CN1328381C - GnRH－白细胞毒素嵌合体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新的免疫载体系统，编码它的DNA以及这些系统的应用。这些系统包括嵌合体蛋白质，该嵌合体蛋白质包括一种与一个或多个选定的GnRH多聚体融合的白细胞毒素多肽，该GnRH多聚体包含至少一个重复的GnRH十肽序列，或至少一个相应于至少一个选定的GnRH分子的表位的序列的重复单元。在本发明中，该选定的GnRH序列可以全部相同，或者可以相应于GnRH的不同的衍生物、类似物或表位，只要该GnRH序列可引发免疫反应。该白细胞毒素的作用是提高与其融合的GnRH多聚体的免疫原性。

Description

GnRH-白细胞毒素嵌合体
技术领域
总的来说本发明涉及免疫学载体系统。更具体地说，本发明涉及白细胞毒素GnRH嵌合体，它包括一个以上的GnRH多肽的拷贝。与单独的GnRH多肽比较，该嵌合体显示出增强的免疫原性。
发明背景
在脊椎动物中，两种促性腺激素，促黄体素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和释放称为促性腺素释放激素(GnRH)(过去称为LHRH)的多肽的调节。因此，一条控制动物群体的生育的途径是降低GnRH的水平，如通过抗GnRH的免疫接种，这一方法使LH和FSH的水平降低，并伴随着破坏发情周期和精子生成。参见例如Adams等人，动物科学杂志(1990)68：2793-2802。
对GnRH分子的早期研究已经表明在对重复注射合成的GnRH肽的应答中产生抗血清是可能的(Arimura等人，内分泌学(1973)93(5)：1092-1103)。另外，在许多种类中，通过将GnRH与适当的载体化学地共轭并以适当的助剂中的共轭物给药已经产生抗GnRH的抗体(Carelli等人，美国核酸科学进程(1982)79：5392-5395)。已经叙述过将含有GnRH或GnRH类似物的重组融合蛋白用于肽疫苗中，以便对各种驯养的和农场的动物进行免疫去雄或抑制它们的生育功能(Meloen等人，疫苗(1994)12(8)：741-746；Hoskinson等人，澳大利亚生物技术杂志(1990)4：166-170；和1992年11月12日公开的国际公开号，WO92/19746；1991年3月7日公开的WO91/02799，1990年10月4日公开的WO90/11298，1986年12月公开的WO86/07383)。
但是，由于不能提供适当的免疫学绝育产品这样的尝试失败，因为GnRH肽的免疫原性较小，和化学共轭方案难于控制，使GnRH共轭物基本上是异源的并且不确定的事实。另外，基于GnRH的肽疫苗在对单个动物个体提供均一的效果的成功率是有限的，甚至在重复接种后。关于这一点，过去的GnRH构建体不能提供均一的成功的免疫绝育疫苗产品，因为GnRH是小的“自体”分子，个体的免疫系统不能正常识别，使该分子的免疫原性较小，并且内在地不能诱导对内源GnRH的明显的免疫应答。
通常认为通过生产这些含有选定的表位的多重拷贝的分子的免疫原性形式可以明显地提高病毒抗原，小蛋白或内源物质的免疫原性。在这一点上，基于1型单纯疱疹病毒糖蛋白D的肽9-12的两个或四个重复(Ploeg等人，免疫学方法杂志(1989)124：211-217)，恶性疟原虫抗原疟的原虫四肽NPNA的两个到六个重复(Lowell等人，科学(1988)240：800-802)，口啼疫疾病病毒的VP1的主要免疫原位点的两个或四个拷贝(Broekhuijsen等人，J.gen.Virol.(1987)68：3137-3143)和类似GnRH的多肽的任意重复(Meloen等人，疫苗(1994)12(8)：741-746)的构建体已经表明能有效地增加这些分子的免疫原性。
为了在受到攻击的寄主中引发明显的免疫应答，将小蛋白或内源物质也可以与适当的载体共轭。通常适当载体是多肽，包括起源于感染物质的蛋白质如病毒表面蛋白，或载体肽序列的抗原区。这些载体的作用是非特异地刺激T辅助细胞的活性，和帮助指导抗原到提供抗原的细胞以便在细胞表面加工和呈现该肽，该肽与主要的组织相容性复合物(MHC)的分子结合。
为了这一目的，已经研制了几个载体系统。例如，小肽抗原经常与蛋白质载体如匙孔血蓝蛋白(Bittle等人，自然(1982)298：30-33)，破伤风类毒素(Muller等人，美国核酸科学进程(1982)79：569-573)，卵清蛋白，和鲸精子肌红蛋白偶联，产生免疫应答。这些偶联反应通常导致在每摩尔的载体蛋白中掺入几摩尔的肽抗原。虽然肽抗原以多重拷贝呈现通常能增强免疫原性，载体可以引发与肽抗原不相关的强免疫性，这可以抑制次级免疫接种的肽疫苗的免疫应答(Schutze等人，免疫学杂志(1985)135：2319-2322)。
抗原传递系统也是基于颗粒载体的。例如，可以将预先形成的颗粒用作平台，抗原可以与其偶联和掺入其中。已经开发的有基于蛋白体(Lowell等人，科学(1988)240：800-802)，免疫刺激复合物(Morein等人，自然(1984)308：457-460)，和病毒颗粒如HBsAg(Neurath等人，分子免疫学(1989)26：53-62)，和轮状病毒内部衣壳蛋白(Redmond等人，分子免疫学(1991)28：269-278)的系统。
利用重组生产的嵌合蛋白也已经设计了载体系统，该嵌合蛋白可以自我组装成颗粒。例如，酵母逆转录转座子，Ty，编码一系列蛋白，可以组装成类似病毒颗粒(Ty-VLPs；Kingsman，S.M.，和A.J.Kingsman疫苗(1988)6：304-306)。已经将外源基因插入TyA基因并在酵母中以融合蛋白形式表达。融合蛋白保留了自我组装成均一大小的颗粒的能力。
已经检测了其它嵌合蛋白颗粒如HBsAg，(Valenzuela等人，生物/技术(1985)3：323-326；美国专利号，4,722,840；Delpeyroux等人，科学(1986)233：472-475)，乙型肝炎核心抗原(Clarke等人，疫苗88(Ed.H.Ginsberg，等人，1988)pp.127-131)，脊髓灰质炎病毒(Burke等人，自然(1988)332：81-82)和烟草花叶病毒(Haynes等人，生物/技术(1986)4：637-641)。但是，这些载体的用途受到限制，因为活性试剂的大小有限，它可以插入结构蛋白而不干扰颗粒的组装。
最后，利用与选定的抗原融合的溶血性巴斯德菌白细胞毒素(LKT)多肽已经设计了嵌合系统。参见，例如1993年4月29日公开的国际公开号WO93/08290，1992年3月5日公开的WO92/03558以及美国专利号5,238,823和5,273,889。通过提供具有广谱种类反应性的T-细胞表位，肽抗原嵌合体中的LKT载体部分的内含物提供的对嵌合体的免疫原性增强，从而在免疫接种个体中引发了依赖于T细胞的免疫应答。在这点上，在产生对嵌合体的肽抗原部分的免疫应答中诱导适当的T细胞辅助是必要的，特别是其中抗原是内源分子。但是，到现在为止，还没有叙述将白细胞毒素多肽载体与GnRH肽的多重表位结合使用。
本发明公开内容
本发明基于溶血性巴斯德菌(P.haemolytica)白细胞毒素基因，其突变体，和编码多个GnRH多肽的一个或多个核苷酸序列之间构建新基因融合体。当与GnRH单独给药引发的免疫原性反应比较时，这些构建体产生免疫原性惊人地增强的嵌合蛋白。
所以，在一个实施方案中，本发明涉及含有与一个或多个多聚体融合的白细胞毒素多肽的嵌合蛋白，其中每个多聚体含有不止一个选定的GnRH多肽。该嵌合体的白细胞毒素部分的作用是增强GnRH多肽的免疫原性。更具体地说，本文所用的GnRH多聚体可以对应于不止一个拷贝的选定的GnRH多肽或表位，或选定的GnRH多肽或表位的多个任意重复。另外，GnRH多聚体可以定位于白细胞毒素多肽的羧基和/或氨基末端，白细胞毒素多肽的内部位点，或任何这样的位点的联合。每个GnRH多聚体也可以为对应于通式GnRH-X-GnRH的分子，其中X选自下组：肽键，氨基酸间隔基团和[GnRH]n，其中n大于或等于1，并且其中的“GnRH”可以包括任何GnRH多肽。在一个特定的实施方案中，提供了含有与两个GnRH多聚体融合的白细胞毒素多肽的嵌合蛋白。在该分子中，一个GnRH多聚体的C-末端与白细胞毒素的多肽的N-末端融合，白细胞毒素多肽的N-末端与其它GnRH多聚体的N-末端融合。
同时公开的是含有该嵌合体蛋白以及药物可接受载体的疫苗组合物，以及通过以有效量的所述疫苗组合物给药对寄主提呈一个或多个选定的GnRH多聚体的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码该嵌合体蛋白的DNA构建体。该DNA构建体包括与一个或多个选定的核苷酸序列可操作地连接的编码白细胞毒素多肽的第一个核苷酸序列，每个选定的核苷酸序列编码一个以上的GnRH多肽或表位的拷贝。
在另一个实施方案中，本发明涉及由上面叙述的DNA构建体组成的表达盒，该构建体与控制序列可操作地连接，控制序列指导其转录，从而该构建体可以在寄主细胞中转录和翻译。
在另一个实施方案中，本发明涉及用这些表达盒转化的寄主细胞。
本发明的另一个实施方案提供了产生重组多肽的方法。该方法包括(a)提供如上所述的寄主细胞群体和(b)在可以表达由表达盒编码的嵌合体多肽的条件下培养细胞群体。
参考本文的公开内容，本发明的这些和其它实施方案对本领域的普通技术人员是显而易见的。
附图的简要说明
图1A和1B显示用于嵌合白细胞毒素GnRH多肽基因融合的GnRH构建体的核苷酸序列和氨基酸序列。图1A描述了包括单个拷贝的GnRH十肽的GnRH-1；图1B描述了包括四个拷贝的GnRH十肽，n＝1，和8个拷贝的GnRH，n＝2等等的GnRH-2。
图2描述了质粒pAA352的结构，其中tac是来自大肠杆菌的杂合trp::lac启动子；bla代表了β-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)；ori是基于ColE1的质粒复制原点。1ktA是溶血性巴斯德菌白细胞毒素结构基因；lac1是大肠杆菌lac操纵子阻遏物。箭头指出了白细胞毒素基因的转录/翻译方向。每个成分的大小没有按比例画出。
图3-1到3-9显示了白细胞毒素352(LKT352)的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。图中显示了LKT352的结构基因和侧接载体区的序列。
图4显示了携带白细胞毒素GnRH(LKT-GnRH)基因融合体的质粒pCB113的结构。
图5-1到5-8显示了来自pCB113的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。来自pCB112的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列与起源于pCB113的嵌合蛋白的序列相同，不同的是如上在图4中所述多重拷贝的GnRH的序列插入两次。
图6显示了携带白细胞毒素-GnRH(LKT-GnRH)基因融合体的质粒pCB111的结构。
图7-1到7-5显示了来自pCB111的LKT-嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。来自pCB114的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列与起源于pCB111的嵌合蛋白的序列相同，不同的是如上图6中所述将多重拷贝的GnRH的序列插入了两次。
图8-1到8-2显示了质粒pCB111的截短的白细胞毒素基因的平齐末端融合点的核苷酸序列和推测的氨基酸序列(图8-2)，其中通过用限制酶BstB1和Nae1消化从LKT352中除去了内部DNA片断(约1300bp长)(图8-1)。
图9-1到9-6显示了来自pCB122的LKT-GnRH嵌合蛋白的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。
图10显示了携带失去细胞毒素活性的LKT101白细胞毒素多肽的质粒pAA101的结构。
图11描述了LKT101白细胞毒素多肽的推测的氨基酸序列。
图12显示了如实施例10所述，阉猪，未处理的公猪，和免疫去雄的公猪(用白细胞毒素GnRH融合蛋白接种)的平均血清抗GnRH抗体效价的比较。
