CN1316004A - 利用拟南芥air合成酶筛选除草剂化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用重组生产的具有AIR合成酶活性的酶筛选具有除草剂活性的化合物的方法,以及由此鉴定可抑制不必要的植被生长的除草剂化合物的用途。另外,本发明提供了使用编码具有AIR合成酶活性之酶的基因使植物,植物组织,植物种子和植物细胞对除草剂产生耐受性的方法,以及使用这种转基因植物选择性抑制农田中的杂草生长的方法。

Description

利用拟南芥AIR合成酶筛选除草剂化合物的方法

本发明涉及筛选除草剂化合物的方法，所述化合物能抑制参与嘌呤从头生物合成的5’-磷酸核糖-5-氨基咪唑(AIR)合成酶的酶促活性。本发明还涉及由上述方法鉴定出的除草剂化合物控制不必要的植被生长的用途。本发明还可用来在植物、植物组织、植物种子和植物细胞中培育除草剂耐受性。

AIR合成酶是嘌呤从头生物合成途径中的酶促步骤，它可导致嘌呤核苷酸IMP,AMP和GMP的合成。嘌呤的从头生物合成在氮同化途径中起主要作用，并且在细菌，酵母，果蝇和哺乳动物中是保守的(Schnorr等(1994)，植物杂志，6:113-121)。AIR合成酶的酶促活性对应于所述途径中的第五步，并催化5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)转变为5’-磷酸核糖-5-氨基咪唑(AIR)。在大肠杆菌中，这一步骤是通过purM基因编码的蛋白质完成的。最近，已克隆出编码具有AIR合成酶活性之酶的拟南芥cDNA，并且测定了该cDNA的序列(Senecoff和Meagher(1993)，植物生理学，102:387-399；Schnorr等(1994)，植物杂志，6:113-121)。

在实践中，人们普遍使用除草剂控制农田中的不必要植被，例如杂草。每年的除草剂销售额超过150亿美元。尽管使用了昂贵的除草剂，但杂草控制仍是农民所面临的重大而费钱的难题。

除草剂的有效使用需要正确的田间管理。例如，使用除草剂的时间和方法以及杂草植物的发育阶段对于用除草剂良好地控制杂草至关重要。由于多种杂草对除草剂具有抗性，因此，生产有效的新除草剂愈发显得重要。目前，使用高流通量的筛选可发现新的除草剂，所述筛选利用了重组DNA技术。可通过标准的分子生物学技术重组生产植物生长和发育所必需的代谢酶，并将所述酶用作除草剂的靶，用于筛选该酶活性的新抑制剂。然后可将通过这种筛选发现的新抑制剂用作除草剂以控制不必要的植被。

不幸的是，表现出较高效力，较宽除杂草谱和在土壤中能更快降解的除草剂也具有较高的作物植物毒性。针对此问题的一个解决方法是研制能抗或耐受除草剂的作物。能耐受除草剂的作物杂种或品种允许使用除草剂杀死杂草，同时不会有损害作物的危险。耐受性的产生使得可以给作物使用除草剂，而以前由于作物对除草剂的敏感性使得除草剂的使用被禁止或限制(例如只能在突出体长出之前使用)。例如，Anderson等的美国专利4,761,373涉及抗多种咪唑啉酮或氨磺酰除草剂的植物。此抗性是由经改变的乙酰羟酸合酶(AHAS)所赋予的。Goodman等的美国专利4,975,374涉及含有编码突变的谷氨酰胺合成酶(GS)之基因的植物细胞和植物，所述植物细胞和植物对已知能抑制GS的除草剂，如膦丝菌素和methionine sulfoximine的抑制作用具有抗性。Bedbrook等的美国专利5,013,659涉及表达突变的乙酰乳酸合酶的植物，所述酶可使植物对磺酰脲除草剂的抑制作用具有抗性。Somers等的美国专利5,162,602公开了能耐受环己二酮和芳氧基苯氧基丙酸除草剂的抑制作用的植物。该耐受性是由经改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)所赋予的。

本发明的一个目的是提供鉴定新的或经改良除草剂的方法。本发明的另一目的是提供使用这种新的或经改良的除草剂抑制诸如杂草的植物生长的方法。本发明的另一目的是提供经改良的作物植物，所述作物植物能耐受这种新的或经改良的除草剂。

本发明的发明人使用能灭活内源性基因表达的反义证实系统阐明：5’-磷酸核糖-5-氨基咪唑(AIR)合成酶活性是植物所必需的。言下之意，能抑制植物AIR合成酶的化合物可能对植物具有有害的影响，并且是潜在的效果良好的候选除草剂。因此，本发明提供了使用纯化的AIR合成酶鉴定其抑制剂的方法，然后可将所述抑制剂用作除草剂以抑制作物生长田地中的不必要的植被生长，所述作物尤其指的是农学上重要的作物，例如玉米和其它谷类作物，如小麦，燕麦，黑麦，高粱，水稻，大麦，小米，草皮和饲料草等，以及棉花，甘蔗，甜菜，油菜子和大豆。

本发明首次公开了拟南芥AIR合成酶基因的正确核苷酸序列。编码前-蛋白质的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1，编码推定的成熟蛋白质的核苷酸序列示于SEQ ID NO:3。拟南芥AIR合成酶前-蛋白质的正确氨基酸序列示于SEQ ID NO:2，推定的成熟拟南芥AIR合成酶的正确氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。本发明还包括分离的酶，该酶具有AIR合成酶活性，并含有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。优选该氨基酸序列得自植物。

本发明还包括分离的核酸分子，其含有编码SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的核苷酸序列。优选核苷酸序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。在另一个实施方案中，该核苷酸序列包含于大肠杆菌菌株DH5apASM中，该菌株的NRRL保藏号为B-21976。本发明还包括嵌合基因，其含有与本发明的核酸分子可操作相连的异源启动子序列；含有所述嵌合基因的重组载体；含有所述嵌合基因的宿主细胞。优选宿主细胞是细菌细胞，酵母细胞或植物细胞。本发明还包括含有本发明的植物细胞的植物以及该植物的种子。

在优选的实施方案中，本发明描述了鉴定化合物的方法，所述化合物能够抑制植物生长或生存力，所述方法包括：(a)在酶能够催化AIR合成的条件下，在第一个反应混合物中将具有AIR合成酶活性的酶与AIR合成酶的底物相混合；(b)在相同条件下，在第二个反应混合物中将待检测的化合物和酶与AIR合成酶的底物相混合，混合时间与第一个反应混合物中的相同；(c)测定和比较第一个和第二个反应混合物中的酶活性；如果第二个反应混合物中的酶活性比第一个反应混合物中的低(明显较低才合乎需要)，则表明(b)中所述的化合物能够抑制植物生长或生存力。在优选的实施方案中，AIR合成酶的底物是5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)，而在更优选的实施方案中，AIR合成酶的底物是b-FGAM。在另一个优选的实施方案中，具有AIR合成酶活性的酶得自植物，更优选所述酶由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列所编码。在另一个实施方案中，AIR合成酶由能编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之氨基酸序列的核苷酸序列所编码。在另一个实施方案中，AIR合成酶具有与SEQID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该化合物能通过抑制植物中的AIR合成酶活性来抑制植物的生长或生存力。在另一个优选的实施方案中，通过检测反应混合物中所产生的AIR来测定酶活性。在另一个优选的实施方案中，通过检测反应混合物中由ATP衍生得到的ADP来测定酶活性。

在另一个优选的实施方案中，本发明描述了鉴定化合物的方法，所述化合物能够抑制植物生长或生存力，所述方法包括：(a)在酶能够催化AIR偶联合成的条件下，在第一个反应混合物中将具有5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)合成酶活性的酶和具有AIR合成酶活性的酶与FGAM合成酶的底物相混合；(b)在相同条件下，在第二个反应混合物中将待检测的化合物和所述酶与FGAM合成酶的底物相混合，混合时间与第一个反应混合物中的相同；和(c)测定和比较第一个和第二个反应混合物中具有AIR合成酶活性的酶的活性；如果第二个反应混合物中的AIR合成酶活性比第一个反应混合物中的低(优选为显著较低)，则表明(b)中所述的化合物能够抑制植物生长或生存力。在优选的实施方案中，FGAM合成酶的底物是5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨酰胺(FGAR)，而在更优选的实施方案中，FGAM合成酶的底物是b-FGAR。在另一个优选的实施方案中，具有AIR合成酶活性的酶得自植物，更优选所述酶由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列所编码。在另一个实施方案中，AIR合成酶由能编码SEQID NO:2或SEQ ID NO:4之氨基酸序列的核苷酸序列所编码。在另一个实施方案中，AIR合成酶具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，该化合物能通过抑制植物中的AIR合成酶活性来抑制植物的生长或生存力。在另一个优选的实施方案中，通过检测反应混合物中所产生的AIR来测定酶活性。在另一个优选的实施方案中，通过检测反应混合物中由ATP衍生得到的ADP来测定酶活性。

本发明还描述了含有下列步骤的试验：(a)在酶能够催化AIR偶联合成的条件下，在第一个反应混合物中将具有5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)合成酶活性的酶和具有AIR合成酶活性的酶与FGAM合成酶的底物相混合；(b)在相同条件下，在第二个反应混合物中将化合物和所述酶与FGAM合成酶的底物相混合，混合时间与第一个反应混合物中的相同；(c)测定第一个和第二个反应混合物中具有AIR合成酶活性的酶的活性；如果第二个反应混合物中具有AIR合成酶活性的酶的活性比第一个反应混合物中具有AIR合成酶活性的酶的活性低(显著较低更合乎需要)，则表明该化合物能够抑制具有AIR合成酶活性的酶的活性。在优选的实施方案中，FGAM合成酶的底物是5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨酰胺(FGAR)，而在更优选的实施方案中，FGAM合成酶的底物是b-FGAR。在另一个优选的实施方案中，通过检测反应混合物中所产生的AIR来测定酶活性。在另一个优选的实施方案中，反应混合物中含有ATP，并通过检测反应混合物中由ATP衍生得到的ADP来测定酶活性。

在另一个优选的实施方案中，本发明描述了鉴定化合物的方法，所述化合物具有抑制植物中的AIR合成酶活性的除草剂活性，所述方法包括：(a)得到转基因植物，植物组织，植物种子或植物细胞，其含有编码具有AIR合成酶活性之酶的分离的核苷酸序列，并能过量表达具有酶促活性的AIR合成酶；(b)将待检测的化合物应用于转基因植物，植物细胞，组织或部分以及等基因的未经转化的植物，植物细胞，组织或部分；(c)使用该化合物之后，测定转基因的和未经转化的植物，植物细胞，组织的生长或生存力；和(d)比较转基因的和未经转化的植物，植物细胞，组织在使用该化合物之后的生长或生存力；如果未经转基因的植物，植物细胞，组织或部分的生长或生存力被抑制，而等基因的转基因植物，植物细胞，组织或部分的生长或生存力未被显著抑制，则表明(b)中所述的化合物具有抑制植物中的AIR合成酶活性的除草剂活性。该化合物必须抑制未经转基因的植物，植物细胞，组织或部分的生存力或生长，而不会显著抑制等基因的转基因植物，植物细胞，组织或部分的生长或生存力。在优选的实施方案中，具有AIR合成酶活性的酶由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列所编码。在另一个实施方案中，AIR合成酶由能编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之氨基酸序列的核苷酸序列所编码。在另一个实施方案中，AIR合成酶具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。

