KR102407470B1 - 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법에 관한 것이다.
이러한 본 발명은, 하이드로겔에 약물을 담지하여 약물-하이드로겔을 제조하는 단계; 상기 약물-하이드로겔을 1차 동결 건조하여 상기 하이드로겔에 함유된 수분을 제거하는 단계; 상기 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분을 제1용매로 용출하여 용출물로 수득하는 단계; 상기 용출물을 2차 동결 건조한 후 제2용매에 용해시키고 여과하여 분리된 액상 여과액의 농도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 기술적 요지로 한다.

Description

하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법{METHOD FOR DETECTING THE AMOUNT OF DRUG RELEASED ON A HYDROGEL}

본 발명은 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법에 관한 것이다.

최근들어 약물의 효과는 증대시키면서 부작용을 감소시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 지용성, 소수성 또는 난용성 약물의 흡수율을 증진시킨 경구용 제제, 투과율을 높인 경피흡수 제제, 체내 수용액에서 안정성이 향상된 주사용 제제 등 다양한 분야에서 약물전달시스템(drug delivery system) 기술 연구가 활발히 진행되고 있다.

전통적인 약물전달은 경구 또는 정맥(intravenous) 주사 등을 통하여 이루어지는데, 약물의 농도가 필요 이상으로 높아지게 되면 유독 범위(toxic level) 이상이 되거나 최저 유효 농도 이하로 투약되는 현상이 반복되고, 이렇게 약물이 반복적으로 투여되면 환자에게 약물의 독성에 의한 부작용을 일으킬 수 있는 위험성이 있다.

예컨대 나노 기술을 접목한 약물전달체는 나노 입자 형태로 나노 입자 표면에 부착된 약물이 목표 부위에 도달하여 약물을 전달하는 방식인데, 이 방식으로는 나노 입자 표면에 위치하고 있는 약물이 급격한 용출에 의한 일시적인 약물 과다가 발생할 수 있다. 또한 나노 입자에서의 용출량을 제어하는 기술이 확보되지 않은 상황이어서 장기간 안정적인 약물 투여가 이루어지지 못하는 문제점이 있다.

한편, 하이드로겔은 높은 수분 함량, 다공성 구조, 세포외 기질과의 유사성으로 인하여 높은 생체적합성을 갖는 것으로, 창상피복재, 경구 투여제, 피하삽입형 약물 등과 같은 바이오메디컬 분야에 널리 사용되고 있다. 이러한 하이드로겔에는 질병에 표적으로 하는 약효를 포함하는 친수성, 지용성, 소수성 또는 난용성 약물이 탑재될 수 있다.

그러나 지용성, 소수성 또는 난용성과 같은 약물의 경우, 약물의 불안정성으로 인해 산화가 쉽게 일어나 관리 및 유통이 힘들기 때문에 실제 복용 시 약물의 담지량이나 생체 이용률에 대한 소비자의 의구심이 높아지고 있다.

이에, 하이드로겔에 탑재된 약물의 방출량을 측정해보고자 하는 시도가 필요하나, 실제론 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량을 검출할 수 있는 공인 측정법이 존재하지 않기 때문에, 체내와 매우 유사한 형태의 모델을 제작하여 시험해 보거나 추측해보는 방법 밖에 없다. 이처럼 지용성, 소수성 또는 난용성 약물이 신체 내에서 용출되는 방출량을 검출하는 방법이 까다롭기도 하고, 인접 국가에서 조차 해외 인증기관에 유사 약물 방출량을 의뢰할 수 밖에 없는 실정이다.

따라서 약물이 경구 투여 등의 방식으로 신체로 주입되는 경우를 고려하여, 신체 내에서 약물이 방출되는 양을 생체외(in-vitro) 시험을 통해 정량적으로 검출할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

국내 등록특허공보 제10-2180045호, 2020.11.11.자 등록.