图13显示了如实施例10所述在阉猪，未处理的公猪，和免疫去雄的公猪(用白细胞毒素GnRH融合蛋白接种)中的平均血清睾酮的水平的比较。
图14显示了如实施例10所述在阉猪，未处理的公猪，和免疫去雄的公猪(用白细胞毒素-GnRH融合蛋白)中的饲料转化效率的比较(表示为公斤饲料：公斤获得重量)。
图15显示了如实施例11所述，在注射含有LKT::8拷贝GnRH融合蛋白的疫苗组合物，或含有8拷贝GnRH::LKT::8拷贝GnRH融合蛋白疫苗组合物的动物中的平均血清抗GnRH抗体的效价的比较。
图16显示了如实施例13中所述，在对照动物(实心块)和用含有8拷贝GnRH::LKT::8拷贝的GnRH融合蛋白的疫苗组合物处理的动物(十字交叉格子块)中平均卵巢的重量(毫克)，平均子宫的重量(毫克)，和平均血清雌二醇(皮克/毫升)的比较。
图17描述了如实施例14中所述在阉猪，公猪，去雄后动物，和免疫去雄动物(用白细胞毒素-GnRH融合蛋白接种)中的脂肪雄烯酮水平的比较。
详细叙述
除非特别说明，本发明的实践中将利用传统的分子生物学，微生物学，病毒学，重组DNA技术，和免疫学技术，它们是本领域技术人员熟知的。文献中完全解释了这些技术。参见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆：实验室手册，DNA克隆，第I和II版(D.N.Glover编辑)；低聚核苷酸的合成(M.J.Gait编辑)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑)；动物细胞培养(R.K.Freshney编辑)；固定化细胞和酶(IRL出版)；B.Perbal，分子克隆的实验指导；酶学方法系列(S.Colowick和N.Kaplan编辑，学术出版公司)；和实验免疫学手册，第I-IV期(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，Blackwell科学出版社)
A.定义
在本发明的叙述中，将利用下面的术语，并按如下所述定义它们。
术语“促性腺素释放激素”或“GnRH”指在脊椎动物中控制黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的释放的下丘脑分泌的十肽(Fink，G.，英国医药手册(1979)35：155-160)。在脊椎动物中，特别是哺乳动物中GnRH的氨基酸序列是高度保守的。在这点上，起源于大多数哺乳动物包括人，小牛，小猪和绵羊GnRH(过去称为LHRH)的GnRH具有氨基酸序列焦Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(Murad等人，激素和激素拮抗物，治疗的药学基础，第六版，(1980)和Seeburg等人，自然(1984)311：666-668)。
如本文所用“GnRH多肽”包括起源于天然GnRH序列的分子以及重组生产或化学合成的GnRH多肽，该多肽具有与天然GnRH基本上同源的氨基酸序列，并如下所述保留免疫原性。所以，该术语包括含有任何单个或多个氨基酸叠加，替代和/或缺失的GnRH的衍生物和类似物，这些GnRH存在于内部或在肽的氨基或羧基末端。因此，在本发明中，“GnRH多肽”包括具有天然序列的分子，如图1A描述的分子(具有N-末端Gln残基，而不是焦Glu残基)，和具有其它氨基酸叠加，替代和/或缺失的分子，这些分子保留了激发与天然存在的GnRH交叉反应的抗体的形成能力。本文特别关注的是GnRH多肽的重复序列，如图1B中描述的低聚物中(其中每个选定的GnRH多肽含有N-末端Gln替代，另外其中每个其它的GnRH多肽在位置2含有Asp残基替代)。该定义同时也包括了GnRH的表位。
术语“表位”指在抗原或半抗原上的位点，该位点与特异的抗体分子结合。因为GnRH是非常小的分子，利用本领域的已知技术可以容易地鉴定能够激发抗体应答的表位。参见如Geysen等人，美国核酸科学进程(1984)81：3998-4002(快速合成肽以便在给定的抗原中定位免疫原性表位的常用方法)；美国专利号4,708,871(鉴定和化学合成抗原表位的方法)；Geysen等人，分子免疫学(1986)23：709-715(鉴定与给定抗体具有高亲和力的肽的技术)。
如本文所用，术语“T细胞表位”指肽结构的特征，该特征是能够诱导对肽结构或相关的半抗原的T细胞免疫性。在这点上，这是本领域可接受的，即T细胞表位含有在MHC分子的肽结合裂口内确定扩展的构型的线性肽决定簇，(Unanue等人，科学(1987)236：551-557)。将多肽到MHC II类相关的线性肽决定簇的转换(通常长度为5-14个氨基酸长度)称为“抗原加工”，这是由呈现抗原的细胞(APCs)进行的。更具体地说，T细胞表位是用不依赖于整个多肽的折叠来定义的。短肽结构的局部特征，如包括带电性和疏水性的初级氨基酸序列，和如螺旋性的某些类型的次级结构。另外，可以相信辅助T细胞能够识别的短肽通常是两亲性结构，该结构包括疏水侧链(以便与MHC分子相互作用)和亲水侧链(以便与T细胞受体相互作用)，(Margalit等人，T细胞表位的计算机推测，新生代疫苗Marcel-Dekker公司出版，G.C.Woodrow等人(1990)109-116)，另外，两亲性结构具有α螺旋构型(参见，如Spouge等人，免疫学杂志(1987)138：204-212；Berkower等人，免疫学杂志(1986)136：2498-2503)。
所以，利用许多的计算机程序可以容易地推测包括T细胞表位的蛋白质片断。(参见如，Margalit等人，T细胞表位的计算机推测，新生代疫苗Marcel-Dekker公司，G.C.Woodrow等人(1990)109-116)。这样的程序通常将肽的氨基酸序列与已知诱导T细胞应答的序列比较，寻找确认是T细胞表位需要的氨基酸的图谱。
“免疫原性蛋白”或“免疫原性氨基酸序列”分别是蛋白质或氨基酸序列，它们能在给药的个体中引发免疫学应答。在本发明中，“GnRH免疫原”指GnRH分子，当将它导入寄主个体中时，刺激免疫应答。在这点上，GnRH免疫原包括对应于不止一个选定GnRH多肽的多聚体；更具体地说，对应于具有多重或任意重复的选定GnRH多肽序列的多聚体，多重或任意重复的选定GnRH表位，或它们的任何可想象的联合的多聚体。
对抗原或疫苗的“免疫应答”是在寄主中发展对需要的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，这样的应答包括，但不限于一个或几个下面的效应：产生特异地抗需要的组合物或疫苗中的抗原或几种抗原的抗体，B细胞，辅助T细胞，阻遏T细胞，和/或有细胞毒性的T细胞和/或γδT细胞。
利用本领域已知的任何几个免疫测试，可以检测免疫应答。
术语”白细胞毒性多肽”或“LKT多肽”指至少包括一个T细胞表位并起源于一类分子的家族蛋白质的多肽，该类分子的特征是在羧基末端具有共有氨基酸序列Gly-Gly-X-Gly-X-Asp(Highlander等人，DNA(1989)8：15-28)，其中X是Lys，Asp，Val或Asn。这样的蛋白质包括起源于溶血性巴斯德菌和大叶性肺炎放线杆菌的白细胞毒素，以及大肠杆菌α溶血素(Strathdee等人，感染免疫学(1987)55：3233-3236；Lo，Can.J.Vet.Res.(1990)54：S33-S35；Welch，分子微生物学(1991)5：521-528)。已知这一毒素家族是“RTX”毒素家族(Lo，Can.J.Vet.Res.(1990)54：S33-S35)。另外，术语“白细胞毒素多肽”指化学地合成，和从表达它的生物体中分离，或重组地产生的白细胞毒素多肽。另外，该术语指具有基本与邻接的氨基酸序列同源的氨基酸序列的免疫原性蛋白质，该氨基酸序列存在于特定的天然白细胞毒素分子中。所以，该术语包括全长和部分序列以及类似物。虽然天然全长白细胞毒素显示了细胞毒素的活性，术语“白细胞毒素”也指保留免疫原性，但仍然缺乏天然白细胞毒素的细胞毒性特征的分子。几个白细胞毒素的核苷酸序列和对应的氨基酸序列是已知的。参见，如，美国专利号，4,957,739和5,055,400；Lo等人，感染免疫学(1985)50：667-67；Lo等人，感染免疫学(1987)55：1987-1996；Strathdee等人，感染免疫学(1987)55：3233-3236；Highlander等人，DNA(1989)8：15-28；Welch，分子微生物学(1991)5：521-528。在本发明生产的嵌合体中，通过提供含有小肽片断的T细胞表位，该小肽片断的长度范围是5到14个氨基酸，它能够与MHC II类分子复合，以呈现和激活T辅助细胞，选定的白细胞毒素多肽序列给予一个或几个融合GnRH多聚体的免疫原性增强，如下面进一步讨论，这些T细胞表位存在于白细胞毒素分子中，并被认为集中在白细胞毒素的N-末端部分，即在氨基酸残基1到199之间。
如本文所用，“失去细胞毒素活性”的白细胞毒素多肽指如上所述的白细胞毒素多肽，与天然的，全长的白细胞毒素比较(如美国专利号，5,055,400和4,957,739中所述的全长的溶血性巴斯德菌白细胞毒素)，它丧失明显的细胞毒性，但仍然保留了免疫原性和至少一个T细胞表位。利用任何几个已知的测试如Korzeniewski等人在免疫学方法杂志64：313-320中所述的乳酸脱氢酶释放测试可以测试白细胞毒素多肽的细胞毒素多肽的活性，其中通过从小牛嗜中性粒细胞释放乳酸脱氢酶测定细胞毒性。确定白细胞毒素分子具有细胞毒性，如果将它与对照非细胞毒性分子比较时，它导致释放产生统计学上显著的乳酸脱氢酶。
含有缺乏白细胞毒素多肽的LKT-GnRH嵌合体提供了几个重要的优点。首先，缺乏细胞毒素活性的白细胞毒素多肽是如人所愿的，因为在个体中注射活性毒素可以导致局部细胞的死亡(PMNs和巨噬细胞)，并且它本身导致严重炎症应答以及在注射位点脓肿。在这点上，导致巨噬细胞死亡的细胞毒素活性可以导致抗原的呈现减少，所以免疫应答在最适度以下。如在用于生产本发明的融合蛋白的非细胞毒性LKT多肽中发现的细胞毒素部分的除去也导致产生截短的LKT基因，它能够以比全长LKT更高的水平表达。另外，在本文构建的保留了足够的T细胞抗原性的融合体中使用非毒性LKT多肽减少了为了对选定的GnRH多肽产生足够的B-细胞响应而需要的对寄主个体施用的白细胞毒素GnRH抗原的总量。缺乏细胞毒素活性的免疫原性白细胞毒素多肽的特定例子包括LKT352，LKT111，和LKT101，下面将非常详细地论述它们。
“LKT352”指起源于1ktA基因的蛋白质，该基因存在于质粒pAA352(图2，ATCC登记号68283)。国际公开号WO91/15237中叙述了该基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，并表示在图3中。该基因编码截短的白细胞毒素，具有914个氨基酸，估计的分子量约为99千道尔顿，它失去了分子的细胞毒性部分。这样产生的截短的基因的表达水平比全长分子高得多(超过40％的细胞总蛋白相对于全长形式的小于1％的细胞总蛋白)并且更容易纯化。衍生的LKT352不是必然物理地起源于质粒pAA352中存在的序列。而是，它可以以任何方式产生，包括例如，化学合成或重组生产。另外，蛋白质的氨基酸序列只需要与描述的序列基本同源。所以，可以存在序列突变，只要LKT多肽的功能是增强与之结合的抗原的免疫原性，但也失去细胞毒性活性。
“LKT111”指白细胞毒素多肽，它起源于质粒pCB111中存在的1ktA基因(图6，ATCC登记号69748)。这一基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列表示在图7。通过除去长度约为1300bp的内部DNA片断，该基因编码更短的白细胞毒素变体，这种白细胞毒素是从质粒pAA352(图2，ATCC登记号68283)中存在的重组白细胞毒素基因发展而来的。LKT111多肽的估计分子量是52千道尔顿(与LKT352多肽的分子量99千道尔顿比较)，但保留了含有T细胞表位的LKT352 N-末端部分，这是足够的T细胞免疫原性所必须的，和保留了含有方便的限制位点的LKT352 C-末端的部分，以便用于生产本发明的融合蛋白。在本发明中，LKT111白细胞毒素多肽不是必须物理地起源于质粒pCB111中存在的序列。而是，它可以以任何方式产生，包括例如，化学合成或重组生产。另外，该蛋白质的氨基酸序列只需要与所述的序列基本同源。所以，可以存在序列突变，只要蛋白质的功能是增强与之结合的抗原的免疫原性，并失去细胞毒性。
