CN1317000C - 治疗奶牛乳房炎的涂膜剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗奶牛乳房炎的涂膜剂，它是以蛇床子、紫花地丁、芙蓉花、金银花、蒲公英为有效成分，苯甲酸钠为防腐剂，冰片为促透剂、聚乙烯醇为成膜材料、甘油为助溶剂，水、乙醇为溶剂，按比例配制，再经煎煮、除渣、过滤、煎煮浓缩、定容制成涂膜剂。本发明配方及制作方法独特，治疗效果显著。

Description

治疗奶牛乳房炎的涂膜剂及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种治疗奶牛乳房炎的涂膜剂及其制备方法。具体地说是以中草药为原料、配合防腐剂、促透剂制备的中成药，本发明还涉及该药物的制备方法。

二、背景技术

奶牛乳腺炎是指由于接触传染性病原微生物定植于奶牛的乳腺或由于奶牛的环境、乳头、乳房、创口或挤奶器被病原菌污染，使病原菌进入乳头池引起乳腺感染所引发的炎性过程。中兽医又称之为奶肿、乳痈等。乳腺炎可分临床型和隐性二种。江苏省农业科学院畜牧兽医研究所于2000～2002年对南京地区的奶牛乳腺炎的发病情况进行了调查，共调查集体奶牛场的奶牛452头和专业户饲养的487头奶牛，其中临床型乳腺炎的发病率为30.9％，隐性乳腺炎发病率为56.76％(头阳性率)。中国农科院中兽医研究所曾对我国22个城市的32个奶牛场的10371头成年奶牛的乳腺炎的发病情况进行了调查，发现临床型乳腺炎的发病率平均为33.41％(9.7％～55.6％)，隐性乳腺炎的发病率为74.57％。相比之下，由于发病率特高，且影响奶产量，造成的经济损失更大。因此，预防和治疗隐性奶牛乳腺炎便显得尤为重要。

目前，公认抗生素治疗奶牛乳房炎不仅会造成药物残留，影响奶的收购，而且会造成细菌耐药性。而中草药制剂因其无毒、无残留，疗效显著，得到广泛的重视与应用。但中药剂型多以口服散剂，乳房注射剂具多。散剂的优点是疗效可靠、使用方便，但由于药物经胃肠吸收，进入全身血液循环，又经肝脏的“首过效应”。真正进入乳房组织的有效物质已经很少；乳房内注射剂因直接将药物经乳头注入乳内，药物浓度高，吸收快，疗效好，但缺点是可能会对乳腺组织产生刺激性，会引发新的炎症。总结上述中药剂型的优缺点，江苏省农科院兽医研究所项目组有关专家提出以外用透皮剂用于治疗奶牛乳房炎的设想。透皮剂种类较多，中国传统的膏剂就是一种外用透皮剂，但应用于奶牛乳房炎治疗就不甚方便，一是不便涂贴，二是影响挤奶，三是容易脱落，难以在生产上推广。国外近些年来推出了一种以高分子材料为基质的外用涂膜透皮剂，优点是载药量大，刺激性小，因而备受医学界工作者的推崇，该剂型在医学上已得到广泛应用，如治疗局部组织如甲状腺、前列腺、乳房等部疾患非常有效。

由于科学技术的进步，现代的经皮给药远远突破了传统界限。现代科学实验已证实，药物透皮吸收过程包括释放、穿透及吸收进入血液循环三个阶段。释放指药物从基质中脱离出来并扩散到皮肤或黏膜表面上，穿透指药物通过表皮进入真皮、皮下组织，主要对局部组织起作用，吸收指药物通过皮肤微循环或黏膜接触后通过血管进入体循环而产生全身作用，其中分子量小的药物，能向角质层中扩散，扩散速度越往里越大；分子量较大的药物以毛孔和汗腺吸收途径为主。透皮给药制剂的优点或特点问世，概述大致有：(1)以保持血药水平稳定在治疗有效浓度范围内，具有更优越的效能性的；(2)可以提高药物在体内的预见性，由于避免了胃肠道及肝的“首过作用”，透皮给药比口服给药更稳定地直接进入血流；(3)改善病者的适应性，不必频繁给药；(4)提高安全性，如有副作用，易将贴剂移去，随时终止给药，减少了口服或注射给药的危险性；(5)可以按贴敷面积增大或减少药物剂量，避免药物的浪费；(6)经皮给药具有最大的方便性和简单性，没有其它剂型可能产生的困难和痛苦。

该剂型的优点是除具有正常疗效外，还可自行成膜，不会从皮肤脱落，在使用后3～5分钟，药剂中的成膜材料即可在外表面形成簿膜，保护内层中药成分不会散失，因药膜紧紧吸附在乳房表皮，不会造成药物脱落，在下次使用时，可揭除整个药膜，使用非常方便。鉴于此，中药涂膜剂已在奶牛业上得到应用，如浙江金华大康动物保健品有限公司研制的“乳康涂膜剂”已开始应用于生产。但该制剂的组方是以传统的蒲公英、金银花、连翘、通草等中草药，而江苏省农科院兽医研究所推出了研制开发中药涂膜剂研制的“复方蛇床子乳炎涂膜”是以蛇床子、紫花地丁、芙蓉花、金银花等为主的涂膜剂，产品性状、生产工艺均有很大差异。

