JPH04502163A - 融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 融合タンパク質 技術分野 本発明は、一般にを推動物の宿主、とくに家畜化した動物の免疫学的去勢または 生殖機能抑制用のワクチンとして有用な融合タンパク質に関するものである。

背景となる技術 犬、馬、羊、畜生、山羊および猫を含む家畜の生殖活性を防止するもっとも人気 のある方法は、外科的な卵巣子宮摘出または去勢である。

この方法は、不可逆的であり、技術的に比較的離しい操作で、したがって訓練さ れた獣医の技能を必要とするという問題がある。

手術に代る方法の１つは、イヌで長期の発情抑止薬（ｌａｐ口＆Ｗｏｌｃｈｕｋ 　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｌ、　Ｒｅ＠、　２４：ｌ００３−１００６．１９６３） として用いることができるが、残念なことに、長期の治療の後では、化膿性子宮 炎、子宮内膜炎および良性の乳房腫瘍の発生増加を含む子宮疾患の誘発と結びつ いているプロゲスターデンステロイド類の投与である。それらの使用は、したが って、発情の短期抑制または発情の延期に限定するようになりがちであった。

経済的に重要な飼育場動物では、現場で日常使用するのに適当であると認められ た一般に使用できる長期の避妊薬はない。

したがって、雄と雌の両方の家畜に適用できる許容性のよい非ステロイド系の家 畜用避妊方法が必要である。

１つのそのような方法は、生殖器官の発達と活性をコントロールするホルモン類 に対する免疫処置であろう。

生殖腺のステロイド産生と配偶子形成を調節し、生殖の周期性の原因となる生殖 腺刺激性の２つのホルモンは黄体形成ホルモン（Ｌ　Ｈ）と卵胞刺激ホルモン（ Ｆ　Ｓ　Ｈ）である。

黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ，またＧｎＲＨとして知られる）は、 腹側の下垂体膣からのＬＨとＦＳＨの合成と放出をコントロールする。哺乳類の ＬＨＲＨは、っぎの配列および配列ＩＤＮｏ：１に述べられている天然に生ずる アミノ酸からなるデカペプチドである。

（Ｐｙｒｏ）　−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔ＋ｐ−３ｅｒ−Ｔ７ｒ−ＧｌマーＬＩ−Ａ ＋ｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＮ２−　ＮおよびＣを末端とするダルタミン酸とグリ シンの残基は、それぞれピログルタミン酸およびグリシナミドに翻訳後、修飾さ れる。

宿主によってＬＨＲＨに対する抗体をつくり出す結果となるワクチンは、その宿 主の内在性ＬＨとＦＳＨの産出および放出を抑制するであろう。この抑制の結果 、処置した動物では、ステロイド産出が減少し、生殖の周期性と好性が損われる 。

それによって生ずる生理学的な効果はつぎのようである。

（ｇ）雌では− （ｉ）ＬＨの搏動の休止 （百）排卵が損われることによる不妊性（ｉｉｉ）発情ホルモンの欠如による発 情周期の休止（１ｖ）生殖管の退行 （ｖ）黄体の退行による流産 （ｂ）雄では− 畢丸中のテイディッヒ細胞からのテストステロンの産出が抑制される結果、循環 するアンドロゲンの末梢血清レベルが低下し、つぎのことが生ずる。

（ｉ）性的衝動の減少 （１１）補助性腺の退行 ｉ＋＋）！丸容積の縮小と精子形成の減少／中止Ｌ　ＨＲＨに対する抗体は、Ｌ ＨＲＨを適当な担体に化学的に接合し、適切なアジュバントの存在でそれを投与 することにより多数の種につくり出すことができる（Ｃｕｒｅｌｌｉ　Ｃ，等、 １９８２．Ｐｒｏｃ。

ＮＮ１．＾ｃｉｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９．５３９２−５３９５）　。しか しながら、化学的な接合はコントロールするのが困難であり、しばしば異質の不 明確な生成物となる。また、有効な免疫処置には、通常、油性のアジュバントが 必要であるが、これはしばしば炎症や肉芽腫の組織障害などの受入れることので きない副作用の形成に導く。

強いアジュバントを使用する必要なく、ＬＨＲＨに対する良好な力価の抗体を産 出する手段を提供することが望ましい。

ＴｒａＴタンパク質（ＴｒａＴｐ）はＴｒａＴ遺伝子によって遺伝信号が指定さ れる。ＴｒａＴｐはある菌株のＥ、ｃｏｌｉによってつくり出される外膜のリポ タンパク質であり、血清による致死に対するこれら菌株の抵抗性の原因となって いる。アジュバントなしで、マウスに筋向注射を行うと、ＴｒａＴｐは抗体応答 を引き出すが、これは、不完全なフロインドアジュバントで注射するときに得ら れるものに匹敵する。さらに、免疫原をＴｒａＴｐに化学的に共役させ、塩類溶 液中の複合体を動物に投与すると、高いレベルの抗免疫原抗体が産出する結果と なる。したがって、ＴｒａＴｐは、免疫原の自己アジュバント的な担体として用 いることができる。ＴｒａＴｐのこの使い方は、さきに国際特許出願番号ＰＣＴ ／＾Ｕｌ１７／　００１０７’　（ＷＨ７１０６５９０として公刊）で述べられ ているが、そこに免疫原分子に対するＴｒａＴｐの化学的および遺伝子的な結合 の両方が述べられている。その明細書で実施され、述べられている特異な融合は 、大きなタンパク質に関するものである。一方、ＬＨＲＨは、適当な担体なしで は使用することが本来困難な短いペプチドである。さらに、種の間でペプチドに ほとんど変化がないので、免疫システムによる自己抗原と見ることができ、その 結果、免疫応答の刺激に対して反抗的である。ＬＨＲＨ配列とＬＴＢ　（ある菌 株のＥ、ｃｏｌｉによってつくり出される熱に不安定な毒素のＢザブユニット） からなる融合タンパク質が述べられている（国際特許出願番号ＰＣＴ／Ａ１１８ ６１００１３５．　ＷＯ３６１０６６３５として公刊）。これらの構成物は、粘 膜質の上皮に結合するＬＴＢの能力を用いて、宿主の免疫システムへＬＨＲＨを 経口によって提供する目的で調製されたものである。それらは自己アジュバント 的でなく、また、生殖機能の抑止が実証されているとはいえ、結果として得られ る抑止は強力な抑止ではなかった。

ＰＣＴ／ＥＰ８９１０１０１３　（ＷＯ９０１０２１８７として公刊）は、単独 では本質的に抗原性でないＬＨＲＨのようなペプチドを含む融合タンパク質を、 高度に抗原性で親水性のタンパク質である肝炎８表面抗原のような担体を用いて 産出することを述べている。Ｔｒ　ａＴｐは膜のりボタンバク質であり、高度な 親水性のタンパク質ではない。

さらにＰＣＴ／ＥＰ８９１０１０１３で教えている融合は、自己アジュバント的 であるとは思われない。

略号 ＬＨＲＨ：黄体形成ホルモン放出ホルモンＬＨ：黄体形成ホルモン ＧｎＲｈ　：性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨの別名）ＦＳＨ：卵胞刺 激ホルモン ＬＴＢ　：ある菌株のＥ、ｔｏｌｉによってつ（り出される熱に不安定な毒素の Ｂサブユニット ＱＣ：品質コントロール ＱＡ　二品質保証 ＥＤＴＡ　：エチレンジアミンテトラ酢酸ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ニ ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳這 ＬＰＳ　：リボ多糖 ＥＤＡＣ：　１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミ ド・ＨＣＩ ＡＢＴＳ　：　２．　２　”−アジノビス（３−エチルベンツチアゾリンスルホ ン酸） ＰＥＧ　：ポリエチレングリコール ＢＳＡ　：ウシ血清アルブミン １Ｆ　：融合タンパク質の不溶形 ＳＦ　：融合タンパク質の可溶形 ＰＨＡ　：フイトヘマグルチニン ＭＢＳ　：ｍ−マレイミド安息香酸のｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル Ａ２．。　二分光光度計で２８０ｎｍにセットしたときの吸光度Ｉ　Ｓ　Ａ　− ２０：　Ｍｏｎ１ａｎｉｄｅアジユバント、５ＥＰＰＩＣＩ　Ｓ　Ａ　−２５： 　Ｍｏｎｊｘｎｉｄｅアジュバント、ＳＥＰＰＩＣｓｅｍ　：平均の標準誤差 Ｓｄ　：標準偏差 ＰＢＳ　ニリン酸緩衝塩類溶液、ＰＨ７，２−７，４ｖｙ／ｗ　：重量対重量 ｖ／ｗ　：容量対重量 ＤＮＡ　：デオキシリボ核酸 ＮＳＢ　：非特異性結合 定義 ＴｒａＴｐはＴｒａＴ遺伝子のタンパク質生成物のことである。

ＴｒａＴｐは、ＴｒａＴとＬＨＲＨ遺伝子融合の発現生成物として形成される融 合タンパク質を示す。

ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨタンパク質融合物は、それらを発現したプラスミドに従っ て、７３０ｐ、７３１ｐなどと示す。

プラスミドはｐＢＴＡ７３０などとして示す。

Ｅ、■見／プラスミドの結合はＢＴＡ　１６６４などとして示す。

本発明によるＴｒａＴｐ類似体は、ＬＨＲＨ類似体配列をＴｒａＴｐ配列に融合 するのに用いる戦略により、挿入、欠失あるいは置換などの交替が起る場合のＴ ｒａＴｐ配列に関係する分子である。

本発明によるＬＨＲＨ類似体は、種の間で起る上に同定した配列の変化、特定の 融合戦略のために起る特定の残基への翻訳後修飾の変化、あるいは特定の融合戦 略のために起るアミノ酸配列の変化のいずれかを考慮するアミノ酸差異が起る場 合のＬＨＲＨ配列に関係する分子である。

発明の説明 本発明においては、ＴｒａＴｐ中の特定の挿入位置が同定され、それによって、 ＬＨＲＨに対する強力な免疫応答を引き出すことのできるＴｒａＴｐまたはその 類似体とＬＨＲＨ類似体の新規な融合タンパク質の産出が得られるようになった 。本発明は、ＬＨＲＨ類似体と’ｌ”ｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体のすべて の融合物が、ＬＨＲＨに対して良好な力価の抗体をつ（り出すのに必ずしも適当 ではないことを示した。さらに種の間で、ＴｒａＴｐの特定の位置におけるＬＨ ＲＨの種々の多量体の効果に変化が見られた。