“LKT101”指起源于质粒pAA101中存在的1ktA基因的白细胞毒性多肽(图10，ATCC登记号67883)。图11描述了从pAA101构建体产生的溶血性巴斯德菌白细胞毒素的推测的氨基酸序列。从截短的1ktA基因形式可以表达LKT101多肽，该形式含有基因的5’末端到唯一的Pst1限制内切酶位点。将截短的基因与β-半乳糖苷酶基因(lacZ)融合，以便简化LKT101多肽的纯化。在本发明中，LKT101白细胞毒素肽不是必然物理地起源于质粒pAA101中存在的序列。而且，它可以以任何方式产生，包括例如，化学合成或重组产生。另外，该蛋白质的氨基酸序列只需要与描述的序列基本同源。所以，可以存在序列突变只要蛋白质的功能是增强与之结合的抗原的免疫原性，并失去细胞毒性。
白细胞毒素GnRH多肽嵌合体显示了“增强的免疫原性”，当它具有比对应的一个或多个单独的GnRH多聚体更大的引发免疫应答的能力。通过对动物给药特定的白细胞毒素GnRH多肽和GnRH多聚体对照，并利用标准测试如本领域已知的放射免疫测试和ELISA将这样得到的抗GnRH抗体的效价进行比较可以确定这样的增强的免疫原性。
“重组”蛋白或多肽指通过重组DNA技术产生的多肽，即从编码需要的多肽的外源DNA构建体转化的细胞产生的多肽。“合成”蛋白质或多肽是那些经过化学合成制备的。
DNA“编码序列”或“编码特定蛋白的核苷酸序列”是当置于适当的调节序列的控制下，在体内或体外转录和翻译为多肽的DNA序列。由5’末端(氨基末端)的起始密码和3’末端(羧基末端)的翻译终止密码确定该编码序列的边界。编码序列可以包括，但不限于，原核生物的序列，来自真核生物mRNA的cDNA，来自真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，和甚至是合成的DNA序列。转录终止序列通常位于编码序列的3’末端。
DNA“控制序列”集合性地指启动子序列，核糖体结合位点，多聚腺苷酸化信号，转录终止序列，上游调节区，增强子，和诸如此类，它们集合性提供寄主细胞中的编码序列的转录和翻译。
一个编码序列“可操作地”与另一个编码序列连接的条件是RNA聚合酶将转录两个编码序列成mRNA，并随后将它们转译成由两个编码序列编码的嵌合体多肽。这些编码序列不需要相互邻接，只要转录序列最终加工产生需要的嵌合体蛋白质。一个控制序列当它控制一个编码序列的转录时，该控制序列与该编码序列为“可操作地连接”。
当RNA聚合酶与启动子序列结合，并将编码序列转录成mRNA，然后转录成编码序列编码的多肽，该控制序列在细胞中为“指导编码序列的转录”。
“寄主细胞”是已经被或能够被外源DNA序列已经转化或能够转化的细胞。
当将这样的外源DNA导入细胞膜内时，外源DNA“转化”了细胞。外源DNA可以或可以不整合(共价地连接)到染色体DNA中组成细胞的基因组。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以保留游离的元件，如质粒。至于真核生物细胞，稳定转化的细胞是外源DNA已经整合到染色体中，以致能通过染色体复制遗传给子细胞。真核生物细胞能建立由含有外源DNA的子细胞的群体组成的细胞系或克隆的能力证明了这一稳定性。
当核苷酸或氨基酸的至少80％(优选地至少约90％，和最优选地至少约95％)与该分子的确定长度匹配时，两个DNA或多肽序列“基本同源”。在用于特定系统的严格条件下进行的Southern杂交实验可以确定基本同源的DNA序列。确定的适当杂交条件是在本领域技术人员已知的范围内的，参见，例如Sambrook等人，出处同上，DNA克隆，I和II版，出处同上，核酸杂交，出处同上。
DNA构建体的”异源”区是在另一个DNA分子内或附着于它的DNA的可鉴定部分，这部分是天然的其它相关分子中没有发现的。所以，当异源区编码细菌基因时，该基因通常与来源细菌的基因组中与细菌基因不侧接的DNA侧接。异源编码序列的另一个例子是构建体，其中的编码序列本身在自然界中不存在(如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。如本文所用，等位基因突变体或天然存在的突变事件不产生DNA的异源区。
“脊椎动物个体”是指脊索动物亚门，包括，但不限于，哺乳动物如啮齿动物，小牛，猪，羊，山羊，马和人；家养动物如狗和猫；鸟，包括家养的，野生的和可捕猎的鸟，如公鸡和母鸡包括小鸡，火鸡和其它家禽类鸟的任何成员。该术语没有规定特定的年龄。所以，包括了成年和新生动物。
B.总的方法
本发明的中心是发现了当与选定的GnRH多肽重复(或多聚体)偶联时，白细胞毒素多肽能够授予相关的GnRH成分很高的免疫原性。在这点上，白细胞毒性多肽的作用是在个体的免疫系统中以高度免疫原性形式提供选定的GnRH多聚体的载体蛋白。所以在本发明中构建的嵌合体蛋白可以配制成疫苗组合物，该组合物提供给其中出现的GnRH多肽的免疫原性增强。将白细胞毒素基因与选定的GnRH多肽融合也简化了从表达它的细胞中纯化嵌合体蛋白的过程。
因此，本文举证的是白细胞毒素嵌合体，它包括与不止一个GnRH多肽融合的白细胞毒素。本发明的特定实施方案包括含有与一个或多个GnRH多聚体融合的白细胞毒性多肽的嵌合体，其中所述的多聚体至少具有一个重复的GnRH十肽序列，或至少具有对应于至少一个选定GnRH分子的表位的重复序列单位。另外，选定的GnRH肽序列可以全部相同，或可以对应于不同的衍生物，类似物，突变体或GnRH表位，只要它们保留引发免疫应答的能力。图1A描述了GnRH十肽的代表性核苷酸序列。通过将天然序列中发现的N-末端的焦Glu氨基酸用谷氨酸残基替代修饰个体的GnRH序列。这一特定的替代使分子保留了天然谷氨酸结构但也保留了焦Glu的未带电结构。因此，得到的肽不需要谷氨酸残基的环化，并可以在缺乏实现环化的必要条件时产生。
因为GnRH序列相对较短，它能容易地利用下面详细叙述的合成技术产生。在本发明中，利用白细胞毒素多肽序列授予相关的GnRH多肽(作为载体蛋白)免疫原性，以便帮助在脊椎动物个体中引发对外源GnRH的适当的免疫应答。以这种方式，通过破坏发情周期或精子生成可以利用GnRH免疫接种调节接种个体的生育率。在美国专利号4,975,420中可以发现GnRH的详细讨论。
本发明的特定目的是提供侵入性绝育方法的可依赖和有效的替代方法，侵入性绝育方法目前常用于家养和农场的动物畜牧业，如外科阉割，外科卵巢子宫切除术，和诸如此类。利用本发明构建的白细胞毒素-GnRH嵌合体在脊椎动物个体中免疫抑制繁殖活性提供了有效的替代方法，其中构建体在免疫接种的动物中均一地失活了繁殖活性。在这点上，为了提供成功地替代外科手术方法，对应于最小量的接种，适当的绝育疫苗产品必须均一地失活各个动物的繁殖能力。对于免疫绝育动物群，这一特征特别重要，特别是在需要免疫去雄的雄性小猪以便防止“公猪沾染”的情况中，这种情况是由于雄性小猪的正常功能的睾丸中性类固醇的合成导致的。参见例如，Meloen等人，疫苗(1994)12(8)：741-746。过去开发这些产品的尝试还没有产生均一的结果，因为GnRH肽和/或相关的载体系统的免疫原性不够，并且因此各种过去的基于GnRH的疫苗不能诱导对内源GnRH的足够的免疫应答。
本发明的另一个特定目的是提供降低哺乳动物个体中乳腺癌的发生率的方法，该方法是在疫苗中利用本文产生的白细胞毒素-GnRH融合分子阻止接种个体中GnRH调节的子宫功能如产生子宫激素雌激素和黄体酮。在乳房肿瘤中雌激素和黄体酮的作用已经确定。这些子宫类固醇在癌症的早期是重要的，但一旦乳房肿瘤形成，一些肿瘤就独立于类固醇。参见例如，内分泌教科书，第7版，Wilson等人(1985)68-69页。已知雌激素和黄体酮在狗中也是致癌的，起始时对乳房肿瘤负有责任。
因此，本文关注的白细胞毒素-GnRH多肽嵌合体含有一个或多个GnRH部分，具有多个选定的GnRH多肽序列，以便提供更多的免疫原性GnRH肽抗原。这一特征是基于这样的认识，即内源性蛋白质通常情况下通过如上所述的它们的表位的多聚体化可有效地提供自身免疫原性。更具体地说，本发明的白细胞毒素-GnRH嵌合体的GnRH部分可以含有选定GnRH序列的多个或任意重复，选定GnRH表位的多个或任意重复，或它们的任何可以想象的联合。利用如上所述的技术可以鉴定GnRH表位，或者可以测试GnRH蛋白质的片断的免疫原性和用于组合物中替代整个多肽的活性片断。当不止一个GnRH多聚体包含于嵌合体分子中时，每个GnRH部分可以与分子中包括的其它GnRH部分相同或不同。
图1B描述了本文所用的一个特定的GnRH部分的序列，其中含有丝氨酸和甘氨酸残基的各种联合的三联体氨基酸隔开序列分开了四个分别标明为(1)，(2)，(3)和(4)的GnRH序列。在一个个体的多聚体中，每隔一个的GnRH序列(那些分别表明为(2)和(4))在GnRH十肽的第二个位置含有非保守的氨基酸替代，该替代包括在天然的GnRH序列中发现的His残基位置被Asp残基替代。这样生产的替代GnRH多聚体序列提供了用于本发明的融合蛋白具有高度的免疫原性的GnRH抗原肽。对应于任何单个或多个氨基酸叠加，替代和/或缺失的其它GnRH类似物也受到本文的特别关注，可用于重复或替代的多聚体序列。在一个特定的白细胞毒素GnRH融合体中，将图1B描述的四个拷贝的GnRH部分与白细胞毒素分子融合，以致白细胞毒素分子在它的N-和C-末端与两个拷贝的个体GnRH多聚体侧接。
另外，图1B描述的特定的GnRH部分含有GnRH成分之间的隔开序列。使用本文的选定GnRH多肽之间战略性地使用各种隔开序列使主体的构建体的免疫原性增强。因此，在本发明中，选定的隔开基因可以编码很多种类的一个或多个氨基酸长度的成分。选定的隔开基团可以优选地提供酶切割位点，以致通过体内的蛋白酶(通过APC和诸如此类)可以加工表达的嵌合体以便产生许多多肽，其中的每个至少含有一个起源于载体部分的T细胞表位(白细胞毒素部分)，它们优选地与基本完整的GnRH多肽序列融合。可以构建隔开的基团以致选定的GnRH成分之间的连接区含有免疫个体中明显的外源序列，从而授予相关的GnRH肽的免疫原性增强。另外，可以构建隔开序列以致提供T细胞抗原性，例如那些编码两亲性和/或α螺旋肽序列的序列的那些，这些序列通常在本领域被认作为提供了免疫原性的辅助T细胞表位。根据特定的接种的脊椎动物种类，对这样的隔开序列提供的特定T细胞表位的选择可以变化。虽然举证的特定GnRH部分包括隔开序列，本发明的一个目的也是提供含有直接邻接的GnRH序列的一个或多个多聚体(没有插入隔开序列)。
白细胞毒素-GnRH多肽复合物可以以嵌合体蛋白质形式重组地方便地产生。可以将嵌合体的GnRH部分在5’和/或3’与分子的白细胞毒素部分融合，一个或多个GnRH部分可以定位于白细胞毒素分子的内部的位点，或者嵌合体可以含有在这些位点的GnRH部分的任何联合。编码全长溶血性巴斯德菌A1白细胞毒素的核苷酸序列已经确定。参见例如，Lo，感染免疫学(1987)55：1987-1996；美国专利号5,055,400。另外，本文已经公开了几个突变的白细胞毒素基因的序列。
同样，小猪，小牛和绵羊的GnRH的编码序列已经确定(Murad等人，激素和激素拮抗物，治疗学的药物原理，第6版，(1980))，并且已经克隆了人GnRH的cDNA，以致它的序列已经很好地确立了(Seeburg等人，自然(1984)311：666-668)。已知序列的其它GnRH多肽已经公开，如存在于大马哈鱼和小鸡中的GnRH分子(1986年12月18日公开的国际公开号，WO86/07383)。脊椎动物，特别是哺乳动物，和小猪，小牛，绵羊和人GnRH序列在高度保守的GnRH编码序列是相互相同的。利用本领域已知的重组技术可以克隆，分离需要的白细胞毒素和GnRH基因并连接在一起。参见例如，Sambrook等人，出处同上。
可替代地，通过合成而不是克隆，可以制备编码嵌合体蛋白质的DNA序列。利用特定氨基酸序列的适当密码子可以设计DNA序列。通常，如果该序列将用于表达，可以选择对于目的寄主是优选的密码子。从标准方法制备的交迭的低聚核苷酸组装完整的序列并组装成完整的编码序列。参见例如，Edge，自然(1981)292：756；Nambair等人，科学(1984)223：1299；Jay等人，生物化学杂志(1984)259：6311。