三、发明内容

本发明目的在于提供一种具有改善病者的适应性，提高用药安全性，使用方便的治疗奶牛乳房炎的涂膜剂。

本发明的另一目的是提供奶牛乳房炎的涂膜剂的制备方法。

本发明的解决方案是基于医学上应用非常广泛的药透皮剂。经透皮实验证实，以中药成分蛇床子素为测定对象，通过奶牛乳房部位皮肤为透皮材料，表明该制剂有明显的透皮效果。这为奶牛乳房炎透皮效果提供了依据。在奶牛乳房炎实际治疗过程中，如采用巴布剂、膏剂等透皮药，则需要布、狗皮等垫料，而乳牛乳房结构不适合张贴，除非添加乳罩样设计。根据这一特点，选择了涂膜剂型，因为该剂型可自行成膜，保护内层药物向皮内扩散，且可随时揭除，随时涂膜，使用很方便。

本发明的治疗奶牛乳房炎的涂膜剂是由下列组分制成的：(用量为重量体积份)

紫花地丁100～150克、金银花150～200克、蛇床子200～300克、蒲公英100～150克、芙蓉花100～150克、苯甲酸钠3～4克、聚乙烯醇12430～40克、甘油50～100毫升、水不低于550ml，乙醇定容至1000ml。

制备本发明涂膜剂的最佳重量体积配比是：

紫花地丁150g、金银花200g、蛇床子300g、蒲公英150g、芙蓉花150g、苯甲酸3g、冰片50g、聚乙烯醇12440g、甘油100ml、乙醇定容至1000ml。

将上述各组分制成本发明涂膜剂的生产方法是：

(1)按质量标准中处方要求进行中药饮片称重、配比；(2)加水煎煮；(3)除去药渣；(4)静置；(5)过滤；(6)加入乙醇使成70％含量；(7)去沉淀；(8)回收乙醇；(9)复加水沉淀；(10)除去沉淀；(11)上清液煎煮浓缩；(12)加乙醇使成60％含量的药液；(13)缓慢加入聚乙烯醇甘油、苯甲酸钠溶液，边加边搅拌；(14)加入冰片的乙醇溶液定容至1000ml充分搅拌均匀制得；其中步骤(2)中的煎煮为文火煎煮，时间大约2小时；步骤(4)中的静置时间大约为24小时。

本发明的一个重要特点是涂膜剂中含有蛇床子。有关实验如下：

1、涂膜剂抑菌试验。

用打孔器将定性滤纸打成与标准药敏纸片一般大的圆形纸片，直径约6mm。将纸片于该涂片剂中浸透、凉干，参照药敏纸片法试验在营养琼脂平板上做复方蛇床子乳炎涂膜剂对无乳链球菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验，同时设青霉素钠药敏纸片做对照。细菌培养液分别均匀涂布于平板后，贴上药敏纸片，分别置37℃温箱培养，24h～36h后观察结果。青霉素纸片对3种细菌均有非常敏感的抑菌作用，抑菌圈在20mm以上，属高度敏感；涂膜剂对金黄色葡萄球菌抑菌圈达19.8mm，按近高度敏感，对无乳链球菌和停乳链球菌抑菌圈分别达18.3mm和16.5mm，属中度敏感。从上述结果看，该涂膜剂对奶牛乳房炎常见致病菌有较好的抑菌效果，虽然抑菌效果不如青霉素，主要是由于该药剂不完全是通过抑菌来发挥药效，而应该是通过抗菌抗炎、提高免疫力来达到治疗目的。

2、涂膜剂对小鼠的抗炎作用。

采用昆明种小鼠，雄性19～21g，用硫化钡脱毛后，洗净擦干，将涂膜剂按2.25cm2面积涂布于脱毛处，待3～5分钟成膜后，为防小鼠撕咬，用胶带固定4h，将二甲苯涂于小鼠左耳。1h后处死小鼠，取动物左、右耳用内径8mm的钢铳铳下耳片称重，比较肿胀度。肿胀度＝左耳片重量-右耳片重量。试验组、对照组均为10只。

结果见下表，涂膜剂对二甲苯所致的耳肿胀有明显的抗炎作用。

组别	动物数(n)	剂量(cm2/20g)	耳肿胀度(Mean±SD)
				涂膜组对照组	1010	2.252.25	0.0138±0.00430.0063±0.0061*

3、涂膜剂对小白鼠白细胞吞噬机能的影响。

采用昆明纯种小白鼠，体重21-25克，全部雌性，共32只：药物组、对照组和空白组均10只。

白细胞吞噬试验：用金黄色葡萄球菌(菌种为中监所1885/C56005)接种于普通琼脂，37℃恒温培养18小时后，用生理盐水稀释成含菌量为20亿/毫升的菌悬液。给药3天后各组小鼠均腹腔注射0.6ml菌悬液；6小时后断尾采血涂片，瑞氏液染色。100倍油镜下计数100个白细胞，记录吞噬细菌的白细胞总数。吞噬率＝(吞噬有葡萄球菌的中性粒细胞/100个中性粒细胞)×100％

结果见下表，药物组与对照组，药物组与空白组比较，白细胞吞噬百分率差异均极显著(P＜0.01)。药物组白细胞吞噬百分率比对照组高22.1-10.5＝11.6个百分点，药物组比空白组高22.1-10.1＝12个百分点。而对照组白细胞吞噬百分率与空白组相差10.5-10.1＝0.4，两组差异不明显(P＞0.05)。

