之完全渗透。
从柱中取出树脂并将其进行冻干。冻干后，将树脂重新悬浮于水中再装入柱中。接着，用5ml缓冲液洗脱柱。初始LDH溶液样本也进行冻干，然后重新溶解在初始体积的水中。
使用Hewlett-Packard UV-VIS分光光度计通过在280nm处的吸收度来测定每种溶液的蛋白质浓度。基于NADH存在时丙酮酸向乳酸的转化来测定LDH活性。残余的丙酮酸用1，4-二硝基苯肼处理产生高度着色的产品。形成的颜色的吸收度与LDH活性成反比。用280nm处的吸收度(“蛋白浓度”)除以442nm处的吸收度(“酶活性”)计算出LDH特异活性。
从溶液冻干后回收的LDH具有起始物料98％的特异活性。由琼脂糖珠洗脱得到的物质，其LDH活性是起始物料的约40％。这是初步研究，分析技术未优化。检测到所有样本的LDH活性均很高，位于标准曲线的顶端。基本上表明：可以将酶负载到琼脂糖珠上、冻干和回收而同时保持酶活性。
实施例3
两种降钙素制剂：降钙素/海藻糖/甘露醇(8/52/甘露醇，适量加入)±3％聚(N-异丙基丙烯酰胺)用作总固体浓度为20％的水凝胶模型。用超声雾化系统(频率为60kHz)将液体制剂(10ml)雾化进入液氮盘中。产生的冰滴/液氮混合物置入在-50℃预冷的冷冻干燥器中。该干燥器在1小时内加热到-25℃，并且使用最小0.1mbr的真空吸引于-25℃保持1小时。初步干燥后继续按一定斜率升温(30小时以上从-25℃升至0℃)。在初步干燥末尾，于另一个1小时内升温至20℃，在20℃再保持12小时作为二级干燥。干燥后，比较相同样本重量的两种粉末制剂的体积表明：含有水凝胶制剂的体积越小，颗粒密度越高。
实施例4
为了评价葡聚糖珠(作为本发明组合物的水凝胶载体颗粒)负载外来活性剂的能力和评价在含水环境时水凝胶所负载的活性剂从水凝胶中浸出的能力，故进行了下述研究。
4％硫酸化交联的葡聚糖珠购自Sigma(Sigma，St.Louis MO，Catalogue No.D-5650，Lot No.111H9575)。胰岛素购自AkzoNobel(SIPP584)vLysozyme。将胰岛素溶于1.5％乙酸溶液中制得负载溶液。负载溶液的浓度为10.10mg/ml。向4.199g负载溶液中加入4.155g水合的葡聚糖珠。将得到的悬浮液进行混合并于室温平衡1小时。经过了此负载过程之后，从负载溶液中分离出珠粒，分析负载溶液的蛋白质浓度。接着，冷冻干燥珠粒。
然后，将干燥的负载了活性剂的珠粒加入到含水提取溶液中，分析提取溶液中的蛋白质浓度。
起始和残余负载溶液以及提取溶液的胰岛素浓度，均使用BioRad(Richmond，CA)UV检测器进行测定。通过测定不同浓度(4.41mg/ml～10.10mg/ml)胰岛素溶液的UV吸收度来制作标准曲线(UV吸收度对胰岛素浓度作出曲线)。然后从标准曲线推出各种被检测溶液的胰岛素浓度。
本研究的结果是，起始负载溶液含有42.4mg胰岛素，与葡聚糖珠平衡1小时后负载溶液中残留3.2mg胰岛素。由此计算出胰岛素在冻干负载珠粒上的负载百分率为25％，因此负载效率为92％。提取溶液中有胰岛素31mg，表明从负载活性剂(即胰岛素)的葡聚糖珠中的回收百分率为79％。
实施例5
为了证明本发明将更多蛋白质外来活性剂掺入到水凝胶载体颗粒中的多次负载方法的能力，进行了下述研究。
4％琼脂糖珠(XC Corporation，Lot# XB219)和8％琼脂糖珠(XCCorporation，Lot# XBl38)用作水凝胶载体系统。猪胰岛素(Akzo Nob(XC Corporation，Lot# XB219)el，Lot SIPP584)用作外来活性剂。将琼脂糖珠冻干(使用VirTis SentryTM3+ES型冷冻干燥设备)过夜得到干燥的琼脂糖珠。然后，通过用饱和猪胰岛素溶液(25mg/ml的1％乙酸溶液)与该干燥的珠粒结合并让悬浮液平衡而使得珠粒再水合。接着，从负载溶液中分离出负载活性剂的颗粒，冷冻干燥48小时以使得负载(再水合)珠粒干燥。该步骤产生初级负载。使用干燥的初级珠粒重复上述过程，产生二级负载(负载次数#2)。然后，以同样方式将干燥的二级珠粒加入到负载溶液中，重复此过程以提供负载次数为#3～#5的二级负载。将每次负载间期的珠粒置入提取溶液中，然后使用反相HPLC(Shimadzu VP HPLC)测定从初级(#1)和二级负载(#2～#5)的每种珠粒中提取的胰岛素浓度。使用HPLC也对未处理珠粒(负载次数#0)进行分析以提供阴性负载对照。
