CN1331608C - 中空膜管式微萃取分析器及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中空膜管式微萃取分析器及其应用方法，属于实验室用的微分析装置技术。该微萃取分析器，由整齐排列在孔模板上的分析单元体构成，每个分析单元体包括一根中空膜管的上端连接着一个扩口小容器构成。该微萃取分析器应用方法，测定有机化合物的LogP或LogD；测定药物穿过此中空膜稳态速度，即药物的渗透性；通过测定药物和BSA或HAS结合前后药物的浓度来测定药物与血清白蛋白的结合率；根据化合物在有机溶剂溶解度不同，可以用于对目的物的富集和干扰的排除，提高测定的灵敏度。本发明中空膜管式微萃取分析器结构简单和应用广泛，样品的分析过程迅速，有机溶剂用量少，利于环保。

Description

中空膜管式微萃取分析器及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种中空膜管式微萃取分析器及其应用方法，属于实验室用的微分析装置技术。

背景技术

萃取技术主要是利用化合物在两个不同相(例如有机相和水相)中溶解度的不同，使化合物在一定条件下达到两相平衡而实现化合物富集分离的一种手段。目前实验室所用的液-液萃取装置的体积一般较大，消耗萃取溶剂量大，难以实现微量样品的预富集；另外由于使用比较多的有机溶剂容易造成环境污染。萃取过程化合物不容易在两相达到平衡，需要比较长的时间。更为严重的是，经过剧烈晃动，在两相直接接触的界面处往往形成乳化层。要使两相完全分离，往往要通过离心，静置很长时间等等。

在药物开发的初期阶段，需要对成千上万的化合物进行筛选，工作量很大。要想对如此多的化合物进行全部筛选几乎是不可能的。因此，人们往往希望通过对这些化合物的一些物理常数的测定，可以较快的进行初选。例如：反映某化合物的脂溶性特点的参数logP(或log D)可以通过测定该化合物在正辛醇相与水相之间的分配系数的对数值来获得；同时，反映一个化合物的药物吸附性和渗透性的渗透性参数也可以通过使该化合物透过一人造膜而获得。目前，测定log P或log D直接方法为摇瓶法，它为液-液萃取方法。这种方法需要样品量大，时间长，而且两相需要完全分离，往往浓度高相干扰测定。化合物渗透性测定主要是通过测定化合物通过人工培养CaCO2细胞形成的膜来获得的。近来，模拟人造膜渗透性测定法(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay PAMPA)能高通量地测定药物的渗透性。所用装置被称作“三明治”的装置，它是用一涂有卵磷脂的人工膜将药物溶液和接受溶液分开，膜处在中间，下面为药物溶液层，上面为接受溶液层。该装置能够实现高通量分析，所以用途很广。但是由于在膜的周围存在着非扰动层，尤其膜下层，非扰动层可达1900μm。因此，此法测定的数据是表观渗透性，当药物的渗透性高时，测定的药物渗透速度实际为药物穿过非扰动层扩散速度，而非实际渗透性。药物在人血管渗透存在的非扰动层厚度约30～100μm，用该方法测定数据与药物在体内的渗透性相差甚远，因此，只有降低非扰动层的厚度，所测定数据与药物在体内的渗透性才能接近。

除了log D和等渗透性物理常数，药物与蛋白质结合常数测定也有着重要意义。一般有萃取法，超滤方法等。其中萃取法和log D测定方法类似，他们都不能进行药物与蛋白质结合常数的高通量分析。

在生物样品(如尿样和血样)复杂样品的分析中，样品的分离及干扰的排除占有很重要的地位。而复杂样品的预分离往往又十分地复杂。样品中待测物浓度很低，需要进行富集后才能测定。因此需要一种既简单分离又能对样品进行分离装置。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中空膜管式微萃取分析器及其应用方法，该中空膜管式微萃取分析器具有结构简单和应用广泛的特点。

本发明是通过下述技术方案加以实现的。一种中空膜管式微萃取分析器，由整齐排列在孔模板上的分析单元体构成，其特征在于：每个分析单元体包括一根直径为0.1～10mm、膜孔径为0.01～1μm和孔密度10％～80％的中空膜管，中空膜管的上端连接着一个扩口小容器构成；由这样结构的分析单元体96个或384个构成中空膜管式微萃取分析器。

上述的中空膜管材质是聚丙烯、聚偏氟乙烯或聚醋酸纤维素。

上述的扩口小容器是玻璃的、塑料铁的、不锈钢的或陶瓷的方形、锥形或圆形小容器。

上述的中空膜管式微萃取分析器的应用方法如下：

应用方法之一，其特征在于将很少量正辛醇经主干管装入中空膜中，放入萃取的水溶液中。能测定包括正辛醇的有机化合物的LogP或LogD。

应用方法之二，其特征在于在中空膜涂上卵磷脂的正十二烷溶液，测定药物穿过此中空膜稳态速度，即药物的渗透性。

应用方法之三，其特征在于将包括正辛醇的少量与水不互溶的有机溶剂经主干管装入中空膜中，通过测定药物和BSA和HAS结合前后药物的浓度来测定药物与血清蛋白的结合特性。

应用方法之四。其特征在于将包括正辛醇的很少量与水不互溶的有机溶剂经主干管装入中空膜中，由于分析物中进入有机溶剂的量不同，可以达到对目的物的富集和干扰的排除，提高测定的灵敏度。