组别	动物只数	吞噬百分率％(X±Sx)	T值	P值
					药物组对照组空白组	101010	22.1±2.7710.5±2.2910.1±1.81	3.681*3.625*	＜0.01＜0.01

4、涂膜剂对健康大白兔皮肤安全性试验。

取6只实验健康大白兔，雌雄各半，体重2.2+0.35kg，分为二组并在背部用脱毛剂脱出10×20cm2无毛区。脱毛后第2天，将一组兔在背部左册涂布该涂膜剂，右侧涂布空白基质剂，待3~5分钟成膜后，隔离饲养观察；第二组用针剂人为破损皮肤，按下面标准观察并评定打分，最后统计平均刺激反应值，评价刺激性大小。评定标准红斑：无红斑0分；勉强可见1分；明显可见2分；中度严重红斑3分；紫红色红斑并有焦痂4分；水肿：无水肿0分；勉强可见1分；可见(边缘高出皮肤)2分；皮肤隆起约1mm，轮廓清楚3分；水肿隆起1mm以上4分。最高值为8分。结果由下表可以看出，完整皮肤组无红斑和水肿反应；损伤皮肤组未发现明显的红斑和水肿反应，个别兔在用药初有勉强可见的红斑但不久消失，表明该涂膜剂无论对完整皮肤组还是破损皮肤组均无明显的刺激性。

皮肤处理	动物数	积分总和			平均反应值
								1h	24h	48h	1h	24h	48h
		正常皮肤使用空白基质正常皮肤使用涂膜剂损伤皮肤使用空白基质损伤皮肤使用涂膜剂	3333	0022	0000	0000	000.660.66							0000	0000

4、涂膜剂稳定性试验。

本试验验证了3个批次“复方蛇床子乳炎涂膜剂”在密封、干燥、室温条件下保存1个月、2个月、3个月、6个月、12个月在颜色、气味、氯原酸和蛇床子素测定及对大白兔皮肤刺激性等方面有无变化。

(1)在不同时间段性状及有效成分测定。

选择3个批次的涂膜剂分别在生产后第1、2、3、6、12个月检查、颜色、气味及氯原酸和蛇床子素检测(均按质量标准要求测定)，记录结果，并作比较分析。结果表明：在生产后1个月、2个月、3个月、6个月及12个月检查均与生产后第1天无明显区别，氯原酸及蛇床子测定均符合质量标准要求(见下表)

                    “涂膜剂”性状及有效成分测定

批次	颜色					气味					绿原酸					蛇床子素
																					1	2	3	6	12	1	2	3	6	12	1	2	3	6	12	1	2	3	6	12
	20020403	棕褐	棕褐	棕褐	棕褐	棕褐	香苦	香苦	香苦	香苦	香苦	+	+	+	+	+	+	+	+	+																					+
20020613																					棕褐	棕褐	棕褐	棕褐	棕褐	香苦	香苦	香苦	香苦	香苦	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
	20021103	棕褐	棕褐	棕褐	棕褐	棕褐	香苦	香苦	香苦	香苦	香苦	+	+	+	+	+	+	+	+	+																					+

注：+表示检测呈阳性反应

(2)观测兔皮肤刺激性试验。

分别取生产后6个月和12个月的“复方蛇床子乳炎涂膜剂”作大白兔试验。经试验，该涂膜剂不引起大白兔皮肤出现红、肿等刺激性反应，证实保存一年后，该药剂仍可安全涂抹用于治疗。

(3)假单胞菌(Pseudomonzs zeruginosa)检测。

取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，阳性菌为本单位分离、鉴定和保存的绿脓杆菌，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18~24小时，观察阴性对照有无菌生长，其余2份培养液化线接种与溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养18~24小时。当阳性对照的平板生长的菌落呈阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判未检出铜绿假单胞菌。经微生物学检验，生产后第1、2、3、6、12个月的涂膜剂液体培养均无可疑菌落生长，表明该制剂均未发现绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌，由此证明该涂膜剂未受这两种细菌的污染。

(4)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)检测。

取亚碲酸钠肉汤(或营养肉汤)培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作为阴性对照。均培养18-24小时(必要时可延至48小时)。观察阴性对照有无细菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板或甘露醇高盐琼脂培养基平板，培养24-72小时。当阳性对照菌C56005的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于上表所列特征，可判未检出金黄色葡萄球菌。

培养基	菌落形态
		卵黄高盐琼脂甘露醇高盐琼脂	金黄色。圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1~2mm金黄色。圆形凸起，边缘整齐，外围有金黄环，菌落直径0.7～1mm

5、测定了涂膜剂对无乳链球菌乳酸脱氢酶(LDH)的影响，表明该方剂组合在达0.0625g/ml时能够降低LDH活力。

6、涂膜剂对小鼠表皮细胞作用的超微结构观察，该涂膜剂能破坏小鼠表皮角质层细胞，有利于促进药物透过皮肤。

7、涂膜剂中蛇床子素在兔血浆中的药物代谢动力学。

试验材料：3只新西兰白兔，体重2kg左右，笼养，表现健康。

仪器：高效液相色谱仪Agilent1100(中国惠普)，Eclipse DB-C18柱(4.6×250mm，5.0um)；低温高速离心机，美国Beckman公司。

试验方法：

(1)给药和血样采集：试验白兔在给药前用8％硫化钠躯干部脱毛，涂抹涂膜剂，给药后分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、10h、12h、24h、36h耳缘静脉取血，每次采血约0.5ml，至于含肝素的离心管中，混匀，3000r/min离心10min，分离血浆，-20℃冰箱保存。

