CN1330329C - 防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物及其制备方法，以1500ml药液计算，含各味中药以生药材计算的量以及敷料量配比为：板蓝根350～450g，黄连150～250g，金银花225～275g，黄芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，95%乙醇225-250ml，亚硫酸氢钠3g，其余为蒸馏水。并采用水提、醇沉、药液配制三步骤制成口服剂。本发明通过大量的临床使用，证明该药物具有抗病毒，抗菌，清热解毒，消炎，增强免疫力功能，对多种病毒和细菌引起的禽类呼吸道感染，甚至顽固性、久治不愈的病症治疗效果十分明显，其应用对于推动我国家禽业的发展将起到积极作用。

Description

防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于畜禽药，尤其是一种防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物及其制备方法。

背景技术

禽类的呼吸道感染性疾病在整个禽病中占有十分重要的地位，其中病毒和细菌性疾病占80％以上。目前发病的禽种和病种都在不断增加，不仅严重影响着禽产业的发展，而且禽类病毒感染人体和人禽共患病症严重威胁人类健康已引起国际社会的高度重视。由于免疫程序复杂、弱毒疫苗的潜在危险性、灭活苗抗原性弱、一些疫苗的保护率降低以及缺少有效的预防用疫苗等因素，尤其在病毒性疾病的防治方面还存在很多缺陷。用中药防治病毒和细菌引起的感染性疾病在我国具有悠久历史，在临床应用中显示出了独特的疗效。由于中草药保持了各种物质的自然形态和生物活性，极少有毒副作用，近年来许多国家都非常重视从中草药或植物药中研究新药。国内的动物用药也正向疗效高、耐药性低、效果持久、低毒、低残留等方向发展，中草药在某些领域有逐渐取代抗生素类药物的趋势。但由于中药在动物体内作用机理的复杂性和复方成分难以定量化，研制和筛选一种非常有效的并能够在临床大规模应用的有效药物仍十分困难，目前市场上仍以中西结合药物为主，而且功能单一。

发明内容

基于现有技术的不足和国内外对抗病毒、抗菌中药产品开发的需求，本发明以祖国传统医学理论为指导，研制了新组方纯中药防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物——“菌毒康”，将其制成口服制剂型，用于治疗和预防禽类顽固性呼吸道感染类疾病。

本发明的另一目的是提供防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物——“菌毒康”的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物，以1500ml药液计算，含各味中药以生药材计算的量以及敷料量配比为：

板蓝根350～450g，黄连150～250g，金银花225～275g，黄芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，95％乙醇225-250ml，亚硫酸氢钠3g，其余为蒸馏水。

本发明的制备方法是：

①水提  按照配方组成，分别称取板蓝根350～450g，黄连150～250g，金银花225～275g，黄芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，第一次加4倍蒸馏水，加热至沸腾，提取0.5小时；过滤取滤液；第二次加入7倍水量，加热至沸腾提取1小时，过滤收集滤液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加热浓缩至1200ml；

②醇沉加入乙醇，使药液的乙醇浓度含量为50％，摇匀后在低温下静置过夜，离心驱除沉淀物，回收上清夜，回收乙醇使药液体积至1200ml，以上述方法分别经过65％、80％的乙醇提取2次，最后浓缩药液1200ml；

③药液配制  药液中加入3g亚硫酸氢钠搅拌溶解。然后加入乙醇225～250ml充分搅拌。最后加入蒸馏水并定容至1500ml。

剂型：

口服液

理化参数：

pH值：5.0±1.0；

比重：1.02±0.15；

性状：棕红色液体，久置可有微量沉淀，味微苦。

鉴别：

取药液作为供试品溶液另取盐酸小檗碱对照品，加水配成0.5mg/ml试验，吸取上述两溶液各1μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇(6∶3∶1.5∶1.5)为展开剂展开，置于蒸气饱和的层析缸内展开，取出晾干后置紫外检测仪(365nm)下检视。供试品与对照品在色谱板相应的位置上显相同的黄色荧光斑点。

含量测定：取药液1ml，加入2M的NaOH溶液4滴，使其pH值调整为9.0-10.0。以2ml的乙酸乙酯提取5次，合并乙酸乙酯并挥干，残渣以0.05M的硫酸溶解并定容至25ml，摇匀，按分光光度法，在345nm波长测定吸收度，按C₂₀H₁₈ClNO₄的吸收系数(El％，1cm)为728计算，即得。“菌毒康”含盐酸小檗碱(C₂₀H₁₈ClNO₄)计，其值应为0.45μg/ml以上。