本发明还包括植物，植物组织，植物种子和植物细胞，它们具有经修饰的AIR合成酶活性，因此对除草剂的抑制作用具有耐受性，而所用除草剂的浓度水平在正常情况下能抑制天然AIR合成酶活性。本发明所包括的除草剂耐受性植物包括那些原本是正常的抑制性除草剂的潜在靶的植物，尤其是上文所述的在农学上重要的作物。根据此实施方案，用重组DNA分子转化，优选稳定转化植物，植物组织，植物种子或植物细胞，所述DNA分子含有适当的在植物中起作用的启动子，该启动子与编码经修饰的AIR合成酶的核苷酸编码序列可操作相连，所述经修饰的酶对除草剂的抑制作用具有耐受性，而所用除草剂的浓度在正常情况下能抑制野生型未经修饰的AIR合成酶活性。也可通过给植物提供多拷贝的野生型AIR合成酶基因而增加野生型除草剂-敏感型AIR合成酶的表达，或者通过在比野生型更强的启动子的控制之下过量表达野生型AIR合成酶基因，而赋予植物经修饰的AIR合成酶活性。然后通过常规的选择技术选择如此产生的转基因植物，植物组织，植物种子或植物细胞，从而分离，鉴定和开发除草剂耐受品系。或者，可使用随机或位点-特异性诱变产生除草剂耐受品系。

因此，本发明提供了被DNA分子转化的植物，植物细胞，植物种子或植物组织，所述DNA分子含有分离自植物，且编码具有AIR合成酶活性之酶的核苷酸序列，其中所述酶具有AIR合成酶活性，该DNA分子赋予植物，植物细胞，植物种子或植物组织对除草剂的耐受性，所述除草剂的用量在正常情况下能抑制天然AIR合成酶活性。根据此实施方案的一个例子，具有AIR合成酶活性的酶由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列所编码，或者具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。

本发明还提供了抑制植物生长的方法，所述方法包括给植物施用能抑制植物中的天然AIR合成酶活性的化合物。在相关的方面，本发明涉及选择性抑制种植有作物种子或植物的田地中的杂草生长的方法，所述方法包括步骤：(a)种植除草剂耐受型作物或作物种子，即对能抑制天然AIR合成酶活性的除草剂具有耐受性的植物或植物种子；和(b)给田地中的作物或作物种子和杂草施用除草剂，所述除草剂的用量能抑制天然AIR合成酶活性，其中除草剂抑制杂草的生长，但不会显著抑制作物的生长。

本发明还提供了由编码具有AIR合成酶活性之酶的模板DNA分子形成编码具有AIR合成酶活性之酶的经诱变DNA分子的方法，其中所述模板DNA分子已被裂解成双链-随机片断，所述方法包括步骤：(a)在所得的双链-随机片断群体中加入至少一种单链或双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有相对于模板DNA分子而言的同一性区域和异源性区域；(b)将所得的双链-随机片断和寡核苷酸的混合物变性为单链分子；(c)在导致所述单链分子在所述同一性区域退火的条件下，将所得单链分子群体与聚合酶保温以形成成对的退火片断，所述同一性区域足以使片断对的一个成员引发另一个成员的复制，籍此形成经诱变的双链多核苷酸；(d)将第二和第三个步骤至少再重复两个循环，其中下一个循环的第二步骤中的所得混合物包括得自前一循环第三步骤中的经诱变的双链多核苷酸，而下一个循环形成了另一个经诱变的双链多核苷酸；其中经诱变的双链多核苷酸编码AIR合成酶，该酶对能抑制由模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性。本发明还提供了通过上述方法得到的、编码具有AIR合成酶活性的酶的经诱变的DNA分子，其中所述经诱变的DNA分子编码AIR合成酶，该酶对能抑制由所述模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性。

本发明还提供了由至少两个不相同的，编码具有AIR合成酶活性之酶的模板DNA分子形成编码具有AIR合成酶活性之酶的经诱变DNA分子的方法，所述方法包括步骤：(a)在模板DNA分子中加入至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸含有相对于每种模板DNA分子而言的同一性区域；(b)将所得的混合物变性为单链分子；(c)在导致寡核苷酸与模板DNA分子退火的条件下，将所得单链分子群体与聚合酶保温，其中由聚合酶聚合化的条件能使得得到相当于模板DNA分子的一部分的聚合化产物；(d)将第二和第三个步骤至少再重复两个循环，其中第三个步骤中得到的延伸产物能够转换模板DNA分子以在下一个循环中聚合化，从而形成经诱变的双链多核苷酸，该多核苷酸含有来自不同模板DNA分子的序列；其中经诱变的双链多核苷酸编码AIR合成酶，该酶对能抑制由模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性。本发明还提供了通过上述方法得到的、编码具有AIR合成酶活性的酶的经诱变的DNA分子，其中所述经诱变的DNA分子编码AIR合成酶，该酶对能抑制由所述模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性。

优选地，根据上述两种方法中的任一种，至少一种模板DNA分子得自真核生物。更优选所述真核生物是植物。更优选所述植物是拟南芥。最优选所述模板DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3相同或基本上相似。在上述两种方法中的任一种的另一个实施方案中，至少一种模板DNA分子得自原核生物。

研究了本发明的下列描述和非限制性实施例之后，本发明的其它目的和优点对本领域技术人员而言是显而易见的。

为了清楚地理解本发明，说明书中所用的某些术语的定义如下：

可激活的DNA序列：调节基因组(尤其是植物基因组)中的基因表达的DNA序列。可激活的DNA序列与基因组中的内源性靶基因互补。当在细胞中导入和表达可激活的DNA序列时，它可抑制靶基因的表达。对本发明有用的可激活DNA序列包括那些编码或用作显性抑制剂的DNA序列，例如可翻译的或不可翻译的有义序列，所述有义序列能破坏稳定转化之植物中的基因功能，从而能正鉴定植物正常生长和发育所必需的一种或多种基因。优选的可激活DNA序列是反义DNA序列。靶基因优选编码植物生长或存活所必需的蛋白质，例如生物合成酶，受体，信号转导蛋白，结构基因产物或转运蛋白。在特别优选的实施方案中，靶基因编码具有AIR合成酶活性的酶。反义序列和靶基因之间的相互作用导致靶基因的表达基本上被抑制，从而杀死植物，或至少抑制正常的植物生长或发育。

可激活的DNA构建体：含有与可激活DNA序列可操作相连的合成启动子的重组DNA构建体，当将该构建体导入细胞，尤其是植物细胞时，它不会表达，即是沉默的，除非存在能结合和激活该合成启动子的完整杂合转录因子，它才会表达。将可激活的DNA构建体导入细胞，组织或植物以形成稳定的转基因品系，所述品系能表达该可激活的DNA序列。

辅因子：酶催化反应中所需的天然反应剂，例如有机分子或金属离子。辅因子是例如NAD(P)，核黄素(包括FAD和FMN)，叶酸，molybdopterin，硫胺素，生物素，硫辛酸，泛酸和辅酶A,S-腺苷甲硫氨酸，吡哆醛磷酸，泛醌，甲基萘醌类。

偶联合成：酶促生物合成，其中通过两个依次的酶促步骤合成终产物，其中通过第一种酶将第一个酶促步骤的底物转变为中间产物，该中间产物可用作第二个酶促步骤的底物，并通过第二种酶被转变为终产物，而无需额外加入中间产物。

DNA改组：DNA改组是在DNA分子中导入(优选随机导入)突变或重排，或者在两个或多个DNA分子之间产生(优选随机产生)DNA序列交换的方法。由DNA改组产生的DNA分子是经改组的DNA分子，它是得自至少一种模板DNA分子的非天然的DNA分子。经改组的DNA编码的酶相对于由模板DNA所编码的酶而言是经过修饰的，优选经修饰的酶相对于由模板DNA所编码的酶而言具有经改变的生物活性。

酶活性：本文指的是酶催化底物转变为产物的能力。酶的底物包括酶的天然底物，但也包括天然底物的、也能被酶转变为产物或产物类似物的类似物。可通过例如测定某一段时间之后反应中产物的量，或通过测定某一段时间之后反应混合物中残留的底物量来测定酶活性。也可通过测定某一段时间之后反应混合物中残留的未使用的辅因子的量，或通过测定某一段时间之后反应混合物中使用的辅因子的量来测定酶活性。也可通过测定某一段时间之后反应混合物中残留的富含自由能或能量的分子的供体(例如ATP，磷酸烯醇丙酮酸，乙酰磷酸或磷酸肌酸)的量，或通过测定某一段时间之后反应混合物中的富含自由能或能量的分子已使用过的供体(例如ADP，丙酮酸，乙酸或肌酸)的量来测定酶活性。

除草剂：用于杀死或抑制植物，植物细胞，植物种子或植物组织生长的化合物。

异源DNA序列：不与导入该DNA序列的宿主细胞天然相关的DNA序列，包括非天然的多拷贝天然DNA序列。

同源DNA序列：与导入该DNA序列的宿主细胞天然相关的DNA序列。

抑制剂：能灭活植物生长或存活所必需蛋白质的酶活性的化合物，所述蛋白质如生物合成酶，受体，信号转导蛋白，结构基因产物或转运蛋白。在本发明的上下文中，抑制剂是可灭活植物AIR合成酶之酶活性的化合物。本文所用术语“除草剂”定义的是用于植物，植物细胞，植物种子或植物组织的抑制剂。

等基因的：基因相同的植物，不同之处在于是否存在转基因。

分离的：在本发明的上下文中，分离的DNA分子或分离的酶是由其天然环境人为分离得到的DNA分子或酶，因此它们不是天然产物。分离的DNA分子或酶可以纯化的形式存在，或者存在于非天然的环境，例如转基因宿主细胞中。

成熟的蛋白质：通常靶向于细胞器，例如叶绿体的蛋白质，从中已除去转运肽。

基本启动子：缺乏上游激活时无启动子活性或启动子活性大大降低的启动子元件，尤其是TATA元件。存在适当的转录因子时，基本启动子发挥作用以进行转录。

经修饰的酶活性：不同于植物中的天然酶活性(即未对该活性进行人为地直接或间接操作时天然存在的酶活性)的酶活性，所述经修饰的酶活性对能抑制天然酶活性的抑制剂具有耐受性。

前-蛋白质：通常靶向于细胞器，例如叶绿体的蛋白质，该蛋白质仍含有其转运肽。存在抑制剂时，酶

显著增加：大于检测技术所固有误差之差值的酶活性增加，优选相比存在抑制剂时野生型酶的活性增加到约2倍或更高，更优选增加到约5倍或更高，最优选增加到约10倍或更高。

显著较低：指的是酶促反应产物的量大于检测技术所固有误差之差值，优选相比缺乏抑制剂时野生型酶的活性降低到约二分之一或更低，更优选降低到约五分之一或更低，最优选降低到约十分之一或更低。

关于核苷酸序列，本文所用术语“基本上相似”的最外延的含义指的是对应于参照核苷酸序列的核苷酸序列，其中对应序列编码的多肽具有与参照核苷酸序列编码的多肽基本上相同的结构和功能，例如氨基酸中仅存在一些不会影响多肽功能的变化。基本上相似的核苷酸序列最好编码参照核苷酸序列所编码的多肽。理想的是基本上相似的核苷酸序列与参照核苷酸序列之间的同一性百分比至少为65％，至少为75％较好，优选至少为85％，更优选至少为90％，更优选至少为95％，更优选至少为99％。使用Smith-Waterman序列对比算法规则(例见Waterman,M.S.计算生物学导言：图谱，序列和基因组，Chapman &Hall,London:1995.ISBN 0-412-99391-0或http://www.hto.usc.edu/software/seqaln/index.html)进行序列比较。使用具有下列参数的localS程序，version1.16：匹配：1，错配罚分：0.33，开放缺口罚分：2，延伸缺口罚分：2。与参照核苷酸序列“基本上相似的”核苷酸序列在下述条件下能与参照核苷酸序列杂交：于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO₄,1mM EDTA中杂交，并于50℃在2×SSC,0.1％SDS中洗涤；较优选于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO₄,1mM EDTA中杂交，并于50℃在1×SSC,0.1％SDS中洗涤；更优选于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5MNaPO₄,1mM EDTA中杂交，并于50℃在0.5×SSC,0.1％SDS中洗涤；更优选于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO₄,1mM EDTA中杂交，并于50℃在0.1×SSC,0.1％SDS中洗涤；更优选于50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO₄,1mM EDTA中杂交，并于65℃在0.1×SSC,0.1％SDS中洗涤。