본 발명은 상기한 문제점을 해소하기 위하여 발명된 것으로, 체외에서 약물의 방출량을 정량적이고 편리하게 측정할 수 있도록 하는, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법을 제공하는 것을 기술적 해결과제로 한다.

상기의 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 하이드로겔에 약물을 담지하여 약물-하이드로겔을 제조하는 단계; 상기 약물-하이드로겔을 1차 동결 건조하여 상기 하이드로겔에 함유된 수분을 제거하는 단계; 상기 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분을 제1용매로 용출하여 용출물로 수득하는 단계; 및 상기 용출물을 2차 동결 건조한 후 제2용매에 용해시키고 여과하여 분리된 액상 여과액의 농도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 약물-하이드로겔은, 상기 약물을 인산염완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)에 희석한 후 알지네이트를 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 상기 약물-하이드로겔은, 상기 알지네이트의 농도는 5 내지 15wt%인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 상기 약물은, 지용성, 소수성 또는 난용성 약물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서 상기 약물은, 베타카로틴(β-carotene)인 것을 특징으로 한다.

상기 과제의 해결 수단에 의한 본 발명의 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법에 따르면, 하이드로겔에 담지된 약물의 유효성분인 베타카로틴을 정량적으로 측정 가능하고, 또한 베타카로틴의 효능 검증이 가능함으로써, 이에 따라 다양한 신약품의 개발에 기여하고 신규 의약품의 부작용을 최소화할 수 있는 효과가 있다.

또한, 두 가지 이상의 특징을 갖는 혼합물질 상태의 하이드로겔에서 필요로 하는 유효성분만을 방출시켜, 그 방출량을 검출할 수 있으므로, 검출의 편의성 및 이로 인한 검출 비용을 절감할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(0시간→4시간→8시간→12시간→24시간)에 따른 alginate 농도별 β-carotene의 방출량을 나타낸 그래프.
도 2는 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(4시간)에 따른 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프.
도 3은 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(8시간)에 따른 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프.
도 4는 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(12시간)에 따른 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프.
도 5는 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(24시간)에 따른 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프.
도 6은 비교예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법에 관한 것으로, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량은, 하이드로겔에 약물을 담지하여 약물-하이드로겔을 제조하는 단계(S10)와, 약물-하이드로겔을 1차 동결 건조하여 하이드로겔에 함유된 수분을 제거하는 단계(S20)와, 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분을 제1용매로 용출하여 용출물로 수득하는 단계(S30)와, 용출물을 2차 동결 건조한 후 제2용매에 용해시키고 여과하여 분리된 여과액의 농도를 측정하는 단계(S40)를 통하여 검출되는 것을 특징으로 한다.

상술한 검출 방법에 따르면 먼저, 하이드로겔에 약물을 담지하여 약물-하이드로겔을 제조한다(S10).

하이드로겔은 창상피복재, 경구 투여제, 피하삽입형 약물 등에 널리 사용되고 있다. 이러한 하이드로겔에 탑재 가능한 약물로는 친수성, 지용성, 소수성 또는 난용성의 성질을 갖는 약물일 수 있으며, 필요로 하는 약효 즉, 질병에 표적으로 하는 약물이라면 다양하게 적용 가능하다.

약물의 경우 앞서 설명했다시피 지용성, 소수성 또는 난용성 약물일 수 있는데, 본 발명에서는 최근 강력한 항산화제 역할을 하는 카로티노이드계의 하나로 비타민 A의 전구체인 베타카로틴(β-carotene)일 수 있다.

즉 약물-하이드로겔은 베타카로틴을 pH를 일정하게 유지해줄 수 있는 무독성 인산염완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)에 희석하여 5,000uM의 베타카로틴 용액을 제조하고, 제조된 베타카로틴 용액을 cryogenic vial에 1ml 담고 알지네이트를 5 내지 15wt%의 농도로 투입하여 알지네이트와 베타카로틴 용액의 혼합이 균일하게 이루어질 수 있도록 한다. 이렇게 제조된 약물-하이드로겔은 β-carotene alginate-based hydrogel일 수 있다. 단, vial의 내벽면에 β-carotene alginate-based hydrogel이 다량 부착되어 있는 경우 원심분리기를 이용하여 vial의 내부 하부 방향으로 침전이 이루어질 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

본 단계의 약물-하이드로겔에 있어서, 알지네이트 농도는 5 내지 15wt% 범위를 갖는 것이 바람직하다. 알지네이트의 농도가 5wt% 미만이거나 15wt%를 초과하면 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량이 저하될 수 있어 바람직하지 않다.