本发明的优点和产生的有益效果是：

本发明属于清热解毒类药物，与活血化淤药、补益药配伍，并且通过大量的临床使用，证明该药物对多种病毒和细菌引起的禽类呼吸道感染甚至十分顽固、久治不愈的病症具有十分良好的治疗效果，其应用对于推动我国家禽业的发展将产生积极作用；

本产品主要治疗和预防禽类顽固性呼吸道感染类疾病，可取代现有的抗生素类药物，临床使用具有高效、安全、低毒、使用方便的优点。

下面，结合病毒试验、药理药效试验、临床试验、治疗鸡呼吸道综合症疗效试验对本发明再作进一步的说明：

实施例1

①按照配方组成，分别称取板蓝根400g，黄连200g，金银花250g，黄芩300g，山豆根200g，甘草150g，第一次加4倍蒸馏水，加热至沸腾，提取0.5小时，过滤取滤液；第二次加入7倍水量，加热至沸腾提取1小时，过滤收集滤液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加热浓缩至1200ml。

②加入乙醇，使药液的乙醇浓度含量为50％，摇匀后在低温下静置过夜，离心驱除沉淀物，回收上清夜，减压加热回收乙醇，使药液体积至1200ml。以上述方法分别经过65％、80％的乙醇醇沉2次，最后浓缩药液至1200ml。

③药液中加入3g亚硫酸氢钠搅拌溶解。然后加入乙醇225ml充分搅拌。最后加入蒸馏水并定容至1500ml。

实施例2

①按照配方组成，分别称取板蓝根400g，黄连200g，金银花250g，黄芩300g，山豆根200g，甘草150g，第一次加4倍蒸馏水，加热至沸腾，提取1小时，过滤取滤液；第二次加入6倍水量，加热至沸腾提取1小时，过滤收集滤液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加热浓缩至1200ml。

②加入乙醇，使药液的乙醇浓度含量为50％，摇匀后在低温下静置过夜，离心驱除沉淀物，回收上清夜，减压加热回收乙醇，使药液体积至1200ml，以上述方法分别经过65％、80％的乙醇醇沉2次，最后浓缩药液至1200ml。

③药液中加入3g亚硫酸氢钠搅拌溶解。然后加入乙醇225ml充分搅拌，最后加入蒸馏水并定容至1500ml。

试验例1

药理药效试验

“菌毒康”对鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)感染细胞能力的影响

取9日龄SPF鸡胚，去头、爪和内脏，用D-Hanks液冲洗3次后置于小烧杯中，剪成1mm³左右大小的碎块，再用D-Hanks液冲洗3次，然后加入4倍量的0.25％胰蛋白酶液，轻轻摇匀后置于37℃水浴中消化至组织块变得疏松、表面发毛：弃上层胰液，用D-Hanks液冲洗，吹散，纱布过滤，以MEM细胞生长液调整细胞数至×10⁶个/ml，分装100ml细胞瓶(10ml/瓶)，置5％CO²培养箱中37℃培养24h，待细胞长成致密单层，再用0.025％的胰酶消化，洗去胰酶，每瓶用细胞生长液稀释成10ml，转入96孔细胞板，每孔0.2ml，继续培养，待细胞长成完整单层时，小心吸去细胞生长液，按以下三种顺序加入中药和病毒：

①先加中药后加病毒  取各稀释度中药分别加入到CEF单层中，每个浓度重复4孔，每孔0.1ml，置于5％CO²培养箱中37℃培养24h，各孔再加入0.1ml的病毒液，每个稀释度同时设设中药对照(只加中药0.2ml)、病毒对照(只加0.2ml病毒)和细胞对照(只加0.2ml细胞维持液)继续培养，每隔24h在倒置显微镜下观察，直至病毒对照组完全死亡时。

②先加病毒后加中药  先将病毒液加入CEF单层中，每孔0.1ml，培养24h，加入各稀释度中药，每孔0.1ml，每个稀释度重复4孔；同时设中药对照、病毒对照和细胞对照。观察同①。

⑧病毒和中药同时加入将各稀释度中药加入CEF单层中，每个浓度重复6孔，每孔0.1ml：同时加入病毒液，每孔0.1ml。并设中药对照、病毒对照和细胞对照。观察同①。