本発明は、ＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体の遺伝暗号指定配列へのＬＨＲＨ 類似体の遺伝暗号指定配列の融合が、を推動物の宿主、とくに飼育されている動 物の生殖機能の抑止またはコントロールに有用なワクチンを有効に提供するのに 用いることができることを実証している。

本発明によれば、ＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体とＬＨＲＨ類似体の新規な 融合タンパク質をつくり出すのに組替えＤＮＡ技術を用いることができ、これを 塩類溶液あるいはサポニンのようなアジュバントに入れて投与すると、ＬＨＲＨ を認識する抗体（以後ＬＨＲＨ抗体という）を産出し、これが、ひるがえって、 動物中の生殖機能を抑止するのである。

ここに例示する免疫原融合の研究は、ＬＨＲＨ類似体の縦列反復の挿入が、１つ の挿入断片の挿入よりも多くの免疫原融合を与えることを示している。

Ｅ、ｃｏｌｉ中に融合タンパク質をつくることに結びつく利点をＴｒａＴｐとＬ ＨＲＨの化学的接合と比較するとつぎのようである。

ａ）化学的な接合よりも製造プロセスが簡単である。

ｂ）化学的な接合よりも融合タンパク質生成物の性質を定義することが容易であ り、したがって、生成物の品質コントロール（Ｑ　Ｃ）と生成物の品質保証（Ｑ Ａ）に有利である。

ｃ）ＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体へのＬＨＲＨ類似体挿入の正確な位置を 選択することができ、また最適の免疫学的応答を与えるように反復するエピトー プの数を選ぶことができるため、融合は化学的接合よりも特異性と柔軟性が大き い。

本発明は新規な融合タンパク質を提供する。これらの融合タンパク質は、Ｔｒａ Ｔｐまたはその類似体に挿入または融合したＬＨＲＨデカペプチドの類似体の単 一模写からなるものでもよ＜、ＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体内の多重の位 置に挿入されるＬＨＲＨ類似体の多重模写からなるものでもよい。特定のクロー ン化戦略は、ＬＨＲＨ類似体又は７ｒａＴｐに先天的でない配列に遺伝暗号を指 定するヌクレオチドの封入を必要としてもよく、あるいは遺伝暗号指定の配列か ら塩基が欠失するように導いてもよい。

好ましくは、融合は、配列ＩＤＮｏ：２に述べられているＬＨＲＨ類似体からな る。

好ましくは、少なくとも１つのＬＨＲＨ類似体をＴｒａＴｐ配列のアミノ酸８０ と８１２００と２０１または２３５と２３６の間、あるいはアミノ酸１がＴｒａ Ｔｐシグナル配列のＭ　ｅ　ｔ　１であるこれらの位置の組合せで挿入する。

本発明の新規な融合タンパク質は、家畜の生殖機能を抑止または修飾するために 、それらの動物に投与するのに適したワクチンを提供するのに利用することがで きる。

本発明は、また、本発明融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチド分子を提 供する。

好ましいポリヌクレオチド分子は、組換えＤＮＡ分子である。より好ましくは、 組換えＤＮＡ分子はプラスミドベクターからなる。好ましいベクターはｐＢＴＡ ８１２である。プラスミドベクター以外のベクターも使用できたことが認められ るであろう。他のベクターには、ウィルス、コスミドおよびファスミドベクター を含む発現システムがある。

本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチド分子を所持する形質転換体宿主を 提供する。典型的には、宿主はＥ、ｃｏ旦のような細菌宿主である。好ましい宿 主は、本発明のポリヌクレオチド分子とともに用いられるＥ、ｃｏｌｉ菌株Ｎ４ ８３０であり、そこでは融合遺伝子がＰＬプロモーターのコントロール下にある 。使用することのできた他、の宿主は、酵母菌、真菌、昆虫や哺乳類の細胞系統 を含む他の細菌宿主および他の真核宿主である。

、本発明のワクチンは、少なくとも１つの本発明の融合タンパク質と、ヒトまた は獣医の使用に適した担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントからな る。

１回分の服用形態をつくり出すために担体と組合せる融合夕・ンパク質の量は、 誘発される条件、処置する宿主および投与の特定の様式に依存する。

また、特定の宿主に対する特殊な投与量が、特殊融合タンパク質の活性、年令、 体重、一般的な健康、宿主の性別および食餌、投与時間、投与経路、排泄速度お よび薬剤の組合せを含む数多くのファクターに依存することは理解できるであろ う。

本発明のワクチンは、希望に応じて、通常の無毒性で薬剤上受入れ可能な担体、 希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含む服用単位の配合で、経口、非 経口、直腸または腟に投与することができる。

注射可能の調製、たとえば無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液は、適当な 分散または湿潤剤と懸濁剤を用い既知の技法にしたがって配合することができる 。無菌の注射可能な調製は、また、無毒性で非経口的に受入れ可能な希釈剤また は溶剤の無菌の注射可能な溶液または懸濁液、たとえば１，３−ブタンジオール の溶液であることもできる。使用することのできる受入れ可能な媒体または溶剤 のなかには、水、リンガ−液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無 菌の所定の油類が溶剤または懸濁媒質として通常どおりに使用される。

この目的には、合成モノ−またはジグリセリドを含むいかなる刺激性の低い所定 の油でも用いることができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸が注射可能薬 の調製に用いられる。

動物またはヒトの予防接種に適当なアジュバントには、サポニン、Ｍｏ５ｊａｎ ｉｄｅ　ｌ５Ａ−２０またはＭｏｎ１ｘｎｉｄｅ　ｌ５Ａ−２５などの油エマル ジョン、Ｍｉ＋ｃｏｌ　５２：　Ｍｏｎｊａｎｉｄｅ　８ＢＢ　（Ｍａｒｃｏｌ はＥｌｓｅの商標。Ｍｏｎｊａｎｉｄｅ。

Ｍｏｎｔｉｎｉｄｅ　ｌ５Ａ−２０およびＭｏｎ１ｉｎｉｄｅ　ｌ５Ａ−２５は ５ＥＰＰＩＣ，パリ、の商標）、スクアランまたはスクアレン、Ａｄｉｕｖａｎ ｊ　６５　（落花生油、マンノースモノオレイン酸エステルおよびモノステアリ ン酸アルミニウムを含む）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸 カルシウムおよびミ＋ｓウバンなどの鉱物質ゲル、ヘキサデシルアミン、オクタ デシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、 Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ−、Ｎ−−ビス−（２−ヒドロキシエチル）プロパ ンジアミン、メトキシヘキサデシルグルセロールおよびプルロニックポリオール 類などの界面活性剤、ピラン、デキストラン硫酸エステル、ＤＥＡＥ−デキスト ラン、ポリアクリル酸およびカルボポールなどのポリアニオン、ムラミルジペプ チド、ジメチルグリシン、タクトシンおよびトレハロースシミコール酸エステル などのペプチドおよびアミノ酸が含まれるが、これらには限定されない。本発明 の融合タンパク質は、また、リポソームまたはその他のミクロ担体へ加えた後、 あるいは多糖類、タンパク賀またはポリマーに接合した後、もしくは“ｌ５ｃｏ ＋ｏｓ”　（免疫刺激性複合体を形成するためにＱｕｉｌ−Ａと組合わせて（Ｍ ｘｒｅｉｎ等、　ＮＮｕｒｅ、３０８，４５７−４６０［１９８４］　）　、投 与することもできる。

注射の頻度だけでなく、投与の経路、投与すべき服用量は、すべて、通常の技法 を用いて最適化することのできるファクターである。典型的には、最初の予防接 種に続いて、数週間後、１回またはそれ以上の“ブースター”予防接種を行うが 、その正味の効果は、免疫原に対する高い力価の抗体の産出である。

本発明の融合タンパク質の直腸または腟に投与するための座薬は、融合タンパク 質を、通常の温度では固体であるが、直腸または腟の温度では液体であるカカオ 脂、テオンロマ油、グリセリン化ゼラチンまたはポリエチレングリコールなどの 適当な炎症を起さない賦形剤と混合するか、あるいは適切な空洞中に存在し、し たがって直腸または腟内で融解し融合タンパク質を放出する液体と接触させるこ とによって調製することができる。

経口投与のための固体服用形態は、カプセル、錠剤、丸薬、粉剤および粒剤を含 むことができる。そのような固体の服用形態では、融合タンパク質を、スクロー ス、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合する ことができる。そのような服用形態は、また、普通実際に行われているように、 不活性希釈剤以外の追加物質、たとえばステアリン酸マグネシウムのような潤滑 剤からなることもできる。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、服用形態は緩 衝剤からなることもできる。錠剤や丸薬は、これに加えて、腸溶性のコーティン グで調製することができる。

経口投与のための液体服用形態は、水のような技法上普通に用いられている不活 性希釈剤を含む薬剤的に受入れ可能なエマルジョン、シロップ、溶液、懸濁液お よびエリキシル中の微小粒子、マイクロカプセルを含むことができる。そのよう な組成物は、また、スクロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ポリ エチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリ ーブ油、大豆油などの油類、アルキルパラヒドロシン安息香酸塩などの防腐剤、 いちごの風味、はっかなどの風味料を含む湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味、風 味および香料などのアジュバントからなることもできる。

本発明は、さらに、好ましくは家畜であるを推動物宿主中の生殖機能をコントロ ールする方法を与えるが、その方法は、本発明の融合タンパク質またはワクチン を宿主に投与して、宿主を予防接種することからなるものである。

本発明は、また、好ましくは家畜であるを推動物宿主中の生殖機能を抑止する方 法を与えるが、その方法は、本発明による融合タンパク質またはワクチンを宿主 に投与して、宿主を予防接種することからなるものである。

本発明の融合タンパク質は、したがって、一般にを推動物の好性および生殖周期 性をコントロールするのに適用されるが、とくに、犬や猫のような愛玩動物や畜 生、羊、山羊、豚、馬などの商業的な目的で用いられる動物の哺乳類の生殖活性 のコントロールに適用される。

本発明の融合タンパク質は、典型的には、ＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体と ＬＨＲＨ類似体に遺伝暗号を指定するキメラの遺伝子発現後、Ｅ、Ｃｏ１１中に 合成される。