一旦已经制备或分离了嵌合体蛋白质的编码序列，它们能够克隆进任何适当的载体或复制子。许多克隆载体是本领域技术人员已知的。适当的克隆载体的选择是机会的问题。克隆的重组DNA载体和它们转化的寄主细胞的例子包括λ噬菌体(大肠杆菌)，pBR322(大肠杆菌)，pACYC177(大肠杆菌)，pKT230(革兰氏阴性细菌)，pGV106(革兰氏阴性细菌)，pLAFR1(革兰氏阴性细菌)，pME290(非大肠杆菌-革兰氏阴性细菌)，pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)，pBD9(芽孢杆菌)，pIJ61(链霉菌)，pUC6(链霉菌)，YIp5(酵母属)，YCp19(酵母属)和小牛乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)。通常参见，DNA克隆，第I和II版，出处同上，T.Maniatis等人，出处同上；B.Perbal，出处同上。
可以将融合基因置于启动子，核糖体结合位点(用于细菌表达)和非强制性地操纵子(本文总称为“对照”元素)的控制下，以致编码嵌合体蛋白质的DNA序列在含有这一表达构建体的载体转化的寄主细胞中转录成RNA。编码序列可以或可以不含有信号肽或引导序列。利用，天然溶血性巴斯德菌启动子，大肠杆菌tac启动子或蛋白质A基因(spc)启动子和信号序列可以表达本发明的嵌合蛋白质。细菌寄主在翻译后的加工过程中可以除去引导序列。参见例如，美国专利号4,431,739；4,425,437；4,338,397。
除了控制序列，可以如人所愿地加入调节序列，它可用于调节与寄主细胞生长相关的蛋白质序列的表达。调节序列是本领域技术人员已知的。例子包括那些应答化学或物理刺激包括调节化合物的存在，导致基因表达的启动和关闭的，载体中也可以存在其它类型的调节元素，例如增强子序列。
构建表达载体以致特定的融合体编码序列定位于含有适当的调节序列的载体中，与控制序列相关的编码序列的定位和取向是该编码序列在控制序列的“控制”下转录(即，在控制序列中结合DNA分子的RNA聚合酶转录编码序列)。修饰编码需要的特定嵌合体蛋白的序列可以如人所愿地达到这一目的。例如，在某些情况下，修饰序列是必须的，能使它附着于适当取向的控制序列；即，维持读码框架。控制序列和其它调节序列可以在插入载体如如上所述的克隆载体中之前与编码序列连接。可替代地，编码序列可以直接克隆进入表达载体，该载体已经含有控制序列和适当的限制位点。
在一些情况中，可以如人所愿地加入一些序列，这些序列导致从寄主有机体分泌多肽，随后切割分泌信号。也可以如人所愿地生产需要的嵌合体蛋白质的突变体或类似物。通过缺失部分编码蛋白质的序列，通过插入序列，和/或通过替代序列内的一个或多个核苷酸可以制备突变体或类似物。修饰核苷酸序列的技术如特异于位点的诱变是本领域技术人员已知的。参见，例如，T.Maniatis等人，出处同上，DNA克隆，第I和II卷，出处同上；核酸杂交，出处同上。
许多原核生物表达载体是本领域已知的。参见例如，美国专利号4,440,859；4,436,815；4,431,740；4,431,739；4,428,941；4,425,437；4,418,149；4,411,994；4,366,246；4,342,832；同时参见英国专利申请GB 2,121,054；GB2,008,123；GB2,007,675；和欧洲专利申请103,395。酵母表达载体也是本领域已知的。参见例如，美国专利号，4,446,235；4,443,539；4,430,428；也参见欧洲专利申请，103,409；100,561；96,491。
根据表达系统和选定的寄主，本发明的蛋白质是通过如上所述的表达载体转化的寄主细胞在各种条件下生长时产生的，从而表达了需要的蛋白质。然后从寄主细胞分离嵌合体蛋白质并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，蛋白质可以直接从培养基中纯化。如果蛋白质没有分泌，可从细胞溶菌物中分离。适当的生长条件和回收方法的选择是本领域技术范围内的。
本发明的嵌合体蛋白质也可以通过化学合成生产，如根据确定的氨基酸序列合成固相肽。这些方法是本领域技术人员已知的。参见例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第二版，Pierce化学公司，Rockford，IL(1984)和G，Barany和R.B.Merrifield，肽：分析，合成，生物学，作者E.Gross和J.Meienhofer，第二卷，学术出版社，纽约(1980)3-234，固相肽合成技术；和M.Bodansky，肽合成原理，Springer-Verlag，Berlin(1984)和E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，肽：分析，合成，生物学，出处同上，1卷，经典的溶液合成。
通过包括本嵌合体白细胞毒素GnRH蛋白质的疫苗组合物的给药，可以给个体接种以抗内源GnRH。在接种之前，它可以如人所愿地进一步增强特定的嵌合体蛋白质的免疫原性。这可以通过本领域技术人员已知的几种方法中的任何一个完成。例如，将白细胞毒素GnRH多肽融合体蛋白质与次级载体连接用于给药。例如，可以将片断与大分子载体共轭。适当的载体通常是大的，慢慢代谢的大分子，如：蛋白质，多糖，如葡聚糖，琼脂糖，纤维素，纤维素小珠和诸如此类；多聚体氨基酸如聚谷氨酸，聚赖氨酸，和诸如此类；氨基酸共聚物；和失活的病毒颗粒。特别有用的蛋白质底物是血清白蛋白，匙孔血蓝蛋白，免疫球蛋白分子，甲状腺球蛋白，卵清蛋白和其它本领域技术人员已知的蛋白质。
该蛋白质底物可以其天然形式使用或者它们的功能基团可以通过例如，赖氨酸残基的琥珀酰化或与Cys-硫代内酯反应进行修饰。通过例如，将氨基官能团与2-亚胺thiolane或3-(4-二硫代吡啶基丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应可以在载体(或选定的GnRH多肽)中掺入硫氢基。为了肽的附着也可以修饰适当的载体掺入间隔臂(如六亚甲基二胺或其它同样大小的双功能分子)。
如美国专利号5,071,651中公开的本发明的嵌合体蛋白的其它适当的载体包括轮状病毒的VP6多肽，或其功能片断。同时使用的是病毒蛋白的融合产物和白细胞毒素GnRH免疫原，其中融合产物是通过美国专利号4,722,840公开的方法制造的。仍然是其它适当的载体包括细胞如淋巴细胞，因为这一形式的呈现模仿了在个体中的呈现的天然方式，产生了免疫接种状态。可替代地，本发明的融合蛋白可以与红细胞偶联，优选地主体自身的红细胞。将肽与蛋白质或细胞偶联的方法是本领域技术人员已知的。
本发明的嵌合体蛋白也可以通过表达它的载体病毒给药。将在本文中使用的载体病毒包括，但不限于，牛痘和其它痘病毒，腺病毒和疱疹病毒。通过实施例，可以如下构建表达新嵌合体蛋白的牛病毒重组体。首先将编码特定的白细胞毒素GnRH嵌合体蛋白的DNA插入适当的载体，使它与牛痘启动子和侧接的牛痘DNA序列如编码胸苷激酶(TK)的序列邻接。然后将这一载体用于转染牛痘自发感染的细胞。同源重组的作用是将牛痘启动子和编码本发明的嵌合体蛋白的基因插入病毒基因组。通过在存在5-溴脱氧尿苷时培养细胞挑选病毒抗性噬菌斑和选择得到的TK重组体。
通过单独给药，或与药物可接受载体或赋形剂混合，也可以利用本发明的嵌合体蛋白免疫个体。通常，以可注射的液体溶液或悬浮液制备疫苗，也可以制备在注射之前适于在液体载体中制成溶液或悬浮液的固体形式。也可以将制剂乳化，或将活性成分包裹在脂质体载体中成为胶囊。活性免疫原成分经常与含有赋形剂的载体混合，该赋形剂是药学可接受并与活性成分相容的。适当的载体例如，水，盐，葡萄糖，甘油，乙醇，或诸如此类，和它们的联合。另外，如果需要，载体可以含有最小量的辅助物质，如加湿剂或乳化剂，pH缓冲试剂，或助剂，它们能增强疫苗的效果。助剂可以包括例如，胞壁酰二肽，avridine，氢氧化铝，油，皂苷，和其它本领域已知的物质。制备这样的剂量形式的方法是本领域技术人员已知的，或将明了的。参见例如，Renington药物科学，Mack出版公司，Easton，宾夕法尼亚，第18版，1990。在然后事件中给药的组合物或配方将含有定量的蛋白质适于待治疗的个体中达到需要的免疫接种状态。
适于其它给药方式的其它疫苗配方包括栓剂，和有些情况下，气雾剂，鼻内的，口服的配方，和持续释放的配方。对于栓剂，组合物将包括传统的结合剂和载体如，聚碱性乙二醇，或甘油三酯。这样的栓剂可以从含有活性成分的混合物配制，活性成分的范围在约0.5％到约10％(w/w)，优选地约1％到约2％。口服载体包括正常使用的赋形剂，如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，镁，硬脂酸，纤维素糖精钠，碳酸镁，和诸如此类。这些口服疫苗组合物可以采取溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，持续释放的配方，或粉末的形式制备，并含有约1％到约30％的活性成分，优选地约2％到约20％。
鼻内配方通常包括既不引起刺激鼻粘膜，也不明显干扰纤毛功能的载体。稀释剂如水，水状盐溶液或其它已知物质可以用于本发明。鼻配方也可以含有防腐剂，如，但不限于，氯丁醇新洁而灭。可以存在表面活性剂以便增强鼻粘膜对主体蛋白的吸收。
在载体如脂质体，非吸收不渗透的多聚体如乙烯乙烯基乙酸共聚物和Hytrel_共聚物，可膨胀的多聚体如水凝胶，或可吸收的多聚体如胶原和某些聚酸或聚酯如那些用于制作可吸收的缝线中掺入嵌合体蛋白质配制控制或持续释放的制剂。嵌合体蛋白也可以利用植入小泵提供，这是本领域已知的。
另外，嵌合体蛋白(或它的复合物)可以配制成中性或盐形式的疫苗组合物。药物可接受盐包括酸加成的盐(与活性多肽的游离氨基一起形成)，和与无机酸一起形成的，无机酸如盐酸或磷酸，或如有机酸，如乙酸，草酸，酒石酸，苦杏仁酸，和诸如此类。从游离羧基基团形成的盐也可以起源于无机碱，如氢氧化钠，钾，铵，钙，或铁，和有机碱如异丙胺，三甲胺，2-乙胺乙醇，组胺，普鲁卡因和诸如此类。
为了免疫接种个体，通常是以适当的载体肌肉内注射而将选定的GnRH白细胞毒素嵌合体非肠道给药。但是，其它给药方式，如皮下，静脉内注射和鼻内释放也是可接受的。可注射的疫苗配方将含有载体中的有效量的活性成分，本领域技术人员很容易确定准确的量。通常活性成分的范围是组合物的约1％到约95％(w/w)。如果适当的话，甚至更高或更低。给药的量根据待治疗的动物，动物的免疫系统合成抗体的能力，和需要的保护程度而变化。
当给药时，对于本发明的疫苗配方，每毫升注射溶液中约1微克到1毫克，通常5微克到200微克GnRH多肽应该能产生免疫应答。在这点上，根据构建那些分子而选择的特定的白细胞毒素和GnRH多肽成分，本发明的疫苗配方中的白细胞毒素-GnRH抗原中的GnRH与白细胞毒素的比例可以变化。更具体地说，在用于本发明条件下生产疫苗配方的白细胞毒素GnRH多肽中，每个融合分子中将有约1到40％GnRH，优选地约3到30％，最优选地是约7到27％GnRH多肽。LKT-GnRH抗原中存在的GnRH的百分数的增加减少了总抗原的量，这个量是为了引发B细胞对GnRH的有效的应答而必须对个体给药的。通过常规试验确定剂量应答曲线，本领域的普通技术人员可以容易地确定有效剂量。免疫接种个体时以至少一个剂量，优选地两个剂量的特定白细胞毒素GnRH多肽给药。另外，可以以保持免疫状态需要的剂量给动物给药。
下面是实施本发明的特定的实施方案的实施例。提供实施例只是为了说明的目的，并不打算以任何方式限制本发明的范围。
c.实验
材料和方法
从商业来源购买酶，根据制造商的指导说明使用。同样从商业来源购买放射性核苷酸和硝酸纤维素滤膜。
在克隆DNA片断时，除了特别注明，所有DNA操作都按照标准方法进行。参见Sambrook等人，出处同上，限制性酶，T4 DNA连接酶，大肠杆菌，DNA聚合酶I，Klenow片断，和其它生物学试剂都从商品供应商购买，根据制造商的指导说明使用。在琼脂糖凝胶上分离双链DNA片断。