对4％珠粒的研究结果示于表4和图2。对8％珠粒的研究结果示于表5和图3。对于4％琼脂糖珠而言，单次负载步骤胰岛素的理论最大负载％为37.5％，而对于8％琼脂糖珠而言，单次负载步骤胰岛素的理论最大负载％为22.3％。
                         表4
 负载次数#  胰岛素负载％   标准差(SD)    ％ CV
    0        0      0      0
    1      36.32     0.2     0.5
    2      49.24     1.2     2.4
    3      59.15     0.6     1.1
    4      63.28     2.4     3.8
    5      68.65     0.6     0.9
                              表5
 负载次数#  胰岛素负载％   标准差(SD)    ％ CV
    0       0      0      0
    1     23.08     0.1     0.5
    2     49.65     0.3     0.7
    3     52.08     0.7     1.3
    4     56.61     0.4     0.6
    5     64.42     1.1     1.7
由这些结果可见，本发明多次(反复)负载方法适宜提供基于每个颗粒干重计极高的药物负载率。
本说明书中提到的所有出版物和专利申请，在此引入作为参考，引入的程度就象每一个单个出版物或专利申请特异地和独立地被引作参考一样。
至此，已经全面描述了本发明。对于本领域技术人员来说，可进行许多变化和修饰而不背离本发明的实质范围。

Claims (38)

1.药理活性剂在制备还含有水凝胶的颗粒药物中的应用，所述颗粒药物经颗粒注射用于对受治疗者进行治疗。
2.权利要求1所述的应用，其中颗粒质均空气动力学直径是10～100μm。
3.权利要求1或2所述的应用，其中颗粒的壳密度是0.8～1.5g/cm3。
4.前述任一项权利要求所述的应用，其中药理活性剂是基因构建体。
5.权利要求4所述的应用，其中基因构建体包含编码与启动子可操作性地连接的抗原的序列。
6.前述任一项权利要求所述的应用，其中水凝胶是琼脂糖或葡聚糖。
7.权利要求6所述的应用，其中水凝胶是琼脂糖并且药物颗粒进一步包含葡聚糖作为赋形剂。
8.编码抗原的可表达基因构建体在制备含有负载了所述构建体的水凝胶的颗粒药物中的应用，所述颗粒药物作为核苷酸疫苗经颗粒注射施予受治疗者。
9.抗原在制备颗粒药物中的应用，该颗粒药物被用作疫苗经颗粒注射施予受治疗者。
10.制备适宜于经颗粒注射给药的粉末药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)水凝胶颗粒与含有药理活性剂的含水组合物接触，从而将活性剂负载到颗粒中；
(b)任选地，在一个至少部分干燥的步骤中从含水组合物中分离负载了活性剂的水凝胶颗粒，并将分离出的颗粒与含有所述药理活性剂的含水组合物接触，从而进一步将活性剂负载到颗粒中；
(c)如果已经进行了(b)步骤，那么任选地重复所述步骤一次或多次；
(d)在干燥步骤中从含水组合物中分离负载了活性剂的水凝胶颗粒；和
(e)得到所需的适用于透皮粉末注射装置的粉末药物组合物。
11.制备粉末状药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)制备预-形成水凝胶颗粒混合物；
(b)水凝胶颗粒与含有药理活性剂的含水组合物接触足够时间，以使得活性剂与水凝胶颗粒结合而掺入其中；和
(c)在一个干燥步骤中从含水组合物中分离水凝胶颗粒得到粉末状药物组合物，其中所述组合物包含所述已掺入了活性剂的水凝胶颗粒，而且所述组合物适宜在透皮粉末注射装置中使用。
12.制备粉末状药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)制备预-形成水凝胶颗粒混合物；
(b)将水凝胶颗粒在含有药理活性剂的含水组合物中悬浮足够时间，以使得颗粒膨胀而将活性剂掺入其中；和
(c)在一个干燥步骤中从悬浮液中除去水和其它溶剂，得到包含已掺入了活性剂的水凝胶颗粒的粉末状药物组合物，其中在所述粉末组合物中的水凝胶颗粒的质均空气动力学直径为10～100μm。