다음으로, 약물-하이드로겔을 1차 동결 건조(예컨대 -70℃)하여 하이드로겔에 함유된 수분을 제거한다(S20).

약물이 지용성, 소수성 또는 난용성일 경우에는 하이드로겔에 녹아들지 못하고 균일하게 분포된 형태로만 사용하게 되는데, 이 경우 체내 대사를 통해 하이드로겔이 분해되어 방출된다. 이때 약물의 방출 속도 및 방출량을 측정하여 임상, 전임상 등에서 인체에 위해하지 않을 정도의 방출 속도와 방출량을 맞춰줘야 하지만 지용성, 소수성 또는 난용성 약물을 담지한 하이드로겔의 경우 체외에서 해당 약물의 방출량 및 방출 속도를 측정하기 쉽지 않다.

이는 하이드로겔 내부에 있는 지용성, 소수성 또는 난용성 약물들의 고른 분포로 인해 하이드로겔 외부에 있는 수용액들의 침투를 막고, 하이드로겔은 지용성, 소수성 또는 난용성 특성을 갖는 약물들을 붙잡고 있어 고른 방출이 어려우며, 심할 경우 약물의 방출이 일어나지 못하고 그 형태를 유지할 수 밖에 없게 된다.

특히 하이드로겔이 수분을 흡수해서 부풀어 오르면서 분해되어 내부에 담지된 베타카로틴을 방출시켜야 하는데, 베타카로틴을 담지한 하이드로겔을 수용성 용매 상에서 방출량을 측정할 시, 지용성 베타카로틴의 소수성 특징으로 수용성 용매를 하이드로겔 외부로 밀어내어, 하이드로겔의 스웰링(swelling)이 전혀 일어나지 않아 정상적인 약물 방출이 이루어지지 못한다. 또한 베타카로틴을 담지한 하이드로겔을 지용성 용매 상에서 방출량을 측정할 시 하이드로겔이 스웰링(swelling)되지 않아 하이드로겔 내부의 베타카로틴이 전혀 방출되지 못한다. 여기서 스웰링(swelling)이라 함은 하이드로겔이 수용성 또는 지용성 용매와 접촉될 경우 부피나 질량이 증가되는 현상을 의미한다.

하이드로겔에 담지된 약물을 방출량을 측정하기 위해서는 체내와 매우 유사한 형태의 모델을 제작하여 실험하거나 추측하는 방법 뿐이어서 많은 공정 비용이 발생할 수 밖에 없으므로, 체내와 측정의 편의성과 비용 절감을 위해 약물의 특성 일부를 차단하는 것이 바람직하다.

이를 위해 약물-하이드로겔을 초저온냉동고(deep freezer)에서 보관한 후 동결 건조기를 이용하여 진공 상태로 만들어 20 내지 28시간 1차 동안 동결 건조함으로써, 하이드로겔에 함유된 수분을 기화시켜 전량 제거하여 1차 동결 건조물을 수득한다. 1차 동결 건조를 통해 하이드로겔에 함유된 수분을 제거하면 수분이 없는 하이드로겔과, 수분이 없는 베타카로틴이 남게 되며, 이에 따라 하이드로겔의 가교가 차단될 수 있다.