关于蛋白质，本文所用术语“基本上相似”指的是对应于参照蛋白质的蛋白质，其中蛋白质具有与参照蛋白质基本上相同的结构和功能，例如氨基酸序列中仅存在一些不会影响多肽功能的变化。当用于蛋白质或氨基酸序列时，基本上相似的与参照的蛋白质或氨基酸序列之间的同一性百分比较理想的是至少为65％，至少为75％较好，优选至少为85％，更优选至少为90％，更优选至少为95％，更优选至少为99％。

底物：底物是在酶天然行使其功能的生物化学途径中由酶天然识别并转变为产物的分子，或者是该分子的经修饰形式，且也可在类似于天然反应的酶促反应中被酶识别，并被酶转变为产物。

耐受性：当暴露于抑制剂或除草剂时仍能持续正常生长或行使功能。

转化：将异源DNA导入细胞，组织或植物的过程，应理解经转化的细胞，组织或植物不仅包括转化过程的终产物，也包括其转基因的后代。

转基因：被重组DNA分子稳定转化，所述DNA分子优选含有与所需DNA序列可操作相连的适当启动子。

           序列表中的序列简述

SEQ ID NO:1编码拟南芥AIR合成酶前蛋白质的DNA序列

SEQ ID NO:2拟南芥AIR合成酶前蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO:3编码推定的成熟拟南芥AIR合成酶的DNA序列

SEQ ID NO:4推定的成熟拟南芥AIR合成酶的氨基酸序列

SEQ ID NO:5寡核苷酸JG-L

SEQ ID NO:6寡核苷酸AS-1

SEQ ID NO:7寡核苷酸AS-2

SEQ ID NO:8寡核苷酸slp242

SEQ ID NO:9寡核苷酸slp244

SEQ ID NO:10寡核苷酸slp243

                     保藏物

根据有关国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，已将下列材料保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心(NRRL),1815 North University Street,Peoria,Illinois 61604。对保藏材料的可获得性的所有限制将在授予专利权之后不可改变地解除。克隆        保藏号          保藏日DH5apASM    NRRL B-21976    1998年4月17日

1．拟南芥AIR合成酶基因的正确序列

本发明的发明人重新测定了拟南芥AIR合成酶基因的序列，并且与公开的拟南芥AIR合成酶基因的DNA序列(GenBank登记号为L12457,Senecoff和Meagher(1993)，植物生理学，102:387-399)进行比较。测序结果显示出公开的DNA序列中存在大的误差，导致对应于SEQ IDNO:1第1027位的位置处插入了胞嘧啶碱基。该插入导致氨基酸序列中出现移码突变，因此与拟南芥AIR合成酶正确的推定氨基酸序列相差甚远。本发明人首次公开了拟南芥AIR合成酶基因正确的核苷酸序列以及拟南芥AIR合成酶正确的氨基酸序列。编码前-蛋白质的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1，编码成熟蛋白质的核苷酸序列示于SEQ IDNO:3。由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码的拟南芥AIR合成酶前-蛋白质的正确氨基酸序列示于SEQ ID NO:2，由SEQ ID NO:3所示核苷酸序列编码的推定的成熟拟南芥AIR合成酶的正确氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。编码拟南芥AIR合成酶前-蛋白质的核苷酸序列包含于大肠杆菌菌株DH5apASM，其保藏号为NRRL B-21976。本发明还包括得自植物的分离的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列编码的氨基酸序列相同或基本上相似，其中所述氨基酸序列具有5’-磷酸核糖-5-氨基咪唑(AIR)合成酶活性。本发明还包括得自植物的分离的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似，其中所述氨基酸序列具有5’-磷酸核糖-5-氨基咪唑(AIR)合成酶活性。

Ⅱ．通过反义抑制阐明植物中AIR合成酶基因的必要性

如以下实施例所示，通过在植物中使用反义证实系统(PCT申请号EP98/07577，列入本文作为参考)进行反义抑制，首次阐明AIR合成酶基因对植物正常生长和发育的必要性。确定了植物中AIR合成酶功能的必要性之后，本发明人籍此提供了重要的寻找工具以用于新除草剂的开发。

在本发明描述的系统中，制备了杂合的转录因子基因，其含有DNA-结合结构域和激活结构域。另外，还制备了可激活的DNA构建体，其含有与可激活的DNA序列可操作相连的合成启动子。选择或设计杂合的转录因子基因和合成的启动子以使杂合转录因子的DNA结合结构域能特异性结合该合成启动子，然后激活可激活DNA序列的表达。用杂合的转录因子基因转化第一种植物，用可激活的DNA构建体转化第二种植物。使第一种植物和第二种植物杂交以产生子代植物，所述子代中含有编码杂合转录因子的序列和合成启动子，其中子代植物中表达了可激活的DNA序列。在优选的实施方案中，可激活的DNA序列是反义序列，该序列可灭活诸如AIR合成酶基因之类的内源性基因的表达。因此，子代植物不能正常表达内源性基因。

该反义证实系统特别可用于作为组成型驱动的转基因表达原本不可能恢复的性状。例如，尽管具有潜在致死作用的外源基因或反义基因或经设计可用来消除必需基因的功能的显性失活突变在植物生物学的基础研究中意义重大，但它们仍存在固有的实验问题。降低的转化频率常常作为与特定的受组成型驱动的转基因相关的致死性的证据被提出，但对这种类型的负性结果有其它一些解释。本发明是农业领域的重大进步，因为它可稳定维持和增殖受试的转基因，而不表达转基因。将转基因插入与表达分开的能力对确定所试验的基因功能的必要性尤其有用。本发明的显著优点是可按此方式鉴定植物正常生长或发育所必需的基因。鉴定这种基因可提供有用的靶以筛选化合物文库，从中鉴定出有效的除草剂。下面将更详细地描述反义证实系统：

A．杂合的转录因子基因

用于本文所述的反义证实系统的杂合转录因子基因含有编码下述的DNA序列：(1)DNA-结合结构域和(2)激活结构域，该结构域与装配于启动子上的转录器组分相互作用。基因片断的连接方式通常使得DNA结合结构域朝向5’末端，激活结构域朝向3’末端，以形成杂合基因，该杂合基因的表达产生了杂合的转录因子。本领域技术人员能按常规方法将编码DNA结合结构域的多个DNA序列与编码激活结构域的多个DNA序列组合以产生一系列杂合的转录因子基因。编码DNA结合结构域的DNA序列的例子包括但不限于编码GAL4，噬菌体434,lexA,lacⅠ和噬菌体λ阻抑蛋白的DNA结合结构域的那些DNA序列。编码激活结构域的DNA序列的例子包括但不限于编码单纯疱疹病毒VP16，玉米C1和P1之酸性激活结构域的那些DNA序列。此外，可通过将得自选定生物体的DNA片断与适当的DNA结合结构域融合，并直接选择功能来分离适当的激活结构域(Estruch等(1994)，核酸研究，22:3983-3989)。不同来源的蛋白质之间的转录激活蛋白结构域可以相互交换使用(Brent和Ptashne(1985)，细胞，43:729-736)。优选的杂合转录因子基因含有编码与玉米C1激活结构域融合的GAL4 DNA结合结构域的DNA序列。

B．可激活的DNA构建体

本文所述的反义证实系统中所用的可激活DNA构建体含有(1)合成的启动子和(2)可激活的DNA序列，其中(1)和(2)可操作相连。该合成的启动子含有至少一个由杂合转录因子的DNA结合结构域所识别的DNA结合位点以及基本启动子，优选为得自植物细胞所识别启动子的TATA元件。更优选该TATA元件得自将掺入该合成启动子的植物细胞类型所识别的启动子。合成启动子中的DNA结合位点最好重复多次以使基本启动子能被更有效地激活，从而与合成启动子相连的可激活DNA序列能被更有效地表达。本领域技术人员可使用常规的分子生物学和重组DNA技术制备出合乎需要的合成启动子。可用于制备本发明所用的合成启动子的DNA结合位点的例子包括但不限于被GAL4 DNA结合蛋白识别的上游激活序列(UAS_G),lac操纵基因和lexA结合位点。被植物细胞识别的启动子TATA元件的例子包括得自CaMV 35S，玉米Bz1启动子和UBQ3启动子的那些TATA元件。特别优选的合成启动子含有截短的CaMV 35S序列，该序列含有TATA元件(相对于转录起始位点而言为核苷酸-59至+48)，其5’末端融合有约10个成串的直接重复的上游激活序列(UAS_G)，所述激活序列可被GAL4 DNA结合结构域识别。

可激活的DNA序列包括任何需稳定导入植物细胞并在其中表达的DNA序列。特别合乎需要的可激活的DNA序列是有义或反义序列，其表达可导致与其相对应的内源性基因的表达减少，从而抑制正常的植物生长或发育。可激活的DNA序列与合成启动子可操作相连，形成可激活的DNA构建体。可激活的DNA构建体中的可激活DNA序列在转基因品系中是不表达的，即是沉默的，除非还存在能结合并激活该合成启动子的杂合转录因子时才会表达。随后，将可激活的DNA构建体导入细胞，组织或植物以形成稳定的转基因品系，该品系能表达可激活的DNA序列，有关内容将在下文中详细描述。在本发明的上下文中，可激活的DNA序列优选含有反义AIR合成酶序列。

C．含有杂合转录因子基因或可激活的DNA构建体的转基因植物

本文所述的反义证实系统利用了含有杂合转录因子基因的第一种植物和含有可激活的DNA构建体的第二种植物。通过本领域众所周知的和常规使用的方法将上文所述的杂合转录因子基因和可激活的DNA构建体导入植物，所述方法包括但不限于杂交，农杆菌介导的转化，Ti质粒载体，直接摄入DNA，例如微粒轰击，脂质体介导的摄入，微量注射等。根据本领域技术人员已知的标准方法筛选转化子中转基因的存在和功能性。

D．含有杂合转录因子基因和可激活的DNA构建体的转基因植物

通过异花授粉产生含有杂合转录因子基因和可激活的DNA构建体的F1植物，并选择适当标记的存在。与仅含有可激活的DNA构建体的植物相反，F1植物产生了高水平的可激活DNA序列表达产物，其量与使用强的组成型启动子，如CaMV 35S所得到的相当。

E．反义证实试验

因此，本文所述系统中的有用试验包括下列步骤：

(a)提供第一种转基因植物，该植物被编码杂合转录因子的杂合转录因子基因稳定转化，当植物中存在合成启动子时，所述杂合转录因子能激活所述合成启动子，其中第一种转基因植物中杂合转录因子是纯合的；(b)提供第二种转基因植物，该植物被可激活的DNA构建体稳定转化，所述构建体含有可被步骤(a)中的杂合转录因子激活的合成启动子，以及与之可操作相连的可激活的DNA序列，如反义AIR合成酶序列；(c)使第一种转基因植物与第二种转基因植物杂交产生F1植物，所述F1植物在杂合转录因子的存在下能表达可激活的DNA序列；和(d)测定可激活的DNA序列的表达对F1植物的影响。

Ⅲ．AIR合成酶的重组生产及其用途

为了在宿主生物体中重组生产AIR合成酶，可将编码具有AIR合成酶活性之酶的核苷酸序列插入为选定宿主而设计的表达盒，然后导入可重组生产AIR合成酶的宿主中。本领域技术人员能容易地选择适合于选定宿主的特定调节序列，例如启动子，信号序列，5’和3’非翻译序列以及增强子。可将所得分子插入能转化至宿主细胞的载体中，所述分子含有在适当读码框中相连接的各个元件。适用于诸如大肠杆菌，酵母和昆虫细胞的宿主生物体的适当表达载体以及在这些宿主中重组生产蛋白质的方法是众所周知的(参见Luckow和Summers,Bio/Technol,6:47(1988))。特例包括质粒，例如pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA),pFLAG(InternationalBiotechnologies公司，New Haven,CT),pTrcHis(Invitrogen,LaJolla,CA)和杆状病毒表达载体，例如衍生自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组的载体。优选的杆状病毒/昆虫系统是pVI11392/Sf21细胞(Invitrogen,La Jo1la,CA)。

