CN1313094C - Zd6474在制备在用电离辐射治疗的人体中治疗癌症的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在温血动物例如人中产生抗血管生成和/或血管渗透性降低效应的方法，尤其是治疗癌症的方法，癌症尤其包括实体瘤，该方法包括联合给予ZD6474和电离辐射；并涉及ZD6474在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗血管生成和/或血管渗透性降低效应的药物中的用途。

Description

ZD6474在制备在用电离辐射治疗的人体中治疗癌症的药物的用途
本发明涉及在温血动物例如人中产生抗血管生成和/或血管渗透性降低效应的方法，尤其是治疗癌症的方法，癌症尤其包括实体瘤，该方法包括联合给予ZD6474和电离辐射；并涉及ZD6474在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗血管生成和/或血管渗透性降低效应的药物中的用途。
正常的血管生成在包括胚胎发育、伤口愈合和雌性生殖功能的若干成分在内的多种进程中起重要作用。不合需要的或病态的血管生成与包括糖尿病性视网膜病、牛皮癣、癌症、类风湿性关节炎、粥样斑、卡波西肉瘤和血管瘤在内的疾病状况有关(Fan等，1995，TrendsPharmacol.Sci.16：57-66；Folkman，1995，Nature Medicine 1：27-31)。血管渗透性的改变被认为在正常和病理生理进程中起作用(Cullinan-Bove等，1993，Endocrinology 133：829-837；Senger等，1993，Cancer and Metastasis Reviews，12：303-324)。已经鉴别了一些具有体外内皮细胞生长促进活性的多肽，包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF & bFGF)以及血管内皮生长因子(VEGF)。由于其受体受限制的表达，VEGF的生长因子活性与FGFs的相反，对于内皮细胞是相对特异性的。最近的证据表明VEGF是正常和病理血管生成(Jakeman等，1993，Endocrinology，133：848-859；Kolch等，1995，Breast Cancer Research and Treatment，36：139-155)和血管渗透性(Connolly等，1989，J.Biol.Chem 264：20017-20024)的重要刺激物。通过用抗体隔绝VEGF的VEGF的拮抗会导致肿瘤生长的抑制(Kim等，1993，Nature 362：841-844)。
受体酪氨酸激酶(RTKs)在生物化学信号跨细胞质膜的传递中是重要的。这些跨膜分子特有地包含通过质膜内的区段与细胞内酪氨酸激酶域相连的细胞外配体结合域。配体与受体的结合导致与受体关联的酪氨酸激酶活性的刺激，这导致酪氨酸残基在受体和其它细胞内分子上的磷酸化。酪氨酸磷酸化中的这些变化启动了导致多种细胞响应的信号串联。迄今为止，已经鉴别了由氨基酸序列同源性定义的至少十九种不同的RTK亚科。目前这些亚科中的一种包含fms样酪氨酸激酶受体-Flt-1、包含激酶插入片段域的受体-KDR(也称作Flk-1)以及另一种fms样酪氨酸激酶受体-Flt-4。已经显示这些相关RTKs中的两种-Flt-1和KDR结合VEGF具有高度亲和性(De Vries等，1992，Science 255：989-991；Terman等，1992，Biochem Biophys.Res.Comm 1992，187：1579-1586)。VEFG与在异种细胞中表达的这些受体的结合与细胞蛋白和钙通量的酪氨酸磷酸化中的变化有关。
VEGF是血管发生和血管生成的关键刺激物。这些细胞因子通过诱导内皮细胞增殖、蛋白酶表达和迁移以及继发的细胞的组织来诱导血管芽殖亚型以形成毛细管(Keck，P.J.，Hauser，S.D.，Krivi，G.，Sanzo，K.，Warren，T.，Feder，J.，和Connolly，D.T.，Science(Washington DC)，246：1309-1312，1989；Lamoreaux，W.J.，Fitzgerald，M.E.，Reiner，A.，Hasty，K.A.，和Charles，S.T.，Microvasc.Res.，55：29-42，1998；Pepper，M.S.，Montesano，R.，Mandroita，S.J.，Orci，L.和Vassalli，J.D.，Enzyme Protein，49：138-162，1996.)。此外，VEGF诱发显著的血管渗透性(Dvorak，H.F.，Detmar，M.，Claffey，K.P.，Nagy，J.A.，van de Water，L.，和Senger，D.R.，(Int.Arch.Allergy Immunol.，107：233-235，1995；Bates，D.O.，Heald，R.I.，Curry，F.E.和Williams，B.J.Physiol.(Lond.)，533：263-272，2001)，促进高渗透性的、不成熟的血管网络形成，这是病理的血管生成的特征。
已有显示单独KDR的激活足以促进对VEGF的所有主表型响应，包括内皮细胞增殖、迁移和存活，以及血管渗透性的诱发(Meyer，M.，Clauss，M.，Lepple-Wienhues，A.，Waltenberger，J.，Augustin，H.G.，Ziche，M.，Lanz，C.，Biittner，M.，Rziha，H-J.，和Dehio，C.，EMBO J.，18：363-374，1999；Zeng，H.，Sanyal，S.和Mukhopadhyay，D.，J.Biol.Chem，276：32714-32719，2001；Gille，H.，Kowalski，J.，Li，B.，LeCouter，J.，Moffat，B，Zioncheck，T.F.，Pelletier，N.和Ferrara，N.，J.Biol.Chem.，276：3222-3230，2001)。
电离辐射和VEGF抗体在多种小鼠异体移植物模型中的应用已有描述(Gorski等，1999，Cancer Res.59，3374-3378和国际专利申请公开号WO 00/61186)。
电离辐射和可溶性VEGF受体(可溶性Flk-1)以及电离辐射和KDR抑制剂-SU5416在小鼠神经胶质瘤异体移植物模型中的应用已有描述(Geng等，2001，Cancer Res.61，2413-2419)。