(2)血浆中蛇床子素浓度的测定：准确吸取0.2ml血浆样品于1.5ml微量离心管中，加入0.3ml乙腈，于漩涡混合器上混合2min，高速离心10min(8000g/min)，吸取上清液10μl作HPLC分析。色谱条件：流动相为甲醇-水(70∶30)，检测波长325nm，流速为1ml/min，色谱柱为Eclipse DB-C18柱(4.6×250mm，5.0um)，进样10μl。

(3)实验回收率：分别取3份空白血浆样品，加入适量的蛇床子素标准溶液，配制成高中低的生物样品，按血浆处理方法处理后进样，由标准曲线求出各样品的浓度，各浓度重复测定3次，取均值，将求得的浓度与已知浓度相比，计算样品的相对回收率。

(4)精密度实验：以上高中低3个浓度的生物样品同法各测定3次，并连续测定3天，计算日内、日间变异。

(5)数据处理数据处理：血药浓度-时间数据分别按一室、二室、三室模型运用Marquardt法迭代拟合，通过对模型拟合的评价，利用F检验法及根据AIC最小的原则选出最佳模型，计算药代动力学参数。计算过程采用中国药理学会编3P87程序运行。

结果：

(1)标准曲线的制备：精确称取蛇床子素配成质量浓度为20μg/ml的蛇床子素溶液。分别取兔新鲜血浆1mL加入蛇床子素溶液，使其质量浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、2μg/ml，HPLC法测各质量浓度蛇床子素峰面积，绘制面积-浓度标准曲线(图1)。本方法测定蛇床子素的线性范围为0.05～2μg/ml，直线方程为A＝19.928C+0.1396，R2＝0.9981。

回收率和精密度实验：实验回收率和精密度见下表：

蛇床子素在血浆中的回收率和精密度

生物样品	浓度(μg/ml)	回收率		日内差		日间差
								X±SD	RSD％	X±SD	RSD％	X±SD	RSD％
		血浆	0.512	98.6±1.24100.9±4.6298.4±3.56	1.34.63.6	98.7±2.3697.6±1.2599.1±2.36	2.41.32.4							97.6±2.5699.2±2.0498.6±1.34	2.62.01.4

(2)药代动力学结果：健康白兔经皮给药后不同时间血浆药物浓度的实测值见下表，蛇床子素标准品及血浆样品的色谱图分别见图2和图3和图4。

          健康白兔经皮给药后血浆药物浓度(X±S，n＝3)

采血时间(h)	血药浓度(μg/ml)	采血时间(h)	血药浓度(μg/ml)
				123456	0.082±0.0320.134±0.0540.155±0.0710.174±0.0580.168±0.0640.153±0.072	7810122436	0.148±0.0530.138±0.0450.122±0.0500.104±0.0410.074±0.0270.054±0.023

血药浓度-时间数据采用中国药理学会编3P87程序计算，分别按一室、二室、三室模型运用Marquardt法迭代拟合，通过对模型拟合的评价，利用F检验法及根据AIC最小的原则选出最佳模型，计算药代动力学参数。经皮肤给药复方蛇床子乳炎涂膜的动力学最佳数学模型为有滞后时间的一级吸收和一级消除的二房室模型，即血药浓度与时间的关系可用下列方程式表示：Ct＝Ae-αt+Be-βt+Ge-Kat，药时曲线见图5，血药浓度的对数-时间曲线见图6，有关动力学参数见下表。

   经皮肤给药后蛇床子素在健康兔体内的药动学参数

参数	单位	数值
			AαBβKaV/FT1/2αT1/2βT1/2KaK21K10K12AUCCL(s)T(peak)C(max)	μg/ml1/hμg/ml1/h1/h(mg/kg)/(μg/ml)hhh1/h1/h1/h(μg/ml)*hmg/kg/(μg/ml)hμg/ml	0.1315700.2105890.1403390.0273120.6451054.4839493.29147625.3786961.0744730.1377600.0417510.0583895.3416160.1872093.6830380.162220

该涂膜剂透皮给药后，其成分蛇床子素能进入兔体血液循环并在血液中保持一定浓度，这为透皮给药治疗提供了佐证。计算药代动力学参数结果表明，经皮肤给药该涂膜剂的动力学最佳数学模型为有滞后时间的一级吸收和一级消除的二房室模型动力学参数：AUC＝5.342(μg/ml)*h、Tmax＝3.683h，Cmax＝166.2ng/ml、T_1/2α＝3.291h、T_1/2β＝25.3781h。

8、涂膜剂经皮渗透后蛇床子素在不同组织中的分布。

方法：

(1)给药和样品采集：

28只大鼠，体重300g左右，笼养，表现健康。试验大鼠在给药前用8％硫化钠躯干部脱毛，涂抹自制银花乳炎清涂膜剂，给药后分别于1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h分别处死大鼠3只，取血液、皮肤、乳腺和肌肉样品。

(2)生物样品的处理：

血液样品：取血液置于含肝素的离心管中，混匀，3000r/min离心10min，分离血浆，准确吸取0.2ml血浆样品于1.5ml微量离心管中，加入0.3ml乙腈，于漩涡混合器上混合2min，高速离心10min(8000g/min)，吸取上清液10ul作HPLC分析。