本发明的优点在于，结构简单和应用广泛，样品的分析过程迅速，有机溶剂用量少，利于环保。

附图说明

图1、中空膜管式微萃取分析器的单元体结构示意图。

图中：1，小容器；2，中空膜管。

图2、为96个分析单元体构成的中空膜管式微萃取装置俯视示意图。

图3、为图2侧视图。

具体实施方式

例一、用于单个有机化合物logD或logP的测定

用该装置测定单个有机化合物log D或log P，所用膜为中空纤维膜，膜孔径大小为0.08μm，膜孔率60％，中空膜管内直径为1mm。将15μL的正辛醇加入到装置的中空纤维膜中，放到中有待测物水溶液的2mL，直径为8mm小瓶上，摇动萃取25分钟后，分别测定待测物在正辛醇相和水相的浓度。正辛醇相浓度/水相浓度即为分配系数。分配系数的对数值即为log D或log P。用本装置测定几种化合物log D或log P，见下表：

化合物       Log P测定值      平均值   参考值    标准偏差

苯胺      0.96  0.91  0.97    0.95     0.9       0.032

苯酚      1.64  1.60  1.65    1.63     1.5       0.026

苯        1.94  2.00  1.96    1.97     2.1       0.030

甲苯      2.60  2.54  2.64    2.59     2.7       0.050

萘        3.53  3.56  3.50    3.53     3.6       0.030

例二、用于药物的渗透性测定

将该装置中空膜管的直径1mm，膜孔径为0.45μm，孔密度80％的聚丙烯中空膜管膜放入磷脂的正十二烷溶液中浸泡，使该膜上涂有磷脂。在中空膜中放入药物溶液，将其浸入接收缓冲溶液中。一小时后分别测定不同时间药物在接收药物的渗透性。由于中空膜中溶液样品量少，如果用中空膜是中空纤维膜，从外观上更像血管，而且可进行比较剧烈搅动，搅动过程中由于中空膜可随之搅动，可降低非搅动层厚度，从而使测定的数据更接近药物在体内的渗透情况，降低测定时间。该装置能够排列到96孔模板中，实现高通量测定，可满足现代药物筛选的需要。

例三、药物-蛋白质亲和性的测定

用本装置可用于测定蛋白质-药物亲和性。具体方法为，将氢化可的松溶解在装有pH为7.4磷酸缓冲溶液中小瓶中，浓度为1μg/mL。在中空膜管式微萃取分析器中，加入25μL正辛醇，萃取25分钟后，测定正辛醇相中药物的浓度。根据药物log D数据，可得到药物的初始浓度C₀；同时作平行试验，将含有同样浓度的氢化可的松缓冲液中加入牛血清血清白蛋白(HAS)，，让氢化可的松和蛋白结合2小时后，在中空膜管式微萃取分析器中，加入25μL正辛醇，萃取25分钟后，可得到此时缓冲液中没有结合蛋白结合的自由药物的浓度。由此，可计算出药物与牛血清蛋白的结合率。实验三次测定了牛血清白蛋白与氢化可的松的结合率分别为88％、91％和90％。与文献报道结果一致。与传统萃取-log D测定方法相比，该方法可直接将有机相和水溶液相分离而无需离心或长时间静止溶液。可大大节省时间，操作方便、简单。同时，该方法可以在一个小瓶中插入多个装有机相中空纤维膜，通过测定在不同时间点的溶液中药物的浓度，可以研究药物与蛋白质结合的动力学。同理，该微型隔膜液-液萃取器装置可以排列到96或384(或更密的)模板上，实现高通量测定。

例四、用于生物样品的测定

微型隔膜液-液萃取器的另一个应用是生物样品的测定。将很少量与水不互溶的有机溶剂如正辛醇经主干管装入中空膜管中。由于有机溶剂的量很少，而各种化合物在有机溶剂中的溶解度也不同。利用此一特征，可以实现选择性地萃取。萃取完成后，在有机相中溶解度大(即log D大)的化合物可实现富集。而在有机相中溶解度小的，则几乎无富集效应。因此可以溶解度小的可排除干扰。例如，直接在人尿中加入很少量萘溶液后，用高效液相色谱测定此尿样中萘的含量，杂质的干扰非常严重。但在用微型隔膜液-液萃取器进行液-液微萃取后(有机相为正辛醇)，再用高效液相色谱测定。萘的色谱峰面积比萃取前增大1000多倍，而且相对而言，其他干扰就变得很小了。再例如、用该方法测定氢化可的松的浓度，可以在尿液中检测到20ng/ml的氢化可的松，而没有干扰。

Claims (1)

1.一种中空膜管式微萃取分析器应用方法，所述的中空膜管式微萃取分析器由整齐排列在孔模板上的96个或384个分析单元体构成，每个分析单元体包括一根直径为0.1～10mm、膜孔径为0.01～1μm、孔密度10％～80％的中空膜管，中空膜管的上端连接着一个扩口小容器，该中空膜管式微萃取分析器应用方法，其特征在于：

1)将很少量的正辛醇经主干管装入中空膜中，放入萃取的水溶液中，测定包括正辛醇、苯胺、苯酚、苯、甲苯和萘的LogP值或LogD值；

2)在中空膜涂上卵磷脂的正十二烷溶液，测定药物穿过此中空膜稳态速度，即药物的渗透性；

3)将包括正辛醇的很少量与水不互溶的有机溶剂经主干管装入中空膜中，测定牛血清白蛋白与氢化可的松的结合率；

4)将包括用很少量正辛醇与水不互溶的有机溶剂经主干管装入中空膜中，用于测定人尿中萘和人尿中氢化可的松，达到对目的物的富集和干扰的排除，提高测定的灵敏度。