在优选的实施方案中，编码具有AIR合成酶活性之酶的核苷酸序列得自真核生物，例如哺乳动物，蝇或酵母，但优选得自植物。在另一个优选的实施方案中，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列相同或基本上相似，或编码具有AIR合成酶活性的酶，所述酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同或基本上相似。SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码拟南芥AIR合成酶前-蛋白质，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3所示核苷酸序列编码拟南芥推定的成熟AIR合成酶，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。在另一个优选的实施方案中，该核苷酸序列得自原核生物，优选得自细菌，例如大肠杆菌。此时，具有AIR合成酶活性的酶由purM基因编码。

使用多种标准技术分离和纯化重组生产的AIR合成酶。实际可使用的技术取决于所用的宿主生物体，酶是否被设计为分泌型酶，和本领域技术人员熟知的其它因素(例见Ausubel,F等，“最新分子生物学方法”第16章，John Wiley & Sons公司出版(1994))。

重组生产的AIR合成酶可用于多种目的。例如，可将它们用于体外试验以筛选已知的，其靶尚未被鉴定的除草剂化合物，从而测定它们是否抑制AIR合成酶。也可将这种体外试验用作更一般的筛选方法，籍此鉴定能抑制所述酶活性，因而是新的候选除草剂的化合物。或者，可使用重组生产的AIR合成酶阐明这些分子的复杂结构，并进一步鉴定它们与已知抑制剂的关系以合理地设计新的抑制性除草剂以及酶的除草剂耐受形式。

Ⅳ．体外抑制剂试验

可用于鉴定由必需的植物基因编码的酶(如AIR合成酶)的抑制剂的体外试验优选包括以下步骤：a)在可疑的酶功能抑制剂的存在下，使具有AIR合成酶活性的酶与其底物反应；b)将存在可疑抑制剂时的酶活性速率与相同条件下不存在可疑抑制剂时的酶活性速率相比较；和c)测定可疑抑制剂是否抑制AIR合成酶的酶活性。在优选的实施方案中，通过使用荧光或光吸收检测比较存在和缺乏候选抑制剂时体外试验中所合成的AIR的量进行检测。在另一个优选的实施方案中，通过使用荧光或光吸收检测比较存在和缺乏候选抑制剂时体外试验中所形成的ADP的量进行检测。优选的AIR合成酶底物是5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)，特别是b异构体，b-FGAM。

在另一个优选的实施方案中，联合使用了FGAM合成酶/AIR合成酶试验，籍此增加试验的检出限并使筛选可抑制AIR合成酶活性之化合物的方法得以改善。所述联合试验优选包括以下步骤：a)在可疑的酶功能抑制剂的存在下，使具有5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)合成酶活性的酶，具有AIR合成酶活性的酶与FGAM合成酶的底物反应；b)将存在可疑抑制剂时的酶活性速率与相同条件下不存在可疑抑制剂时的酶活性速率相比较；和c)测定可疑抑制剂是否抑制AIR合成酶的酶活性。在优选的实施方案中，通过使用荧光或光吸收检测比较存在和缺乏候选抑制剂时体外试验中所合成的AIR的量进行检测。在另一个优选的实施方案中，通过使用荧光或光吸收检测比较存在和缺乏候选抑制剂时体外试验中所形成的ADP的量进行检测。优选的FGAM合成酶底物是5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨酰胺(FGAR)，特别是b异构体，b-FGAR。在另一个优选的实施方案中，具有FGAM合成酶活性的酶得自细菌，优选为由purL基因编码的大肠杆菌FGAM合成酶。优选在大肠杆菌中重组生产purL基因。上述体外试验可使用任何适当的AIR合成酶，但优选使用得自植物的AIR合成酶。在另一个优选的实施方案中，使用联合了一个以上的酶活性的试验，所述酶活性在嘌呤生物合成途径中位于AIR合成酶之前。

在优选的实施方案中，体外试验中所用的酶得自含有该酶的细胞，优选得自细胞的粗提取物。优选酶分离和纯化自细胞或粗提取物。优选重组生产酶，并优选在用于试验之前分离和纯化酶。然后检测体外试验中所鉴定的化合物抑制植物生长或生存力的能力。

Ⅴ．体内抑制试验

A．在一个实施方案中，将不同浓度的可疑除草剂，例如体外筛选鉴定出的除草剂施用于植物。优选将可疑除草剂喷洒于植物上。施用可疑除草剂之后，记录该除草剂对植物的影响，例如死亡或生长抑制。

B．在另一个实施方案中，AIR合成酶活性抑制剂的体内筛选试验使用了能过量表达具有AIR合成酶活性之核苷酸序列的转基因植物，植物组织，植物种子或植物细胞，其中AIR合成酶在转基因植物，植物组织，植物种子或植物细胞中具有酶活性。该核苷酸序列优选得自真核生物，如哺乳动物，蝇或酵母，但优选得自植物。在另一个优选的实施方案中，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列相同或基本上相似，或编码具有AIR合成酶活性的酶，所述酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列相同或基本上相似。在另一个优选的实施方案中，该核苷酸序列得自原核生物，优选得自细菌，例如大肠杆菌。此时，具有AIR合成酶活性的酶由purM基因编码。

然后将化合物施用于转基因植物，植物组织，植物种子或植物细胞以及等基因的未经转化的植物，植物组织，植物种子或植物细胞，施用化合物之后测定转基因的和未经转化的植物，植物组织，植物种子或植物细胞的生长或生存力，并进行比较。

Ⅵ．除草剂耐受植物

本发明进一步涉及能耐受除草剂的植物，植物组织，植物种子和植物细胞，所述除草剂能抑制这些植物中的天然AIR合成酶活性，其中耐受性是由经改变的AIR合成酶活性所赋予的。通过给植物提供额外的野生型AIR合成酶基因以增加野生型除草剂敏感型AIR合成酶的表达，通过在植物中表达经修饰的除草剂耐受型AIR合成酶，或通过联合使用这些技术，即可赋予本发明的植物经改变的AIR合成酶活性。代表性的植物包括任何为了除草而使用这些除草剂的植物，优选所述植物是农学上重要的作物，例如棉花，大豆，油菜子，甜菜，玉米，水稻，小麦，大麦，燕麦，黑麦，高粱，小米，草皮，饲料草，草皮草等。

A．增加的野生型AIR合成酶表达

通过增加表达获得经改变的AIR合成酶活性，结果导致植物细胞中的AIR合成酶水平至少足以克服由除草剂导致的生长抑制作用。所表达的酶水平一般至少2倍于，优选至少5倍于，更优选至少10倍于天然表达量。表达量增加可能是下列因素所致：多拷贝的野生型AIR合成酶基因，基因中多次出现编码序列(即基因扩增)或植物细胞内源性基因的非编码调节序列中的突变。通过本领域已知的方法(例见美国专利5,162,602和美国专利4,761,373以及其中提及的参考文献)直接在植物中选择可得到具有这种经改变的基因活性的植物。通过本领域已知的基因工程技术也可得到这些植物。通过用重组或嵌合的DNA分子转化植物细胞也可增加除草剂敏感型AIR合成酶基因的表达，所述DNA分子含有能驱动植物细胞中的相关结构基因表达的启动子以及与之可操作连接的编码AIR合成酶的同源或异源结构基因。优选转化是稳定的，籍此提供可遗传的转基因性状。

B．表达经修饰的除草剂耐受型AIR合成酶

根据此实施方案，用重组DNA分子稳定转化植物，植物组织，植物种子或植物细胞，所述DNA分子含有适当的能在植物中发挥作用的启动子以及与之可操作连接的编码除草剂耐受型AIR合成酶形式的编码序列。除草剂耐受型酶具有至少一个氨基酸取代，添加或缺失，籍此赋予植物对除草剂的耐受性，所述除草剂能抑制未经修饰的天然酶。然后通过常规选择技术选择如此产生的转基因植物，植物组织，植物种子或植物细胞，从而分离，鉴定和开发出能耐受除草剂的品系。

下文描述了获得编码除草剂耐受型AIR合成酶的基因的方法：

一个一般性的策略包括直接或间接诱变微生物。例如，可在体内用诸如UV光或者甲磺酸乙酯或甲酯的诱变剂随机诱变可进行基因操作的微生物，例如大肠杆菌或酿酒酵母。诱变方法描述于例如Miller，分子遗传学实验，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1972)；Davis等，现代细菌遗传学，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1980)；Sherman等，酵母遗传学方法，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1983)；和美国专利4,975,374。被选择用于诱变的微生物含有正常的抑制剂-敏感型AIR合成酶基因，并依赖于由此基因赋予的活性。在抑制剂的存在下培养经诱变的细胞，所述抑制剂的浓度能抑制未经修饰的基因。在抑制剂的存在下长势比未经诱变的微生物好的经诱变的微生物菌落(即表现出对抑制剂的抗性)被选择出来用于进一步的分析。通过克隆或通过PCR扩增从这些菌落中分离AIR合成酶基因，并测定其序列。然后将编码经改变的基因产物的序列克隆至原来的微生物中以证实它们赋予抑制剂耐受性的能力。

得到植物AIR合成酶基因突变的除草剂-耐受型等位基因的方法包括直接在植物中选择。例如，将通过常规方法消毒的种子铺于纯粹的基本盐类培养基平板上，所述培养基中含有浓度渐增的抑制剂，籍此测定经诱变的AIR合成酶基因对诸如拟南芥，大豆或玉米之类的植物的生长抑制作用。上述浓度范围为0.001,0.003,0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10,30,110,300,1000和3000ppm。将可重新检测到显著生长抑制作用的最低剂量用于随后的实验。最低剂量的测定是本领域的常规技术。

利用对植物材料的诱变增加选定群体中出现抗性等位基因的频率。经诱变的种子材料得自多个来源，包括经化学或物理诱变的种子，或者经化学或物理诱变的花粉(Neuffer，玉米生物学研究，Sheridan编，Univ.Press,Grand Forks,ND.,p61-64(1982))，然后使用所述花粉给植物传粉，收集所得的M1突变体的种子。对拟南芥而言，一般将M2种子(Lehle Seeds,Tucson,AZ)以高达10,000个种子/平板(直径为10cm)的密度铺于含有适当浓度的抑制剂的基本盐类培养基上以选择耐受性，所述M2种子是用诸如甲磺酸乙酯的化学诱变剂或用诸如γ射线或快中子的物理诱变剂诱变的种子生长出的植物的后代种子。将铺板之后7至21天持续生长并仍为绿色的幼苗移植到土壤中，培养至成熟期并结出种子。检测这些种子的后代对除草剂的耐受性。如果耐受性性状是显性的，M2代植物的种子分离为3∶1/抗性∶敏感型意味着该植物的抗性是杂合的，M2代植物产生的种子皆表现出抗性意味着该植物的抗性是纯合的。也可对其它植物，例如大豆实施上述方法，即对完好的种子进行诱变并筛选其M2代种子(例见美国专利5,084,082)。或者，通过与经化学或物理方法诱变的花粉受精，得到待筛选除草剂耐受性的突变种子。

下文进一步证实：除草剂耐受性的遗传基础是经修饰的AIR合成酶基因。首先，使用PCR分离对抑制剂表现出抗性的植物中的AIR合成酶基因的等位基因，所述PCR使用的引物基于SEQ ID NO:1所示的拟南芥cDNA编码序列，或更优选基于未经改变的AIR合成酶基因序列，所述未经改变的基因序列得自用于产生耐受型等位基因的植物。测定等位基因的序列以确定编码序列中存在突变之后，检测等位基因赋予植物对抑制剂的耐受性的能力，所述植物中转化有推定的可赋予耐受性的等位基因。这些植物可以是拟南芥植物或其生长对AIR合成酶抑制剂敏感的任何其它植物。其次，相对于已知的限制性片断长度多态性(RFLP)绘制插入的AIR合成酶基因的图谱(例见Chang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6856-6860(1988)；Nam等，植物细胞，1:699-705(1989))。使用相同的标记对AIR合成酶抑制剂耐受性性状进行单独作图。如果耐受性是由AIR合成酶基因中的突变引起的，耐受性性状作图的位置将与AIR合成酶基因的位置重合。