通过标准技术分别在pUC13和λ噬菌体gt11中制备cDNA和基因组文库，参见DNA克隆：第I和II卷，出处同上。
从死于肺炎巴士德菌病的小牛的肺中分离溶血性巴斯德菌生物型A，血清型1(“ A1”)菌株B122，并储藏于-70℃的去纤维蛋白的血液中。在血液琼脂平板或脑心泡制的肉汤(Difco实验室，低特律，MI)中进行常规的繁殖，培养基补充5％(v/v)马血清(Gibco加拿大公司，Burlington，加拿大)。所有培养物在37℃下温育。
实施例1
分离溶血性巴斯德菌白细胞毒素基因
为了分离白细胞毒素基因，利用标准方法构建溶血性巴斯德菌A1(菌株B122)的基因文库。参见，Lo等人，感染免疫学，出处同上，DNA克隆：I和II卷出处同上；和Sambrook等人，出处同上。在质粒载体pUC13中构建基因组文库，并在λgt11噬菌体中构建DNA文库。将得到的克隆用于转化大肠杆菌，合并单个菌落，筛选与来自小牛的血清的反应，小牛已经幸免于溶血性巴斯德菌感染，并且已经利用浓缩的溶血性巴斯德菌的培养上清液加强接种以便增强抗白细胞毒素抗体水平。筛选阳性菌落生产白细胞毒素的能力，方法是用小牛嗜中性粒细胞温育细胞溶菌物和随后测量从后者释放的乳酸脱氢酶。
鉴定了几个阳性菌落，通过限制性内切酶图谱定位分析这些重组体。一个克隆似乎与前面克隆的白细胞毒素基因相同。参见Lo等人，感染免疫学，出处同上。为了证实这一点，再克隆更小的片断，比较限制性图谱。可以确定已经克隆的DNA约为4kbp。为了分离约8kb的全长的重组体进行染色体步行(5’到3’方向)分离过逐渐较大的克隆。最后的构建体命名为pAA114。这一构建体含有整个白细胞毒性基因序列。
利用DNA聚合酶I的Klenow片断加三磷酸核苷酸处理含有整个白细胞毒素基因的pAA114的1ktA，MaeI限制性核酸内切酶片断，并连接到克隆载体pUC13的SmaI位点。这一质粒命名为pAA179。由这一质粒，在用SmaI消化的基于ptac的载体pGH432:lacI中产生两个表达构建体。一个是pAA342，由1ktA基因的5’-AhaIII片断组成。而另一个是pAA345，含有如上所述的整个MaeI片断。克隆pAA345中以高水平表达截短的白细胞毒素肽，而pAA345非常低水平表达全长白细胞毒素。所以，1ktA基因的3’末端(来自pAA345的StyI BamHI片断)连接到StyI BamHI消化的pAA342上，产生质粒pAA352。图2显示了pAA352的结构，图3显示了从pAA352构建体(下文称为LKT352)产生的溶血性巴斯德菌白细胞毒素的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。
pAA114表达了几个截短形式的白细胞毒素基因。这些截短的形式与B-半乳糖苷酶(lacZ)基因融合。从pAA114分离纯化的限制片断(分别为1.0kb和2.1kb)形式的来自EcoRV Pst1的双链消化物的两个LTX1.1和LTX3.2的片断。将这些片断克隆进入克隆载体pTZ18R，该质粒已经利用HincII和Pst1消化。利用得到的载体，命名为pLTX3P.1转化大肠杆菌菌株JM105。通过在含有氨苄青霉素加Xgal和IPTG的培养基上涂板鉴定转化的细胞。蓝色菌落标志着有功能性的lacZ基因的存在。通过限制性核酸内切酶消化分析来自转化细胞的DNA，发现含有白细胞毒素基因的5’末端(1ktC和1ktA)。
将白细胞毒素EcoRV/Pst1 5’片断(来自pLTX3P.1)亚克隆到克隆载体pBR325，该质粒已经利用EcoR1和Pst1消化。pBR325质粒也含有天然白细胞毒素启动子(从pLTX3P.1得到)和无启动子的，全长lacZ基因。利用得到的构建体转化大肠杆菌JM105，从Xgal琼脂板分离蓝色菌落。将新的构建体命名为pAA101(ATCC No.67883)并描述在图10中。图11描述了来自pAA101构建体(下文称为LKT101)产生的溶血性巴斯德菌白细胞毒素的推测的氨基酸序列。
实施例2
LKT-GnRH融合体的构建
如下构建了代表性的LKT-GnRH融合体。利用标准的亚磷酰胺化学法，在Pharmacia基因组装器上构建含有对应于单个拷贝的GnRH和GnRH的四个重复的序列的低聚核苷酸。图1A和1B显示了这些低聚核苷酸的序列。将主体低聚核苷酸退火，连接到载体pAA352(ATCC No.68283，和如上所述)，该质粒已经利用限制性核酸内切酶BamHI消化。这一质粒含有溶血性巴斯德菌白细胞毒素基因。利用连接的DNA转化大肠杆菌菌株MH3000。提供限制性内切酶图谱定位鉴定含有低聚核苷酸插入片断的转化体。
通过退火四个拷贝的GnRH低聚核苷酸且将它们连接到载体制备8个拷贝GnRH串联重复序列，其中载体已经利用限制性核酸内切酶BamHI消化。当插入时，将低聚物设计为使上游的BamHI位点残缺，保证插入的低聚物的附加拷贝定位于适当的读码框架中。图1B显示了个体的低聚核苷酸的序列。然后，分离来自大肠杆菌MH3000菌株的质粒DNA，并用于转化菌株JM105。将重组质粒命名为pCB113(LKT352：4拷贝GnRH，ATCC入藏号：69749和pCB112(LKT352：8个拷贝的GnRH)。图4显示了重组质粒pCB113，质粒pCB112与pCB113相同，不同的是如上所述多重拷贝的GnRH序列(对应于图1B的低聚物)插入了两次。图5显示了pCB113的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列。重组LKT-GnRH融合体pCB112的核苷酸序列是相同的，不同的是多重拷贝的GnRH序列插入了两次。
实施例3
构建缩短的LKT载体肽
从质粒pAA352中存在的重组基因构建缩短的重组白细胞毒性肽变体(如上所述)。通过从如下的重组LKT基因中缺失约1300bp长度的内部DNA片断产生缩短的LKT基因。
用限制性酶BstB1(新英格兰实验室)消化质粒pCB113，(ATCC登记号，69749)，该质粒包括与四个拷贝的GnRH多肽融合的LKT352多肽。然后利用绿豆核酸酶(Pharmacia)消化得到的线性质粒，以便除去由BstB1消化产生的单链的突出末端。然后利用限制性酶Nae1(新英格兰实验室)消化平齐化的DNA，将消化的DNA加载到1％的琼脂糖凝胶上，在凝胶上通过电泳分离DNA片断。分离出约6190bp的大DNA片断，并利用Gene Clean试剂盒(Bio 101)从琼脂糖凝胶中纯化，利用T4噬菌体DNA连接酶(Pharmacia)允许将纯化的片断自身连接。将得到的连接混合物用于转化感受态大肠杆菌JM105细胞，由它们产生分子量约为57千道尔顿的凝聚体蛋白质的能力鉴定阳性克隆。将这样形成的重组质粒命名为pCB111，(ATCC登记号，69748)，并产生缩短的白细胞毒素多肽(下文中称为LKT111)，该多肽与四个拷贝的GnRH多肽融合。PCB111的结构显示于附图6。质粒pCB114与pCB111相同，不同的是多重拷贝的GnRH序列(对应于图1B的低聚物)插入了两次。图7显示了pCB111的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列，pCB114的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列是相同的，不同的是多重拷贝的GnRH序列插入了两次。
通过噬菌体T7聚合酶测序试剂盒(Pharmacia)进行测序已经证明了个体克隆的连接融合点的核苷酸序列。图8显示了这些融合点的核苷酸序列。
实施例4
构建含有8个拷贝的氨基末端和羧基末端
GnRH多聚体的LKT-GnRH融合体
重组LKT-GnRH融合体分子含有8个拷贝的GnRH多聚体，一个排列在LKT111的N’末端，其它排列在LKT111的C’末端，从pCB114质粒得到的LKT-GnRH融合体序列构建可以这样融合体分子，方法是将GnRH序列的多重拷贝(对应于图1B的低聚物)在LKT111编码序列的5’末端连接两次。将含有下面的核苷酸序列：5’-ATGGCTACTGTTATAGATCGATCT-3’的合成核酸分子与多个拷贝的GnRH序列的5’末端连接。合成核酸分子编码8个氨基酸的序列(Met-Ala-Thr-Val-Ile-Asp-Arg-Ser)。得到的重组分子以5’到3’方向给定的顺序含有：合成核酸分子；编码开始8个拷贝的GnRH的核苷酸序列；编码缩短的LKT肽(LKT111)的核苷酸序列；和编码第二个8个拷贝的GnRH多聚体的核苷酸序列。
将重组分子环化，利用得到的分子转化感受态大肠杆菌JM105细胞。由生产分子量约为74千道尔顿的凝聚体蛋白质的能力鉴定阳性克隆。将这样形成的重组质粒命名为pCB122，它产生了与16个拷贝的GnRH多肽融合的LKT111多肽。图9-1到9-6显示了pCB122的重组LKT-GnRH融合体的核苷酸序列。
实施例5
纯化LKT-抗原融合体
利用下面的方法可以纯化来自实施例2，3和4的重组LKT-GnRH融合体。对于每个融合体，将5到10个转化大肠杆菌菌株的菌落接种到10毫升用100微克/毫升氨苄青霉素补充的TB肉汤，并在37℃，在G10摇床上，在220rpm温育6小时。将4毫升培养物稀释到2个含有400毫升TB肉汤+氨苄青霉素的Fernbach烧瓶的每一个中，并如上所述温育过夜。通过以4000rpm，在500毫升体积的聚丙烯瓶中，在Sorvall GS3离心机中离心10分钟收集细胞。将沉淀在含有预热到37℃的氨苄青霉素的等体积的TB肉汤(即2×400毫升)中再悬浮，并将细胞如上所述温育2小时。
为了诱导合成重组融合体蛋白，在每个培养物中加入3.2毫升异丙基-β，D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，Gibco/BRL)，溶解于水的500毫摩尔浓度(最后浓度为4毫摩尔浓度)。将培养物温育2小时。如上所述，通过离心收集细胞，再悬浮于30毫升的50毫摩尔浓度Tris-HCl，25％(w/v)蔗糖，pH8.0，冷冻到-70℃。在-70℃保持60分钟后，在室温下熔化冷冻的细胞，加入5毫升溶菌酶(Sigma，溶于250毫摩尔浓度Tris-HCl，pH8.0的20毫克/毫升)，高速旋转混合物10秒，然后置于冰上15分钟。然后在1000毫升烧瓶中的500毫升溶解缓冲液中加入细胞，用2个抽吸管搅拌混合。将含有溶解细胞悬浮液的烧瓶置于冰上并用超声波处理2.5分钟(5-30秒脉冲，之间1分钟冷却)，仪器是Braun超声波处理器，大探针，设定在100瓦的动力。将等体积的溶液置于Teflon SS34离心管只，以10,000rpm，在Sorvall SS34离心机中离心20分钟。通过高速旋转，重复离心步骤，将沉淀再悬浮于100毫升无菌重蒸水中。丢弃上清液，将沉淀合并在20毫升的10毫摩尔浓度Tris-HCl，150毫摩尔浓度氯化钠，pH8.0(Tris缓冲盐)中，在-20℃冷冻悬浮液过夜。
在室温解冻重组悬浮液，加入溶于Tris缓冲盐中的100毫升8摩尔的盐酸胍(Sigma)中，并剧烈混合。在瓶中加入磁搅拌棒，在室温下混合溶解的样品30分钟。将溶液转移到2000毫升的Erlenmeyer烧瓶中，快速加入1200毫升Tris-缓冲盐。在室温下再搅拌这一混合物2小时。将500毫升等分试样置于透析袋中(Spectrum，63.7毫米直径，6,000-8,000mw截止分子量，#132670，来自Fisher scientific)，将这些置于4，000毫升含有3,500毫升Tris-缓冲盐+0.5摩尔浓度盐酸胍的烧瓶中。将烧瓶置于4℃的室内，在磁搅拌器上搅拌过夜，然后用Tris缓冲盐+0.1摩尔浓度盐酸胍替代透析缓冲液，继续透析12小时。然后用Tris-缓冲盐+0.05摩尔浓度盐酸胍替代缓冲盐，继续透析过夜。用Tris缓冲盐(没有胍)替代缓冲液，继续透析12小时。重复3次以上。将最后的溶液倒入2000毫升塑料园瓶中，加入13毫升100毫摩尔浓度PMSF(在乙醇中)，以便抑制蛋白酶活性。将溶液以100毫升的等分试样储存于-20℃。
为了证实已经分离融合蛋白，将每种制剂的等分试样在重蒸水中稀释20倍，并与等体积的SDS-PAGE样品缓冲液混合，置于沸水浴5分钟，在12％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。同时电泳的有重组白细胞毒素对照。