皮肤样品：取1g的皮肤，至于10ml的塑料管，加入2ml蒸馏水，在高速乳匀机上打碎皮肤组织、取0.5ml的组织浆，加入0.5ml的乙腈沉淀蛋白，于漩涡混合器上混合2min，高速离心10min(8000g/min)，吸取上清液10ul作HPLC分析。

乳腺样品：取1g的乳腺，置于10ml的塑料管，加入2ml蒸馏水，在高速乳匀机上打碎乳腺组织、取0.5ml的组织浆，加入0.5ml的乙腈沉淀蛋白，于漩涡混合器上混合2min，高速离心10min(8000g/min)，吸取上清液10ul作HPLC分析。

肌肉组织：取1g的肌肉，置于10ml的塑料管，加入2ml蒸馏水，在高速乳匀机上打碎肌肉组织、取0.5ml的组织浆，加入0.5ml的乙腈沉淀蛋白，于漩涡混合器上混合2min，高速离心10min(8000g/min)，吸取上清液10ul作HPLC分析。

(3)生物样品中蛇床子素浓度的测定。

准确吸取2.2中处理的上清液10ul进样作HPLC分析。色谱条件：流动相为甲醇-水(70∶30)，检测波长325nm，流速为1ml/min，色谱柱为Eclipse DB-C18柱(4.6×250mm，5.0um)，进样10ul。

(4)分析方法的建立

标准曲线的建立：精确称取蛇床子素配成质量浓度为20μg/ml的蛇床子素溶液，分别稀释成10、2、1、0.5、0.1、0.05μg/ml的标准溶液。分别取空白血浆、皮肤、乳腺和肌肉匀浆6份，分别加入不同浓度的蛇床子素标准液，按生物样品处理方法处理后进样分析。

实验回收率：分别取3份血浆、皮肤、乳腺和肌肉样品，加入适量的蛇床子素标准溶液，配制成高中低的生物样品，按生物样品处理方法处理后进样，由标准曲线求出各样品的浓度，各浓度重复测定3次，取均值，将求得的浓度与已知浓度相比，计算样品的相对回收率。

精密度实验：以上高中低3个浓度的生物样品同法各测定3次，并连续测定3天，计算日内、日间变异。

结果：

(1)标准曲线。

蛇床子素在生物样品中的标准曲线见下表

生物样品	标准曲线方程	决定系数(R2)
			血浆皮肤乳腺肌肉	A＝21.887C-0.7872A＝21.605C-0.6109A＝19.563C+0.3961A＝19.787C+0.8333	0.99990.99990.99990.9999

(2)回收率和精密度实验见下表

生物样品	浓度(μg/ml)	回收率		日内差		日间差
								X±SD	RSD％	X±SD	RSD％	X±SD	RSD％
		血浆	0.512	98.6±1.24100.9±4.6298.4±3.56	1.34.63.6	98.7±2.3697.6±1.2599.1±2.36	2.41.32.4							97.6±2.5699.2±2.0498.6±1.34	2.62.01.4
皮肤	0.512							97.6±5.4198.3±4.3297.8±4.52	5.44.44.6	98.6±3.2499.2±2.4598.8±1.24	3.32.51.3	96.8±2.0198.7±1.2598.4±1.54	2.11.31.6
		乳腺	0.512	98.5±2.3697.5±4.21100.7±3.56	2.45.63.5	99.4±1.2898.8±2.1299.1±1.02	1.32.11.0							99.6±1.2498.7±2.0498.2±1.06	1.32.11.1
肌肉	0.512							96.4±2.5698.2±2.32100.8±3.42	2.72.43.4	98.4±1.2697.8±2.8699.6±1.13	1.32.91.1	98.6±1.1198.9±1.2596.8±2.24	1.11.32.3

(3)局部透皮给药实验见下表(X±S，n＝3)

时间(h)	药物浓度(μg/ml或μg/g)
					血浆	皮肤	乳腺	肌肉
	12	0.062±0.0280.094±0.031	10.991±3.78824.890±7.016	2.867±0.8784.137±1.349					1.424±0.6521.570±0.626

48122448

0.142±0.0420.106±0.0490.087±0.0360.074±0.0280.053±0.014

11.923±4.24515.359±6.51317.540±6.4955.292±1.2761.662±0.605

3.379±1.1295.791±2.28411.018±4.6984.745±1.4070.890±0.247

1.880±0.7251.981±0.5393.452±1.1811.944±0.8440.597±0.132

空白样品和蛇床子素标准品及生物样品样品的色谱图分别见图7、8、9。

本发明的另一重要特点是涂膜剂中还含有冰片。

1、不同促透剂组合(5％冰片、5％氮酮、5％冰片+5％氮酮及空白对照)对复方蛇床子乳炎涂膜剂中蛇床子素经大鼠皮肤渗透的促透作用。

用高效液相色谱法以甲醇-水(70∶30)作为流动相，测定4中不同配方促透剂经皮给药后，蛇床子素在皮肤和肌肉中的含量。作比较分析，评价4种促透组合作用。结果表明，5％的冰片促进蛇床子素透皮效果最好。