このようなキメラの遺伝子をつくるには二、三の可能な戦略がある。

それらをつぎに述べるが、これらに限定されるものではない。

１．ランダム挿入：適切な遺伝子構成法を用いて、ＬＨＲＨ類似体をＴｒａＴタ ンパク質またはその類似体内のどこかに位置させればよい。生成物は耐ＬＨＲＨ 免疫原性とワクチンを基礎として選択される最良の構成物についてテストするこ とができる。多数の可能な方法がある。

ｓ）　ＴｒａＴｐまたはその類似体に遺伝暗号を指定するＤＮＡに、ＤＮＡｔｅ 　ｌ　（Ｌｌｎ等、　Ａ＋＋ｇ１．　Ｂｉｏｃｂｅｍ、　１９７．１１４−１１ ９　（１９１１５））を用いてランダム開裂を受けさせ、ＬＨＲＨに遺伝暗号を 指定するＤＮＡ断片を挿入し、できたプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ中にクローン化 する。

ＴｒａＴ遺伝子を適当なプロモーターのコントロール下に置くことによって、誘 発が、さらにそれ以上の特性評価をするためにＬＨＲＨ抗体でコロニーの免疫検 定を行うことによって選択することのできる融合発現するある割合の組換え体ク ローンを生ずる結果となるであろう。

ｂ）　ＬＨＲＨ類似体の、暗号化ＤＮＡをＴｒａＴ遺伝子中の便利な制限位置に 挿入することによる。ＤＮＡの挿入は、種々の制限エンドヌクレアーゼによって つくり出される各種の付着末端と両立するようにあつらえなければならず、また 翻訳の読み枠を保持しなければならない。

２、指定された挿入：　ＬＨＲＨ類似体がＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体の 表面にさらされるように’ｌ’ｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体の配列中にＬＨ ＲＨ類似体を挿入することは、ＴｒａＴｐまたは類似体の分裂が最小限となり、 ＬＨＲＨが好ましくは分子の外部表面に位置するようなＴ　ｒ　ａ　Ｔ　ｐ−Ｌ ＨＲＨ接合をまねることによって、免疫システムにＬＨＲＨ類似体の最適の表示 を生ずる結果となるであろう。代りとなる取組み方は、ＴｒａＴｐの一部をＬＨ ＲＨ類似体で置き換えることであろう。この指定された挿入は、適当な制限酵素 位置を遺伝子配列の特異な位置に構成することによって行う。

３、ＬＨＲＨ類似体は、モノマーとして、ＴｒａＴｌ）または７ｒａＴｐ類似体 中の１つの位置に、モノマーとして、１つ以上の位置に、あるいは多重模写とし て１つあるいはそれ以上の位置に挿入することができる。

４、アミノ酸を含むＬＨＲＨ類似体の１つまたはそれ以上の位置での置換、挿入 あるいは欠失は、上述のいかなる手段においても用いることができる。ＬＨＲＨ のアミノ末端のｐｙｒｏＧｌｕは、ＬＨＲＨ遺伝子によって暗号化されるアミノ 酸配列が融合タンパク質の内部にある場合には、形成することができないことに 注目する必要がある。したがって、遺伝子の発現は、ＴｒａＴｐタンパク質の内 部でＬＨＲＨのＧｌｕ−１類似体を生ずる結果となる。

同様に、在来分子のカルボキシ末端は、翻訳後プロセシングの結果として、グリ シナミド残基である。ＬＨＲＨに遺伝信号を指定するアミノ酸配列が内部残基で あるように融合物中に位置するときには、翻訳後プロセシングは起らず、したが ってＬＨＲＨのＧ　１　ｙ−ｙｔ　Ｏ類似体が結果として生ずる。

（ａ）配列ＩＤＮｏ：３，４および５に述べられているような天然に生ずるＬＨ ＲＨの変異体： （ｂ）Ｇｌｕ−１，Ｈｉｓ−１，Ｐｒｏ−１およびＬｙｓ−６類似体（配列ＩＤ Ｎｏ：６．７．８および９にも述べられている）図面の簡単な説明 第１図：Ａ、ＴｒａＴ遺伝子を発現させるプラスミドｐＢＴＡ８１２の地図、Ｂ 、ＰＬプロモーターの配列とＴｒａＴ遺伝子（配列ＩＤＮｏ：１０にも述べられ ている）の５′非翻訳領域。

第２図：遺伝子暗号を指定するＴｒａＴの配列と誘導されたＴｒａＴｐのペプチ ド配列（配列ＩＤＮｏ：１１にも述べられている）、各線の下の番号はアミノ酸 を指す。配列の遺伝暗号を指定するＬＨＲＨ類似体の挿入に用いられる制限位置 を示した。

第３図：ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ融合タンパク質のＤＮＡとアミノ酸配列（配列Ｉ ＤＮｏ：１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９および２０にも述べ られている）。各構成物について、ＬＨＲＨ類似体とそれに隣接するＴｒａＴｐ 配列のみを示した。番号はＴｒａＴｐ中のアミノ酸を指す。

第４図：　（１）ＬＨＲＨ類似体に遺伝暗号を指定するＤＮＡ断片の配列（配列 ＴＤＮｏ：２１および２２にも述べられている）（ｂ）　リンカ−ＤＮＡの配列 （配列ＩＤＮｏ：２３および２４にも述べられている） ［ｃ）ｐＢＴＡ８７０の構成に用いるＬＨＲＨ類似体ＤＮＡの配列（配列ＩＤＮ ｏ：２５および２６にも述べられている） （ｄ）ｐＢＴＡ８６２の構成に用いるＬＨＲＨ類似体ダイマーＤＮＡの配列（配 列ＩＤＮｏ　：　２７および２８にも述べられている） 第５図ニアｒａＴｐ中へのＬＨＲＨ類似体の多量体挿入の配列（配列ＩＤＮｏ　 ：　２９．３０および３１にも述べられている）番号は、第２図と同様に、Ｔｒ ａＴｐ中のアミノ酸を示す。

第６図：各種配合で７３２ｐにより免疫処置をしたイヌからのＴ−細胞の増殖応 答。データは平均±ｓｄとして表示した。刺激指数は、抗原が存在するときのｃ 、　ｐ、　ｍ、を抗原が存在しないときのｃ、　ｐ、　ｍ、で割って計算した。

第７図：各種配合で７３２ｐにより０，２８および５６日目に免疫処置をしたイ ヌからの平均（±ｓｅｍ）のＬＨＲＨ血清抗体応答。

血液試料（５〜８ｍ１）を、０．２Ｂ、　４２．５６および７０日目に頭部また は頚部の静脈から収集し、その血清について、ＬＨＲＨトレーサー結合検定法（ 実施例３Ｂで説明）で”’Ｉ−ＬＨＲＨを結合する能力を（最終１　：　２ＨＩ ｌの希釈度で）測定した。

第８５Ｚ＋７３２ｐにより０，２８および５６日目、ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ融合 タ融合タンパク列に配置したＬＨＲＨ類似体（配列ＩＤＮｏ：３０にも述べられ ている）の４つの挿入物を含む８６２ｐにより　１２１２１日目疫処置をしたイ ヌからの平均（±ｓｅｍ）のＬＨＲＨ血清抗体応答。イヌにはそれぞれ、０．０ ５％サポニンおよび０．１％ＳＤＳ中の８６２ｐ５００μｇを与えた。これらの イヌから１２１　（ブースター＃３前）。

１３４、　１４１．　１５５．　１６２．　１６４および１６７６７日目を取り 、その血清について、ＬＨＲＨ）レーサー結合検定法（実施例３Ｂで説明）で” ’１−ＬＨＲＨを結合する能力を分析した。

第９図：ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体融合タンパク質７３３　ｐ。

８７０ｐ、８６２ｐ、８５９ｐにより、０および２８日目に免疫装置をした　（ ａ）イヌおよび（ｂ）マウスから、２８および４２日目に平均（±ｓｅｍ）のＬ ＨＲＨ血清抗体応答を測定した。

血清について（最終１　：　２０００の希釈度で）ＬＨＲＨトレーサー結合検定 法（実施例３Ｂで説明）で”’Ｉ−ＬＨＲＨを結合する能力を分析した。

第１Ｏ図：血清のテストステロン濃度（ｎｇ／ｍｔ；実施例３Ｃで説明）とイヌ ＃０６０／１０でのＬＨＲＨ血清抗体の結合。血液は、０、２８．４２．５６． 　ＴＯおよび８４日目（７３２ｐで免疫処置；１０００μｇ）および１２１　（ ８６２ｐでブースティング；５００ｐｇ）、１３４．　１４１．　１４８．　１ ５５．　１６２．　１６９お、よび　１７６７６日目取した。日数は、（０日月 での）７３２ｐによる最初の免疫処置についてのものである。血清について（最 終１：２０００の希釈度で）ＬＨＲＨトレーサー結合検定法（実施例３Ｂで説明 ）で】２Ｊ−ＬＨＲＨを結合すとる能力を分析した。

３１１１１１図：サポニン／ＳＤＳアジュバント中の種々のＴｒａＴｐ−ＬＨＲ Ｈ類似体類似体融合タンパ色質処置をしたイヌからのＴ−細胞の増殖応答。デー タは平均±ｓｄとして示しである。

刺激指数は、抗原が存在するときのｃ、　ｐ、　ｍ、を抗原が存在しないときの ｃ、　ｐ、　ｍ、で割って計算した。

発明を実施するうえでの最良の様式 本発明の組替えＤＮＡ分子と形質転換宿主は、消化、連結反応などの分子生物学 の標準操作を用いて調製した。

本発明の融合タンパク質は、本発明の形質転換宿主をその特定の宿主に適切であ るような標準条件のもとで培養し、標準の技法によって融合タンパク質を培養か ら分離することによって得られる。融合タンパク質は不純な形で用いてもいいし 、産出される融合タンパク質に適切であるような標準の抜法によって精製しても よい。

本発明のワクチンは、薬剤調製の標準法を用いて、融合タンパク質を、ヒトまた は獣医の使用に受入れ可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバント と混合、好ましくは均質に混合することによって調製する。

１回分の服用形態をつくるに必要な融合タンパク質の量は、誘発すべき条件、処 置すべき宿主および投与の特定の様式によって変化するであろう。特定の固体に 対する特殊の投与量は、使用する融合のタンパク質の活性、個体の年令、体重、 一般的な健康、性別および食餌、投与時間、投与経路、排出速度および薬剤の組 合せを含む数多くのファクターに依存するであろう。

ワクチンは、希望に応じて、ヒトまたは獣医の使用に受入れ可能な通常の無毒性 の担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む単位服用量の配合で 経口、非経口、直腸または腟に投与することができる。