另一种得到AIR合成酶基因的除草剂-耐受型等位基因的方法是通过在植物细胞培养物中进行选择。在浓度渐增的抑制性除草剂或适用于实验室环境的类似抑制剂存在下，在培养基中培养植物组织的外植体，例如胚，叶片等，或活跃生长的愈伤组织或所需植物的悬浮培养物。记录不同培养物的不同生长程度。在某些培养物中，产生了快速生长的变体集落，所述集落甚至在存在正常抑制性浓度的抑制剂时也能持续生长。将组织或细胞暴露于抑制剂之前用化学或物理诱变剂处理，可以提高所述快速生长的变体发生的频率。按上文段落中所述，分离并检测AIR合成酶基因推定的可赋予耐受性的等位基因。然后，为了获得最佳表达，可对经鉴定可赋予除草剂耐受性的等位基因进行基因改造并转化至植物。或者，可由含有这些等位基因的组织或细胞培养物再生植物。

另一种方法包括诱变细菌或酵母中的野生型的除草剂敏感型植物AIR合成酶基因，接着在含有抑制性浓度的抑制剂的培养基中培养微生物，选择存在抑制剂时仍能生长的菌落。更具体地，将植物cDNA，例如编码AIR合成酶的拟南芥cDNA克隆至微生物中，所述微生物中原本缺乏该选定基因的活性。然后通过本领域已知的几种化学或酶方法中的任一种体内诱变或体外诱变经转化的微生物，所述方法包括例如亚硫酸氢钠(Shortle等，酶学方法，100:457-468(1983))；甲氧基胺(Kadonaga等，核酸研究，13:1733-1745(1985))；寡核苷酸定向饱和诱变(Hutchinson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:710-714(1986))；或多种聚合酶错误掺入策略(例见Shortle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:1588-1592(1982)；Shiraishi等，基因，64:313-319(1988)；和Leung等，技术，1:11-15(1989))。挑选存在正常抑制性浓度的抑制剂时仍能生长的菌落，通过重复划线进行纯化。纯化质粒，通过将所述质粒重新转化至缺乏AIR合成酶基因活性的微生物中来检测该质粒赋予抑制剂耐受性的能力。然后测定通过该检验的质粒中的cDNA插入物的DNA序列。

使用包括体外重组，也称为DNA改组的方法也可得到对除草剂具有抗性的AIR合成酶。通过DNA改组，将突变，优选为随机突变导入AIR合成酶基因。DNA改组也可导致AIR合成酶基因中的序列重组和重排，或者导致两种或多种不同的AIR合成酶基因之间发生序列重组和交换。这些方法可以产生数百万个突变的AIR合成酶基因。从突变基因或改组基因中筛选具有所需特性的基因，例如对除草剂的耐受性有所改良的基因，并且筛选出突变后可提供对不同类抑制剂化学的宽谱耐受性的基因。所述筛选是本领域技术人员众所周知的技术。

在优选的实施方案中，由至少一种模板AIR合成酶基因形成经诱变的AIR合成酶基因，其中模板AIR合成酶基因已被裂解成所需大小的双链随机片断，所述方法包括下述步骤：在所得双链随机片断群体中添加一种或多种单链或双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有相对于双链随机片断而言的同一性区域和异源性区域；将所得的双链随机片断和寡核苷酸的混合物变性为单链片断；在导致所述单链片断在所述同一性区域退火的条件下，将所得单链片断群体与聚合酶保温以形成成对的退火片断，所述同一性区域足以使片断对的一个成员引发另一个成员的复制，籍此形成经诱变的双链多核苷酸；将第二和第三个步骤至少再重复两个循环，其中下一个循环的第二步骤中的所得混合物包括得自前一循环第三步骤中的经诱变的双链多核苷酸，且该下一个循环形成了另一个经诱变的双链多核苷酸，其中经诱变的多核苷酸是突变的AIR合成酶基因，该突变基因对可抑制天然AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性。在优选的实施方案中，双链随机片断群体中的一种双链随机片断的浓度低于总DNA重量的1％。在另一个优选的实施方案中，模板双链多核苷酸含有至少约100种多核苷酸。在另一个优选的实施方案中，双链随机片断的大小约为5bp至5kb。在另一个优选的实施方案中，上述方法的第四个步骤包括将第二和第三个步骤至少重复10个循环。上述方法描述于例如Stemmer等(1994)，自然370:389-391，美国专利5,605,793和Crameri等(1998)，自然，391:288-291以及WO97/20078，这些参考文献都列入本文作为参考。

在另一个优选的实施方案中，通过如Zhao等(1998),NatureBiotechnology 16:258-261所述的交错切口延伸法(StEP)体外诱变两种或多种不同AIR合成酶基因的任何组合。将该两种或多种AIR合成酶基因用作PCR扩增的模板，优选在比聚合酶的最适聚合温度低的温度下进行所述PCR反应的延伸循环。例如，当使用最适温度约为72℃的热稳定性聚合酶时，延伸反应的温度较好是低于72℃，低于65℃更好，优选低于60℃，更优选延伸反应的温度低于55℃。此外，PCR循环的延伸反应时间较好是短于本领域常用的时间，低于30秒更好，优选低于15秒，更优选延伸反应时间为5秒。在每个延伸反应中，仅聚合成短的DNA片断，使每个变性和退火循环之后，起始DNA分子之间发生延伸产物的模板转换，从而产生多种多样的延伸产物。PCR反应的最佳循环数目取决于待诱变的AIR合成酶编码区的长度，但较好是多于40个循环，多于60个循环更好，优选多于80个循环。使用本领域众所周知的方法可确定每一AIR合成酶基因组合的最佳延伸条件和PCR循环的最佳数目。PCR反应的其它参数实质上与本领域常用的相同。优选将扩增反应的引物设计为能与位于AIR合成酶基因编码序列外部的DNA序列退火，例如与含有该AIR合成酶基因的载体的DNA序列退火，从而使PCR反应中所用的不同AIR合成酶基因优选包含于不同的载体中。引物较好是与位于距AIR合成酶编码序列500bp以内的序列退火，优选与位于距AIR合成酶编码序列200bp以内的序列退火，更优选与位于距AIR合成酶编码序列120bp以内的序列退火。优选AIR合成酶编码序列周围具有限制性位点，在PCR反应过程中，所述位点被包含在经扩增的DNA序列内，从而便于将扩增产物克隆至适当的载体中。

在另一个优选的实施方案中，按WO98/05765所述产生具有粘性末端的AIR合成酶基因片断。通过连接第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸可产生粘性末端，所述第一个寡核苷酸对应于AIR合成酶基因的一部分，所述第二个寡核苷酸是基因中不存在的，或者对应于与第一个寡核苷酸所对应的基因部分不相邻的基因部分，其中第二个寡核苷酸中含有至少一个核糖核苷酸。使用第一个寡核苷酸为模板，第二个寡核苷酸为引物产生双链DNA。裂解并除去核糖核苷酸。也除去位于该核糖核苷酸5’方向的核苷酸，从而产生具有粘性末端的双链片断。通过连接随机地重新装配所述片断以得到新的基因序列组合。

在本发明的上下文中，将任何AIR合成酶基因或任何AIR合成酶基因的组合用于体外重组，例如，得自植物(如拟南芥)的AIR合成酶基因，如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示的AIR合成酶基因，得自诸如枯草芽孢杆菌(Ebbole和Zalkin(1987)，生物化学杂志，262:8274-8287)或大肠杆菌(Smith和Daum(1986)，生物化学杂志，261:10632-10637)的细菌的AIR合成酶基因，人AIR合成酶基因(Aimi等(1990)，核酸研究，18:6665-6672)，或得自果蝇的AIR合成酶基因(Henikoff等(1986),PNAS 289:33-37)，得自鸡的AIR合成酶基因(Chen等(1990),PNAS 87:3097-3101)(皆列入本文作为参考)。

本发明的上下文中使用了完整的AIR合成酶基因或其部分。将通过上述方法得到的突变AIR合成酶基因文库克隆至适当的表达载体中，用所得载体转化适当宿主，例如藻类如Chlamydomonas，酵母或细菌。优选适当宿主是原本缺乏AIR合成酶基因活性的宿主，例如大肠杆菌菌株SΦ6609/IKC(Schnorr等，(1994)，植物杂志，6:113-121)。用含有突变AIR合成酶基因文库的载体转化宿主细胞，在含有抑制浓度的抑制剂的培养基上培养这些宿主细胞，选择那些存在抑制剂时仍能生长的菌落。挑选存在正常抑制浓度的抑制剂时仍能生长的菌落，通过重复划线进行纯化。纯化质粒，然后测定通过该检验的质粒中的cDNA插入物的DNA序列。

鉴定能耐受抑制剂的经修饰AIR合成酶基因的试验方法与鉴定AIR合成酶活性抑制剂的试验(上文所述的抑制试验)方法基本相同，不同之处在于：首先，在一个反应混合物中，用突变的AIR合成酶替代抑制试验中的野生型AIR合成酶。其次，两个反应混合物中都存在野生型酶的抑制剂。第三，比较突变的活性(存在抑制剂和突变酶时的活性)和未突变的活性(存在抑制剂和野生型酶时的活性)，籍此确定当与未突变的活性相比时，在突变的活性中是否能观察到显著增加的酶活性。突变的活性是存在适当底物和抑制剂时突变酶活性的任何测量值。未突变的活性是存在适当底物和抑制剂时野生型酶活性的任何测量值。显著增加被定义为大于检测技术所固有误差之差值的酶活性增加，优选比存在抑制剂时野生型酶的活性增加到约2倍或更高，更优选增加到约5倍或更高，最优选增加到约10倍或更高。

除了用于产生除草剂耐受型植物外，也可在植物细胞转化方法中将编码除草剂耐受型AIR合成酶的基因用作选择标记。例如，也可用编码经改变的AIR合成酶并能被植物表达的基因转化被转基因转化的植物，植物组织，植物种子或植物细胞。将转化细胞转移至培养基中，所述培养基中含有酶的抑制剂，其含量足以抑制不表达经修饰基因的植物细胞的生存能力，其中只有经转化的细胞才能存活。此方法适用于能被编码经修饰AIR合成酶的基因转化的任何植物细胞，此方法可与任何所需的转基因一起使用。转基因和经修饰基因的表达可以由在植物细胞中起作用的相同启动子，或不同启动子驱动。

Ⅶ．植物转化技术

可使用常规重组DNA技术将野生型或除草剂-耐受型AIR合成酶基因掺入植物或细菌细胞。通常，所述技术包括使用本领域已知的标准克隆方法将编码AIR合成酶的DNA分子插入表达系统，所述DNA分子相对于该表达系统而言是异源的(即一般不存在于该表达系统中)。载体含有在含该载体的宿主细胞中转录和翻译插入的蛋白质编码序列所必需的元件。可使用本领域已知的大量载体系统，例如质粒，噬菌体病毒和其它经修饰的病毒。也可修饰表达系统的组分以增加表达。例如，可利用截短序列，核苷酸取代或其它修饰。实质上，可在适当条件下使用本领域已知的表达系统转化任何作物植物细胞。优选将含有野生型或除草剂-耐受型AIR合成酶基因的转基因稳定转化并整合至宿主细胞基因组中。在另一个优选的实施方案中，含有野生型或除草剂-耐受型AIR合成酶基因的转基因位于自我复制的载体上。自我复制的载体的例子是病毒，尤其是双粒病毒组。经转化的细胞可再生为完整的植物，使得选定形式的AIR合成酶基因能赋予转基因植物对除草剂的耐受性。

A．构建植物表达盒的需求

首先将欲在转基因植物中表达的基因序列装配于表达盒中，使其位于可在植物中表达的适当启动子之后。表达盒还可含有转基因表达所需的或被选择用于表达转基因的任何其它序列。所述序列包括但不限于转录终止子，增强表达所用的外部序列，例如内含子，必不可少的序列，和欲将基因产物靶向特定细胞器和细胞区室的序列。然后，可容易地将这些表达盒转移至下文所述的植物转化载体。下文描述了典型表达盒的多个组分。