13.制备粉末状药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)制备预-形成水凝胶颗粒混合物；
(b)将水凝胶颗粒与含有药理活性剂的含水组合物接触足够时间，使得活性剂与水凝胶颗粒结合而掺入其中；
(c)在一个至少部分干燥的步骤中从含水组合物中分离水凝胶颗粒，得到已经掺入了活性剂的初级负载水凝胶颗粒；
(d)将初级负载水凝胶颗粒与含有所述药理活性剂的含水组合物接触足够时间，从而进一步将活性剂与水凝胶颗粒结合而掺入到水凝胶颗粒中；
(e)在至少一个部分干燥步骤中从含水组合物中分离在(d)步骤形成的水凝胶颗粒，得到掺入了活性剂的二级负载水凝胶颗粒；和
(f)干燥二级负载水凝胶颗粒得到粉末药物组合物。
14.权利要求13所述的方法，其中在步骤(f)前，将步骤(e)形成的二级负载水凝胶颗粒至少再一次与含有所述药理活性剂的含水组合物接触足够时间，以便进一步将活性剂与水凝胶颗粒结合而掺入其中。
15.权利要求10-14中任一项所述的方法，其中步骤(b)的水凝胶颗粒在干燥状态时与含水组合物接触。
16.权利要求10-14中任一项所述的方法，其中步骤(b)的水凝胶颗粒在处于润温水合前状态时与含水组合物接触。
17.权利要求10-16中任一项所述的方法，其中水凝胶颗粒选自琼脂糖、葡聚糖、聚乙二醇和聚对苯二酸丁二醇酯颗粒。
18.权利要求10-17中任一项所述的方法，其中活性剂在粉末状药物组合物中的含量占组合物的约0.1～85wt％。
19.权利要求10-18中任一项所述的方法，其中粉末状药物组合物是使用冷冻-干燥步骤而形成的。
20.权利要求10-18中任一项所述的方法，其中粉末状药物组合物是使用喷雾-干燥步骤而形成的。
21.含有水凝胶和药理活性剂的药物组合物，其中组合物是适宜于通过高速粉末注射对受治疗者透皮或透粘膜给药的粉末。
22.一种药物组合物，含有直径约10～100μm、每一颗粒含有掺入了药理活性剂的水凝胶的固体颗粒，所述颗粒适宜于通过高速粉末注射对受治疗者透皮或透粘膜给药。，
23.权利要求21或22所述的组合物，其中水凝胶是琼脂糖。
24.权利要求21-23中任一项所述的组合物，其中活性剂是肽。
25.权利要求21-24中任一项所述的组合物，与对于通过透皮或透粘膜高速粉末注射给药所作的书面标识说明书相结合。
26.权利要求21-24的任一项组合物的单位剂型。
27.对受治疗者透皮或透粘膜释放药理活性剂的制品，该制品的一个容器中含有权利要求21-24中任一项所述药物组合物，所述组合物包含单位剂量的活性剂。
28.权利要求27所述的制品，其中水凝胶是琼脂糖。
29.权利要求27或28所述的制品，其中活性剂是肽或蛋白质。
30.权利要求27-29中任一项所述的制品，与对于通过透皮或透粘膜高速粉末注射给药颗粒所作的书面标识说明书相结合。
31.对需要治疗的受治疗者释放药物的方法，所述方法包括
—制备权利要求21-24中任一项所述的药物组合物，
—加速所述颗粒至高速，和
—释放所述加速后的颗粒进入靶皮肤或粘膜部位。
32.权利要求31所述方法，其中水凝胶是琼脂糖。
33.权利要求31或32所述方法，其中活性剂是肽。
34.制备粉末状药物组合物的方法，所述方法包括：
—提供大小在约10～100μm范围的预-形成水凝胶颗粒混合物，
—将颗粒在含有溶解了的药理活性剂的含水组合物中悬浮足够时间，以使得颗粒膨胀并将活性剂掺入其中，和
—从悬浮液中除去水和其它溶剂，形成已经将活性剂掺入其中并且每一颗粒具有约10～100μm直径的固体水凝胶颗粒。
35.权利要求34所述方法，其中水凝胶颗粒在处于干燥状态时加入到含水组合物中。
36.权利要求34所述方法，其中水凝胶颗粒在处于润湿、膨胀前状态时加入到含水组合物中。
37.制备粉末状药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)形成含有药理活性剂和水凝胶的含水药物制剂，水凝胶含量为制剂的0.1～10wt％，和
(b)干燥制剂得到具有质均空气动力学直径10～100μm的颗粒。
38.适宜于通过颗粒注射对受治疗者给药且包含负载了药理活性剂的水凝胶的粉末，该粉末被用于对人或动物体的治疗方法中。
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