本発明を、以下の実施例に関して、さらに説明するが、これらは本発明の範囲を 決して制限するものではない。

実施例１ 各種のＴｒａＴ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ色質するプラスミド ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ色質■見中に産出する。ＴｒａＴ ｐに遺伝暗号を指定する遺伝子は、ＬＨＲＨ類似体に遺伝暗号を指定するＤＮＡ の１つまたはそれ以上の模写を挿入することによって修飾した多重模写プラスミ ドベクターに所持される。

ＬＨＲＨ遺伝子が融合の５′末端であるときには、融合タンパク質を含むＰ７ｒ ｏＧＩυが結果として生ずるが、ＬＨＲＨ遺伝子がＴｒａＴ配列の内部にあると きには、Ｇｌｕ−１をＬＨＲＨ配列の最初のアミノ酸として含むＴｒａＴｐ−Ｌ ＨＲＨ融合タンパク質がつくり出される。

同様に、ＬＨＲＨが融合の３′末端であるときには、融合タンパク質を含むグリ シナミドが結果として生ずるが、ＬＨＲＨ遺伝子がＴｒａＴ配列の内部にあると きには、Ｇｕｙ−１０をＬＨＲＨ配列の最後のアミノ酸として含むＴｒａＴｐ− ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ色質り出される。

基本的なＴｒａＴ発現ベクターｐＢＴＡ８１２を第１Ａ図に示した。

これはプラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２［Ｂｏｌｉｗｘｒ　Ｆ、等　（１９７〕）Ｇ ｅｎｅ、　２．９５−１１３１から誘導され、プラスミドを支えるＥ、■見の選 択を可能にする耐アンピシリン遺伝子を所持する（他の抗生抵抗に遺伝暗号を指 定するようなこれに代る選択可能な遺伝子を組込むことができた）。これは、ま た、ＴｒａＴ遺伝子の転写を促進するラムダの左方プロモーター（ＰＬ）　［Ｏ ｇ出Ｒ，Ｔ、等（＋９８２）Ｊ、Ｂａｃｊｅ＋ｉｏ１．、１５１．８１９−８２ ７コを所持する。プラスミドＢＴＡ８１２は、ＰＣＴ／ＡＵ８７１００１０７　 （ＷＯ８７１０６５９Ｇとして公刊）に述べられており、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｌｐｅ　ＣｏＨｕｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎで＾ＴＣＣ６７３３］　として供託 されているｐＢＴＡ４３９と同様のものである。

ｐＢＴＡ８１２はつぎのようにしてつくることができる。ｐＰＬ−ラムダ（Ｐｈ ｘｒｍｉｃｉｘ　ＬＫＢ、　Ｕｐｐｓｘｌａ、スウェーデン、が提供しテイルプ ラスミドと配列）を、製造業者の使用説明書に従って、制限エンドヌクレアーゼ Ｓｍａ　ＩおよびＥｃｏＲｌで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断片） とデオキシヌクレオチドトリリン酸エステルの存在で、線状ベクターを再結合し た。（方法論は、Ｔ、Ｍｍｎｉｉｌｔｓ、　Ｅ、Ｆ。

Ｆｒｅｎｃｈ　＆　Ｊ　Ｓ１＋ｅｂｒｏｏｋが、「分子クローニング：実験室便 覧Ｊ　、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈｘｒｂａ＋　Ｌａｂｏ＋ｘｔｏｒｙ　Ｐｒｅ ｓｓ、　１９Ｂ２．で述べているのと同じである）。各結合ステップの後、適当 なし　■貝宿主菌株（たとえば、Ｐ、プロモーターのレプレッサーを所持するＣ ６００λ）に生成物を形質転換する。新しいプラスミドには、これによって、Ｅ ｃｏＲＩ、Ｓｍａ　ＩおよびＢａｍＨＩの位置の１つが欠如する。ついで、この プラスミドをＨｐａｌで切断し、Ｂ　ａ　ｌ　３１　（ＦｒｏｍＢａ）のような エキソヌクレアーゼ処理して、５′非翻訳Ｎ遺伝子ＤＮＡの大部分とともにＮ遺 伝子に遺伝暗号を指定するＤＮＡを除いた後、ＤＮＡのフェノール抽出およびエ タノール沈殿を行う。これを、ついでＸｍｎＩで切断し、約６７０の塩基対ＤＮ Ａを低ゲル化温度のアガロース上で電気泳動によって分離した。ｐＢＴＡ４３９ をＳｍａ　Ｉと５ａｃｌで切断し、ついでフレノウ断片とデオキシヌクレオチド トリリン酸エステルの存在で再結合（これはこれらの位置を除去する）した後、 ＢａｍＨＩとＢｇｌｌＩによる切断と再結合（ＢａｍＨＩＳＳａ　Ｉ　Ｉ、Ｐｓ 　ｔ　ＩおよびＢｇｌＩＩの位置を除去するための）を行った。結果として得ら れるプラスミドをＥｃｏＲＩとＸｍｎ１で切断し、３０５４の塩基対断片をアガ ロース上で電気泳動によって分離し、フレノウ断片とデオキシヌクレオチドトリ リン酸エステルの存在で、上に述べた６７０の塩基対断片に結合した。アンピシ リン上の成長によって選択すると、β−ラクタマーゼ遺伝子の再構築による断片 の正しい配向が保証される。約６７０の塩基対断片の先頭ストランド中のＧは、 ３０５４の塩基対断片のＡＡＴＴＣの次にある。組替えプラスミドは、ＥｃｏＲ Ｉが存在するように選抜し、正のクローンのＤＮＡをＥｃｏＲＩの位置の領域に 配列する。ＰＬプロモーターとｐＢＴＡ８１２の５′非翻訳ｍＲＮＡに対応する それの配列を第１Ｂ図および配列ＩＤＮｏ：１０に示す。

ＰＬプロモーターと’ｌ”ｒａＴｐの発現は、Ｎ４８３０　［Ｍ、Ｊｏｙｃｅ　 ＆ＮＤＦ　Ｇｒｉｎｄｌｅ７　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎｘ１１．Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．ｌ８３０−１８３４参照］のような修飾されていないＬ 　■貝菌株に存在する温度感受性のレプレッサーＣ１８５７によってコントロー ルする。

ＴｒａＴｐの遺伝暗号指定全配列を第２図（Ｑｇａｊｇ、前掲）および配列ＩＤ Ｎｏ：１１に示した。これは、Ｌ　■旦中、アミノ酸２ｏと２１の間で開裂して 、脂肪酸修飾物を所持するＮ−末端のシスティン［Ｐｅ＋＋ｎｘｌ、Ｎ、Ｂ、　 ＆　ＭｉｎｋｌｅｙＥ、Ｇ、　（１９８４）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｂｅｍ、、２５ ９．５３５９−５３６０１を残すシグナル配列を含む。

ＬＨＲＨ類似体ＤＮＡの挿入の位置として用いたＴｒａＴ遺伝子内部の制限位置 が示されている。

ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体融合を発現する８つのプラスミド構成の例を第３図 および配列ＩＤＮｏ：１２．１３．１４．１５．１６．１７．１８．１９と２０ に示した。独特の挿入位置がＴｒａＴｐ分子の全体にわたって分布した。

プラスミドの構成：ｐＢＴＡ８１２は適当なＥ、ｃｏｌｉ　ＫＩ２宿主菌株（た とえばＣ６００λ）から抽出し、塩化セシウム密度勾配上で精製して調製した。

ｐＢＴＡ７３１は、製造業者の使用説明書に従って、ｐ　ＢＴＡ８１２を制限エ ンドヌクレアーゼＨｐａｌで切断し、線状ＤＮＡを、たとえば低ゲル化温度のア ガロース上で精製して構成した（Ｍａｎｉａｔｉｓ。

前掲）。

第４（ａ）図および配列ＩＤＮｏ＋２１と２２に示すＬＨＲＨ類似体に遺伝暗号 を指定するＤＮＡを、Ｂｅａｕｃａｇｔ　Ｓ、Ｌ、　＆　Ｃａｒｕ＋ｂｅｒ＋　 （１９８１）Ｔｅｌｒａ、ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｕ、、２２．１８５９−１８６２ が述べているものに基づく方法によって合成し、線状化したｐＢＴＡ８１２に結 合し、適当な菌種のンを含む媒質上で平板分離によって選択した。ＬＨＲＨ類似 体挿入物をもつプラスミドのコロニーは　［３２Ｐ］〜標識のＬＨＲＨＤＮＡを プローブとして用いるコロニーハイブリッド形成（Ｍｘｎｉｘｔｉｓ、前掲）に よるか、あるいは多数のコロニーを拾い上げ、プラスミドを抽出し、ＬＨＲＨＤ ＮＡに独特のＳｍａ　Ｉ制限位置の存在を決定することによって同定した。ＬＨ ＲＨ類似体ＤＮＡと隣接するＴｒａＴ　ＤＮＡの正しい配列と配向は、ジデオキ シヌクレオチド配列決定によって確かめた。

ｐＢＴＡ７３０．７３３および７３４は、プラスミド中の酵素の位置がすべて切 断されないように、ｐＢＴＡ８１２を、それぞれ限定量の制限エンドヌクレアー ゼ５ｓｐＩＳＳｃａ■およびＲｓａｌで消化することによって構成した。各酵素 で一度切断されたプラスミドのみを電気泳動に続いて、低ゲル化温度アガロース から除去した。第４（８）図および配列ＩＤＮｏ：２１と２２に示したＬＨＲＨ 類似体に遺伝暗号を指定するＤＮＡをこのＤＮＡに結合し、適切な新しい組替え プラスミドを所持するＥ、ｃｏｌｉを、上述のようにして同定した。正しい制限 位置がＬＨＲＨ類似体ＤＮＡを正しい配向で含んでいることを示すために、制限 地図作成とＤＮＡ配列決定を用いた。

ｐＢＴＡ７３２．７３５．７３７および７４０：これらは、選ばれた位置に挿入 されるＤＮＡの短いリンカ−断片を含む中間体の構成を必要とした。リンカ−（ 第４（ｂ）図そして配列■ＤＮｏ：２３および２４に記述）は、ＬＨＲＨ類似体 に遺伝暗号を指定するＤＮＡが、ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体の全長融合タンパ ク質を発現するための枠の中に挿入されるように、コドンの間に位置する独特の 新しいＳｍａ　Ｉの位置を提供する。