按以下标准判定和列表记录：

从表1可以看出：“菌毒康”先于病毒加入时，在0.0488mg/ml浓度出抑制高峰(强抑制)，0.0977mg/ml呈中抑制，0.1953-0.7813mg/ml和0.0244mg/ml以下浓度呈弱抑制，后加时未出现抑制效应，与病毒同时加入时，在0.0122mg/ml以上呈强抑制，0.0061mg/ml以下呈中抑制。本结果表明，”菌毒康”的抗病毒机理应是通过抑制细胞的生长而抑制病毒的，并且存在量效关系。

表1  菌毒清对IBDV感染细胞能力的影响(浓度：mg·ml^-1)

浓度	0.7813	0.3906	0.1953	0.0977	0.0488	0.0244	0.0122	0.0061	0.0031	0.0015	0.0008
												先加	+	+	+	++	+++	+	+	+	+	+	+
后加	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
												同时加	+++	+++	+++	+++	+++	+++	+++	++	++	++	++

*注：中药对照和细胞对照细胞组成层好，无游离细胞、死细胞，细胞折光好，病毒对照细胞全部死亡。

-：细胞全部死亡或仅有少数活细胞，表示中药不能抑制病毒；

+：活细胞较多，细胞单层出现严重拉网状，表示弱抑制；

++：细胞单层完好，折光性差，表示中抑制；

+++：细胞单层完好，折光性好，表示强抑制。

试验例2

对小鼠的口服急性毒性试验

对体重18～22g的昆明系小白鼠50只，分5组灌服”菌毒康”，各组剂量依次为6451、7021、8295和8930mg/kg，观察小鼠的死亡情况并进行记录，实验期限为7天，试验中死亡小鼠及试验结束时存活小鼠进行剖检，观察病理变化。试验数据见表2。

表2  小鼠口服急性中毒试验数据统计

组别	剂量(mg/kg)	动物数	死亡数	死亡率(P)	存活率(q)
						1	6451	10	0	0	1.0
2	7021	10	2	0.2	0.8
						3	7506	10	4	0.4	0.6
4	8295	10	7	0.7	0.3
						5	8960	10	10	1.0	0

结果计算表明，”菌毒康”对小鼠的口服LD₅₀为7624mg/kg，LD₅₀的95％的可信限为6917～9793mg/kg，根据毒理学毒物分级标准，应为低毒。与临床推荐使用量相比，换算的单位体重用量非常小，由此可见，菌毒清安全范围大，毒性小很，临床使用安全可靠。

试验例3

临床药效试验

1、“菌毒康”防治鸡传染性支气管炎(IBV)的试验结果

1日龄京白939雏鸡，经临床检查均为健康，IBV-T株原液接种于9日龄鸡胚尿囊腔，每胚0.2ml，共接种8只鸡胚并做2只空白对照，接种后恒温箱37℃下培养24h，抛弃死胚，72h后，无菌收获尿囊液加入青霉素后放4℃冰箱保存备用。将120只1日龄京白939雏鸡随机分成四组，每组30只。各组具体饲养与管理见表3。病料组织采集于攻毒后1天，3天，5天，分别采集气管、肺、肾等组织，石蜡切片，普通H·E染色。

表3  饲养管理情况

从表4可以看出，攻毒后第III组症状明显严重，人工感染IB-T株前后用”菌毒康”预防及治疗的第I、II组症状几乎没有或只有轻微临床症状，攻毒后未给予治疗的第III组临床症状明显严重。说明”菌毒康”能拮抗或轻微减轻IBV-T株侵害后的症状。证明了该药对IBV-T株有预防和治疗的作用。

表4  攻毒后临床症状

表5  攻毒后的肉眼病变

表6  光镜下病理组织变化

攻毒日	器官	I组	II组	III组	IV组
						攻毒1天	气管	正常	只有个别器官区域黏膜上皮细胞纤毛脱落	气管大部分区域黏膜上皮细胞纤毛脱落，上皮细胞发生坏死，脱落黏层表面呈锯齿状，固有层及黏膜下层水肿。	正常
攻毒3天	气管	正常		气管大部分区域呈现一致的变化即上皮细胞组成，细胞核体积大呈椭圆形或圆形，染色质疏松	正常
						攻毒5天	气管	正常	固有层及黏膜下层约淋巴细胞浸润	固有层及黏膜下层的细胞浸润广泛浸润细胞为淋巴细胞，有少量单核细胞	正常
攻毒后	气管	正常	轻微的肺初级、次级支气管水肿	肺毛细支气管见的毛细血管充血、出血小叶间结缔组织有较局灶性淋巴细胞浸润肺初级、次级支气管下有淋巴细胞浸润及水肿。	正常