在国际专利申请公开号WO98/13354和WO 01/32651中公开了是VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂的喹唑啉衍生物。在WO 98/13354和WO01/32651中，化合物被描述具有抗VEGF受体酪氨酸激酶活性同时具有某些抗EGF受体酪氨酸激酶活性。本发明的化合物-ZD6474落入了WO98/13354的广泛一般的公开并且在WO 01/32651中被举例说明。
在WO 01/32651中，它陈述了该发明的化合物：“可以作为单独治疗剂应用，或者除本发明的化合物外可以包含一种或多种其它的物质和/或疗法。这些联合疗法可以通过同时、相继或分隔给药治疗的单独成分的途径来完成”。
然后WO 01/32651继续描述了这种联合疗法的实施例，包括手术、放射疗法和各种类型的化学治疗剂。在WO 01/32651中没有陈述本发明任何化合物与其它疗法的使用将产生令人惊奇的有益效果。
现在我们出乎意料地和令人惊奇地发现，特定化合物ZD6474与在WO 01/32651中列出的组合疗法的特定选择一称作电离辐射的组合使用，产生超过单独使用ZD6474和电离辐射中任一个的显著更好的效果。
按照本发明的一个方面，ZD6474与电离辐射的组合使用产生超过单独使用ZD6474和电离辐射中任一个的显著更好的抗癌效果。
按照本发明的一个方面，ZD6474与电离辐射的组合使用产生超过单独使用ZD6474和电离辐射中任一个的显著更好的抗实体瘤效果。
本发明的治疗方法的抗癌效果包括但不限于抗肿瘤效应、应答率、疾病进展的时间和生存率。本发明的治疗方法的抗肿瘤效果包括但不限于抑制肿瘤生长、肿瘤生长延迟、肿瘤退化、肿瘤收缩、在治疗停止基础上肿瘤再生的时间延长、减缓疾病进程。据预期当本发明的治疗方法被施用于患有或未患实体瘤的需要癌症治疗的温血动物例如人时，所述治疗方法将产生例如通过抗肿瘤效应范围、响应率、疾病进展的时间和生存率中的一种或多种测量到的效应。
按照本发明，其提供在温血动物例如人中产生抗血管生成和/或血管渗透性降低效应的方法，其包括在给予有效量的电离辐射之前、之后或同时，给予所述动物有效量的4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉，也称作ZD6474：
Figure C0381910100061
ZD6474
或其可药用盐。
按照本发明的另一方面，其提供治疗温血动物例如人癌症的方法，其包括在给予有效量的电离辐射之前、之后或同时，给予所述动物有效量的ZD6474或其可药用盐。
按照本发明的另一方面，其提供治疗温血动物例如人的癌症包括实体瘤的方法，其包括在给予有效量的电离辐射之前、之后或同时，给予所述动物有效量的ZD6474或其可药用盐。
按照本发明的另一方面，其提供ZD6474或其可药用盐在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗血管生成的和/或血管渗透性降低效应的药物中的用途。
按照本发明的另一方面，其提供ZD6474或其可药用盐在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗癌效应的药物中的用途。
按照本发明的另一方面，其提供ZD6474或其可药用盐在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗肿瘤效应的药物中的用途。
正在用电离辐射治疗的温血动物例如人指在给予包含ZD6474的药物之前、之后或同时用电离辐射治疗温血动物例如人。例如所述电离辐射可以在给予包含ZD6474的药物一星期前至一星期后的时间段内给予所述温血动物例如人。按照本发明的一个方面，ZD6474在动物用电离辐射治疗完后被给予温血动物。温血动物会同时经历ZD6474和电离辐射每一个的效应。
如上所述，对如本文定义的本发明的组合疗法感兴趣的是它们的抗血管生成和/或血管渗透性作用。本发明的这种组合疗法被预期用于预防和治疗在其中不适当的血管生成发生的广泛的疾病状况，包括癌症和卡波西肉瘤。癌症会影响任何组织，并包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤。本发明的这种组合疗法尤其被预期能有利地减缓例如结肠、乳腺、前列腺、肺和皮肤的原发的和继发的实体瘤。更具体地，本发明的组合疗法被预期能有利地减缓肺癌肿瘤的生长，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)。更特别地，本发明的这种组合疗法被预期能抑制任何形式的与VEGF相关的癌症包括白血病、多发性骨髓瘤和淋巴瘤，并且例如也能抑制那些与VEGF相关的原发的和再发的实体瘤的生长，特别是那些它们的生长和扩散显著地依赖于VEGF的肿瘤，包括例如某些结肠、乳腺、前列腺、肺、外阴和皮肤肿瘤，尤其是NSCLC。
在本发明的另一方面中，ZD6474和电离辐射被预期能抑制与EGF相关的那些原发和再发实体瘤的生长，特别是它们的生长和扩散显著地依赖于EGF的那些肿瘤。
在本发明的另一方面中，ZD6474和电离辐射被预期能抑制与VEGF和EGF相关的那些原发和再发实体瘤的生长，特别是它们的生长和扩散显著地依赖于VBGF和EGF的那些肿瘤。
按照本发明的另一方面，本发明的治疗方法的效应被预期至少等价于单独使用所述治疗的每个成分的效应的加和，即单独使用ZD6474和电离辐射中每一个。
按照本发明的另一方面，本发明的治疗方法的效应被预期大于单独使用所述治疗的每个成分的效应的加和，即单独使用ZD6474和电离辐射中每一个。
按照本发明的另一方面，本发明治疗方法的效应被预期有协同效应。
也应该理解，如果效应在治疗上优于以常规剂量给药组合疗法中的成分的不管哪一个获得的效应，则组合疗法被定义为提供协同效应，这一点例如通过响应范围、响应率、减少进程的时间或存活期来测量。例如，如果效应在治疗上优于单独用ZD6474或电离辐射获得的效应，则该组合疗法的效应是协同的。此外，如果在一组对单独的ZD6474或电离辐射不响应(或响应很差)的患者身上获得了有益效果，则该组合疗法的效应是协同的。另外，如果成分中的一种以它的常规剂量给药且其它成分以减少的剂量给药，并且如通过响应范围、响应率、减少进程的时间或存活期测量的治疗效应等价于给药组合疗法中成分的常规剂量获得的效应，则该组合疗法的效应被定义为提供协同效应。特别地，与当使用每个成分的常规剂量发生的效应相比，如果ZD6474或电离辐射的常规剂量可以降低而没有对响应范围、响应率、减少进程的时间或存活期中的一种或多种的危害，尤其是不危害响应的持续，但是有很少和/或不麻烦的副作用，则协同被认为存在。