ｐＢＴＡ８１２は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶＳＳｔｕｌまたはＢａ１ ｌで完全に切断するか、あるいはＨａｅｍおよびアガロースゲル電気泳動によっ て分離したこれらの各酵素で一度切断した線状ＤＮＡで部分的に切断した。リン カ−ＤＮＡ　（第４（ｂ）図そして配列ＩＤＮｏ：２３および２４に記述）をこ れらのＤＮＡのそれぞれに結合し、Ｌ　■見に挿入した。組替えたものは、（放 射性標識のリンカ−をプローブに用いるか、あるいは数多くのコロニーからのＤ ＮＡの制限分析による）コロニーハイブリッド形成によって選抜した。リンカ− は、リンカ−の配向に応じて、ＳｍａＩの位置がコドンの間にあるように設計さ れていた。リンカ−の配向は、その領域のＤＮＡを配列決定するかあるいはあた らしい位置がっくり出されるときにはその存在によって、もしくはＬＨＲＨ類似 体遺伝子をＳｍａ　Ｉの位置に挿入し、その組替え物についてＴｒａＴｐ−ＬＨ ＲＨ類似体融合タンパク質を検定することによって決定した。

ＬＨＲＨ類似体に遺伝暗号を指定するＤＮＡ　（第４図そして配列ＩＤＮｏ＋２ １および２２に記述）は、ｐ　ＢＴＡ　７３０について上に述べたのと同じリン カ−を含む構成物のＳｍａ　Ｉの位置に挿入した。

最終の構成物のヌクレオチド配列を決定するに際し、ｐＢＴＡ７３２は、ＬＨＲ Ｈ類似体／リンカ−／ＴｒａＴ　ＤＮＡの３′結合部において、３つの塩基を失 っていることを認めた。

ｐＢＴＡ６０９は、ＬＨＲＨ類似体がアミノ酸３１と３２の間に挿入されたＴｒ ａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体融合物である。生体外の突然変異誘発によってコドンが ＰｖｕＩＩの位置に変換しく新しいコドンはＧｌｎとＬｅｕを表す）　、ＬＨＲ Ｈ類似体に遺伝暗号を指定するＤＮＡがこの位置に挿入された。タンパク質配列 がこの領域でとくに親水性であるため、この位置を選んだ。この位置での挿入ペ プチドはＴｒａＴｐ分子の表面に露出し、したがってより抗原性となるであろう 。

ｐＢＴＡ７３６　（宿主ベクター組合せＢＴＡ１６６９）は、ＴｒａＴ中の２つ の異なる位置に挿入されたＬＨＲＨ類似体を含み、ｐＢＴＡ７３１とｐＢＴＡ７ ３２の複合物である。

プラスミドは、また、１つの位置にＬＨＲＨ類似体の多重挿入を含むように構成 した。２個のＬＨＲＨ類似体分子をもつ構成物（ｐＢＴＡ８７０そして配列ＩＤ Ｎｏ　：　２９に記述されている通り）は、第４（Ｃ）図と配列ＩＤＮｏ：２５ および２６に示すＬＨＲＨ類似体に遺伝暗号を指定するＤＮＡをｐＢＴＡ７３３ 中のＬＨＲＨ類似体のＳｍａ　Ｉの位置に挿入し、形質転換後、上述のように、 ２つのＬＨＲＨ類似体挿入物をもつコロニーを固定してつくった。本来の’３ｍ ａ　Ｉの位置は再構成しなかったが、新しいＬＨＲＨ類似体挿入物は、第２のＬ ＨＲＨ類似体遺伝子の同等の位置にＳｍａｌの位置を所持していた（第５図：配 列ＩＤＮｏ：２９に述べられているようにｐＢＴＡ８７０）。

４つのＬＨＲＨ類似体反復をもつそれ以上の構成物（ｐＢＴＡ８６２そして配列 ＩＤＮｏ　：　３０に記述）は、ＬＨＲＨ類似体のダイマー（第４（ｄ）図と配 列ＩＤＮｏ　：　２７および２８に述べられているように）に遺伝暗号を指定す るＤＮＡをｐＢＴＡ８７０のＳｍａ　Ｉの位置に挿入するこによってつくった。

再び、本来のＳｍａ１位置は失われ、新しい位置がＬＨＲＨ類似体ＤＮＡの末端 近くにつくり出された。ＬＨＲＨ類似体の６および８の反復をもつ構成物は、Ｌ ＨＲＨ類似体のダイマーＤＮＡをｐＢＴＡ８６２に連続的に添加してつくった。

いくつかのＬＨＲＨ類似体遺伝子のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ多重同一縦列反復を用 いる場合に起ることのあるプラスミドの不安定性を避けるため、（コドン縮退を 使用して）変化させた。

第５図は、ＴｒａＴｐのアミノ酸２００と２０１の間にそれぞれ２．４および８ つのＬＨＲＨ類似体挿入物を所持するプラスミドｐＢＴＡ８７０、ｐＢＴＡ８６ ２、ｐＢＴＡ８５９を示すものである（配列ＩＤＮｏ：２９．３０および３１に 夫々述べられている通り）。出発プラスミドとしてｐＢＴＡ７３２とｐＢＴＡ７ ４０を用いて、ＬＨＲＨ類似体ＤＮＡ（７）多重物を含むｐＢＴＡ８７０．ｐＢ ＴＡ８６２およびｐＢＴＡ８５９に類似のプラスミドを構成することができるこ とが分る。

上述のすべてのプラスミドを、Ｐｈｕｕｅｉｘ　ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、　： １．ウェーデン、から利用できる温度感受性のレプレッサーＣｌ８５７［Ｍ。

Ｊｏ７ｅ！、　Ｎ、　Ｄ、　Ｆ、　Ｇ山川！、前掲コを含むＬ　■見菌株に挿入 した。Ｃ１８５７レブレツサーを所持する他の菌株がＮ４８３００代りに使用で 上げることによって誘発する。いずれの構成物も予想した大きさのＴｒａＴｐ− ＬＨＲＨ類似体タンパク質を産出した。それぞれの産出量はＬＨＲＨ類似体押入 の位置によって変化し、大部分はＴｒａＴｐ単独よりも高いレベルで産出した。

細胞破損に続いて、融合タンパク質を抽出し、実施例２のように、動物に注射す るため精製した。

実施例２ ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体融合タンパク質の精製実施例４に述べた最初の選抜 実験では、Ｌ　■亘タンパク質のパルから融合タンパク質を分離するのに、簡単 な分画操作を用いた。

ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体の遺伝子融合プラスミドを含むＥ、ｃｏｌｉ菌株を 、振盪フラスコ中で３０℃で成長させ、４１℃で３ｈｒ誘発した。

遠心分離（１７，０００ｇ、２０ｍ１ｎ）によって細菌を収納し、細胞は、フレ ンチプレスを用いて０．１Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５、ＩＯｍＭＥＤＴＡに 溶解した。溶解した細胞は、ついで、２５％グリセロール上に重層し１０．０Ｏ ＯＸ　ｇで］　５ｍ　ｉ　ｎ遠心分離して、封入体から分離した。

封入体（ベレット）は、音波処理によって、５％ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ−１００を含 むＩ）、１Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＥＤＴＡに懸濁した。音 波処理をした物質は、１２．　［１００Ｘ　ｇで２０ｍ１ｎ遠心分離し、不溶体 （ＩＦ）を得た。可容体（Ｓ　Ｆ）は、ベレットを０、ＩＭ）リス−ＨＣｌ　ｐ Ｈ７，５，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ中に再懸濁して得た。この物質は、 ついで、エタノールを５０％まで加えて沈殿させ、注射前に、塩類溶液（Ｓ　Ｆ ）に再懸濁した。不溶体（ＩＦ）も、注射前に、塩類溶液に懸濁した。

より純度の高い免疫原をより多量に必要とする後の試験では、ＴｒａＴｐ−ＬＨ ＲＨ類似体の遺伝子融合プラスミドを含むＥ、ｃｏｌｉ菌株を振盪フラスコ中で ３０℃成長させ、４１℃で３ｈｒ誘発した。細菌を遠心分離（１７，０００ｇ、 ２０ｍ１ｎ）によって収納し、細胞は、ＡＰＶＧａｕｌｉｎ　１５ＭＲホモジナ イーザ−（９，０ＱＯｐ　ｓ　ｉで７回通し）を用いて、０．１Ｍトリス−ＨＣ ｌ　ｐＨ７，５，５［１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解した。遠心分離（２０ｍ１ｎ、　 ＩＯ，０ＯＯＸｇ）の後、融合タンパク質を含む不溶性のベレット画分を溶解緩 衝液で一度洗浄し、ついでタンパク質を１０％ＳＤＳ、０．］ＩＭリス−ＭＣＩ 　ｐＨ７，５，２５ｍ　ＭＥＤＴＡに可溶化した。この物質を遠心分離（２０ｍ １ｎＸ］５，０００ｇ）　Ｌ、、上澄みを、２％ＳＤＳ、５０ｍＭ　トリス−Ｍ ＣＩ　ｐＨ７，５，２５ｍ　ＭＥＤＴＡで平衡化した５ｅｐｂｌｃ＋７１５−２ ００　ＨＲカラムにかけた。カラムはこの緩衝液で溶出し、融合タンパク質（Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥで分析）を含む画分を５０％エタノールで沈殿させる。ベレット は、１％２ｖｉｌｌｅｒｇｅｎｌ　３−１２．　０．　ＩＭ　）リス−ＨＣｌ　 ｐＨ７，５，２５ｍ　ＭＥＤＴＡで抽出し、ついで２％ＳＤＳに再可溶化した。

この物質を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，５，［１，５％ＳＤＳ平衡 化したヒドロキシアパタイトカラムにかけ、０．５％ＳＤＳ中の０．０５−０． ５Ｍリン酸ナトリウム勾配ｐＨ６，５で溶出した。融合タンパク質を含む画分を プールし、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で純度を分析した。タンパク質濃度はＡｇ３とア ミノ酸分析によって測定し、リポ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）含有率は１％（Ｗ／Ｗ）以 下であることが示された。最終の生成物は５０％エタノールで沈殿させ、配合前 に０．１％ＳＤＳに再可溶化した。