1차 동결 건조 시 20시간 미만으로 할 경우 하이드로겔에 함유된 수분을 100% 제거하기 어려운 단점이 있으며, 28시간을 초과할 경우 수분 제거 능률이 높아져 하이드로겔의 가교 차단이 용이하게 이루어질 수 있기는 하나, 그 이하의 시간으로 1차 동결 건조한 경우와 비교하여 탁월한 검출 효과가 도출되지 않으며, 오히려 시간 측면에서 생산성 저하를 초래하는 단점이 있다. 따라서 1차 동결 건조는 20 내지 28시간 동안 이루어지는 것이 바람직하며, 24시간 동안 1차 동결 건조되는 것이 가장 바람직하다.

다음으로, 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분을 제1용매로 용출하여 용출물로 수득한다(S30).

이를 위해 탄소수 1 내지 4의 알코올 10wt% 및 인산염완충용액(phosphate-buffered saline, PBS) 90wt%로 이루어진 제1용매가 투입된 conical tube에, 1차 동결이 완료된 약물-하이드로겔을 투입하고 shaking incubator로 균일하게 교반한다.

shaking incubator는 36 내지 37℃의 온도 조건에서 분당 120 내지 180회 회전수로 설정한 상태에서 제1용매 상에서 1차 동결이 완료된 약물-하이드로겔의 유효성분 즉, 베타카로틴의 용출을 유도하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 36.5℃에서 분당 150회로 회전될 수 있다.

shaking incubator의 온도가 36℃ 미만이면 약물-하이드로겔의 외부로 방출되는 지용성, 소수성 또는 난용성 약물을 녹이는데 많은 시간이 소모되고, 37℃를 초과하면 제1용매의 끓는점에 가까워질 수 있어 펌핑 현상 발생으로 1차 동결이 완료된 약물-하이드로겔의 시료 손실률이 높아질 위험이 있다.

shaking incubator에서 분당 120회 미만으로 회전이 이루어지면 지용성, 소수성 또는 난용성 약물 즉, 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분인 베타카로틴을 녹이는데 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 베타카로틴의 용출 효율이 저하될 수 있다. 반면 shaking incubator에서 분당 180회를 초과하여 회전이 이루어지면 베타카로틴이 목적으로 하는 용출량을 갖는 용출물로 수득되는데 어려움이 있다. 따라서 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분인 베타카로틴을 제1용매로 용출할 시 36 내지 37℃의 온도 조건에서 분당 120 내지 180회 범위로 회전시키면서 균일 교반하는 것이 바람직하다.

단, 약물 방출량 검출을 위해서 shaking incubator에서 제1용매와, 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔이 투입된 시점으로부터 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 째 conical tube의 모든 용출물을 micro tube에 1ml씩 담을 수 있다.

마지막으로, 용출물을 2차 동결 건조한 후 제2용매에 용해시키고 여과하여 분리된 여과액의 농도를 측정한다(S40).

앞서 shaking incubator에서 제1용매와, 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔이 투입된 시점으로부터 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 째 conical tube의 모든 용출물을 micro tube에 1ml씩 담은 후 초저온냉동고(deep freezer)에 보관한 다음 20 내지 28시간 동안 2차 동결 건조할 수 있다.

1차 동결 건조된 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분을 제1용매로 용출하여 수득된 용액 상태의 용출물 그대로 측정을 할 수도 있긴 하나, 제1용매의 극성도 및 하이드로겔에 의해 정확한 방출량 측정이 어려울 수 있기 때문에 용출물을 2차 동결 건조하는 것이 바람직하다.

2차 동결 건조 시 20시간 미만으로 이루어지면 베타카로틴의 방출량을 정확히 측정하는데 어려움이 있으며, 28시간을 초과하여 이루어지면 그 이하의 시간으로 2차 동결 건조한 경우와 비교하여 베타카로틴의 방출량 검출 성능에 더 효율적이지 않으므로, 20 내지 28시간 2차 동결 건조하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 24시간 동안 2차 동결 건조할 수 있다.