如本文所定义的本发明的组合疗法可以通过同时、相继或分隔的给予所述疗法的单独组分的方式完成。如本文所定义的组合疗法可以作为单独的疗法应用或者除本发明的组合疗法之外还可以包括手术。手术可以包括在给予利用本文描述的利用ZD6474的组合疗法之前、之中或之后部分或完全肿瘤切除的步骤。
本文描述的组合物可以是适于口服给药的形式，例如作为片剂或胶囊，适于鼻内给药或通过吸入给药的形式，例如粉剂或溶液剂，适于胃肠外注射的形式(包括静脉内、皮下、肌内、血管内或输注)例如作为无菌溶液、混悬液或乳剂，适于局部给药的形式，例如软膏或乳膏，用于直肠给药的形式，例如栓剂，或可以是通过直接注射入肿瘤或通过局域给药或局部给药的给药途径。在本发明的其它实施方案中，组合疗法的ZD6474可以内窥镜地、气管内地、内部损害地、经皮地、静脉内地、皮下地、腹膜内地或肿瘤内地给药。优选地，ZD6474是口服给药。通常，本文描述的组合物可以利用常规赋形剂以常规方式制备。本发明的组合物有利地以单元剂型存在。
ZD6474一般以每平方米动物机体面积10-500mg范围内的单元剂量给予温血动物，例如大约0.3-15mg/kg给予人。设想单元剂量的范围例如是0.3-15mg/kg，优选0.5-5mg/kg，并且这通常是治疗有效量。例如片剂或胶囊的单元剂型通常将包含例如25-500mg活性成分。优选使用0.5-5mg/kg范围的日剂量。
特别地，在本发明具体实施方案中使用的电离辐射可以是X-辐射、γ-辐射或β-辐射。
电离辐射的剂量将是在临床放射疗法中应用已知的那些。使用的辐射疗法将包括例如应用γ-射线、X-射线、和/或来自来自放射性同位素的直接传递。DNA损害因子的其它形式也包括在本发明中例如微波和紫外线照射。最可能的是，所有这些因子在DNA上、在DNA的前体上、在DNA的复制和修复上和在染色体的组装和维持上引起广泛的损伤。例如X-射线可以以1.8-2.0Gy的日剂量，一周五天给药5-6星期。通常总分次剂量在45-60Gy范围。单次较大剂量，例如5-10Gy可以作为放射疗法过程的部分给予。单次剂量可以在手术中给予。可以采用超分割放射疗法，其中经一段时间规则地给予小剂量的X-射线，例如经许多天每小时0.1Gy。放射疗法的剂量范围变化很广，并且依赖于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型和细胞的摄取。
如上所述，需要用来治疗性或预防性治疗特定疾病状况的每一疗法的剂量的大小将必须取决于治疗的宿主、给药途径和被治疗的疾病的严重性而变化。因此，可以由治疗任何特定患者的医生决定最适宜剂量。例如，可能是必须或希望的能减少上述组合疗法中成分的剂量以便减少毒性。
本发明涉及电离辐射与ZD6474或与ZD6474的盐的组合。
用于药物组合物的ZD6474的盐是可药用盐，但是其它盐可以用于生产ZD6474和其可药用盐。这种盐可以用提供可药用阳离子的无机或有机碱形成。这种用无机或有机碱的盐包括，例如碱金属盐例如钠或钾盐，碱土金属盐例如钙或镁盐，铵盐或用甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺的盐。
ZD6474例如可以按照由实施例(a)-(c)举例说明的下述方法中的任何一个来制备，除非另外说明：—
(i)通过在真空中旋转蒸发来进行蒸发，并在通过过滤除去残留固体例如干燥剂后逐步进行操作；
(ii)在环境温度即在18-25℃和在惰性气氛例如氩气下进行操作；
(iii)在获得自E.Merck(Darmstadt，德国)的Merck硅胶二氧化硅(Art.9385)或Merck Lichroprep RP-18(Art.9303)反相二氧化硅柱上执行柱层析(通过闪光程序)和中压液相层析(MPLC)；
(iv)给出的产量仅用于说明，并不必是最大可获得的；
(v)熔点是未校正的，并且是利用Mettler SP62自动熔点仪、油浴装置或Koffler热板装置测定的。
(vi)通过核(通常是质子)磁共振(NMR)和质谱技术确认式I的终产物的结构；在δ标度上测量质子磁共振化学位移值且峰多样性如下表示：s，单峰；d，双峰；t，三峰；m，多重峰；br，宽峰；q，四重峰；在24℃在400MHz机器上进行NMR光谱。
(vii)中间产品通常不是完全特征化的，通过薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、红外(IR)或NMR分析来评价纯度。
使用下述缩略语：—
DMF  N，N-二甲基酰胺
DMSO 二甲基亚砜
THF  四氢呋喃
TFA  三氟醋酸
NMP  1-甲基-2-吡咯烷酮
方法(a)
将37％的含水甲醛(50μl，0.6毫摩尔)加入4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(139mg，0.3mmol)在THF/甲苯(1.4ml/1.4ml)混合物中的溶液中，然后加入氰基硼氢化钠(23mg，0.36mmol)。在室温搅拌1小时后，加入水，并在真空下除去挥发物。用水研磨残留物，过滤，用水洗涤并真空干燥。通过在中性氧化铝上用二氯甲烷洗脱，然后用二氯甲烷/乙酸乙酯(1/1)洗脱，然后用二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(50/45/5)洗脱的色谱法纯化该固体。在真空下蒸发包含预期产品的馏分。将得到白色固体溶解在二氯甲烷/甲醇(3ml/3ml)中，并加入在醚(0.5ml)中的3N盐酸。在真空下除去挥发物。将固体用醚研磨，过滤，用醚洗涤并在真空下干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉盐酸盐(120mg，69％)。
MS-ESI：475-477[MH]+
4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉盐酸盐质子化形式的NMR谱显示2种形式A和B以A∶B大约9∶1的比率存在。