所有融合蛋白以内含体形式高水平表达。根据融合蛋白的DNA序列推测的分子量是104，869(LKT352::4拷贝的GnRH，来自pCB113；110，392(LKT352::8拷贝GnRH，来自pCB112)；57，542(LKT111::4拷贝的GnRH，来自pCB111)；63，241(LKT111::8拷贝GnRH，来自pCB14)；和73，886(8拷贝GnRH::LKT111::8拷贝GnRH，来自pCB122)。重组LKT352分子的推测分子量是99,338，重组LKT111分子的推测分子量是51,843。
实施例6
LKT-GnRH融合体的体内免疫活性
为了测试LKT-GnRH融合体诱导体内抗GnRH免疫应答的能力，和将这一应答与对其它GnRH载体共轭物的应答比较，进行了下面的接种试验。利用了三组，每组8个雄性猪，约8星期大(35-50公斤)，它们是没有特异的病原体的。将动物保持在最小的疾病条件下，在试验的0天和21天接种，接种的配方如下：
组1--含有盐水的安慰剂，盐水是在含有15毫克二甲基二十八烷基铵溴(DDA)(2毫升)的Emulsigen Plus助剂中配制的；
组2--在同样的助剂(2毫升)中配制的LKT352-GnRH(如前面的实施例中所述制备的250微克LKT)；
组3--VP6-GnRH，在同样的助剂(2毫升)中配制得到0.5微克VP6和5微克GnRH。如美国专利号5,071,651中所述，利用其中所述的结合肽制备VP6制剂。
在0，21和35天，取血样，允许凝块，在1500g离心，除去血清。利用Silversides等人，免疫学再杂志(1985)7：171-184的RIA方法测量抗GnRH的血清抗体效价。
这一试验的结果表明只有那些用LKT352-GnRH配方免疫接种的动物产生明显的抗GnRH效价(效价＞1∶70)。安慰剂和VP6-GnRH组都不产生抗GnRH效价。如上所述，诱导抗激素效价需要用与其它载体蛋白共轭的100微克以上的剂量的GnRH多次接种。这些结果表明LKT-GnRH载体系统提供了比过去的载体系统大大增强的免疫原。
实施例7
与LKT连接的多个任意GnRH重复的体内免疫效果
为了测试含有多个GnRH多肽重复的重组LKT-GnRH融合体蛋白在体内诱导抗GnRH免疫应答的能力，进行了下面的接种试验。如上所述制备了含有质粒pCB113和pCB175(分别含有4和8个拷贝的与LKT352连接的GnRH)，和具有1个拷贝的与LKT352连接的GnRH的质粒的大肠杆菌培养物。将来自上面每个培养物的疫苗配制含有同等的溶解于0.2毫升的Emulsigen Plus的5微克GnRH。每隔23天给三组10个雌性小鼠皮下注射两次，在初次注射后23，35和44天收集血样。利用标准放射性免疫测试方法以1∶100和1∶1000最后稀释液测量抗GnRH的血清抗体效价。如果结合的碘化GnRH小于5％，认为抗体是不可检测的。表1概括了这样得到的抗体效价。
这一研究的结果表明等剂量的多个串联重复提供的GnRH(4或8个拷贝)比单个拷贝的GnRH产生的抗体明显增加(如通过结合碘化的天然GnRH测量的)。另外，上面的结果表明含有与LKT52连接的4个拷贝的GnRH串联重复的融合体蛋白表示了有效的免疫原GnRH抗原形式，虽然剂量或个体种类可以影响免疫原性。
表1
    采样日     组1   组2     组3
    LKT352::1拷贝GnRH   LKT352::4拷贝GnRH     LKT352::8拷贝GnRH
    应答数     平均应答(％)*   应答数   平均应答(％)*     应答数     平均应答(％)*
    1∶1000     1∶1000     1∶1000     1∶1000     1∶1000     1∶1000   1∶1000    1∶1000     1∶1000     1∶1000     1∶1000     1∶1000
    23     0     0     3     1   16    9     2     0     33
35 2 2 45 20 9 9 75 30 7 5 48 41
    44     2     2     60     39     10     10   55    43     8     7     57     46
*平均应答是只有那些结合超过5％的那些动物的结合I125-GnRH的平均结合。
实施例8
LKT352::GnRH和LKT111::GnRH融合体的
体内免疫活性和生物学效果
为了测试含有多个串联重复的GnRH(与LKT352或LKT111连接)的融合体蛋白质在体内引发抗GnRH免疫应答的能力，和证实体内的生物学效果，进行了下面的接种试验。如上所述制备了含有质粒pCB113和pCB111(分别与LKT352或LKT111连接的4个拷贝的GnRH)的大肠杆菌培养物。将来自上面各个培养物的疫苗配制成含有溶于0.2毫升的VSA-3助剂(修饰的Emulsigen Plus助剂)的5微克GnRH的当量，同时制备的有含有0.2毫升的助剂的对照疫苗。间隔21天给予三组各5个雄性的小鼠两次皮下注射，在5-6星期大的时候给予第一次注射(0天)。在49天杀死个体。
利用标准的放射性免疫测试方法在1∶1000血清稀释度，测量抗GnRH抗体效价测量个体GnRH-LKT融合体的免疫活性。通过标准的放射性免疫测量血清睾酮水平，其敏感度为25皮克/毫升，定量测定GnRH-LKT融合体的生物学效果，称重睾丸组织并进行组织学检测。表2概括了这一试验的结果。
在试验中，所有注射GnRH:LKT抗原的动物个体具有容易检测的抗体水平；但是，LKT111::GnRH融合体(来自pCB111质粒)显示了如由应答和效价的均一性指明的优越的免疫原性。血清睾酮以搏动方式分泌(睾丸的间质细胞产生)，因此，在正常的动物个体中可以预期血清水平的低值并且变化特别大。在试验中，对照组(接受0.2毫升辅助疫苗注射)具有正常的睾酮水平，而两组处理个体基本没有检测到血清睾酮。
另外在试验中，对睾丸组织的组织学评估发现不同程度的间质细胞萎缩，减小了精细管直径和干扰了被治疗个体中的精子生成；但是，治疗动物中睾丸重量仍然接近正常，甚至存在高抗GnRH抗体效价时，虽然在接受LKT111::4个拷贝的GnRH融合体的5个个体中有2个有睾丸抑制的明显证据。
因此，这些结果显示与LKT352或LKT111连接的多个拷贝的GnRH含有潜在的免疫原；另外表明的是，用本融合蛋白接种引发了抗体的产生，该抗体能够中和体内的内源GnRH，并且在接受这样的接种的动物个体中伴随的体内生物学效果是明显的。
表2
 组1   组2    组3
  动物  对照   5微克LKT352::4拷贝GnRH    5微克LKT111::4拷贝GnRH
 抗体效价*   睾丸Wt(毫克)    血清睾酮+   抗体效价*     睾丸Wt(毫克)    血清睾酮+    抗体效价*     睾丸Wt(毫克)     血清睾酮+
  1  7.0   252    .04   73.0     282    .13    75.0     163     .00
  2  4.0   327    .18   14.0     334    .10    59.0     296     .07
  3  0.0   276    2.73   18.0     254    .03    54.0     260     .24
  4  0.0   220    .36   55.0     222    .05    66.0     265     .03
  5  1.0   232    1.44   61.0     226    .19    64.0     50     .00
  平均值  2.4   261    .95   44     263    .10    64     206     .07
  标准误差  1.4   19    .51   12     21    .03    4     45     .04
*1∶1000血清稀释度时I125 GnRH的结合％+纳克/毫升
实施例9
在小猪个体中LKT::GnRH融合体的体内免疫活性
为了测试含有多个串联GnRH重复(与LKT352或LKT111连接)融合体蛋白在小猪个体体内引发抗GnRH免疫应答的能力，进行下面的接种试验。如上所述制备了含有质粒pCB113，pCB111，pCB175和pCB114(分别是LKT352::4个拷贝GnRH，LKT111::4个拷贝的GnRH，LKT352::8个拷贝GnRH，和LKT111::8个拷贝GnRH)的大肠杆菌培养物。将来自上面每个培养物的疫苗配制成含有同等的50微克GnRH，并溶解于2.0毫升体积的VSA-3助剂中给药。在0天对4组各5个雄性和5个雌性的35天大(0天)的刚断奶的小猪注射，在试验的21天再注射。在0，21和35天收集血样，利用标准放射性免疫测试在最后稀释度1∶1000时测量抗GnRH抗体的效价，表3概括了测试结果。
在试验中，在任何个体中，在接种之前，检测不到抗GnRH抗体，但在35天时大多数个体中容易地检测到该抗体(在治疗组4中一个个体死于与治疗无关的感染)。这一试验中的结果表明含有与LKT352或LKT111载体多肽连接的多个GnRH重复的融合蛋白形成小猪个体中有用的免疫原。根据十肽GnRH(1,200)，LKT111多肽(52,000)和LKT352多肽(100,000)的推测分子量，LKT-GnRH抗原融合体中GnRH的百分数如下：4.9％(LKT352::4个拷贝的GnRH)；8.5％(1kt111::4个拷贝的GnRH)；9.3％(LKT352::8个拷贝的GnRH)和15.7％(LKT111::8个拷贝的GnRH)。因此，这样得到的实际结果表明通过利用含有LKT111多肽载体的LKT-GnRH融合体，给个体给药的全部抗原(LRt-GnRH)的量可以减半(与利用LKT352载体多肽系统的疫苗组合物比较)，但得到同等的抗GnRH应答。
表3
  动物数     组1     组2     组3     组4
    LKT352::4拷贝GnRH 50微克     LKT 111::4拷贝GnRH 50微克     LKT352::8拷贝GnRH 50微克     LKT111::8拷贝GnRH50微克
    35天1∶1000稀释     35天1∶1000稀释     35天1∶1000稀释     35天1∶1000稀释
  1     ♂47.7     ♀46.0     ♂68.3     ♂51.0
  2     ♀50.3     ♂71.6     ♂65.1     ♂31.7
  3     ♀66.0     ♀21.4     ♀50.7     ♀35.7
  4     ♀70.2     ♂46.2     ♂4.7     ♀65.9
  5     ♂17.3     ♀48.9     ♀38.3     ♀
  6     ♂18.3     ♂69.4     ♀17.4     ♂11.3
  7     ♀14.7     ♂47.9     ♀51.4     ♀28.3
  8     ♂37.0     ♀44.4     ♂18.0     ♂43.0
  9     ♂26.0     ♂70.8     ♂83.5     ♀78.7
  10     ♀2.7     ♀37.8     ♀24.2     ♂55.9
  平均值     35.0     50.4     42.2     44.6
  标准偏差     7.3     5.1     8.1     6.9
  应答     9/10     10/10     9/10     9/9
实施例10
对LKT111::8个拷贝的GnRH免疫去雄的疫苗效果进行评估