2、含5％冰片复方蛇床子乳炎涂膜剂中蛇床子经皮渗透后在大白鼠皮肤，肌肉，乳腺及血液等组织的浓度变化。

用高效液相色谱法，以甲醇-水(70∶30)作为流动相，测定不同时间皮肤，肌肉，乳腺及血液中的射床子素含量。同时口服同样剂量蛇床子含量的药物，并测定上述四种组织中蛇床子素的含量，作比较分析。结果表明，蛇床子血液浓度：口服给药4h可达最高峰Cmax＝3.482μg/ml，而透皮给药4h只达0.142μg/ml；皮肤中含量：口服给药在皮肤中蛇床子检测不到，而透皮给药后2h可达24.89μg/g；肌肉含量：透皮给药12h，肌肉中蛇床子素含量最高为3.452μg/ml，而口服给药后峰值在4h，为0.442μg/g。乳腺含量：透皮给药后12h浓度最高为11.018μg/g，而口服给药最高含量为0.327μg/g。因此可得出：(1)口服给药后蛇床子在组织中的浓度分布大小为：血液＞肌肉＞乳腺＞皮肤；(2)透皮给药后蛇床子在组织中的浓度分布大小为：皮肤＞乳腺＞肌肉＞血液；(3)透皮给药后蛇床子在皮肤，肌肉，乳腺及血液中的含量远比口服给药高。

3、含5％冰片复方蛇床子乳炎涂膜剂中蛇床子素在兔体内的药物代谢动力学

实验兔经透皮给药后，用高效液相色谱法以甲醇-水(80∶20)作为流动相，测定血液中蛇床子素的含量。采用3P87程序计算药物代谢动力参数。结果表明，蛇床子素经透皮给药后药代动力学符合二房室开放模型，T_1/2α＝3.291h，T_1/2β＝25.378h，K₂₁＝0.1377.min^-1，AUC＝5.342(μg/ml)*h.Tmax＝3.683h，Cmax＝166.2μg/ml。复方蛇床子涂抹剂中蛇床子素能够透过皮肤进入血液，并维持一定的血药浓度。

4、含5％冰片复方蛇床子乳炎涂膜剂经奶牛乳房皮肤的体外透皮效果。

将制备的复方蛇床子乳炎涂膜剂置于牛皮表皮上方透皮装置的给药室，用HPLC法测定涂抹剂中的蛇床子素的透皮效果。试验结果表明蛇床子素的经皮渗透近似于零级动力学特征，表明该透皮剂对牛皮乳房皮肤具有明显的透皮效果。

5、含5％冰片复方蛇床子乳炎涂膜剂中蛇床子素经牛皮透皮效果观察方法：

含5％的冰片透皮剂由江苏省农业科学院兽医研究所和南京中医药大学药学院、联合研制。按方剂组成除其它药物成分不变外，蛇床子素按原药含1％的比例加入蛇床子素标准品(购自中国药物监察所)，使每克透皮剂中含有1.6mg蛇床子素。紫外扫描：确定蛇床子素最大吸收峰为325nm。

(1)标准曲线的建立。

取4mg/ml蛇床子溶液1ml，以40％乙醇定容至100ml，配成40ug/ml蛇床子素溶液，再5倍稀释；分别配成8μg/ml、1.6ug/ml、0.32ug/ml的蛇床子溶液。色谱条件：流动相为甲醇∶水＝70∶30。检测波长325nm，流速为1ml/min。检测时间为20min。将各浓度蛇床子素、溶液进样5ul，按上述色谱分离条件测定，得回归方程为Y＝4.9621X+6.6569(r＝0.99806)结果表明，蛇床子素在0.32～40μg范围内呈良好线性关系。

(2)精密度试验：取标准品溶度8μg/ml，连续进样6次进样量为5μg，按上述色谱条件分离测定，RSD＝0.31％。

(3)经皮渗透试验：取泌乳期淘汰的奶牛乳房部位皮肤；剪脱牛毛，小心剥离皮下脂肪组织，置生理盐水中浸泡，置于4℃冰箱保存。将处理好的奶牛乳房部皮肤，平展于改良的Franz扩散池装置中，固定，皮肤呈圆形，半径0.8cm，面积2cm2，给药室给予0.70g透皮剂，下层接受液为15.5ml40％乙醇溶液。磁力搅拌器搅拌，整个装置放于39℃恒温水浴中，药物从给药室渗透到接受池，每小时取接收液3ml，同时向装置中补充3ml40％乙醇溶液。液相进样5μl，测定蛇床子素的含量。

结果：

(1)2小时蛇床子素累计透过量。

不同取样点的累积经皮渗透量M按下式计算：M＝(Cn V+∑Ci Vi)

式中，M：累积透皮渗透量；Cn：各取样点时取样液的浓度。V：接收池体积；Ci：各取样点取样液的浓度；Vi：取样体积。透皮试验进行了二次重复试验(结果见表)。从下表结果可以看出二组结果基本相似。累计12h总透过量分别

444.32μg和404.93μg，平均总透过量为424.6μg。

组别	不同取样时间蛇床子素累积通透量(μg)												平均
														1h	2h	3h	4h	5h	6h	7h	8h	9h	10h	11h	12h	424.6
	1	43.4	84.8	136.9	182.6	221.3	260.9	294.7	321.0	368.6	393.6	419.2	444.3
2														40.3	88.6	739.8	189.9	241.9	279.7	290.3	345.3	363.4	382.0	392.9	404.9

(2)12h蛇床子素透过率

蛇床子素平均总透过量为424.6ug，给药室0.7克透皮剂中蛇床子素总含量1120ug，由此得出第1组透过率为39.67％，第2组透过率为36.15％，总平均透过率为37.9％。