以上结果表明：各用药组病鸡在药物的作用下，大部分得到保护，少数发病的雏鸡病变比较轻微，器官受损轻而易恢复，而攻毒致病的第III组组织严重，病变明显。

从表6可见IBV-T株侵害的主要组织是气管和肾，致病的第III组组织病变最严重最明显。而第I组预防和第二组治疗组组织几乎没有病变或轻微。说明”菌毒康”能抑制IBV-T株侵害组织，对组织有保护作用。

试验例4

治疗鸡呼吸道综合症疗效试验

2500只伊沙褐蛋鸡(90日龄-183日龄)，均为临床病例，三个月病程，鸡产蛋率只有30％。临床症状为鸡冠及肉髯深红，嗜饮水；营养不良羽毛凌乱无光泽，削廋；咳嗽甩头流鼻液，大便稀或水样、色灰白；头、颈肿胀。诊断结果为鸡传染性喉气管炎，及大肠杆菌、葡萄球菌等细菌混合感染。治疗试验，2000只病鸡采用”菌毒康”饮水治疗，方法为按1∶100稀释”菌毒康”给病鸡自由饮用，连续用药5天；每天观察记录鸡的症状变化。500只鸡采用对照药物病毒唑治疗，饮水药物浓度为0.1％，给药方法同上。

试验结果

用药前后鸡产蛋率变化：

“菌毒康”治疗组：用药后95％鸡只临床治愈，至第七天平均产蛋率达最高峰80％，接近正常产蛋的水平。临床治愈鸡实验室检查结果，玻片凝集试验鸡喉气管炎呈阴性，镜检埃希氏大肠杆菌和葡萄球菌感染率在正常范围之内。临床治愈病鸡饮食正常，甩头、咳嗽、拉稀、头颈肿等症状消失。

对照药物病毒唑治疗组：用药后10％鸡只临床治愈，用药后第七天产蛋率为40％。病鸡实验室检查结果，玻片凝集试验检查鸡喉气管炎病毒呈阳性，镜检埃希氏大肠杆菌和葡萄球菌感染率高于正常范围。所有病鸡甩头、咳嗽、拉稀、头颈肿等症状未消失。

使用方法说明

功能：抗病毒，抗菌，清热解毒，消炎，增强免疫力。

主治：禽呼吸道病毒与细菌感染性疾病。

用量方法：禽：饮水，按1％稀释于水中，每日1-2次，连续使用3-5天。预防量减半。

规格：100ml/瓶，32瓶/箱。

贮藏：密闭，避光，置阴凉处。

有效期：二年。

Claims (2)

1、一种防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物，其特征是：

以1500ml药液计算，含各味中药以生药材计算的量以及敷料量配比为：

板蓝根350～450g，黄连150～250g，金银花225～275g，黄芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，95％乙醇225-250ml，亚硫酸氢钠3g，其余为蒸馏水。

2、如权利要求1所述的一种防治禽类呼吸道病毒与细菌感染药物组合物的制备方法是：

①水提按照配方组成，分别称取板蓝根350～450g，黄连150～250g，金银花225～275g，黄芩270～330g，山豆根180～220g，甘草135～165g，第一次加4倍蒸馏水，加热至沸腾，提取0.5小时；过滤取滤液；第二次加入7倍水量，加热至沸腾提取1小时，过滤收集滤液；第三次同第二次，然后合并三次提取液，加热浓缩至1200ml；

②醇沉加入乙醇，使药液的乙醇浓度含量为50％，摇匀后在低温下静置过夜，离心驱除沉淀物，回收上清夜，回收乙醇使药液体积至1200ml，以上述方法分别经过65％、80％的乙醇提取2次，最后浓缩药液1200ml；

③药液配制药液中加入3g亚硫酸氢钠搅拌溶解。然后加入乙醇225～250ml充分搅拌。最后加入蒸馏水并定容至1500ml。