実施例３ 血清中の抗原とテストステロン産出の測定法Ａ、ＥＬＩＳＡ ”Ｉｍｍｕｌｏｎ　２″　ミクロエリサブレート（Ｄ７ｎｌｅｃｂ）を、　０． １Ｍ炭炭酸塩型炭酸塩ｐＨ９，６（ウェル当り　１００μＩ）中のオボアル溶液 または０．２５μｇ／ｍｌ　ＴｒａＴｐにより、４℃チー夜温ｉ１した。各ステ ップ後、０．０５％Ｔｖｅｅｎを含むリン酸塩緩衝塩類溶液で５回洗浄した。プ レートは、０．１Ｍ炭炭酸塩型炭酸塩中の１％ゼラチン溶液（Ｄｘｖｉｓ　Ｇｅ ｌ！ｔｉｎｅ　Ｃｏｍｐｕｙ　Ａｏｓｌ、　Ｐｊ７．　Ｌａｄ、）のウェル当り 　２００μｌにより、３７℃でｌｈｒ　“ブロック”した。プレートは上記のよ うに洗浄した。血清をＰＢＳ／Ｔ中１：２００に希釈し、これを１００μｌ　Ｐ ＢＳ／Ｔ中２倍に希釈した。血清は３７℃でｌｈｒ温置装た。

ＰＢＳ／Ｔ中で洗浄後、ペルオキシダーゼに結合した接合物をＰＢＳ／Ｔ（ウェ ル当す１００μｌ）中１：　１　／２０［１０）割合でプレートに加え、３７℃ で４０〜４５ｍ１ｎ温置した。接合物は、Ｇｏｌｔ　ｘｎｌｉ−ｒｚｌ　１１Ｇ 、　（ＩＰＬ）Ｒｘｂｂｉｌ　ｚｌｉ−ｍｏｕｅ　ＩｇＧ、　（ＩＰＬ）、Ｒｓ ｂｂｉｔ　！ＩＩ目−ｄｏｇＩｇＧ、　（Ｎｏｒｄｉｃ）、ＧｏＮ　ａｎｔｉ− ｂａｖｉｎｅ　ＩｇＧ、　０ＦＰＬ）およびＲａｂｂｉｔ　ａｎｌｉ−ｓｂｅｅ ｐ　ＩｇＧ、　（Ｄａｋｏ）であった。

洗浄後、ペルオキシダーゼ基質１００μｌを各ウェルに加えた。

この基質は、０，１Ｍクエン酸塩リン酸塩緩衝液ｐＨ４，０中の０．５ｍｇ／ｍ ｌ　２．　２−−アジノビス（３−エチルベンジンチアプリンスルホン酸（ＡＢ ＴＳ）からなっており、プレートへ添加する直前にこれに０．１％Ｈ２０゜を加 えた。別に述べなければ、使用したすべての薬品と試薬はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　ＣｏｍｐａＢからの分析ブレ血清を、０．５％ｖ／ｖのウシ血清アル ブミンを含む０．０１Ｍリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ／ＢＳＡ：以下緩衝液と する）中、１：５００に希釈した。この溶液１００μｍを、緩衝液２００μｍを 含む３ｍｌポリプロピレン放射線免疫検定管（Ｉｏｂｎｓ）に加え、これに、最 終的に抗血清の希釈度が１　：　２００Ｇとなるように、ＩＱ、　０００ｃｐｍ 　（概略）のＩ　１２’　ＬＨＲＨ（Ａｍｅｒｓ’ｈａｍ／Ｄｕｐｏｎｊ）　Ｉ Ｏ［１μｌを加えた。

管は、室温（１４〜２０℃）で−夜装置した。第２の抗体（Ｓｈｅｅｐａｎロー ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧまたは５ｈｅｅｐ　ｘｕｌｉ−ｄｏｇ　ＩｇＧ；５ｉｌｅｎ ｕｓ）を緩衝液で１＝２０に希釈して管当り　１００μｍをを加え、ついで室温 でｌｈｒ温直した。

容管に、ポリエチレングリコール（１ｍｌ）分子量６０００〜フ５００（ＰＥＧ 、ＢＤＨ）を加え（全計数を除＜）、管に渦をつくった後、２．５００＋ｐｍで ３Ｑｍｉｎ遠心分離した。上澄みをデカントし、管を水切りした。

多重チャンネルのガンマ計数器（Ｃ１ｉｎｉｇ１ｍｍｇ計数器、ＬＫＢ）中で１ 　ｍｉｎ間ペレットを計数した。結果は、加えた全放射能計数「マイナス非特異 性結合（ＮＳＢ）Ｊの百分率（％）として表し、血清中のＬＨＲＨ抗体の％を得 た。

別に述べなければ、使用したすべての薬品と試薬はＳ　ｉ　ｇｍａＣ１＋ｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ７からの分析グレードであった。

Ｃ，イヌ血清中のテストステロンの測定“Ｄｉｒｅｃｔ　Ｔｅ５ｊｏｓｊｅ＋ｏ ｎｅ　ｃｏｍｍｅｒｉｃｘｌ　ｋ目”　（ＳＰＥＣＴＲＩＡ、Ｆａ＋ｍｏｓＤｉ ａｇｎｏｓｔｉｅｘ、フィンランド製）を用いて、テストステロンを測定したが 、支給された管には、第２の抗体をプレコートした。イヌ血清を、正副２本のプ レコード管に加えた後、１２５１−テストステロン（２００μｌ）、テストステ ロン抗血清（２００ｍｌ、ウサギ中で育てたもの）を添加し、３７℃で正確に２ ｈｒ温置した。去勢したイヌの血清を標準曲線とＱＣ曲線に加え、放射線免疫検 定での血清の影響を補償した。遠心分離することなく上澄みをデカントし、吸収 紙で軽くたたき、洗浄液（リン酸塩緩衝液、支給品）１ｍｌで洗浄して水を切り 、その後多重チャンネルのガンマ計数器（（ｌｉｌｉｇｘｍｍａ計数器、ＬＫＢ ）中で１　ｍｉｎ計数した。データはテストステロンのｎ　ｇ　／　ｍ　Ｉとし て表した。

どのＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体融合タンパク質がＬＨＲＨ抗体を引出すのにも ；とも活性があるかというととことを決定するため、数グループの雌スイスマウ ス（ｎ＝５：各１８〜２２ｇ）を、アジュバント（７３０１）〜７３７ｐおよび ７４０ｐ）なしで、９種の異なるＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ 酸質構成物処置をし、タンパク質の不溶体（ＩＦ）と可溶体（Ｓ　Ｆ）を比較し た。コントロールグループ（Ｎ＝５）は、同じ方法で調製した’ｌ”ｒａＴｐで 免疫処置をした。

マウスには、１００μｌ塩類溶液中のタンｄり質１５０μｇを、０日と２８日目 にそれぞれの腿部筋肉に注射した。

血液試料は、帆２８および４２日目に眼窩後方の網状構造から採集した。個々の マウスからの血清のアリコートをプールし、ＥＬＩＳＡおよびＬＨＲＨトレーサ ー結合検定法によってＬＨＲＨ抗体の力価を分析した。４２日目の採血のデータ を第２表に示した。

データによれば、融合タンパク質構成物のうちの若干のもの、とくにタンパク質 ７３２ｐ、７３３および７４０ｐのみが、塩類溶液中で投与したとき、ＬＨＲＨ 抗体を育てるのに有効であった。有効な抗原を発生するＬＨＲＨ類似体挿入の位 置は、つくられた構成物の検査で予想することができなかった。ＬＨＲＨへの結 合％（およびると、種々の構成物からのＩＦとＳＦ物質のいずれによっても、有 効り質は、単一の明確な化学的実体を生じ、したがって、それらは、ＬＨＲＨの 化学的接合と比較して、安定性、生産性、品質コントロールおよび品質保証の面 で有利性が加わっている。

実施例５ １す］１二りす上員鄭り瞳久ηジ［（７む■工ｉＡ１渣で免疫処置したイヌのＴ −細胞増殖および抗体応答この実験は、イヌなどの目標とする種で、融合タン、 （り質７３２ｐが、ＬＨＲＨに対する抗体応答だけでなく、Ｔ−細胞を引出すこ と力（できるかどうかを決定するために計画した。Ｔ−細胞応答は、免疫去勢プ ロセスそのものにおける望ましいエフェクターメカニズムを表し、また／あるい は、ＬＨＲＨ抗体の産出におけるＴ−細胞の助力を与えるであろう。

年令、性および飼育の混った１５匹のイヌを、５匹づつ３グループにランダムに 分けた。１つのグループには、アルヒドロゲル中のｐＢＴＡ７３２融合タンパク 質１ｍｇを与え、もう１つのグループには、Ｍａｎｌａｎｉｄｅ　Ｉ　Ｓ　Ａ　 −２０中の融合タンパク質１ｍｇを与え、第３のグループには、サポニン中の融 合タンパク質構成物１ｍｇを注射した。この３つの配合は、すべて、０．１％Ｓ ＤＳを含んでいた。動物には、０．２８および５６日目に筋肉に注射した。

Ａ、　Ｔ−細胞増殖 ｐＢＴＡ７３２から誘導した融合タンパク質による免疫処置後のＴ−細胞応答を 、つぎのようにして測定した。簡単に、頭部または頚部の血管から血液試料（５ 〜］０ｍ１）を採取しく４２日目以前）、Ｔ−細胞を豊富にした細胞画分をつぎ のように調製した。

ヘパリンを添加した血液的］Ｏｍ　１を、Ｆｉｃｏｌｌ−？ｇｕｅ　（Ｐｈａｒ ｍｇｃｉａ）６ｍｌ上に重層し、４００ｇ、　３０〜４０ｍ１ｎの勾配遠心分離 によって、Ｔ−細胞を分離した。ヘパリン添加の血液１０ｍ１から回収されたＴ −細胞の収率は１５〜２０ＸＩＯ’であった。Ｔ−細胞（１０％ウシ胎児血清を 含むＲＰＭ１１６４０媒質（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏ「ｉｅｓ　Ｉｎｃ、。

Ｍｃｌｅａｎ、　Ｖｌ、米国）０．２ｍｌ中１０５個）は、平底培養プレート中 で、種々の量のＴｒａＴｐ、ＬＨＲＨまたはＰＨＡにより、３７℃で３〜５日培 養した。収納の１６〜１８ｈ　ｒ前に、トリチウム化したチミジンの０．５μＣ ４で細胞に標識をつけ、収納して、液体シンチレーション計数器中で計数した。