为了对含有LKT111::8个拷贝的GnRH融合蛋白的疫苗制剂的效果和商业用途，进行了下面的接种试验。如上所述制备了含有质粒pCB114(LKT111::8个拷贝GnRH)的大肠杆菌培养物。制备来自上面的培养物的疫苗配方，它含有同等的50微克GnRH。将疫苗配方溶解于2.5毫升终体积的VSA-3助剂中给药。建立3个治疗组，每个含有30个雄性小猪(公猪)。3个组包括30个阉猪(公猪在性成熟之前外科去雄)，30个对照公猪和30个免疫去雄的猪(通过GnRH免疫原接种去雄的公猪)。在断奶时(21天)，用安慰剂(仅VSA-3助剂)注射阉猪和对照公猪组动物，而用上面所述的疫苗配方注射免疫去雄的组。当动物在屠宰之前3星期达到预定重量时，给予免疫去势组加强剂量的疫苗，而阉猪和对照公猪组再次用安慰剂注射。测量包括抗GnRH的血清抗体效价，血液睾酮水平，尸体特征，动物行为，饲料效率，增重速度，和唾液腺体和身体脂肪雄甾酮水平(作为公猪沾染的措施)。
(a)血清抗GnRH抗体效价：
利用标准的放射性免疫测试方法，在1∶5000血清稀释度时通过测量抗GnRH抗体效价测量8个拷贝的GnRH-LKT融合体疫苗配方的免疫活性。图12提供了在3个实验组中的血清抗体效价的比较。可以看到，在免疫去雄(接种)的公猪中抗GnRH抗体效价明显提高，并在接种后20天内保持在明显超过产生生物学效果(图12中的约10到20％的结合率)需要的最小量的水平。
(b)免疫去势疫苗对性腺大小的生物学影响：
通过比较来自对照公猪和免疫去雄(接种)的公猪的性腺的重量和测量结果，和通过测量和比较这两实验组的血清睾酮水平可以确定8拷贝GnRH-LKT融合体疫苗配方的生物学效果。特别是，称重和测量了动物的尿道球腺和睾丸。下面的表4叙述了结果。可以看到，在接种动物中尿道球腺的平均重量比对照动物减少约32％。另外，接种动物中睾丸的重量比对照动物减少约32％。这些结果与接种动物中睾酮生成减少是一致的。
表4
 尿道球腺     睾丸
  处理   动物号  平均重量(毫克)     ％对照   平均长度(厘米) ％对照 平均重量(毫克)     ％对照
  对照公猪   22  60.5±3.5*   11.4±.21 263±10.9
  免疫去雄公猪   27  41.3±5.2     68.3   9.5±.47 83.3 198±11.3     75.3
*平均±标准误差
通过敏感度为25皮克/毫升的血清睾酮水平的标准放射性免疫测试确定所有三个实验组中的平均血清睾酮水平。在加强接种后(在对照公猪和阉猪组中安慰剂接种)，在0天，7天，14天，和21天进行测试。图13描述了测试的结果。可以看到在接种后，在接种动物中，血清睾酮的水平下降，而对照公猪中的水平上升。
(c)尸体组合物：
在动物屠宰后，评估两组每个实验组的动物的尸体组合物的商业价值。特别是，确定了平均体重和脂肪含量。进行腰眼的平均测量，确定修整的股臀部和腰的平均重量。表5报道了尸体评估的结果。可以看到，尸体资料显示对照公猪和免疫去雄(接种动物)具有非常相似的尸体组合物，而阉猪具有更多的身体脂肪，更少的瘦肉。另外，阉猪的生长表现在生命期的最后24天达到平稳(结果未显示)。这些尸体资料与使免疫去雄动物的尸体组成模仿对照公猪，除了在生长期的最后几天，的目的是一致的。
表5
尸体资料
    阉猪     对照公猪     免疫去雄
  尸体重量(公斤)     110.5     115.2     115.4
  脂肪(毫米)     19.1     15.7     15.3
  腰眼(厘米2)     41.5     44.5     44.2
  根本修整(公斤)     27.3     28.4     28.2
  修整股臀部(公斤)     7.70     8.23     8.11
  修整腰眼(公斤)     7.38     7.79     7.65
(d)饲料转换：
从断奶到屠宰的时期中测量每个实验组的动物的饲料转换效率。特别是，将平均饲料转换效率表达为公斤饲料：获得的公斤重量的比例。图14描述了结果。可以看到在对照公猪和免疫去雄(接种动物)中饲料转换约为10％，比阉猪中的饲料转换更有效。
(e)阉猪沾染成分水平：
通过测试来自各个实验组的动物的脂肪和唾液腺中的雄甾酮水平(阉猪沾染成分)评估在接种动物中8拷贝GnRH-LKT融合疫苗制剂减少公猪沾染的能力。通过对从各组得到的脂肪和唾液腺样品进行标准化学过程可以定量测定雄甾酮水平。表6报道了结果。可以看到对照公猪与阉猪和免疫去雄(接种动物)相比具有非常高的雄甾酮浓度。
表6
  阉猪   对照公猪   免疫去雄
  脂肪雄甾酮   0.14微克/克   0.44微克/克   0.26微克/克*
  唾液腺雄甾酮   33.76微克/克   40.46微克/克   30.18微克/克
*p小于.01
所有上面的结果表明含有短LKT::8个拷贝的GnRH融合分子的免疫去雄疫苗制剂提供了外科去雄方法的商业可行的替代方法。
实施例11
具有一个或两个GnRH多聚体的融合分子
的体内免疫原活性的比较
为了比较含有单个GnRH多聚体(含有8个GnRH的串联重复)，或两个GnRH多聚体(两个都含有8个GnRH的串联重复)的LKT-GnRH融合蛋白在体内引发抗GnRH免疫应答的能力，进行了几个接种试验。
如上所述，制备了含有质粒pCB114(一个与LKT111的C’末端连接的8拷贝GnRH多聚体)，和质粒pCB122(两个8拷贝GnRH多聚体，一个与LKT111的N’末端连接，另一个与LKT111的C’末端连接)的大肠杆菌培养物。将起源于含有pCB114质粒的培养物的疫苗配制成在2毫升终体积的VSA-3助剂中含有160微克融合分子(25微克总的GnRH)。将起源于含有pCB122质粒的疫苗配制成在2毫升终体积的VSA-3助剂中含有185微克融合分子(50微克总GnRH)。以这样的方式，保持两种制剂中LKT载体分子的量不变(每个配方135微克总LKT)。在下面的接种试验中利用疫苗制剂。
(a)抗GnRH抗体效价和抗GnRH抗体分子的功能活性：
进行了两个实验疫苗制剂引发的抗GnRH抗体效价之间的比较，其中也评估了引发的抗体阻止内源地产生GnRH的影响的能力。特别是，如下确立了三组雄性小猪：50个动物用单个GnRH多聚体疫苗组合物(pCB114得到的LKT111::8个拷贝的GnRH融合体)注射，10个动物用多倍的GnRH多聚体疫苗组合物注射(从pCB122得到的8拷贝GnRH::LKT111::8拷贝GnRH融合体)，和10个对照动物只注射2毫升VSA-3助剂。
在断奶时(21天大)进行接种，在30天后加强接种动物。在加强接种后14到28天收集血液。获得血清并测试抗GnRH抗体效价和黄体激素(LH)的血清水平。利用标准放射性免疫测试的碘化GnRH，在最后血清稀释度1∶5000时确定血清抗GnRH抗体效价。在标准放射性免疫测试中利用小猪LH作为参考标准测试血清LH水平。表7报道了测试结果，以平均值±标准误差表示。正如在表7中描述的数据可以看到，与接受单个GnRH多聚体疫苗(LKT111::8个拷贝GnRH)的动物相比，注射多倍GnRH多聚体的疫苗组合物(8个拷贝GnRH::LKT111::8个拷贝GnRH)的动物抗GnRH的抗体效价更高。另外，接受多倍GnRH多聚体疫苗的动物的血清LH水平更低。血清LH水平的降低反映了疫苗动物中产生的抗GnRH抗体阻止内源产生的GnRH效果的能力。最后，通过产生抗GnRH抗体100％的接受多倍GnRH多聚体疫苗的动物应答疫苗，而90-92％的接受单个GnRH多聚体的动物产生应答。
表7
    GnRH抗体日期     血清LH日期
    在加强免疫后的日期     14     28     14
    处理1(对照)     0.5±.3     0.5±.3     1.16±.22
    处理2LKT111::8个拷贝GnRH160微克(25微克GnRH)     44.6±4.1     37.2±4.1     0.13±.04
    处理38个拷贝GnRH::LKT111::8个拷贝GnRH185微克(50微克GnRH)     60.5±6.9     51.8±7.5     0.06±.02
(b)比较抗GnRH的效价和增加疫苗剂量的效果的评估：
如下再次评估两个疫苗配方的免疫原性(8个拷贝的GnRH单个多聚体抗原和16个拷贝的GnRH多倍多聚体抗原)。建立了每个20个雄性小猪的两个实验组。在断奶时(21天)用160微克单个多聚体抗原制剂接种第一组动物，然后用同样的剂量在33天后加强接种。在断奶时(21天)用185微克多倍多聚体抗原制剂接种第二组中的动物，同样在33天后加强接种。在加强注射后8，14，和24天时收集血液，如上所述，利用标准的放射性免疫测试，在最后稀释度1∶5000测试血清的抗GnRH抗体分子。图15叙述了结果。可以看到，应答多倍多聚体疫苗(8个拷贝GnRH::LKT111::8个拷贝GnRH)的抗体比单个多聚体疫苗(LKT111::8个拷贝GnRH)的高(p＜.001)。仍然参考图15，在Y轴上20％处的水平线代表了抗体效价，这在前面的试验中没有报道，它已经显示接种动物抑制LH的分泌。又一次，接受多倍GnRH多聚体疫苗的动物100％应答(产生抗GnRH抗体)，而接受单个多聚体疫苗的动物的90-92％产生应答。
为了确定用多倍GnRH多聚体疫苗观察到增强的免疫原性是GnRH抗原剂量增强造成的(例如，在[8拷贝GnRH::LKT111::8拷贝GnRH]疫苗中50微克GnRH，相比之下，在[LKT111::8拷贝GnRH]疫苗中25微克GnRH)，进行了下面的研究。在断奶时(21天)接种三组各20个小猪，在约30天后用单个GnRH多聚体疫苗组合物(从pCB114得到的LKT111::8个拷贝的GnRH融合体)加强接种，接种剂量如下：分别50微克，150微克和450微克融合蛋白。在加强注射后14，28和64天收集血液。如上所述在最后稀释度1∶5000测试血清的抗GnRH抗体。表8叙述了结果。可以看到对用增大剂量的单个GnRH多聚体疫苗组合物的应答没有得到抗GnRH抗体效价的明显增加。这表明用多倍GnRH多聚体疫苗(从pCB122得到的8个拷贝GnRH::LKT111::8个拷贝的GnRH融合体)观察到的免疫原性增强不是由GnRH抗原浓度增高导致的；而增强的免疫原性似乎是由特定的LKT-GnRH融合分子的三维结构造成的，或者在于GnRH抗原对产生抗体的细胞的物理表现。
表8
    剂量(微克)     在加强免疫后的日期在稀释度1∶5000时的％结合率
    LKT111::8个拷贝的GnRH     14天     28天     64天
    50微克     60.9±4.8     50.7±5.8     22.0±4.7
    150微克     59.0±4.9     46.0±4.9     16.8±3.6
    450微克     62.6±4.0     56.5±4.7     22.8±4.8
实施例12
具有两个GnRH多聚体的LKT-GnRH
融合分子进行的剂量应答研究
为了确定从含有两个GnRH多聚体(两者含有8个GnRH串联重复)的LKT-GnRH融合蛋白形成的疫苗组合物的最适剂量，进行了下面的体内剂量应答的研究。
如上所述制备了含有质粒pCB122的大肠杆菌培养物(两个8拷贝的GnRH多聚体，一个与LKT111的N’末端连接，一个与LKT111的C’末端连接)。以下面的总融合蛋白剂量配制含有pCB122质粒培养物起源的7个疫苗：0微克(对照)；1微克；5微克；10微克；20微克；40微克；和80微克，每个溶解于最后体积为1毫升的VSA-3助剂中。
组成各20个动物的7个实验组，并用上面所述的疫苗配方接种。在接种后35天取血样，在如上所述的标准放射性免疫测试中，在稀释度为1∶100时测量抗GnRH抗体的效价。表9报道了测试的结果。如上所述效价表示为％结合率。可以看到从统计学看0微克融合蛋白不同于所有其它值。1微克融合蛋白剂量(p＜.009)低于所有从接受蛋白质抗原的组中得到的其它值。5微克剂量小于20微克剂量(p＜.06)，但是，所有10微克以上的剂量的总融合蛋白的值统计地看基本相同。这些数据表明起源于质粒pCB122的融合蛋白(8个拷贝nRH::LKT111::8个拷贝GnRH)的疫苗的最适剂量约为20-40微克融合蛋白。
表9
                  8个拷贝GnRH::LKT111::8个拷贝GnRH剂量(微克)
    0     1     5     10     20     40     80
    效价X     2.6     20.5     47.9     52.0     59.6     62.0     64.6