透皮试验结果表明，本透皮剂具有一定的透皮效果，12h平均累积透过量424.6ug，透过率达37.9％。本次结果是二次重复透皮试验的结果。从重复试验结果看，二次透总量分别为444.3ug和404.9ug，误差相差不大。我们认为，累积透过率在36.15％~39.67％之间。如果以蛇床子素作为有效物质来衡量治疗量，奶牛每天使用透皮剂2次，共50克，按蛇床子素37.9％的透过量计算，应该有18克之多的生药进入奶牛乳房组织。如奶牛改用口服50克生药，那么按1％的比例计算乳房部位生药浓度(实际远不足此数)不足0.5克，相比之下，乳房外用透皮剂在药物利用率上应该是非常合理的，加之使用方便，应该具有很好的实际应用价值，应加以临床试验以验证这一推论。

本发明的涂膜剂临床使用结果表明，有以下优点：

1、本发明对奶牛无毒无害。

2、本发明使用方便，符合国家兽药规定。

3、本发明从治疗过程看，需要一定的疗程，对临床型和隐性乳房炎均有不同，应区别对待。另外，个别特别严重的超急性病例还是配合抗生素治疗为宜，在防止抗生素残留的同时，不要完全拒绝西药。

为表明本发明的涂膜剂对奶牛乳房炎治疗效果，本发明经103例临床应用，对临床型乳房炎治疗总治愈率达85％，总有效率为91.6％；对隐性乳房炎治疗总治愈率83.6％，总有效率92.7％。“复方蛇床子乳炎涂膜”分别在南京栖霞、朝阳、摄山、燕子矶等奶牛小区进行了推广试验，从推广应用的情况看，该制剂具有使用方便，疗效可靠等优点，值得进一步扩大应用。

在南京市栖霞区摄山、朝阳奶牛小区选择临床型病例患病奶牛，共48头。患病牛乳房肿大，触之热痛，不愿意行动或卧地，乳汁变深或乳汁变稀薄，混有絮状物或粒状物。重症时可呈淡黄色水样或带红色水样粘性液。同时出现不同程度的全身症状，如食欲减退或消失，有的牛体温上升达41~42℃，呼吸和心博加快，精神萎顿，有时体温可持续数天而不退。用上海乳房炎诊断试剂SMT检测阳性程度在“++”以上为隐性乳房炎病例。共有55头。

使用方法：对48头临床型乳房炎病牛的患病乳区，先挤干奶，在将乳房洗净擦干，然后用本品25ml均匀涂抹在患病乳区上，待3～5分钟便可成膜，保持至下次挤奶或第二次用药前将膜撕下。急性乳房炎(重症病例)：每天2次(早晚各一次)，连用3～4天。轻症病例及隐性乳房炎：每天2～3次，连用6～8天。使用时应注意：(1)此为外用药，不可内服。(2)乳房坏疽、损伤性乳房出血忌用。(3)如有严重性的全身症状，应配合其它药物进行综合对症治疗。(4)对急性病例，发病初期，只能冷敷。对慢性病例，在使用本品前进行热敷，可增强本品疗效。(5)本品使用前一定要将乳房洗净擦干，否则将影响本剂成膜和药物透皮，并最终影响疗效。

效果评价标准：对奶牛乳房炎治疗效果评价：临床型乳房炎：(1)痊愈：凡治疗后病牛乳房红肿消退，乳汁恢复正常，产奶量恢复病前水平，精神食欲等恢复正常。(2)有效或好转：乳房红、肿、热、痛基本消失，乳汁尚有少量凝块，产奶量回升；(3)无效：病牛乳房症状无好转、或转为慢性炎症，乳腺失去泌乳能力或瞎奶头。隐性乳房炎治疗效果评价：经治疗后，用SMT检测，凡从“+++”(强阳性)转为“-”、“+“(阴性或可疑判为治愈；“+++”→“+”亦为好转；凡“+++”“++”在治疗后不变的为无效。体细胞测定：根据乳汁体细胞数的大小确定有无好转，牛奶对体细胞的要求不得超过100万/毫升。

临床型乳房炎治疗效果：在对重症病例治疗过程中，治愈率只有73.33％(12/15)，而对轻症病例治愈率可达87.8％(29/33)，总治愈率和总有效率分别达85％(41/48)和91.6％(44/48)；与此相对比，青霉素肌肉注射作对照，对重症病例和轻症病例治愈率可分别达80％(8/10)和83.3％(10/12)，总治愈率和总有效率分别达81.8％(18/22)和90.9％(20/22)。

       “复方蛇床子乳炎涂膜剂”对临床型乳房炎临床治疗结果

从表结果中可以看出“复方蛇床子乳炎涂膜剂”对临床乳房炎具有显著的治疗效果，与青霉素治疗对照相比，疗效略高些，差异不显著。但中药涂膜剂不存在抗生素残留问题。因而不影响牛奶收购。该结果也提示我们，对严重的临床型病例可配合使用青霉素等抗生素，只是病牛所产奶不能混放。绝对排除抗生素也是不合理的。

隐性乳房炎临床治疗效果：

分别测定了治疗当日、治疗第5天和治疗第8天的测定结果。治疗5天后，治愈率达67.3％(37/55)，有效率达85.6％(47/55)；至治疗8天后治愈率和有效率分别达83.6％(37/55)和92.7％(47/55)。对照组未见一头好转。详见表。