1H NMR谱：(DMSOd6；CF3COOD)1.55-1.7(m，A型2H)；1.85-2.0(m，B型4H)；2.03(d，A型2H)；2.08-2.14(br s，A型1H)；2.31-2.38(br s，B型1H)；2.79(s，A型3H)；2.82(s，B型3H)；3.03(t，A型2H)；3.21(br s，B型2H)；3.30(br s，B型2H)；3.52(d，A型2H)；4.02(s，3H)；4.12(d，A型2H)；4.30(d，B型2H)；7.41(s，1H)；7.5-7.65(m，2H)；7.81(d，1H)；8.20(s，1H)；8.88(s，1H)
元素分析：                             发现  C 46.0  H 5.2  N 9.6
C22H24N4O2BrF 0.3H2O 2.65HCl    需要  C 45.8  H 4.8  N 9.7％
如下制备起始物质：
将7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉盐酸盐(8.35g，27.8毫摩尔)(例如如在WO97/22596实施例1中的描述制备的)和4-溴-2-氟苯胺(5.65g，29.7毫摩尔)  在2-丙醇(200ml)中的溶液加热回流4小时。通过过滤收集得到的沉淀物，用2-丙醇洗涤，然后用醚洗涤，并真空干燥得到7-苄氧基-4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉盐酸盐(9.46g，78％)。
1H NMR谱：(DMSOd6；CD3COOD)4.0(s，3H)；5.37(8，2H)；7.35-7.5(m，4H)；7.52-7.62(m，4H)；7.8(d，1H)；8.14(9s，1H)；8.79(s，1H)
MS-ESI：456[MH]+
元素分析：                            发现  C 54.0  H 3.7  N 8.7
C22H17N3O2BrF 0.9HCl            需要  C 54.2  H 3.7  N 8.6％
将7-苄氧基-4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基喹唑啉盐酸盐(9.4g，19.1毫摩尔)在TFA(90ml)中的溶液加热回流50分钟。使混合物冷却并倒入冰中。通过过滤收集得到的沉淀物并溶解在甲醇(70ml)中。用浓缩的氨水溶液将溶液调整到pH9-10。通过蒸发将混合物浓缩至原始体积的一半。通过过滤收集得到的沉淀物，用水洗涤，然后用醚洗涤，真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺基)-7-羟基-6-甲氧基喹唑啉(5.66g，82％)。
1H NMR谱：(DMSOd6；CD3COOD)3.95(s，3H)；7.09(s，1H)；7.48(s，1H)；7.54(t，1H)；7.64(d，1H)；7.79(s，1H)；8.31(s，1H)
MS-ESI：366[MH]+
元素分析：                        发现  C 49.5  H 3.1  N 11.3
C15H11N3O2BrF               需要  C 49.5  H 3.0  N 11.5％
当维持温度在0-5℃的同时，将二-叔丁基碳酸氢盐(41.7g，0.19摩尔)在乙酸乙酯(75摩尔)中的溶液分次加入在5℃冷却的4-哌啶羧酸乙酯(30g，0.19摩尔)在乙酸乙酯(150ml)中的溶液。在室温搅拌48小时后，将混合物倒入水(300ml)中。分离有机层，相继用水(200ml)、0.1N含水盐酸(200ml)、饱和的碳酸氢钠(200ml)和盐水(200ml)洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发得到4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶)羧酸乙酯(48g，98％)。
1H NMR谱：(CDCl3)1.25(t，3H)；1.45(s，9H)；1.55-1.70(m，2H)；1.8-2.0(d，2H)；2.35-2.5(m，1H)；2.7-2.95(t，2H)；3.9-4.1(br s，2H)；4.15(q，2H)
将1M氢化铝锂在THF(133ml，0.133摩尔)中的溶液分次加入在0℃冷却的4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶)羧酸乙酯(48g，0.19摩尔)在无水THF(180ml)中的溶液中。在0℃搅拌2小时后，加入水(30ml)然后加入2N氢氧化钠(10ml)。通过过滤滤过硅藻土除去沉淀物，并用乙酸乙酯洗涤。滤液用水、盐水洗涤，干燥(Mg2SO4)并蒸发得到1-(叔丁氧基羰基)-4-羟甲基哌啶(36.3g，89％)。
MS(EI)：215[M.]+
1H NMR谱：(CDCl3)1.05-1.2(m，2H)；1.35-1.55(m，10H)；1.6-1.8(m，2H)；2.6-2.8(t，2H)；3.4-3.6(t，2H)；4.0-4.2(br s，2H)
将1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(42.4g，0.378摩尔)加入1-(叔丁氧基羰基)-4-羟甲基哌啶(52.5g，0.244摩尔)在叔丁基甲基醚(525ml)的溶液中。在环境温度搅拌15分钟后，将混合物冷却至5℃，并在维持温度在0℃的同时经2小时分次加入甲苯磺酰氯化物(62.8g，0.33毫摩尔)在叔丁基甲基醚(525摩尔)中的溶液。在环境温度搅拌1小时后，加入石油醚(11)。通过过滤除去沉淀物。蒸发滤液得到固体。将该固体溶解在醚中，并接连用0.5N含水盐酸(2×500ml)、水、饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发得到1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲苯基磺酰氧甲基)哌啶(76.7g，85％)。
MS(ESI)：392[MNa]+
1H NMR谱：(CDCl3)1.0-1.2(m，2H)；1.45(s，9H)；1.65(d，2H)；1.75-1.9(m，2H)；2.45(s，3H)；2.55-2.75(m，2H)；3.85(d，1H)；4.0-4.2(br s，2H)；7.35(d，2H)；7.8(d，2H)