    SX     ±.6     5.0     5.8     4.6     4.4     3.4     3.6
实施例13
雌性大鼠的GnRH免疫接种
为了评估雌性个体的GnRH接种的生物学效果，进行了下面的研究。
如上所述制备了含有pCB122质粒的大肠杆菌培养物(2个8拷贝的GnRH多聚体，一个与LKT111的N’末端连接，一个与LKT111的C’末端连接)。将起源于培养物的疫苗配制成在1毫升最后体积的VSA-3助剂中含有185微克融合分子(50微克总GnRH)。然后将配方用于下面的接种试验，以评估GnRH接种对雌性个体中的卵巢重量，子宫重量，血清雌激素浓度的影响。
组成各10个雌性Sprague Dawley大鼠的两个实验组。在实验的0天给对照组(组1)安慰剂注射(仅VSA-3助剂)。在第二组的动物接受GnRH/LKT疫苗配方的单次注射。在处理后检测抗GnRH抗体效价，在组2中的动物在注射后21天到研究的约50天达到最大水平显示了效价上升，然后水平逐渐下降直到在研究的224天杀死动物。
然后确定和记录卵巢重量，子宫重量，和血清雌激素水平。图16描述了这些测量的结果。可以看到，在治疗动物(用GnRH-LKT疫苗配方接种)中的卵巢重量比对照动物明显减少。对组织的组织学检查发现在卵巢组织中没有活性卵泡。在治疗动物中子宫重量也明显减少。子宫重量提供了血清雌激素浓度的良好反映，与生殖巢类固醇的分泌相关。另外，治疗动物中血清雌激素水平下降到约20皮克/毫升，而在对照动物中血清雌激素水平约为50皮克/毫升。由于雌激素起源于卵巢，可以预期在处理动物中血清雌激素将下降。这些结果证明本发明的GnRH/LKT接种方法可以有效地控制卵巢功能，表明这是子宫切除术或用GnRH拮抗物治疗的可行的替代方法。
实施例14
利用含有两个GnRH多聚体的LKT-GnRH
融合分子对雄性小猪个体免疫去雄
为了确定从含有两个GnRH多聚体(两者含有8个GnRH的串联重复)的LKT-GnRH融合蛋白形成的疫苗组合物减少脂肪中雄甾酮的能力，进行了下面的研究。
如上所述制备了含有质粒pCB122的大肠杆菌培养物(两个8拷贝的GnRH多聚体，一个与LKT111的N’末端连接，一个与LKT111的C’末端连接)。也如上所述制备了起源于该培养物的疫苗组合物。如下所述形成4个雄性小猪个体的实验组：组1，包括6个阉猪(在出生后几天内外科去势的雄性动物)；组2，包括7个公猪(在研究过程中保留雄性器官完整)；组3，包括6个后去势动物(保留雄性器官完整直到135天大，麻醉动物并外科去势)；组4，包括10个完整的雄性动物，将它们在断奶时(21天)和约135天大时用LKT-GnRH疫苗组合物免疫接种。
在42天后，完成研究，并杀死动物。通过标准化学方法定量在各实验组中，来自动物的脂肪样品中的脂肪雄甾酮水平(公猪沾染成分)。图17叙述了结果。在图中可以看到，在阉猪(组1)，后去势小猪(组3)和免疫去势组(组4，用LKT-GnRH疫苗处理)中脂肪雄甾酮水平相同，与组2的公猪相比，所有3组的脂肪雄甾酮水平都低。
同时确定了试验动物中尸体组合物的各个方面。特别是，在各组中确定了尸体重量，背部脂肪测量，睾丸重量(恰当的话)和尿道球腺长度(BU)。下面的表10叙述了测量的平均值。BU腺体是依赖于睾酮来维持大小和功能的。
表10
  治疗组   尸体重量(公斤)     背部脂肪(毫米)     睾丸重量(毫克)     BU长度(厘米)
  LKT-GnRH(n＝10)   90.4     24.5(18-32)     261(145-480)     9.6(8.0-11.0)
  后去势(n＝6)   88.8     24.3(18-32)     ----  ----     10.1(8.8-12.1)
  公猪(n＝7)   90.3     18.3(15-26)     641(458-800)     14.2(11.9-16.5)
  阉猪(n＝6)   83.6     28.0(22-36)     ----  ----     ----  ----
在表10中可以看到，与未测量公猪组2相比，组4的免疫去势动物中睾丸重量和BU腺体长度明显减少，表明在接种动物中，LKT-GnRH疫苗组合物有效地减少了血清睾酮的水平和/或效果。
实施例15
在重组LKT352和LKT111分子中T细胞表位的推测
为了推测用于本发明的LKT-GnRH嵌合体中的白细胞毒素多肽序列中的潜在的T细胞表位，如表11所述对对应于LKT分子1到199编号的氨基酸序列进行Margalit和其合作者建议的方法(Margalit等人，免疫学杂志(1987)138：2213)。在本方法中，将白细胞毒素多肽序列的氨基酸序列与其它已知诱导T细胞应答的序列比较和确信是T细胞表位需要的氨基酸类型模式比较。表11描述了比较的结果。
从这样推测的结果可以看到，在白细胞毒素肽中存在几个短序列，利用Margalit等人(出处同上)提出的原则鉴定了它们是潜在的T细胞表位。更具体地说，鉴定了9个序列具有(带电/Gly-疏水-疏水-极性/Gly)序列(在表11中表示为模式“1”)，和3个序列具有(带电/Gly-疏水-疏水-疏水/Pro-极性/Gly)序列(在表11中表示为模式“2”)。将这些数据与上面的实施例7和8中的LKT352和LKT111载体系统在体内产生的抗GnRH活性结合，可以表明关键的T细胞表位保留在短LKT111分子中，并且那些表位似乎是包含在LKT352和LKT111分子的N’末端部分。
表11
对应于潜在的T细胞表位的LKT序列图谱
显示模式“1”的LKT氨基酸序列
GTID    (氨基酸27-30)
GITG    (氨基酸66-69)
GVIS    (氨基酸69-72)
HVAN    (氨基酸85-88)
KIVE    (氨基酸93-96)
DLAG    (氨基酸152-155)
KVLS    (氨基酸162-165)
DAFE    (氨基酸171-174)
KLVQ    (氨基酸183-186)
GIID    (氨基酸192-195)
显示模式“2”的LKT氨基酸序列
RYLAN   (氨基酸114-118)
KFLLN   (氨基酸124-128)
KAYVD   (氨基酸167-171)
实施例16
推测从pCB122得到的LKT-GnRH融合蛋白的物理结构
为了推测从pCB122构建体得到的8个拷贝的GnRH::LKT111::8拷贝的GnRH融合分子的B细胞表位的物理结构，利用前面所述的方法分析了pCB122的氨基酸序列(在图9-1到9-6中有描述)，以便确定蛋白质的物理结构。Rost等人(1993)分子生物学杂志232：584-599，Rost等人(1994)蛋白质19：55-72，和Rost等人(1994)蛋白质20：216-226。特别是，通过神经网络系统进行推测，其中输人数据包括多个序列排列。利用程序MaxHom(Sander等人(1991)蛋白质9：56-68)进行网络分析，其中残留溶剂可接近性的训练来自Kabsch等人(1983)生物多聚体22：2577-2637。神经网络分析评估了在pCB122序列中的每个氨基酸，并推测是否残基将以环，螺旋或暴露的结构存在。在推测过程中，推测了pCB122分子的氨基末端的8拷贝GnRH主要以环结构存在，而羧基末端的8个拷贝的GnRH具有混合的推测结构(环，螺旋和暴露残基)。
这些数据表明用从pCB122构建体得到的8拷贝GnRH::LKT111::8拷贝GnRH融合分子观察到的免疫原性增强可以与分子中GnRH抗原的不同的三维结构有关。
D.工业应用
本发明的白细胞毒素GnRH嵌合体用于提供免疫原，当对脊椎动物寄主给药时，该免疫原的作用是接种寄主抗内源GnRH，它的作用依次是抑制寄主的繁殖功能和能力。
除了本说明书中举证的特殊用途，本文公开的新嵌合体分子提供了得到含有一个以上的GnRH多肽，以多个或串联重复存在的融合蛋白的方法，这些多肽与分子的白细胞毒素多肽部分提供的免疫原表位融合(在某些情况下，由选定的GnRH序列之间存在的间隔肽序列提供)。在本发明中关键的个体嵌合体蛋白提供了对融合GnRH肽序列的免疫原性增强，使接种脊椎动物寄主对内源GnRH有效免疫应答；有效地干扰了两种促性腺激素，黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)的合成和释放，并使寄主暂时不育。以这样的方式，新白细胞毒素GnRH构建体可以应用免疫绝育疫苗，提供目前在家养和农场动物畜牧业中使用的侵入性绝育方法的替代方法。
白细胞毒素GnRH融合分子也可以用于在哺乳动物个体中减少乳房肿瘤的迹象，所用的疫苗含有妨碍乳房功能如产生子宫激素雌激素和黄体酮的那些分子。以差不多相同的方法，免疫绝育的犬科和猫科个体将不发展子宫积脓(子宫感染)，因为接种动物将不产生的能诱导这一症状黄体酮。
本融合分子的其它受关注的用途包括控制群体数目，例如干扰野生啮齿动物群体的再生能力。在这点上，LKT-GnRH融合分子可以用作目前实施的如毒杀和诸如此类的控制群体的措施的替代方法。本发明的融合体产物也可以处于含有慢和快释放成分的构建体中给药。以这种方式，可以避免多次接种。另外，由于在种类之间GnRH的氨基酸序列是高度保守的，可以生产单个白细胞毒素GnRH融合体疫苗，该疫苗将展示广泛的种类交叉的有效性。
所以，已经公开了各种含有与选定GnRH多肽融合的白细胞毒素的嵌合体蛋白。虽然本发明的优选实施方案已经较为详细地叙述了，可以理解的是，不脱离附加的权利要求确定的本发明的精神和范围，可以有各种变化。
在本发明的实施中有用的菌株的保藏
在美国典型培养物收藏处(ATCC)，12301Parklawn大道，Rockville，马利兰州，进行下面菌株的生物学纯化培养物的保藏。在成功的存活性测试后，分配了所指明的登记号，同时交付了必要的费用。按照国际公认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约和其规则进行保藏。这保证在保藏之日起30年的时期，和最后要求保藏机构提供保藏物的样品后至少5年的时期内维持存活的培养物。按照布达佩斯条约可以ATCC获得微生物，这保证对于美国专利和商标委员会根据35USC§122和委员会的规则(包括37CFR§1.12)确定登记的对象是永远和不受限制地可以得到该培养物的。在专利授权的情况下，所有对公众获得保藏培养物的限制将不可改变地去除。
这些保藏物仅仅是为了方便本领域技术人员而提供，没有承认保藏物是35USC§112所需要的。这些质粒的核酸序列以及它们编码的多肽的氨基酸序列将引入本文作为参考，并在任何与本文的叙述有争议的事件中起作用。生产，使用或销售保藏物质需要许可证，还没有授序这样的许可。
菌株号             保藏日期        ATCC号
溶血性巴斯德菌     1989年2月1日    53863
血清型1 B122
大肠杆菌JM105中    1989年2月1      67883
的pAA101
大肠杆菌W1485中    1990年3月30日   68283
的pAA352
大肠杆菌JM105中    1995年2月1日    69749
的pCB113
大肠杆菌JM105中    1995年2月1日    69748
的pCB111

Claims (9)

1.一种嵌合体蛋白，具有图9-1至9-6所示氨基酸序列。
2.含有权利要求1的嵌合体蛋白以及药用载体的疫苗组合物。
3.一种对非人接受者提呈选定的GnRH多聚体用于免疫绝育的方法，包括对所述接受者施用有效量的权利要求2的疫苗组合物。
4.一种编码权利要求1的嵌合体蛋白的DNA构建体。
5.一种表达盒，包括：
(a)权利要求4的DNA构建体；和
(b)指导所述构建体转录的调控序列，由此所述构建体能够在宿主细胞中转录和翻译。
6.用权利要求5的表达盒转化的宿主细胞。
7.一种产生重组多肽的方法，包括：
(a)提供权利要求6所述的宿主细胞的群体；和
(b)在表达所述的表达盒编码的多肽的条件下培养所述的细胞的群体。
8.按照权利要求2所述的疫苗组合物用于对非人接受者免疫绝育的用途。
9.权利要求1的嵌合体蛋白用于制备对非人接受者免疫绝育的药物的用途。
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