2차 동결 건조를 통해 입자 형태로 수득된 2차 동결 건조물은 수분이 존재하지 않는데, 이를 지용성 성분을 녹일 수 있는 액상의 제2용매(예컨대, 아세톤)에 용해시킨 후 여과하여 분리된 여과액의 농도를 측정함으로써, 지용성 약물 즉, 베타카로틴이 담지된 하이드로겔에 함유되어 있던 베타카로틴의 방출량을 정량적으로 검출할 수 있게 된다.

이하, 본 발명의 실시예를 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다. 단, 이하의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

1-1. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 5wt%)의 제조

β-carotene을 PBS로 희석한 β-carotene(5,000uM) 용액을 제조하였다. cryogenic vial에 수용액 상태의 β-carotene 용액 1ml와, 알지네이트 농도가 5wt%가 되도록 담아 β-carotene 용액과 알지네이트를 균일하게 혼합하여 β-carotene alginate-based hydrogel을 제조하였으며, β-carotene alginate-based hydrogel이 vial의 벽면에 다량 붙어있는 경우, 원심분리기를 이용하여 vial의 저면에 잘 가라앉도록 하였다.

1-2. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 5wt%)의 여과액의 제조

β-carotene alginate-based hydrogel을 deep freezer에 보관한 후 동결 건조기를 사용하여 24시간 동안 1차 동결 건조하여 hydrogel의 수분을 모두 제거하였다. 1차 동결 건조된 β-carotene alginate-based hydrogel을 알코올 10wt% 및 PBS 90wt%로 혼합된 제1용매가 담긴 conical tube에 넣어 shaking incubator로 섞었다. 이때 shaking incubator의 동작 조건 관련, 온도는 36 내지 37℃, 회전수는 분당 150회로 설정하였다.

shaking incubator에서 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 마다 conical tube의 모든 용출물을 micro tube에 1ml씩 담아 deep freezer에 보관 후 24시간 동안 2차 동결 건조하였으며, 2차 동결 건조된 용출물을 acetone의 제2용매에 담아 syringe filter로 여과물을 제거한 여과액을 제조하였다.

<실시예 2>

2-1. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 10wt%)의 제조

β-carotene을 PBS로 희석한 β-carotene(5,000uM) 용액을 제조하였다. cryogenic vial에 수용액 상태의 β-carotene 용액 1ml와, 알지네이트 농도가 10wt%가 되도록 담아 β-carotene 용액과 알지네이트를 균일하게 혼합하여 β-carotene alginate-based hydrogel을 제조하였으며, β-carotene alginate-based hydrogel이 vial의 벽면에 다량 붙어있는 경우, 원심분리기를 이용하여 vial의 저면에 잘 가라앉도록 하였다.

2-2. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 10wt%)의 여과액의 제조

β-carotene alginate-based hydrogel을 deep freezer에 보관한 후 동결 건조기를 사용하여 24시간 동안 1차 동결 건조하여 hydrogel의 수분을 모두 제거하였다. 1차 동결 건조된 β-carotene alginate-based hydrogel을 알코올 10wt% 및 PBS 90wt%로 혼합된 제1용매가 담긴 conical tube에 넣어 shaking incubator로 섞었다. 이때 shaking incubator의 동작 조건 관련, 온도는 36 내지 37℃, 회전수는 분당 150회로 설정하였다.

shaking incubator에서 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 마다 conical tube의 모든 용출물을 micro tube에 1ml씩 담아 deep freezer에 보관 후 24시간 동안 2차 동결 건조하였으며, 2차 동결 건조된 용출물을 acetone의 제2용매에 담아 syringe filter로 여과물을 제거한 여과액을 제조하였다.

<실시예 3>

3-1. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 15wt%)의 제조

β-carotene을 PBS로 희석한 β-carotene(5,000uM) 용액을 제조하였다. cryogenic vial에 수용액 상태의 β-carotene 용액 1ml와, 알지네이트 농도가 15wt%가 되도록 담아 β-carotene 용액과 알지네이트를 균일하게 혼합하여 β-carotene alginate-based hydrogel을 제조하였으며, β-carotene alginate-based hydrogel이 vial의 벽면에 다량 붙어있는 경우, 원심분리기를 이용하여 vial의 저면에 잘 가라앉도록 하였다.