結果は刺激指数で表したが、これは、抗原が存在するときのｃ、　ｐ、　ｍ、を 抗原が存在しないときのｃ、　ｐ、　ｍ、で割って計算したものである。

第６図のデータによれば、３つのグループのすべてで、ＴｒａＴｐおよびＬＨＲ Ｈのいずれに対しても、強いＴ−細胞の応答が引出されている。サポニン中に配 合したタンパク質７３２ｐは、とくにＬＨＲＨに対して、Ｍｏｎｊａｎｉｄｅ　 ｌ５Ａ−２０やアルヒドロゲル中よりも、Ｔ−細胞を喚起するのにより有効であ るように思われた。得られた強いＴ−細胞の応答は、ＬＨＲＨに対する抗体応答 （結合検定法で測定した）と適度によく相関した。

Ｂ、抗体応答 １、融合タンパク質７３２ｐで免疫処置をした後に発生するＬＨＲＨのレベルを 測定するために、０．２８．４２．５６および７０日目に頭部および頚部の血管 から血液試料（５〜８ｍ１）を採取し、ＬＨＲＨトレーサー結合検定法（実施例 ３Ｂで述べた）により、血清（希釈度１：２０００最終）の”５ｌ−ＬＨＲＨを 結合する能力を分析した。

第７図のデータによれば、ＬＨＲＨに対する抗体は、ＳＤＳ／サポニン配合中の ７３２ｐ融合タンパク質で免疫処置をしたイヌで引出され、一方、抗ＬＨＲＨ応 答は、アルヒドロゲルまたはＭｏ１ｘｎｉｄｅ　ｌ５Ａ−２０中の融合タンパク 質を与えられた動物で、ずっと低かった。したがって、ＬＨＲＨに対する抗体を 引出すには、アルヒドロゲルやＭｏｎ１ａｎｉｄｅ　Ｉｓ＾−２０よりも、サポ ニンがこの融合タンパク質にとってより有効なアジュバントであると思われる。

２、多重ＬＨＲＨ類似体構成物（８６２ｐ）がＬＨＲＨ抗体を刺激する効力を検 定するために、上記の実験から５匹のイヌ、４匹は゛サポニングループ”、１匹 はＭｏｎｊａｎｉｄｅ　Ｉｓ＾−２０グループ、をさらにつぎのようにテストし た。　１２１２１日目１次の免疫処置に関して）に、５匹のイヌすべてに、縦列 に配置したＬＨＲＨ類似体［配列ＩＤＮｏ：３０に述べられているようにコの４ つの挿入物を含むＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ色質６２　ｐ） のブースター注射（第８図のブースター＃３）をさらに与えた。すなわち、各イ ヌに、０．０５％サポニンと０．１％ＳＤＳ中のこの融合タンパク質構成物５０ ０μｇを与えた。これらのイヌから、　Ｉ２１（ブースター＃３の前）、１３４ ．　Ｊ４］、１４８．　１５５．　１５２．　］Ｉ６および１６７６７日目を採 った。第８図のデータによれば、ＬＨＲＨ類似体の４つの挿入物を含むＴｒａＴ ｐ融合タン融合タンパ物質構成物て、これらの５匹のイヌに、高いレベルのＬＨ ＲＨ抗体が引出された。７３２ｐに対するＬＨＲＨ抗体応答（第８図のブースタ ー１とブースター２）も、比較として示した。

これらの結果は、サポニンとＳＤＳ中にＬＨＲＨ類似体の多重模写を含む融合タ ンパク質でイヌの免疫処置を行うと、強いＬＨＲＨ抗体応答を喚起できることを 示している。この応答の結果として、畢丸と前立腺の重量減少によって示される 随伴の去勢効果とともに、テストステロン合成が完全に減少した。すなわち、１ ２．０−１７．０ｋｇの範囲の比較できる体重で、畢丸はコントロールのイヌの ９．６に対して３．２ｇ、前立腺はコントロールのイヌの９２に対して１．５ｇ であった（第１０図）。これらのデータは、融合タンパク質の混合物、たとえば 、８６２　ｐと７３２ｐまたは７３２ｐの誘導体が、それぞれ単独の投与よりも 、より効力のあることを証明するものであろう。

サポニン中に配合したＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ色質原性は 、アルヒドロシルまたはＭｏｎｆａｎｉｄｅ　ｌ５Ａ−２０中のそれよりも優れ ていたので融合タンパク質構成物を含む以後の研究は、すべて、サポニン／ＳＤ Ｓ配合を用いて行った。

実施例６ ＬＨＲＨ類似体多重挿入物を含むＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ 色質処置をしたイヌのＴ−細胞増殖応答ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ色質原 性を高めることを試みて、われわれは、縦列に配置した１〜８のＬＨＲＨ類似体 エピトープを含むＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合タンパ色質として指定 する構成物を調製した。精製後、融合タンパク質の免疫原を異系交配したマウス とイヌでテストした。

第９（ａ）図の結果によれば、イヌにおいて、ＬＨＲＨ類似体の多重挿入物を含 む融合タンパク質は、１つの挿入物を含む構成物よりも、高い抗ＬＨＲＨ応答を 発生した（　ｉ２’１−ＬＨＲＨの結合によって測定、血清の希釈度１　：　２ ０００最終）。実際に、ＴｒａＴｐ１分子当りのＬＨＲＨ類似体挿入物の数の増 加に対応するＬＨＲＨ結合の増加があった。Ｔ−細胞の増殖については、担体分 子中のＬＨＲＨ類似体単位の数に対応して、試験管内で、ＬＨＲＨに対する応答 の増加（刺激指数の点から）があった（第１Ｉ図）。したがって、Ｔ−細胞デー タは、ＬＨＲＨ対する抗体応答で見られる傾向を確かにする（第１１図）。

ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体融合物７３３ｐ、８７０ｐ、８６２ｐおよび８５９ ｐは、ＴｒａＴｐの同じ位置に、それぞれ１−）、２つ、４つおよび８つのＬＨ ＲＨ類似体挿入物を含む融合タンパク質のことである。

異系交配したイヌ（グループ当りｎ＝５）の２つの位置に、０日および２８日目 に筋肉に免疫処置をした（位置当り０．５ｒｎｌ）、一方、異系交配したマウス （ＡＲＣスイス、グループ当りｎ＝１０）にも２つの位置で筋肉に免疫処置をし たが、投与量はイヌに投与した量の１／１０（位置当り０．０５ｍ１）とした。

使用した融合タンパク質はっぎのようである。

グループ１　：　７３３　（０，０７５％サポニンと０．１％ＳＤＳ中７５０中 宮５０μループ２　：　８７０ｐ　（０，０７９％サポニンと０．１％ＳＤＳ中 ７９０μｇ）、グループ３　：　８６２ｐ　（０，０８６％サポニンと０．１％ ＳＤＳ中８６０μｇ）、グループ４　：　８５９１）（０，１％サポニンと０， １％ＳＤＳ中１ｍｇ）。マウスはこの投与量の１／１０である。イヌでは、ヘパ リン添加とヘパリン無添加の血液試料（５〜ＩＯｍ　Ｉ　）を、２８および４２ 日目に頚部の血管から採集し、４２日目のＴ−細胞増殖（前節で述べたのと同様 に測定）および２８日目と４２日目のＬＨＲＨ抗体応答（実施例４で述べたと同 じ）を測定した。マウスでは、ＬＨＲＨ抗体応答のみを血清（眼窩後方の網状組 織ルートを経て厚めた血液０．４ｍ１）中で測定した。

第９（ａ）図の結果によれば、イヌの４２日目で、ＬＨＲＨ類似体の多重挿入物 を含む融合タンパク質は、１つの挿入物を含む構成物よりも、かなり免疫原性で あった（より高い抗ＬＨＲＨ応答を喚起）。事実、ＴｒａＴｐの１分子当りのＬ ＨＲＨ類似体挿入物の数に対応して、ＬＨＲＨ結合に漸進的な増加があった。こ れと対称的に、マウスでは、８７０ｐのＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ類似体類似体融合 タンパ色質た動物の血清にはピークの結合が見られたが、８６２ｐと８５９ｐの タンパク質はいくぶん低いレベルのＬＨＲＨ結合応答を引出した（第９（ｂ）図 ）。マウスでは、ＴｒａＴｐ分子中のＬＨＲＨ類似体挿入物の数の増加とともに 結合応答が減少したという示唆はあったけれども、２８日目（最初のブースター 前）では、ＬＨＲＨ結合のレベルは両方の種とも低かった。他方において、イヌ では、融合タンパク質構成物中のＬＨＲＨ類似体単位の増加に対し、ＬＨＲＨ抗 体レベルのわずかな増加が対応した。これらの観察は、ＴｒａＴｐ分子へペプチ ドの多重反復を導入すると、挿入されたペプチドの免疫原性（より高い抗ペプチ ド応答を喚起する能力）がかなり高められることを示している。さらに、特定の 種にもっとも有効な免疫原は論理に基いて確立することができなかった。それに もかかわらず、本発明によっていま確立された原理と操作は、この技術を商業的 に興味のある他の種や融合タンパク質に適用する手段を与えるものである。

工業上の適用性 本発明の融合タンパク質は、宿主の生殖機能を抑止するように内因性ＬＨＲＨに 対してを推動物宿主の免疫処置をするために、塩類溶液あるいはサポニンのよう な担体に入れてその宿主に投与することのできる自己アジュバントの免疫原を提 供するのに用いられるものである。

本明細書に例示した特異な使い方にもかかわらず、ＬＨＲＨ類似体融合物に関し てここで用いた取組み方は、ＴｒａＴｐと他の免疫原性エピトープ、すなわちタ ンパク質の断片を含む天然または合成の源からのペプチドを包合するエピトープ からなる融合タンパク質を提供する手段を示唆する。タンパク質は、ＬＨＲＨＳ ＬＨ，ＦＳＨＳｇ毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）　、副腎皮質刺激ホルモン（Ａ ＣＴＨ）　、ソマトトロピン、ソマトスタチン、インスリン様増殖因子、インヒ ビン、アクチビン、フォリスタチンおよびその変異体などのホルモンまたは成長 因子であってもよく、またそれらは、透明帯抗原のような精液抗原あるいは卵子 抗原などの生物学的に興味のあるタンパク質であってもよい。代りのものとして 、原生動物、線虫、条虫、昆虫およびダニを含む寄生虫のタンパク質から誘導し た抗原であってもよく、またそれらは、細菌またはウィルス、とくに、コレラ、 エイズ、狂犬病、破傷風、天然痘、小児麻痺、ジフテリアおよび商業的に重要な その他のものを含む哺乳動物の病気に対【７て防御できるものからの抗原を含む こともできる。本発明によれば、ＴｒａＴｐとＬＨＲＨ類似体配列の融合は、Ｌ ＨＲＨに対して免疫処置をするためのワクチンを提供するのに用いることができ ることが分り、また、本発明者らは、この取組み方が、ここに含まれている教え に基づいて、上記したさらにそれ以上の免疫原性エピトープにまで外挿すること ができ得るものと信する。