1．启动子

表达盒中所用启动子的选择将决定转基因植物中转基因的空间和时间表达模式。选定的启动子将在特定的细胞类型(如叶上皮细胞，叶肉细胞，根皮质细胞)或特定的组织或器官(如根，叶或花)中表达转基因，启动子的选择将会反映出基因产物积累的位置。或者，选定的启动子可在多种诱导条件下驱动基因表达。启动子的强度，即促进转录的能力各不相同。根据所用的宿主细胞系统，可使用本领域已知的多种适当启动子中的任一种。例如，为了进行组成型表达，可使用CaMV35S启动子，水稻肌动蛋白启动子或遍在蛋白启动子。为了进行可调节的表达，可使用得自烟草或拟南芥的化学诱导型PR-1启动子(例见美国专利5,689,044)。

2．转录终止子

多种转录终止子适用于表达盒。它们负责在转基因之后终止转录及其正确的聚腺苷酸化。适当的转录终止子是已知能在植物中起作用的那些终止子，包括CaMV 35S终止子，tml终止子，胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。在单子叶和双子叶植物中都可使用这些终止子。

3．增强或调节表达的序列

已发现多个序列可增强转录单位中的基因表达，这些序列可与本发明的基因联合使用以增强所述基因在转基因植物中的表达。例如，已证实多种内含子序列，例如玉米AdhⅠ基因的内含子可增强表达，尤其是单子叶植物中的表达。另外，还知道得自病毒的多种非翻译前导序列能增强表达，这些序列在双子叶植物细胞中特别有效。

4．编码序列的最优化

通过改变选定基因的编码序列而对该编码序列进行基因改造，从而在所需作物中获得最佳表达。修饰编码序列从而在特定作物中获得最佳表达的方法是众所周知的(例见Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3324(1991)；和Koziel等，Bio/technol,11:194(1993))。

5．使基因产物靶向于细胞内

已知植物中存在靶向基因产物的多种机制，已详细鉴定了控制这些机制运行的序列。例如，将基因产物靶向叶绿体受信号序列的控制，所述信号序列发现位于多种蛋白质的氨基末端，它在叶绿体输入过程中被裂解，从而产生成熟的蛋白质(例如Comai等，生物化学杂志，263:15104-15109(1988))。有其它基因产物位于其它细胞器，例如线粒体和过氧化物酶体中(例见Unger等，植物分子生物学，13:411-418(1989))。也可对编码这些产物的cDNA进行操作以使异源基因产物靶向这些细胞器。另外，已鉴定出导致基因产物靶向其它细胞区室的序列。氨基末端序列负责靶向ER，质外体，以及负责由糊粉细胞分泌至胞外(Koehler & Ho，植物细胞，2:769-783(1990))。另外，氨基末端序列与羧基末端序列一起负责将基因产物靶向液泡(Shinshi等，植物分子生物学，14:357-368(1990))。通过将上文所述的适当靶向序列与所需的转基因序列融合，可以将转基因产物靶向任何细胞器或细胞区室。

B．构建植物转化载体

植物转化领域的普通技术人员已知多种转化载体适用于植物转化，与本发明有关的基因可与任何这种载体联合使用。载体的选择取决于优选的转化技术和转化的靶物种。对于某些靶而言，可能优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括nptⅡ基因，该基因赋予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(Messing & Vierra，基因，19:259-268(1982)；Bevan等，自然，304:184-187(1983)),bar基因，该基因赋予对除草剂膦丝菌素的抗性(White等，核酸研究，18:1062(1990),Spencer等，理论与应用遗传学，79:625-631(1990)),hph基因，该基因赋予对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger & Diggelmann，分子细胞生物学，4:2929-2931)，和dhfr基因，该基因赋予对氨甲喋呤(methatrexate)的抗性(Bourouis等，EMBO J,2(7):1099-1104(1983))和EPSPS基因，该基因赋予对草甘膦的抗性(美国专利4,940,935和5,188,642)。

1．适用于农杆菌转化的载体

很多载体适于使用根瘤农杆菌进行转化。这些载体一般携有至少一个T-DNA边界序列，包括诸如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ的载体。适于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素选择衍生物(例见美国专利5,639,949)。

2．适用于非-农杆菌转化的载体

不使用根瘤农杆菌的转化在选定的转化载体中不需要T-DNA序列，因此，除了含有T-DNA序列的上述载体外，也可使用缺乏这些序列的载体。不依靠农杆菌的转化技术包括通过颗粒轰击，原生质体摄取(例如PEG和电穿孔)和微量注射进行转化。载体的选择主要取决于对转化生物体的优先选择。适用于非-农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064,pSOG19和pSOG35(例见美国专利5,639,949)。

C．转化技术

一旦将所需编码序列克隆至表达系统，即用该系统转化植物细胞。转化和再生植物的方法是本领域众所周知的。例如，可利用Ti质粒载体传递外源DNA，还可使用直接摄入DNA，脂质体，电穿孔，微量注射和微粒轰击等方法。另外，可利用农杆菌属的细菌转化植物细胞。

双子叶植物的转化技术是本领域众所周知的，其包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非-农杆菌技术包括直接通过原生质体或细胞摄取外源遗传物质。通过PEG或电穿孔介导的摄取，颗粒轰击-介导的传递或微量注射可实现这一目的。在每种情况下，可使用本领域已知的标准技术将经转化的细胞再生为完整的植物。

目前，转化大多数单子叶植物的技术也是常规的。优选技术包括使用PEG或电穿孔技术将基因直接转移至原生质体，通过颗粒轰击将基因直接转移至愈伤组织，以及农杆菌-介导的转化。

Ⅷ．育种

可使用本发明的野生型或经改变的AIR合成酶基因赋予多种植物细胞对除草剂的耐受性，所述植物细胞包括裸子植物，单子叶植物和双子叶植物的细胞。尽管可将基因插入类别很宽的任何植物细胞，但插入以下作物植物细胞中特别有用，例如水稻，小麦，大麦，燕麦，玉米，土豆，胡萝卜，甘薯，甜菜，蚕豆，豌豆，菊苣，莴苣，甘蓝，花椰菜，嫩茎花椰菜，萝卜，芜菁，菠菜，芦笋，洋葱，大蒜，茄子，胡椒，芹菜，胡萝卜，西葫芦，南瓜，夏南瓜(zucchini)，黄瓜，苹果，梨，榅桲(quince)，甜瓜，李子，樱桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓(raspberry)，黑莓，凤梨，鳄梨，番木瓜，芒果，香蕉，大豆，烟草，番茄，高粱和甘蔗。

通过育种方法和本领域已知的技术，可将野生型AIR合成酶基因和/或能赋予植物对除草剂的耐受性的除草剂-耐受型AIR合成酶基因的高水平表达，以及其它对生产和质量至关重要的特征掺入植物品系。

当通过直接在作物植物或植物细胞培养物(该培养物可再生为作物植物)中进行选择，得到除草剂耐受型AIR合成酶基因等位基因时，可使用传统的育种技术将其变为商业品种，从而开发出除草剂耐受型作物，而无需通过基因工程的方法改造等位基因，并将其转化至植物中。

参照下列详细的实施例，进一步地描述了本发明。除非另有说明，提供这些实施例仅是为了阐明而不是限制本发明。

                    实施例

这里所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的，并描述于SamBrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989),T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)和Ausubel,F.M等，最新分子生物学方法，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。

实施例1：构建含有与反义AIR合成酶融合的GAL4结合位点/基本35S CaMV启动子的载体

pAT71：

从pGALLuc2(Goff等，1991，基因&发育5:298-309)中以EcoRⅠ-PstⅠ片断的形式切下GAL4结合位点和基本35S启动子(-59至+1)，插入pBluescript中的相应位点，产生pAT52。在pAT52的HindⅢ-PstⅠ片断，pCIB1716的PstⅠ-EcoRⅠ片断(含有35S非翻译的前导序列，GUS基因，35S终止子)和经HindⅢ-EcoRⅠ切割的pUC18之间进行三方连接，构建出pAT66。用PstⅠ-NcoⅠ切下pAT66的35S前导序列，用PCR产生的从+1延伸至+48的35S前导序列进行替换，产生pAT71。

pJG304：

用SacⅠ使质粒pBS SK+(Stratagene,LaJolla,CA)线性化，用绿豆核酸酶处理以除去SacⅠ位点，用T4连接酶重新连接，制备出pJG201。用KpnⅠ从pAT71中切出10×GAL4共有序列结合位点/CaMV 35S基本启动子/GUS基因/CaMV终止子盒，克隆至pJG201的KpnⅠ位点，制备出pJG304。

用限制性内切核酸酶Asp718部分消化pJG304以分离全长线性片断。将该片断与摩尔过量的22碱基寡核苷酸JG-L(5’GTACCTCGAGTCTAGACTCG AG 3’,SEQ ID NO:5)连接。使用限制性分析鉴定在GAL4DNA结合位点5’方向插入了该接头的克隆，将该质粒称为pJG304DXhoⅠ。

pDG3：

使用寡核苷酸AS-1(5’GAT CGA GCT CGT TCT CTT CTG TGT CAT C3’,SEQ ID NO:6)和AS-2(5’GAT CCC ATG GTC CCC AGG TAA AGA CGTC3’,SEQ ID NO:7)，从拟南芥cDNA质粒文库pFL61(Minet等(1992)，植物杂志，2:417-422)中经PCR扩增5’-磷酸核糖-5-氨基咪唑(AIR)合成酶cDNA克隆(Senecoff和Meagher(1993)，植物生理学，102:387-399)的片断。

用SacⅠ和NcoⅠ消化载体pJG304ΔXhoⅠ以切下GUS基因编码序列。用SacⅠ和NcoⅠ消化AIR合成酶PCR片断并连接至pJG304ΔXhoⅠ，制备出pDG3。

实施例2：由GAL4结合位点/CaMV基本35S启动子反义表达AIR合成酶的植物转化载体

pJG261：

用EcoRⅠ和HindⅢ消化载体pGPTV(Becker等，1992，植物分子生物学，20:1195-1197)以除去胭脂氨酸合酶启动子/GUS盒。同时，用EcoRⅠ和HindⅢ从pSE380(Invitrogen,San Diego,CA)上切下超级接头(superlinker)，克隆至用EcoRⅠ/HindⅢ线性化的pGPTV中，制备出pJG261。

pDG4：

用XhoⅠ切割pDG3以切下含有GAL4 DNA结合位点/35S基本启动子/反义AIR合成酶/CaMV终止子融合物的盒。将该盒连接至经XhoⅠ消化的pJG261中，使得转录与BAR选择标记的迥异，产生pDG4。

实施例3：产生GAL4结合位点/基本CaMV 35S反义AIR合成酶转基因植物

将pDG4电转化(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)至根瘤农杆菌菌株C58C1(pMP90)，通过渗入转化拟南芥植物(EcotypeColumbia)(Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris,316:1188-93(1993))。在含有15mg/l Basta的萌发培养基(4.3g/lMurashige-Skoog盐，0.5g/l Mes,1％蔗糖，10ug/l硫胺素，5ug/l吡哆醇，5ug/l烟酸，1mg/l肌醇，pH5.8)上选择经渗入转化的植物的种子。

实施例4：产生GAL4/C1反式激活子转基因植物

通过将pGALC1(Goff等，1991，基因&发育，5:298-309)的GAL4-C1 EcoRⅠ片断连接至pIC20H的EcoRⅠ位点来构建pSGZL1。用BamHⅠ-BglⅡ切下pSGZL1的GAL4-C1片断，插入pCIB770(Rothstein等，1987，基因，53:153-161)的BamHⅠ位点，产生pAT53。

按Valvekens等，1985,PNAS USA 85:5536-5540所述方法，用pAT53转化拟南芥根外植体。使具有单个位点插入且GAL4/C1表达为阳性的转基因植物成为纯合子。