将碳酸钾(414mg，3毫摩尔)加入4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-羟基-6-甲氧基喹唑啉(546mg，1.5毫摩尔)在DMF(5ml)中的混悬液中。在室温搅拌10分钟后，加入1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲苯基磺酰氧甲基)哌啶(636mg，1.72毫摩尔)并将混合物在95℃加热2小时。在冷却后，将混合物倒入冷水(20ml)中。通过过滤收集沉淀物，用水洗涤，并真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基喹唑啉(665mg，79％)。
MS-ESI：561-563[MH]+
1H NMR谱：(DMSOd6)1.15-1.3(m，2H)，1.46(s，9H)，1.8(d，2H)，2.0-2.1(m，1H)，2.65-2.9(m，2H)，3.95(s，3H)，4.02(br s，2H)，4.05(d，2H)，7.2(s，1H)，7.48(d，1H)，7.55(t，1H)，7.65(d，1H)，7.8(s，1H)，8.35(s，1H)，9.55(br s，1H)
将TFA(3ml)加入4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基喹唑啉(673mg，1.2毫摩尔)在二氯甲烷(10ml)的混悬液中。在环境温度搅拌1小时后，在真空下除去挥发物。用水/醚混合物研磨残留物。分离有机层。用醚再次洗涤水层。用2N氢氧化钠将水层调节至pH10，用二氯甲烷萃取水层。干燥有机层(MgSO4)并在真空下除去溶剂。用混合物醚/石油醚(1/1)研磨该固体，过滤，用醚洗涤，并真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(390mg，70.5％)。
MS-ESI：461-463[MH]+
1H NMR谱：(DMSOd6)1.13-1.3(m，2H)，1.75(d，2H)，1.87-2.0(m，1H)，2.5(d，2H)，3.0(d，2H)，3.96(s，3H)，3.98(d，2H)，7.2(s，1H)，7.5(dd，1H)，7.55(t，1H)，7.68(dd，1H)，7.80(s，1H)，8.36(s，1H)，9.55(br s，1H)
元素分析：                          发现  C 54.5  H 4.9  N 12.1
C21H22N4O2BrF                 需要  C 54.7  H 4.8  N 12.1％
方法(b)
将37％含水甲醛(3.5ml，42毫摩尔)加入到4-(4-溴-2-氟苯胺)-7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基喹唑啉(3.49g，6.22毫摩尔)(如在上述方法(a)中对起始物质的描述来制备)在甲酸(35ml)的溶液中。在95℃加热4小时后，在真空下除去挥发物。将残留物混悬在水中，并通过缓慢加入2N氢氧化钠溶液将混合物调节至pH10.5。用以酸乙酯萃取混悬液。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥，并蒸发得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(2.61g，88％)。
MS-ESI：475-477[MH]+
1H NMR谱(DMSOd6)1.3-1.45(m，2H)，1.8(d，2H)，1.7-1.9(m，1H)，1.95(t，2H)，2.2(s，3H)，2.85(d，2H)，3.96(s，3H)，4.05(d，2H)，7.19(s，1H)，7.5(d，1H)，7.55(t，1H)，7.67(d，1H)，7.81(s，1H)，8.37(s，1H)，9.54(s，1H)
元素分析：                          发现  C 55.4  H 5.1  N 11.6
C22H24N4O2BrF                 需要  C 55.6  H 5.1  N 11.8％
方法c)
将4-氯-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(200mg，0.62毫摩尔)和4-溴-2-氟苯胺(142mg，0.74毫摩尔)在异丙醇(3ml)中的混悬液加热回流1.5小时，其包含在异丙醇中的6N盐酸(110μl，0.68ml)。在冷却后通过过滤收集沉淀物，用异丙醇洗涤，然后用醚洗涤，并真空干燥得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉盐酸盐(304mg，90％)。
元素分析：                           发现  C 47.9  H 4.9  N 10.0
C22H24N4O2BrF 0.5H2O 1.8HCl   需要  C 48.2  H 5.0  N 10.1％
0.08异丙醇
4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉盐酸盐质子化形式的NMR谱显示两种形式A和B以A∶B大约9∶1的比率存在。
1H NMR谱(DMSOd6)1.6-1.78(m，A型2H)；1.81-1.93(br s，B型4H)；1.94-2.07(d，A型2H)；2.08-2.23(br s，A型1H)；2.29-2.37(br s，B型1H)；2.73(d，A型3H)；2.77(d，B型3H)；2.93-3.10(q，A型2H)；3.21(br s，B型2H)；3.27(br s，B型2H)；3.42-3.48(d，formA 2H)；4.04(s，3H)；4.10(d，A型2H)；4.29(d，B型2H)；7.49(s，1H)；7.53-7.61(m，2H)；7.78(d，1H)；8.47(s，1H)；8.81(s，1H)；10.48(br s，formA 1H)；10.79(br s，B型1H)；11.90(br s，1H)
至于另一NMR读数，将一些固态碳酸钾加入上述4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉盐酸盐中，以便在NMR管中释放游离碱。然后再次记录NMR谱，并且仅显示如下描述的一种形式：