１９９０年８月２１日に、オーストラリア国Ｎｅｗ　５ｏｕｔｈ　Ｖａｌｅｓ　 ２０７３．　Ｐｙｍｂｌｅ。

５ｕｔｋｉｎ　５ＨｅｅＮのＣｏｍｍｏｎｖｌＨｈ　Ｄｅｐｉ目ｗｅｎｔ　ｏｆ 　ＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅＳｅｒｖｉｃｅ＋、Ｎｅｗ　５ｏｕｔｈ　Ｗｘ ｌｅｓ　Ｒｅｇｉｏｎｘｌ　Ｌｍｂｏ＋ａ＋ｏ＋ｙにある＾ｕｓｌｒｘｌｉａｎ Ｇｏｖｅ＋＋＋ｍｅｎｌ　Ａｎｘ１７１ｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに 供託した。

菌　種　番　号　加　入　番　号 ＢＴＡ　１６６５　Ｎ９０１０３１３６６ＢＴＡ　１６６６　Ｎ９０１０３１３ ６７ＢＴＡ　１９０７　Ｎ９０１０３１３６８ｐＢＴＡ４３９を所持するＢＴＡ 　１３４９は、ブダペスト協定の規定に従って、１９８７年３月２日に、ＡＴＣ Ｃ６７３３１の加入番号で、米国ＭＤ　２０８５２、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｐａ ｒｋｌｘｖｎ　Ｄｒｉｖｅ　１２３０１のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに供託した。

第１表　ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ融合タンパク質ＴｒａＴｐ−Ｅ、　ｃ　ｏ　ｌ　 ｉ　ＴｒａＴｐ中のＬＨＲ）！　プラスミド　プラスミド　ア　ミ　ノ酸　ＬＨ ＲＨ＠＠；’Ｉｌｌ　ｐＢＴＡ　ｉ　組合せ　挿入位置※反復の数６０９ｐ　ｐ ＢＴＡｆｉＱ９　ＢＴＡＩ９０５　３Ｇ／３１　１７３０ｐ　ｐＢＴＡ７３０　 ＢＴＡＩ６６３　２４１／２４２　１７３１ｐ　ｐＢＴＡ７３１　ＢＴＡＩ６６ ４　２２０／２２１　］７３２ｐ　ｐＢＴＡ７３２　ＢＴＡ１６６５　８０／８ １　１７３３ｐ　ｐＢＴＡフ３３　ＢＴＡＩ６６６　２００／２０１　１フ３４ ｐ　ｐＢＴＡ７３４　ＢＴＡ１６６７　１７５／１７６　１７３５ｐ　ｐＢＴＡ ７３５　ＢＴＡＩ６６８　１０１／１Ｇ２　１７３６ｐ　ｐＢＴＡ７３６　ＢＴ ＡＩ６６９　８０／８１；２２０／２２１　１　各位置にっき７３７ｐ　ｐＢＴ Ａ７３７　ＢＴＡ１６７０　１４５／１４６　１７４０ｐ　ｐＢＴＡ７４０　Ｂ ＴＡ］、９０？　２３５／２３６　１８５９ｐ　ｐＢＴＡ８５９　ＢＴＡ２００ ０　２００／２０１　８８６２ｐ　ｐＢＴＡ８６２　ＢＴＡ２００４　２００／ ２０＋　４８７０ｐ　ｐＢＴＡ８７０　ＢＴＡ２０２４　２００／２０１　２※ 　アミノ酸１は、第２図に示したＴｒａＴｐシグナル配列のＭｅｔｌである。

浄シ（内容に変更なし） 第１Ｂ図 ＡＧＡＴＣＴ（ＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＡＡＣＡＡＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＡＡ ＡＡＡＴＡＡＡＴ’ＴＣＡＴＡＴＡＡＡＡＡオペレーター１３　オペレーター１ ２ ＡＣＡＴＡＣＡＧＡＴＭＣＣＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＴＣＴ ＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧΔ工ｑ Ｔｒａτ 浄！（内容に変更なし） 第３図 ＴｒａＴｐ−ＬＨＲＨ融合タンパク質 浄書（内容に変更なしン 第４図 ａＩＬＨＲＨに遺伝暗号を指定するＤＮＡ断片の配列ＧＴＣＧＴＧ　ＡＣＣＡＧ Ｔ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＧＣＡ　ＧＧＧ　ＣＣＣＧｌｕ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　 Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙｂ＝リンカ−ＤＮＡ の配列 Ｃ：ｐＢＴＡ　８７０の構成に用いられるＬＨＲＨＤＮＡの配列ＧＧＴ　ＧＡＡ 　ＣＡＴ　ＴＧＧ　ＡＧＣＴＡＣＧＧＴ　ＣＴｋ　ＣＧＣＣＣＣＣＣＡ　ＣＴＴ 　ＧＴＡ　ＡＣＣＴＣＧ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＧＣＧ　ＧＧＧｃｌｙ　Ｇ ｌｕ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

ａＩ　ｃｃＴ、’ｃＡＡ、ＣＡｃ、ｗｃ、Ｔｃｒ、ＴＡｒ、ａａｃ、ｒＴＡ、ｃ ｃａ、ｃｃａ、ｃａＡ、ｃｐ、ａ、ＣＡＴ、Ｔｃｃ、Ａｃ′秩AＴｈｃ ＣＣＡ、Ｃ？’Ｔ、ＧＴＧ、ＡＣＣ，ＡＧＡ、ＡＴＡ、ＣＣＧ、ＡＡＴ、ＧＣＣ ，ＧＧＣ，ＣＣＴ、ＣＴＣ，ＧＴＡ、ＡＣＣ，ＴＣＡ、ＡＴf Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｒｌｓ　Ｔｒｐ　Ｓ＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｓｓｒ　ＴｙｒＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ａ ｒｇ　Ｐｒ。

Ｆｉ￥！ｕｒｅ　６ Ｆｉｒ！ｕｒｅ　７ Ｆｉｇｕｒｅ　Ｓ ７３３　８７０ｐ　８６２ｐ　８５９ｐＦｉｇｕｒｅ　９ 「１闘ｒｅ　ｌ１１ ＴｒａＴｐ　（４（］　ｐｇ）　ＬＨＲＨ（４０１ｇ）　ＬＨＲＨ（４１ｇ）　 ＰトＩＡ　（２μｇ）手続補正書（自発） 平成３年５月２８日国

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＬＨＲＨ類似体の少なくとも１つの模写をＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似 体配列中の少なくとも１つの位置に挿入するか、あるいはＴｒａＴｐまたはＴｒ ａＴｐ類似体配列に融合し、脊椎動物の宿主に投与するとき、その融合タンパク 質が、脊椎動物宿主の生殖機能を抑止するＬＨＲＨに対する抗体の産出を引出す ことのできる、ＴｒａＴｐまたはその類似体とＬＨＲＨの類似体からなる融合タ ンパク質。 ２．ＬＨＲＨ類似体が配列ＩＤＮｏ．２に述べられている通りである請求項１の 融合タンパク質。 ３．アミノ酸１がＴｒａＴｐシグナル配列のＭｅｔ１である場合に、少なくとも １つのＬＨＲＨ類似体を、ＴｒａＴｐまたはＴｒａＴｐ類似体配列のアミノ酸８ ０と８１、２００と２０１あるいは２３５と２３６の間、またはこれらの位置を 組合せて挿入する請求項１または請求項２の融合タンパク質。 ４．融合タンパク質を、ここで定義した７３２ｐ、７３３ｐ、７４０ｐ、８５９ ｐ、８６２ｐおよび８７０ｐから選択する請求項１〜３のうちのいずれか１項の 融合タンパク質。 ５．請求項１〜４のうちのいずれか１項に従って、融合タンパク質を暗号化する ポリヌクレオチド分子。 ６．ポリヌクレオチド分子が、プラスミドベクターからなる組替えＤＮＡ分子で ある請求項５のポリヌクレオチド分子。 ７．融合タンパク質の発現がＰＬプロモーターのコントロール下にある請求項５ または請求項６のポリヌクレオチド分子。 ８．プラスミドベクターがｐＢＴＡ８１２である請求項６または請求項７のポリ ヌクレオチド分子。 ９．ポリヌクレオチド分子が、ここで定義したｐＢＴＡ７３２，ｐＢＴＡ７３３ ，ｐＢＴＡ７４０，ｐＢＴＡ８５９，ｐＢＴＡ８６２，およびｐＢＴＡ８７０か ら選択された組替えプラスミドである請求項５〜８のうちのいずれか１項のポリ ヌクレオチド分子。 １０．請求項１〜４のうちのいずれか１項の少なくとも１つの融合タンパク質の 有効な投与量が、ヒトまたは獣医の使用に適した担体、希釈剤、賦形剤および／ またはアジュバントとともになるワクチン。 １１．アジュバントがサポニンである請求項ｍのワクチン。 １２ポリヌクレオチド分子が複製型であり、融合タンパク質が宿主によって発現 されることのできる、請求項５〜９のうちのいずれか１項のポリヌクレオチド分 子を所持する形質転換宿主。 １３宿主がＥ．ｃｏｌｉ菌株である請求項１２の形質転換宿主。 １４．形質転換宿主が、ここで定義したＢＴＡ１６６５，ＢＴＡ１６６６，ＢＴ Ａ１９０７ＢＴＡ２０００，ＢＴＡ２００４およびＢＴＡ２０２４から選択され る請求項１２または１３の形質転換宿主。 １５．請求項１〜４のうちのいずれか１項の融合タンパク質あるいは請求項１０ または１１のワクチンで宿主を免疫処置することからなる脊椎動物宿主の生殖機 能コントロール法。 １６．請求項１〜４のうちにいずれか１項の融合タンパク質、あるいは請求項１ ０または１１のワクチンで宿主を免疫処置することからなる脊椎動物宿主の生殖 機能抑止法。 １７．宿主が家畜である請求項１５または１６の方法。