          “复方蛇床子乳炎涂膜剂”对隐性乳房炎临床治疗结果

从表可以看出，“复方蛇床子乳炎涂膜剂”对隐性乳房炎也有较好的治疗效果，治疗8天后，总治愈率达到了83.6％(46/55)，总有效率为92.7％(51/55)。根据该结果，在使用“复方蛇床子乳炎涂膜剂”治疗隐性乳房炎时，宜治疗6~8天，可获满意疗效。

治疗前后体细胞测定结果。

从表可以看出，用复方蛇床子乳炎涂膜剂治疗后，奶牛乳汁中的体细胞数大大减少，低于100万/毫升，达到对生鲜奶的要求。

     复方蛇床子乳炎涂膜剂治疗前后奶牛体细胞数数测定结果

组别	体细胞数(105个/毫升)
				试验前	试验后10天	试验后15天
	试验组	44.24±10.12	21.54±5.08				9.29±1.96**
阳性对照组				40.2±4.69	37.89±4.48	37.76±3.98
	阴性对照组	7.38±1.31	7.56±1.24				6.80±0.89

**P＜0.01

对临床型乳房炎总治愈率和总有效率分别达85％和91.6％，对隐性乳房炎总治愈率达到了83.6％(46/55)，总有效率为92.7％(51/55)。为奶牛乳房炎的治疗提供了一种新的制剂，在治疗手段上也开辟了一条新的途径。

四、附图说明

图1蛇床子素标准曲线图。

图2蛇床子素标准品色谱图。

图3空白血浆样品色谱图。

图4给药后血浆样品色谱图。

图5经皮肤给药后蛇床子素在健康兔体内的药时曲线。

图6经皮肤给药后蛇床子素在健康兔体内的血药浓度的对数-时间曲线。

图7空白样品色谱图。

图8蛇床子素标准品色谱图。

图9生物样品色谱图。

五、具体实施方式

实施例1：

按下述配比称取原料：

紫花地丁150g、金银花200g、蛇床子300g、蒲公英150g、芙蓉花150g、冰片50g、苯甲酸钠3g、聚乙烯醇124 40g、甘油100ml、水600ml、乙醇加至1000ml。上述药物共制成涂膜剂，全量1000ml，分装成25ml/袋，40袋。

生产方法如下：

按质量标准中处方要求中药饮片称重、配比；加水文火煎煮2h；除去药渣；静置24h；滤过；加入乙醇使成70％含量；去沉淀；回收乙醇；复加水沉淀；除去沉淀；上清液煎煮浓缩；加乙醇使成60％含量的药液；缓慢加入聚乙烯醇甘油及0.3％苯甲酸钠溶液，边加边搅拌；加入5％冰片的乙醇溶液；至1000ml；充分搅拌均匀；过滤、于洁净室分装。

涂膜剂使用说明：

[组成]紫花地丁、蛇床子、芙蓉花、金银花、蒲公英。

[性状]本品为外用涂膜剂，棕色粘液。

[功效]清热解毒，活血化瘀，消肿散结，抗菌消炎。

[主治]用于治疗奶牛乳房炎症，在乳区肿胀、发热，乳汁检测有絮状凝及泌乳量减少时使用。

[用法]患牛每次挤奶后，洗净乳房，在患部乳区均匀涂抹，待3～5分钟形成膜后，至第二次挤奶时揭除药膜，进行第二次涂膜。切记口服！

[用量]每次一小包(25毫升)，均匀涂抹，每天2～3次，急性病例连用3～4天，慢性、隐性病例连用6～8天。

[储存]存于密封、干燥、阴凉处。

[包装]每箱100包，每包25毫升，每毫升含生药1克。

实施例2：

按下述配比称取原料：

紫花地丁100g、金银花150g、蛇床子200g、蒲公英100g、芙蓉花100g、冰片30g、苯甲酸钠4g、聚乙烯醇12430g、甘油50ml、水550ml、乙醇加至1000ml。

上述药物共制成涂膜剂，全量1000ml，分装成25ml/袋，40袋。

Claims (3)

1、一种治疗奶牛乳房炎的涂膜剂，其特征在于它是由下述重量体积配比的原料制成的涂膜剂：

紫花地丁100～150克、金银花150～200克、蛇床子200～300克、蒲公英100～150克、芙蓉花100～150克、苯甲酸钠3～4克、聚乙烯醇12430～40克、甘油50～100毫升、水550～600ml、冰片30～50克、乙醇定容至1000ml。

2、根据权利要求1所述的治疗奶牛乳房炎的涂膜剂，其中各有效成分的重量体积配比是：

紫花地丁150g、金银花200g、蛇床子300g、蒲公英150g、芙蓉花150g、苯甲酸钠3g、聚乙烯醇12440g、甘油100ml、水不低于550ml、乙醇定容至1000ml。

3、根据权利要求1或2所述的治疗奶牛乳房炎的涂膜剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)按所述成分进行称重、配比；(2)加水文火煎煮；(3)除去药渣；(4)静置；(5)过滤、浓缩；(6)加入乙醇；(7)去沉淀；(8)回收乙醇；(9)复加水沉淀；(10)除去沉淀；(11)上清液煎煮浓缩；(12)加水；(13)缓慢加入聚乙烯醇124、甘油及苯甲酸钠溶液，边加边搅拌；(14)加入含冰片的乙醇溶液定容至1000ml充分搅拌均匀、过滤制得。

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