3-2. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 15wt%)의 여과액의 제조

β-carotene alginate-based hydrogel을 deep freezer에 보관한 후 동결 건조기를 사용하여 24시간 동안 1차 동결 건조하여 hydrogel의 수분을 모두 제거하였다. 1차 동결 건조된 β-carotene alginate-based hydrogel을 알코올 10wt% 및 PBS 90wt%로 혼합된 제1용매가 담긴 conical tube에 넣어 shaking incubator로 섞었다. 이때 shaking incubator의 동작 조건 관련, 온도는 36 내지 37℃, 회전수는 분당 150회로 설정하였다.

shaking incubator에서 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 마다 conical tube의 모든 용출물을 micro tube에 1ml씩 담아 deep freezer에 보관 후 24시간 동안 2차 동결 건조하였으며, 2차 동결 건조된 용출물을 acetone의 제2용매에 담아 syringe filter로 여과물을 제거한 여과액을 제조하였다.

<비교예 1>

1-1. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 5wt%)의 제조

β-carotene을 PBS로 희석한 β-carotene(5,000uM) 용액을 제조하였다. cryogenic vial에 수용액 상태의 β-carotene 용액 1ml와, 알지네이트 농도가 5wt%가 되도록 담아 β-carotene 용액과 알지네이트를 균일하게 혼합하여 β-carotene alginate-based hydrogel을 제조하였으며, β-carotene alginate-based hydrogel이 vial의 벽면에 다량 붙어있는 경우, 원심분리기를 이용하여 vial의 저면에 잘 가라앉도록 하였다.

1-2. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 5wt%)의 여과액의 제조

실시예 1 내지 3에서 실시하는 동결 건조 과정을 제외하고, β-carotene alginate-based hydrogel을 알코올 10wt% 및 PBS 90wt%로 혼합된 제1용매가 담긴 conical tube에 넣어 shaking incubator로 섞었다. 이때 shaking incubator의 동작 조건 관련, 온도는 36 내지 37℃, 회전수는 분당 150회로 설정하였다.

shaking incubator에서 conical tube의 용출물을 micro tube에 1ml씩 담고, 이에 acetone을 각각 혼합하여 syringe filter로 여과물을 제거한 여과액을 제조하였다.

<비교예 2>

2-1. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 10wt%)의 제조

β-carotene을 PBS로 희석한 β-carotene(5,000uM) 용액을 제조하였다. cryogenic vial에 수용액 상태의 β-carotene 용액 1ml와, 알지네이트 농도가 10wt%가 되도록 담아 β-carotene 용액과 알지네이트를 균일하게 혼합하여 β-carotene alginate-based hydrogel을 제조하였으며, β-carotene alginate-based hydrogel이 vial의 벽면에 다량 붙어있는 경우, 원심분리기를 이용하여 vial의 저면에 잘 가라앉도록 하였다.

2-2. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 10wt%)의 여과액의 제조

실시예 1 내지 3에서 실시하는 동결 건조 과정을 제외하고, β-carotene alginate-based hydrogel을 알코올 10wt% 및 PBS 90wt%로 혼합된 제1용매가 담긴 conical tube에 넣어 shaking incubator로 섞었다. 이때 shaking incubator의 동작 조건 관련, 온도는 36 내지 37℃, 회전수는 분당 150회로 설정하였다.

shaking incubator에서 conical tube의 용출물을 micro tube에 1ml씩 담고, 이에 acetone을 각각 혼합하여 syringe filter로 여과물을 제거한 여과액을 제조하였다.

<비교예 3>

3-1. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 15wt%)의 제조

β-carotene을 PBS로 희석한 β-carotene(5,000uM) 용액을 제조하였다. cryogenic vial에 수용액 상태의 β-carotene 용액 1ml와, 알지네이트 농도가 15wt%가 되도록 담아 β-carotene 용액과 알지네이트를 균일하게 혼합하여 β-carotene alginate-based hydrogel을 제조하였으며, β-carotene alginate-based hydrogel이 vial의 벽면에 다량 붙어있는 경우, 원심분리기를 이용하여 vial의 저면에 잘 가라앉도록 하였다.