1H NMR谱：(DMSOd6；固态碳酸钾)1.3-1.45(m，2H)；1.75(d，2H)；1.7-1.9(m，1H)；1.89(t，2H)；2.18(s，3H)；2.8(d，2H)；3.98(s，3H)；4.0(d，2H)；7.2(s，1H)；7.48(d，1H)；7.55(t，1H)；7.68(d，1H)；7.8(s，1H)；8.35(s，1H)；9.75(s，1H)
从4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉盐酸盐(如上所述制备的)产生4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(游离碱)的样本，如下：
将4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基喹唑啉盐酸盐(50mg)混悬在二氯甲烷(2ml)中，并用饱和的碳酸氢钠洗涤。干燥二氯甲烷溶液，并通过蒸发除去挥发物以得到4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(游离碱)。如此产生的游离碱的NMR仅显示如下描述的一种形式：
1H NMR谱(DMSOd6)1.3-1.45(m，2H)；1.76(d，2H)；1.7-1.9(m，1H)；1.9(t，2H)；2.19(s，3H)；2.8(d，2H)；3.95(s，3H)；4.02(d，2H)；7.2(s，1H)；7.48(d，1H)；7.55(t，1H)；7.68(dd，1H)；7.8(s，1H)；8.38(s，1H)；9.55(br s，1H)
至于另一个NMR读数，将一些CF3COOD加入上述4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(游离碱)的NMR DMSO的溶液中，并再次记录NMR谱。4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉三氟醋酸盐的质子化形式的NMR谱显示两种形式A和B以A∶B大约9∶1的比率存在。
1H NMR谱：(DMSOd6；CF3COOD)1.5-1.7(m，A型2H)；1.93(br s，B型4H)；2.0-2.1(d，A型2H)；2.17(br s，A型1H)；2.35(brs，B型1H)；2.71(s，A型3H)；2.73(s，B型3H)；2.97-3.09(t，A型2H)；3.23(br s，B型2H)；3.34(br s，B型2H)；3.47-3.57(d，A型2H)；4.02(s，3H)；4.15(d，A型2H)；4.30(d，B型2H)；7.2(s，1H)；7.3-7.5(m，2H)；7.6(d，1H)；7.9(s，1H)；8.7(s，1H)
如下制备起始物质：
将1-(叔丁氧基羰基)-4-(4-甲基苯基磺酰氧甲基)哌啶(40g，0.11摩尔)(如在上面方法(a)中对起始物质的描述制备的)加入4-羟基-3-甲氧基苯甲酸乙酯(19.6g，0.1摩尔)和碳酸钾(28g，0.2摩尔)在无水DMF(200摩尔)中的混悬液中。在95℃搅拌2.5小时后，将混合物冷却至环境温度，并在水和乙酸乙酯/醚之间分配。用水、盐水洗涤有机层，干燥(MgSO4)并蒸发。从石油醚结晶得到的油并将混悬液在5℃贮存过夜。通过过滤收集固体，用石油醚洗涤并真空干燥得到4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯(35g，89％)。
m.p.81-83℃
MS(ESI)：416[MNa]+
1H NMR谱(CDCl3)1.2-1.35(m，2H)；1.4(t，3H)；1.48(s，9H)；1.8-1.9(d，2H)；2.0-2.15(m，2H)；2.75(t，2H)；3.9(d，2H)；3.95(s，3H)；4.05-4.25(br s，2H)；4.35(q，2H)；6.85(d，1H)；7.55(s，1H)；7.65(d，1H)
元素分析：                        发现  C 63.4  H 8.0  N 3.5
C21H31NO6 0.3H2O            需要  C 63.2  H 8.0  N 3.5％
将甲醛(12M，37％在水中，35ml，420毫摩尔)加入4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯(35g，89毫摩尔)在甲酸(35ml)中的溶液中。在95℃搅拌3小时后，通过蒸发除去挥发物。将残留物溶解在二氯甲烷中，并加入在醚(40ml，120毫摩尔)中的3M盐酸。在用醚稀释后，研磨混合物直到形成固体。通过过滤收集固体，用醚洗涤并在真空下在50℃干燥过夜，以得到3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(30.6g，定量)。
MS(ESI)：308[MH]+
1H NMR谱(DMSOd6)1.29(t，3H)；1.5-1.7(m，2H)；1.95(d，2H)；2.0-2.15(br s，1H)；2.72(s，3H)；2.9-3.1(m，2H)；3.35-3.5(br s，2H)；3.85(s，3H)；3.9-4.05(br s，2H)；4.3(q，2H)；7.1(d，1H)；7.48(s，1H)；7.6(d，1H)
将3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(30.6g，89毫摩尔)在二氯甲烷(75ml)中的溶液冷却至0-5℃。加入TFA(37.5ml)后，经15分钟滴加发烟的24N硝酸(7.42ml，178毫摩尔)在二氯甲烷(15ml)中的溶液。在添加完成后，加温溶液并在环境温度搅拌2小时。在真空下除去挥发物，并将残留物溶解在二氯甲烷(50ml)中。将该溶液冷却至0-5℃并加入醚。通过过滤收集沉淀物，在50℃真空干燥。将该固体溶解在二氯甲烷(500ml)中并加入在醚(30ml)中的3M盐酸，随后加入醚(500ml)。通过过滤收集固体，在50℃真空干燥得到3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-6-硝基苯甲酸乙酯(28.4g，82％)。
MS(ESI)：353[MH]+
1H NMR谱(DMSOd6)1.3(t，3H)；1.45-1.65(m，2H)；1.75-2.1(m，3H)；2.75(s，3H)；2.9-3.05(m，2H)；3.4-3.5(d，2H)；3.95(s，3H)；4.05(d，2H)；4.3(q，2H)；7.32(s，1H)；7.66(s，1H)