实施例5：使用GAL4/C1反式激活子和GAL4结合位点/基本CaMV35S启动子反义抑制AIR合成酶

将15株含有GAL4结合位点/基本CaMV 35S启动子/反义AIR合成酶构建体的转基因植物植入土壤，在温室中培养至成熟。使原代转化体的花与纯合的GAL4/C1反式激活子品系pAT53-103的花粉杂交。将F1种子铺于含有15mg/l Basta的萌发培养基上。将5个F1品系的幼苗植入土壤，在温室中培养至成熟。2个F1品系的幼苗有一半在土壤中死亡，3个F1品系的幼苗有一半褪色并且生长严重受阻。这些结果表明AIR合成酶基因是植物所必需的。

实施例6：在大肠杆菌中表达重组植物AIR合成酶

得到并扩增位于质粒载体pFL61(Minet等，植物杂志，2:417-422(1992))中的拟南芥(Landsberg)cDNA文库。由公开的DNA序列(GenBank登记号为L12457,Senecoff和Meagher，植物生理学，102:387-399(1993))设计扩增拟南芥AIR合成酶之蛋白质编码序列所用的PCR引物，使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)以及所得引物由质粒文库扩增AIR合成酶编码序列。对PCR产物进行测序，结果表明公开的DNA序列中存在误差，导致对应于SEQ ID NO:1第1027位的位置处插入了胞嘧啶碱基。该插入导致错误的推测蛋白质。还观察到几个其它的改变，例如叶绿体转运肽中的9bp(=3个氨基酸)插入，这可能是由于生态型之间的变异引起的。重新设计引物以与正确的编码序列相对应。对于包括AIR合成酶前蛋白质编码区的构建体而言，使用引物slp242(5’CGC GGA TCC TCA CTA CTG ATA GCT TAC GCC TTC ACC3’,SEQ ID NO:8)和slp244(5’TTG AAG CCA TGG AAG CTC GGA TTT TG3’,SEQ ID NO:9)，对于包括推定的成熟AIR合成酶编码区的构建体而言，使用引物slp242和slp243(5’CGC ATG CCA TGG ATA AAG ATGATG ACA CTG ATA GTC T 3’,SEQ ID NO:10)。将前-蛋白质和推定的成熟蛋白质的编码区亚克隆至表达载体pET32a(Novagen)，使用Biorad基因脉冲仪和厂商提供的条件进行电穿孔，将上述两种重组载体转化至大肠杆菌BL21 DE3 pLysS(Novagen)。

实施例7：培养和提取FGAM合成酶

于30℃，在温箱/摇床中，在含有50μg/ml羧苄青霉素的LB肉汤培养基中培养大肠杆菌菌株TX635/pJS113(Schendel等，1989，生物化学，28,2459-2471)。当细胞于600nm下的光密度达到约10D时，加入等体积56℃的LB羧苄青霉素以热激细胞。随后，将细胞置于温箱/摇床中，于42℃培养。使用低速离心收集对数生长末期的细胞。倒转离心瓶使培养基全部流出。用小漆刷使细胞沉淀物重新悬浮于缓冲液A(50mM EPPS,pH7.5,1mM EDTA,2mM DTT,150mM KCl,10％甘油)，然后在法式压力槽中用18,000PSI的压力破碎细胞。高速离心以除去细胞碎片之后，用硫酸铵(40-60％)沉淀酶，将沉淀物储存于-80℃。将酶重新悬浮于小体积的缓冲液A中，上样于Sephadex G-25柱以将盐脱至缓冲液A中。按下文所述的方法测定酶活性。

实施例8：培养和提取AIR合成酶

于37℃，在温箱/摇床中，在含有50μg/ml羧苄青霉素的LB肉汤培养基中培养大肠杆菌菌株pJS24/Tx393(Schrimsher等，1986，生物化学，25,4366-4371)，所述菌株含有天然AIR合成酶的多个基因拷贝。使用低速离心收集对数生长末期的细胞，使其沉淀于离心管中。倒出培养基，倒转离心瓶使培养基全部流出。用小漆刷使细胞重新悬浮于缓冲液A，然后在法式压力槽中用约18,000PSI的压力破碎细胞。高速离心以沉淀细胞碎片之后，用硫酸铵沉淀上清液，将沉淀物储存于-80℃。

实施例9：AIR合成酶活性分析试验

AIR合成酶活性检测试验实质上来自Schrimsher等，1986，生物化学，25,4356-4365。反应体积优选为下文所述的体积，但也可根据实验需求改变体积。在终体积为96ml的50mM HEPES(pH7.4-8.1，但优选为7.7),20mM MgCl₂,150mM KCl和0.01-10mM，优选为2.0mM ATP中混合0.2-1.0×10^-4单位具有AIR合成酶活性的酶(一个活性单位被定义为产生1mmol/min产物所需酶的量)和0.1mM 5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)。优选根据Bratton和Marshall(生物化学杂志，1939,128,537-550)所述，加入32ml含1.33M磷酸钾的20％(w/v)三氯醋酸(pH1.4)以测定AIR的产生。离心混合物以除去沉淀的蛋白质，加入32ml 0.1％(w/v)亚硝酸钠。3分钟之后，加入32ml 0.5％(w/v)氨基磺酸铵，过1分钟之后加入8ml 25％N-(1-萘基)乙二胺二盐酸化物。10分钟之后测定530nm下的光吸收值。

或者，通过偶联反应法定量ADP的形成。此时，加入3.5单位丙酮酸激酶，4.7单位乳酸脱氢酶，1.0mM磷酸烯醇丙酮酸和0.2mM NADH，测定340nm处的光吸收值。

实施例10：联合分析FGAM合成酶和AIR合成酶的试验

A．FGAM合成酶分析试验

FGAR转变为FGAM，然后检测同时形成的ADP。利用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶(试剂酶)，并在磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的存在下检测NADH至NAD+的转变即可定量ADP的形成。在340nm下监测结果。丙酮酸激酶和PEP促使ADP再生为ATP。ATP是FGAM合成酶和AIR合成酶都需要的底物。检测缓冲液是添加有20mM MgCl₂的缓冲液A。

B．AIR合成酶分析试验

为了检测AIR合成酶，必须提供底物FGAM。通过在相同的反应混合物中将FGAR转变为FGAM即可提供FGAM。如果加入NADH，利用FGAM合成酶分析试验可跟踪这种转变。当FGAR-FGAM转变充分进行时(约为50μM)，则可加入AIR合成酶。在产生FGAM之后加入AIR合成酶可确保所有反应孔中FGAM的初始浓度保持不变。通过Bratton和Marshall(生物化学杂志，1939,128,537-550)的方法检测AIR合成酶。当产生AIR的时间足够长(一般为15分钟)时，即可用TCA终止酶反应。用亚硝酸钠使AIR衍生化，随后用氨基磺酸铵中和亚硝酸盐。加入N-(1-萘基)乙二胺二盐酸化物(NEDD)以显色，10分钟之后，在530nm处监测颜色。

C．分析试验方法

无论酶的来源如何，以相同的方法进行检测。在300μl 96孔微滴板中进行检测，检测反应的总体积为200μl。以一定的比例混合底物(除FGAR以外)以使终浓度(微滴板中的浓度)如下：L-谷氨酰胺(600μM),ATP(600μM),PEP(1mM)和NADH(200μM)。以20μl/孔的量将10倍浓度的底物混合物移入孔中。也可先混合试剂酶和FGAM合成酶，然后同时加入孔中。建议的ADP检测/再生混合物的量是每个反应含0.7单位丙酮酸激酶和0.97单位乳酸脱氢酶。应该根据这一建议进行具体试验，酶的用量可按经验进行调整。FGAR(200μM)应该在保温2分钟之后加入。在FGAM合成酶反应以约10μM/min的速度进行完毕(15分钟之内完成)之后，加入AIR合成酶。间隔一段时间(由AIR合成酶的活性决定)之后，用66μl含1M K₃PO₄的20％TCA终止反应。在离心机中离心微滴板，使沉淀的蛋白质沉淀下来，将上清液转移至另一个微滴板中进行显色和读数。加入1.2μl 10％亚硝酸钠，3分钟之后加入1.2μl 50％氨基磺酸铵(中和过量的亚硝酸盐)。1分钟之后，加入8.3μl1％NEDD,5分钟之后，使用读取微滴板数值的UV/VIS分光光度计对530nm下的微滴板进行读数。将AICAR用作标准，因为为此目的得不到AIR。根据AICAR，可容易地得到10μM合理的检出限(OD值3倍于背景值)。

L-谷氨酰胺，ATP，亚硝酸钠，氨基磺酸铵和NEDD得自SigmaChemicals。通过Chen和Henderson(加拿大化学杂志，1970,48:2306-2309)或Carrington等(J.Chem.Soc,1968,6864)的方法合成FGAR。

实施例11：通过DNA改组体外重组AIR合成酶基因

按实施例6所述，通过PCR扩增编码前-蛋白质的拟南芥AIR合成酶基因。基本上按文献(Stemmer等，1994,PNAS 91:10747-10751)所述，通过DNA酶Ⅰ处理消化所得的DNA片断，从反应混合物中除去PCR引物。不用引物进行PCR反应，接着用引物进行PCR反应，所用方法皆描述于Stemmer等，1994,PNAS 91:10747-10751。将所得DNA片断克隆至pTRC99a(Pharmacia,Cat no:27-5007-01)，然后使用Biorad基因脉冲仪和厂商提供的条件进行电穿孔，以将重组载体转化至大肠杆菌菌株SΦ6609/IKC(Schnorr等，1994，植物杂志，6:113-121)。在含有抑制浓度的抑制剂的培养基上培养经转化的细菌，选择那些存在抑制剂时仍能生长的菌落。挑选存在正常抑制浓度的抑制剂时仍能生长的菌落，通过重复划线进行纯化。纯化质粒，然后测定通过该检验的质粒中的cDNA插入物的DNA序列。

在类似的反应中，在体外重组经PCR扩增的含有编码前-蛋白质的拟南芥AIR合成酶基因的DNA片断和经PCR扩增的含有大肠杆菌purM基因的DNA片断，按上文所述方法回收所得的具有经改良的抑制剂耐受性的变体。

实施例12：通过交错切口延伸法体外重组AIR合成酶基因

将编码成熟蛋白质的拟南芥AIR合成酶基因和大肠杆菌purM基因各克隆至pBluescript载体的多接头中。基本上按文献(Zhao等，1998,Nature Biotechnology 16:258-261)所述，使用“反向引物”和“M1320引物”(Stratagene Catalog)进行PCR反应。用适当的限制性酶消化扩增的PCR片断，并克隆至pTRC99a，按实施例11所述筛选突变的AIR合成酶基因。

以上公开的实施方案是为了阐明本发明。本发明所公开的内容允许本领域技术人员对本发明作出很多改变。所有这些显而易见的和可预见的改变都包括在所附权利要求书的范围之内。

                               序列表<110>Novartis AG<120>筛选除草剂化合物的方法及其用途<130>PH/5-30552/A/CGCl999<140><141><150>US09/103,895<151>1998-06-24<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1172<212>DNA<213>拟南芥<220><221>CDS<222>(3)..(1160)<223>AIR合成酶cDNA<400>1cc atg gaa gct cgg att ttg cag tct tct tct tcc tgt tat tcg tct     47Met Glu Ala Arg Ile Leu Gln Ser Ser Ser Ser Cys Tyr Ser Ser

 1               5                  10                  15ctt tac act gtc aat cga tcc cgg ttc tct tct ccg aaa cct ttc tcc    95Leu Tyr Thr Val Asn Arg Ser Arg Phe Ser Ser Pro Lys Pro Phe Ser

             20                  25                  30gtc agc ttt gct cag acg acg aga aca agg act cgt gta tta tcc atg    143Val Ser Phe Ala Gln Thr Thr Arg Thr Arg Thr Arg Val Leu Ser Met

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        340                 345                 350Ser Pro Glu Ala Ala Ser Arg Ile Leu Glu Glu Val Lys Asn Gly Asp

    355                 360                 365Tyr Val Ala Tyr Arg Val Gly Glu Val Val Asn Gly Glu Gly Val Ser

370                 375                 380Tyr Gln385<210>3<211>1013<212>DNA<213>拟南芥<220><221>mat_peptide<222>(3)..(1001)<223>推定的AIR合成酶成熟肽的编码序列<220><221>CDS<222>(3)..(1001)<400>3cc atg gat aaa gat gat gac act gat agt ctc aat tac aaa gat tct     47Met Asp Lys Asp Asp Asp Thr Asp Ser Leu Asn Tyr Lys Asp Ser