3-2. β-carotene alginate-based hydrogel(alginate 농도: 15wt%)의 여과액의 제조

실시예 1 내지 3에서 실시하는 동결 건조 과정을 제외하고, β-carotene alginate-based hydrogel을 알코올 10wt% 및 PBS 90wt%로 혼합된 제1용매가 담긴 conical tube에 넣어 shaking incubator로 섞었다. 이때 shaking incubator의 동작 조건 관련, 온도는 36 내지 37℃, 회전수는 분당 150회로 설정하였다.

shaking incubator에서 conical tube의 용출물을 micro tube에 1ml씩 담고, 이에 acetone을 각각 혼합하여 syringe filter로 여과물을 제거한 여과액을 제조하였다.

<시험예 1>

본 시험예에서는 실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 3에 따라 알지네이트 농도별(5wt, 10wt% 및 15wt%)로 제조된 β-carotene alginate-based hydrogel의 최종 여과액의 β-carotene의 방출량 검출 여부를 분석해 보았다.

관련하여, 실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 3에 따른 각각의 여과액을 실온에서 Shimadzu UV-2600 UV-vis 분광 광도계를 사용하여 β-carotene alginate-based hydrogel의 농도를 측정하였다.

도 1은 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(0시간→4시간→8시간→12시간→24시간)에 따른 alginate 농도별 β-carotene의 방출량을 그래프로 나타낸 것으로, x축은 시간을, y축은 흡광도(absorbance)를 나타내며, 도 1의 5는 실시예 1을, 10은 실시예 2를, 15는 실시예 3을 의미한다. 도 1을 참조하면, β-carotene alginate-based hydrogel의 β-carotene 방출량이 시간이 지남에 따라 증가하는 추세를 보임을 확인할 수 있다.

도 2는 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(4시간)에 따른 흡광도를 측정하여 그래프로 나타낸 것으로, x축은 파장(wavelength)을, y축은 흡광도(absorbance)를 나타낸다. 또한 5-2-1, 5-3-1, 5-4-1은 실시예 1을, 10-1-1, 10-2-1, 10-3-1, 10-4-1은 실시예 2를, 15-2-1, 15-3-1, 15-4-1, 15-5-1은 실시예 3을 나타낸다. 이러한 도 2를 참조하면, 450 ± 20nm에서 β-carotene이 검출됨을 확인할 수 있다.

도 3은 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(8시간)에 따른 흡광도를 측정하여 그래프로 나타낸 것으로, x축은 파장(wavelength)을, y축은 흡광도(absorbance)를 나타낸다. 또한 5-2-2, 5-3-2, 5-4-2, 5-5-2는 실시예 1을, 10-1-2, 10-2-2, 10-3-2, 10-4-2는 실시예 2를, 15-2-2, 15-3-2, 15-4-2, 15-5-2는 실시예 3을 나타낸다. 이러한 도 3을 참조하면, 450 ± 20nm에서 β-carotene이 검출됨을 확인할 수 있다.

도 4는 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(12시간)에 따른 흡광도를 측정하여 그래프로 나타낸 것으로, x축은 파장(wavelength)을, y축은 흡광도(absorbance)를 나타낸다. 또한 5-2-3, 5-3-3, 5-4-3, 5-5-3은 실시예 1을, 10-1-3, 10-2-3, 10-3-3, 10-4-3은 실시예 2를, 15-1-3, 15-2-3, 15-3-3, 15-4-3, 15-5-3은 실시예 3을 나타낸다. 이러한 도 4를 참조하면, 450 ± 20nm에서 β-carotene이 검출됨을 확인할 수 있다.