在1.8大气压，将包含10％铂的3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-6-硝基苯甲酸乙酯(3.89g，10毫摩尔)在甲醇(80摩尔)中的混悬液在活性炭(50％湿)(389mg)上氢化，直到氢的摄取停止。过滤混合物并蒸发滤液。将残留物溶解在水(30ml)中，并用饱和的碳酸氢钠溶液调节至pH10。用乙酸乙酯/醚(1/1)稀释该混合物并分离有机层。进一步用乙酸乙酯/醚萃取水层并合并有机层。用水、盐水洗涤有机层，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发。在醚/石油醚中研磨得到的固体，过滤，用石油醚洗涤，在60℃真空干燥得到乙基-6-氨基-3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(2.58g，80％)。
m.p.111-112℃
MS(ESI)：323[MH]+
1H NMR谱：(CDCl3)1.35(t，3H)；1.4-1.5(m，2H)；1.85(m，3H)；1.95(t，2H)；2.29(s，3H)；2.9(d，2H)；3.8(s，3H)；3.85(d，2H)；4.3(q，2H)；5.55(br s，2H)；6.13(s，1H)；7.33(s，1H)
元素分析：                         发现  C 62.8  H 8.5  N 8.3
C17H26N2O4 0.2H2O           需要  C 62.6  H 8.2  N 8.6％
将包含甲脒醋酸盐(5.2g，50毫摩尔)的氨基-3-甲氧基-4-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)苯甲酸乙酯(16.1g，50毫摩尔)在2-甲氧基乙醇(160ml)中的溶液在115℃加热2小时。经4小时，每30分钟分次加入甲脒醋酸盐(10.4g，100毫摩尔)。在最后一次加入后，将加热延长30分钟。在冷却后，在真空下除去挥发物。将该固体溶解在乙醇(100ml)和二氯甲烷(50ml)中。通过过滤除去沉淀物并将滤液浓缩至最终体积为100ml。将混悬液冷却至5℃并通过过滤收集固体，用冷乙醇洗涤，然后用醚洗涤，并在60℃真空干燥过夜，得到6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(12.7g，70％)。
MS(ESI)：304[MH]+
1H NMR谱：(DMSOd6)1.25-1.4(m，2H)；1.75(d，2H)；1.9(t，1H)；1.9(s，3H)；2.16(s，2H)；2.8(d，2H)；3.9(s，3H)；4.0(d，2H)；7.11(s，1H)；7.44(s，1H)；7.97(s，1H)
将包含DMF(280μl)的6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(2.8g，9.24毫摩尔)在亚硫酰氯(28ml)中的溶液在85℃加热回流1小时。冷却后，通过过滤除去挥发物。用醚研磨沉淀物，过滤，用醚洗涤并真空干燥。将固体溶解在二氯甲烷中并加入饱和的含水碳酸氢钠。分离有机层，用水、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发得到4-氯-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(2.9g，98％)。
MS(ESI)：322[MH]+
1H NMR谱：(DMSOd6)1.3-1.5(m，2H)；1.75-1.9(m，3H)；2.0(t，1H)；2.25(s，3H)；2.85(d，2H)；4.02(s，3H)；4.12(d，2H)；7.41(s，1H)；7.46(s，1H)；8.9(s，1H)
或者，可以如下制备6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮：
经20分钟将氢化钠(1.44g在矿物油中的60％混悬液，36毫摩尔)分次加入7-苄氧基-6-甲氧基-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(8.46g，30毫摩尔)(例如如在WO 97/22596实施例1中的描述制备的)在DMF(70ml)中的溶液，并将此混合物搅拌1.5小时。分次加入氯甲基特戊酸酯(5.65g，37.5毫摩尔)，并在环境温度搅拌该混合物2小时。将此混合物用乙酸乙酯(100ml)稀释，并倒入冰/水(400ml)和2N盐酸(4ml)。分离有机层并用乙酸乙酯萃取水层，用盐水洗涤合并的提取物，干燥(MgSO4)并通过蒸发除去溶剂。用醚和石油醚的混合物研磨残留物，通过过滤收集固体，并真空干燥得到7-苄氧基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(10g，84％)。
1H NMR谱：(DMSOd6)1.11(s，9H)；3.89(s，3H)；5.3(s，2H)；5.9(s，2H)；7.27(s，1H)；7.35(m，1H)；7.47(t，2H)；7.49(d，2H)；7.51(s，1H)；8.34(s，1H)
将7-苄氧基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(7g，17.7毫摩尔)和10％在碳上钯催化剂(700mg)在乙酸乙酯(250ml)、DMF(50ml)、甲醇(50ml)和醋酸(0.7ml)中的混合物在氢下在大气压下搅拌40分钟。通过过滤除去催化剂并通过蒸发从滤液中除去溶剂。用醚研磨残留物，通过过滤收集，真空干燥得到7-羟基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(4.36g，80％)。
1H NMR谱：(DMSOd6)1.1(s，9H)；3.89(s，3H)；5.89(s，2H)；7.0(s，1H)；7.48(s，1H)；8.5(s，1H)