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        275                 280                 285acg ttt aac ctg ggg ata ggg atg gtt atg gtg gtt agt cca gag gca    911Thr Phe Asn Leu Gly Ile Gly Met Val Met Val Val Ser Pro Glu Ala

    290                 295                 300gct tca cga ata cta gaa gaa gtc aag aat gga gac tat gtt gcg tat    959Ala Ser Arg Ile Leu Glu Glu Val Lys Asn Gly Asp Tyr Val Ala Tyr

305                 310                 315cgc gta gga gag gtt gtc aac ggt gaa ggc gta agc tat cag            1001Arg Val Gly Glu Val Val Asn Gly Glu Gly Val Ser Tyr Gln320                 325                 330tagtgaggat cc                                                      1013<210>4<211>333<212>PRT<213>拟南芥<400>4Met Asp Lys Asp Asp Asp Thr Asp Ser Leu Asn Tyr Lys Asp Ser Gly1               5                  10                  15Val Asp Ile Asp Ala Gly Ala Glu Leu Val Lys Arg Ile Ala Lys Met

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        100                 105                 110Ile Lys Gly Ile Val Glu Gly Cys Arg Gln Ser Glu Cys Ala Leu Leu

    115                 120                 125Gly Gly Glu Thr Ala Glu Met Pro Asp Phe Tyr Ala Glu Gly Glu Tyr

130                 135                 140Asp Leu Ser Gly Phe Ala Val Gly Ile Val Lys Lys Thr Ser Val Ile145                 150                 155                 160Asn Gly Lys Asn Ile Val Ala Gly Asp Val Leu Ile Gly Leu Pro Ser

            165                 170                 175Ser Gly Val His Ser Asn Gly Phe Ser Leu Val Arg Arg Val Leu Ala

        180                 185                 190Arg Ser Asn Leu Ser Leu Asn Asp Ala Leu Pro Gly Gly Ser Ser Thr

    195                 200                 205Leu Gly Asp Ala Leu Met Ala Pro Thr Val Ile Tyr Val Lys Gln Val

210                 215                 220Leu Asp Met Ile Glu Lys Gly Gly Val Lys Gly Leu Ala His Ile Thr225                 230                 235                 240Gly Gly Gly Phe Thr Asp Asn Ile Pro Arg Val Phe Pro Asp Gly Leu

            245                 250                 255Gly Ala Val Ile His Thr Asp Thr Trp Glu Leu Pro Pro Leu Phe Lys

        260                 265                 270Trp Ile Gln Gln Thr Gly Arg Ile Glu Asp Ser Glu Met Arg Arg Thr

    275                 280                 285Phe Asn Leu Gly Ile Gly Met Val Met Val Val Ser Pro Glu Ala Ala

290                 295                 300Ser Arg Ile Leu Glu Glu Val Lys Asn Gly Asp Tyr Val Ala Tyr Arg305                 310                 315                 320Val Gly Glu Val Val Asn Gly Glu Gly Val Ser Tyr Gln

            325                 330<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述：寡核苷酸JG-L<400>5gtacctcgag tctagactcg ag                                         22<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸AS-1<400>6gatcgagctc gttctcttct gtgtcatc                                   28<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸AS-2<400>7gatcccatg gtccccaggta aagacgtc                                   28<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸slp242<400>8cgcggatcct cactactgat agcttacgcc ttcacc                          36<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸slp244<400>9ttgaagccat ggaagctcgg attttg                                     26<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸slp243<400>10cgcatgccat ggataaagat gatgacactg atagtct                         37

Claims (39)

1．分离的酶，其含有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4相同或基本上相似的氨基酸序列，其中所述酶具有5’-磷酸核糖-5-氨基咪唑(AIR)合成酶活性。

2．根据权利要求1的分离的酶，其中所述氨基酸序列得自植物。

3．根据权利要求1的分离的酶，其中所述氨基酸序列是SEQ IDNO:2。

4．根据权利要求1的分离的酶，其中所述氨基酸序列是SEQ IDNO:4。

5．分离的核酸分子，其含有编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的核苷酸序列。

6．根据权利要求5的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是SEQID NO:1或SEQ ID NO:3。

7．根据权利要求5的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含于保藏号为NRRL B-21976的大肠杆菌菌株DH5apASM中。

8．嵌合基因，其含有与权利要求5的核酸分子可操作相连的异源启动子序列。

9．重组载体，其含有权利要求8的嵌合基因。

10．宿主细胞，其含有权利要求8的嵌合基因。

11．根据权利要求10的宿主细胞，其为细菌细胞。

12．根据权利要求10的宿主细胞，其为酵母细胞。

13．根据权利要求10的宿主细胞，其为植物细胞。

14．含有权利要求13的植物细胞的植物。

15．得自权利要求14的植物的种子。

16．鉴定能够抑制植物生长或生存力的化合物的方法，所述方法包括：

(a)在酶能够催化AIR合成的条件下，在第一个反应混合物中将具有AIR合成酶活性的酶与AIR合成酶的底物相混合；

(b)在相同条件下，在第二个反应混合物中将待检测的化合物和酶与AIR合成酶的底物相混合，混合时间与第一个反应混合物中的相同；和

(c)测定和比较第一个和第二个反应混合物中的酶活性；

其中第二个反应混合物中的酶活性比第一个反应混合物中的低，则表明(b)中所述的化合物能够抑制植物生长或生存力。

17．鉴定能够抑制植物生长或生存力的化合物的方法，所述方法包括：

(a)在酶能够催化AIR偶联合成的条件下，在第一个反应混合物中将具有5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)合成酶活性的酶和具有AIR合成酶活性的酶与FGAM合成酶的底物相混合；

(b)在相同条件下，在第二个反应混合物中将待检测的化合物和所述酶与FGAM合成酶的底物相混合，混合时间与第一个反应混合物中的相同；和

(c)测定和比较第一个和第二个反应混合物中具有AIR合成酶活性的酶的活性；

其中第二个反应混合物中的酶活性比第一个反应混合物中的低，则表明(b)中所述的化合物能够抑制植物生长或生存力。

18．鉴定具有抑制植物中的AIR合成酶活性的除草剂活性的化合物的方法，所述方法包括：

(a)得到转基因植物，植物组织，植物种子或植物细胞，其含有编码具有AIR合成酶活性之酶的分离的核苷酸序列，并能过量表达具有酶促活性的AIR合成酶；

(b)将待检测的化合物应用于转基因植物，植物细胞，组织或部分以及等基因的未经转化的植物，植物细胞，组织或部分；

(c)使用化合物之后，测定转基因的和未经转化的植物，植物细胞，组织的生长或生存力；和

(d)比较转基因的和未经转化的植物，植物细胞，组织在使用化合物之后的生长或生存力；

其中未经转基因的植物，植物细胞，组织或部分的生长或生存力被抑制，而等基因的转基因植物，植物细胞，组织或部分的生长或生存力未被显著抑制，则表明(b)中所述的化合物具有抑制植物中的AIR合成酶活性的除草剂活性。

19．根据权利要求16的方法，其中底物是5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨脒(FGAM)。

20．根据权利要求16的方法，其中底物是b-FGAM。

21．根据权利要求17的方法，其中底物是5’-磷酸核糖-N-甲酰甘氨酰胺(FGAR)。

22．根据权利要求17的方法，其中底物是b-FGAR。

23．根据权利要求16至18中的任一项的方法，其中具有AIR合成酶活性的酶得自植物。

24．根据权利要求16至18中的任一项的方法，其中具有AIR合成酶活性的酶含有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列相同或基本上相似的氨基酸序列。

25．根据权利要求16至18中的任一项的方法，其中具有AIR合成酶活性的酶得自大肠杆菌。

26．根据权利要求16至18中的任一项的方法，其中通过检测反应混合物中产生的AIR来测定酶活性。

27．抑制不必要的植被生长的方法，所述方法包括给不必要的植被施用通过权利要求16至18中的任一项的方法鉴定的化合物。

28．转基因植物，植物细胞，植物种子或植物组织，它们含有编码具有AIR合成酶活性之酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列赋予所述转基因植物，植物细胞，植物种子或植物组织对一定用量的通过权利要求16至18中任一项的方法鉴定的化合物的耐受性，所述化合物的该用量可正常抑制野生型植物中的AIR合成酶活性。

29．通过下列方法制备的植物，所述方法包括用分离的DNA分子转化植物或植物的亲本，所述DNA分子含有编码具有AIR合成酶活性之酶的核苷酸序列，并能在植物中表达该核苷酸序列以赋予植物对通过权利要求16至18中任一项的方法鉴定的化合物的耐受性。

30．选择性抑制种植有作物种子或植物的田地中的杂草生长的方法，所述方法包括步骤：

(a)种植除草剂耐受型作物或作物种子，即被分离的DNA分子转化的植物或植物种子，所述DNA分子含有具有AIR合成酶活性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能在所述植物或植物种子中表达；和

(b)给田地中的作物或作物种子和杂草施用除草剂，所述除草剂的用量能抑制天然AIR合成酶活性，其中除草剂抑制杂草的生长，但不会显著抑制作物的生长。

31．由编码具有AIR合成酶活性之酶的模板DNA分子形成编码具有AIR合成酶活性之酶的经诱变DNA分子的方法，其中所述模板DNA分子已被裂解成双链随机片断，所述方法包括步骤：

(a)在所得的双链随机片断群体中加入至少一种单链或双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有相对于模板DNA分子而言的同一性区域和异源性区域；

(b)将所得的双链随机片断和寡核苷酸的混合物变性为单链分子；

(c)在导致所述单链分子在所述同一性区域退火的条件下，将所得单链分子群体与聚合酶保温以形成成对的退火片断，所述同一性区域足以使片断对的一个成员引发另一个成员的复制，籍此形成经诱变的双链多核苷酸；

(d)将第二和第三个步骤至少再重复两个循环，其中下一个循环的第二步骤中的所得混合物包括得自前一循环第三步骤中的经诱变的双链多核苷酸，且该下一个循环形成了另一个经诱变的双链多核苷酸；

其中经诱变的双链多核苷酸编码AIR合成酶，该酶对可抑制由模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性。

32．由至少两个不相同的，编码具有AIR合成酶活性之酶的模板DNA分子形成编码具有AIR合成酶活性之酶的经诱变DNA分子的方法，所述方法包括步骤：

(a)在模板DNA分子中加入至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸含有相对于每种模板DNA分子而言的同一性区域；

(b)将所得的混合物变性为单链分子；

(c)在导致寡核苷酸与模板DNA分子退火的条件下，将所得单链分子群体与聚合酶保温，其中由聚合酶聚合化的条件能使得得到相当于模板DNA分子一部分的聚合化产物；

(d)将第二和第三个步骤至少再重复两个循环，其中第三个步骤中得到的延伸产物能够转换在下一个循环中聚合化的模板DNA分子，从而形成经诱变的双链多核苷酸，该多核苷酸含有得自不同模板DNA分子的序列；

其中经诱变的双链多核苷酸编码AIR合成酶，该酶对可抑制由模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性。

33．通过权利要求31的方法得到的编码具有AIR合成酶活性之酶的经诱变DNA分子，其中所述经诱变的DNA分子编码对可抑制由所述模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性的AIR合成酶。

34．通过权利要求32的方法得到的编码具有AIR合成酶活性之酶的经诱变DNA分子，其中所述经诱变的DNA分子编码对可抑制由所述模板DNA分子编码的AIR合成酶活性的除草剂具有增强的耐受性的AIR合成酶。

35．权利要求31或权利要求32的方法，其中至少一种模板DNA分子得自真核生物。

36．权利要求35的方法，其中所述真核生物是植物。

37．权利要求36的方法，其中所述植物是拟南芥。

38．权利要求37的方法，其中所述模板DNA分子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3相同或基本上相似。

39．权利要求31或权利要求32的方法，其中一种模板DNA分子得自原核生物。