도 5는 실시예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 시간(24시간)에 따른 흡광도를 측정하여 그래프로 나타낸 것으로, x축은 파장(wavelength)을, y축은 흡광도(absorbance)를 나타낸다. 또한 5-2-4, 5-3-4, 5-4-4, 5-5-4는 실시예 1을, 10-1-4, 10-2-4, 10-3-4, 10-4-4는 실시예 2를, 15-1-4, 15-2-4, 15-3-4, 15-4-4, 15-5-4는 실시예 3을 나타낸다. 이러한 도 5를 참조하면, 450 ± 20nm에서 β-carotene이 검출됨을 확인할 수 있다.

도 6은 비교예 1 내지 3의 β-carotene alginate-based hydrogel의 흡광도를 측정하여 그래프로 나타낸 것으로, x축은 파장(wavelength)을, y축은 흡광도(absorbance)를 나타낸다. 또한 5-1, 5-2, 5-3, 5-4는 비교예 1을, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4는 비교예 2를, 15-1, 15-2, 15-3, 15-4는 비교예 3을 나타낸다. 도 6을 살펴보면, 비교예 1 내지 3의 경우 450 ± 20nm에서 흡광도 peak가 나타나지 않아 베타카로틴이 방출되지 않음을 알 수 있다.

상술한 실시예 1 내지 3, 비교예 1 내지 3 및 시험예 1의 결과로부터, 베타카로틴이 담지된 하이드로겔을 2회 동결 건조하는 과정을 포함함으로써 하이드로겔의 가교가 차단되어 유효성분인 베타카로틴의 방출이 안정적으로 이루어질 수 있음이 확인된다.

정리하면, 본 발명은 하이드로겔과 같은 친수성 고분자에 담지된 지용성, 소수성 또는 난용성 약물의 방출량을 정량적으로 검출하기 위하여, 하이드로겔에 지용성, 소수성 또는 난용성 약물이 담지된 약물-하이드로겔을 1차 동결 건조하여 하이드로겔에 함유된 수분을 제거한 후 제1용매로 용출하여 수득되는 용출물을 2차 동결 건조하고 제2용매에 용해시킨 후 여과하여 분리된 액상 여과액의 농도를 측정함으로써, 달성될 수 있는 특징이 있다.

상기 특징에 따르면, 종래 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량을 측정하기 위해 체내와 매우 유사한 형태의 모델을 제작하여 시험하거나 추측할 수 밖에 없었던 방법을 탈피할 수 있을 것으로 기대된다.

이를 통해 약물의 불안정성으로 인해 쉽게 산화되고 관리가 힘든 베타카로틴의 실제 복용 시 담지량 또는 생체 이용률에 대한 소비자의 신뢰도를 높일 수 있으며, 신규 의약품 개발 시 부작용 또한 최소화할 수 있다는 점에 의미가 있으므로, 국내 시장에서 다양한 신약품 개발에 기여하고, 해외 시장에서 신약품의 경쟁력을 가질 수 있는데 일조할 것으로 기대된다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서 본 발명에 개시된 실시예는 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라, 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것도 아니다. 본 발명의 보호 범위는 특허청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

1. 하이드로겔에 약물을 담지하여 약물-하이드로겔을 제조하는 단계;
   상기 약물-하이드로겔을 1차 동결 건조하여 상기 하이드로겔에 함유된 수분을 제거하는 단계;
   상기 1차 동결 건조된 약물-하이드로겔에 함유된 유효성분을 제1용매로 용출하여 용출물로 수득하는 단계; 및
   상기 용출물을 2차 동결 건조한 후 제2용매에 용해시키고 여과하여 분리된 액상 여과액의 농도를 측정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 약물-하이드로겔은, 상기 약물을 인산염완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)에 희석한 후 알지네이트를 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 약물-하이드로겔은, 상기 알지네이트의 농도는 5 내지 15wt%인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 약물은, 지용성, 소수성 또는 난용성 약물인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 약물은, 베타카로틴(β-carotene)인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔에 담지된 약물의 방출량 검출 방법.

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