在氮下将三苯膦(1.7g，6.5毫摩尔)加入7-羟基-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(1.53g，5毫摩尔)在二氯甲烷(20ml)中的混悬液，然后加入1-(叔丁氧基羰基)-4-(羟基甲基)哌啶(1.29g，6毫摩尔)(如在上述方法(a)中对起始物质的描述制备的)，并加入偶氮二羧酸二乙酯(1.13g，6.5毫摩尔)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。在环境温度搅拌30分钟后，将反应混合物倒入二氧化硅柱并用乙酸乙酯/石油醚(1/1，然后6/5、6/4和7/3)洗脱。蒸发包含预期产品的馏分，得到油，它是用戊烷研磨结晶的。通过过滤收集固体，真空干燥得到7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(232g，92％)。
MS-ESI：526[MNa]+
1H NMR谱：(CDCl3)1.20(s，9H)，1.2-1.35(m，2H)，1.43(s，9H)，1.87(d，2H)，2.05-2.2(m，1H)，2.75(t，2H)，3.96(d，2H)，3.97(s，3H)，4.1-4.25(br s，2H)，5.95(s，2H)，7.07(s，1H)，7.63(s，1H)，8.17(s，1H)
元素分析：                       发现  C 61.8  H 7.5  N 8.3
C26H37N3O7                  需要  C 62.0  H 7.4  N 8.3％
将7-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基甲氧基)-6-甲氧基-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(2.32g，4.6毫摩尔)在包含TFA(5ml)的二氯甲烷(23ml)中的溶液在环境温度搅拌1小时。在真空下除去挥发物。在乙酸乙酯和碳酸氢钠之间分配残留物。在真空中除去有机溶剂并过滤残留物。将该固体与甲苯共沸混合，并在真空下干燥得到6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(1.7g，92％)。
MS-ESI：404[MH]+
1H NMR谱(DMSOd6，CF3COOD)1.15(s，9H)，1.45-1.6(m，2H)，1.95(d，2H)，2.1-2.25(m，1H)，2.95(t，2H)，3.35(d，2H)，3.95(s，3H)，4.1(d，2H)，5.95(s，2H)，7.23(s，1H)，7.54(s，1H)，8.45(s，1H)
分次向6-甲氧基-7-(哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(1.21g，3毫摩尔)在THF/甲醇(10ml/10ml)的混合物的溶液中加37％的甲醛水溶液(501μl，6毫摩尔)，然后加入氰基硼氢化钠(228mg，3.6毫摩尔)。在环境温度搅拌30分钟后，在真空下除去有机溶剂并在二氯甲烷和水之间分配残留物。分离有机层，用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)并通过蒸发除去挥发物。用醚研磨残留物，并通过过滤收集得到的固体，用醚洗涤并真空干燥得到6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(1.02g，82％)。
MS-ESI：418[MH]+
1H NMR谱：(CDCl3)1.19(s，9H)，1.4-1.55(m，2H)，1.9(d，2H)，2.0(t，2H)，1.85-2.1(m，1H)，2.3(s，3H)，2.92(d，2H)，3.96(s，3H)，3.99(d，2H)，5.94(s，2H)，7.08(s，1H)，7.63(s，1H)，8.17(s，1H)
将氨水在甲醇(14ml)中的饱和溶液加入6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3-((特戊酰氧基)甲基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(1.38g，3.3毫摩尔)在甲醇(5ml)中的溶液。在环境温度搅拌20小时后，用二氧甲烷(10ml)稀释混悬液。过滤溶液。在真空下蒸发滤液，并用醚研磨残留物，通过过滤收集，用醚洗涤并在真空下干燥得到6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)-3，4-二氢喹唑啉-4-酮(910mg，83％)。
MS-ESI：304[MH]+
1H NMR谱：(DMSOd6)1.3-1.45(m，2H)，1.75(d，2H)，1.7-1.85(m，1H)，1.9(t，2H)，2.2(s，3H)，2.8(d，2H)，3.9(s，3H)，4.0(d，2H)，7.13(s，1H)，7.45(s，1H)，7.99(s，1H)
采用述试验来证明ZD6474与电离辐射组合的活性。
Calu-6(肺癌)细胞获得自美国典型菌种收藏所(American TypeCulture Collection)(Manassas，VA)。所有细胞培养试剂，如没有指定，都获得自Life Technologies，Paisley，UK。细胞被维持为在伊格尔最低必需培养基(EMEM)中指数生长单层，该培养基包含10％FCS(Labtech Internatiomal，Ringmer，UK)、2mM L-谷氨酰胺(SigmaChemical Co.，Poole，UK)、1％丙酮酸钠(100mM)和1％非必需氨基酸。由于微等离子体在培养物中的存在定时地筛选细胞，并且在体内常规应用前在小鼠抗体产生试验中分析15种病毒(AstraZenecaCentral Toxicology Laboratories，Alderley Park，UK)。
在50％(v/v)基质胶(Fred Baker，Liverpool，UK)在无血清Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培养基中的混合物中制备用于植入的Calu-6细胞(2×107细胞/毫升)。通过将0.1ml细胞混悬液(即2×106细胞/小鼠)皮下注射入雌性Alderley Park裸鼠(nu/nu基因型；年龄为8-10星期)来建立肿瘤异体移植物。一旦可触及的肿瘤是明显的，就用测径器测量和利用公式长度×宽度×高度来每天评价肿瘤体积。
在治疗前，当肿瘤测量值为225-315mm3时，将小鼠随机分成八组。以每分钟2Gy的给药频率给予受限制于聚乙烯夹具的未麻醉的小鼠电离辐射，该夹具有铅遮板和切掉的区域以允许通过单侧光的肿瘤的局部辐射(PantacX射线机)。在射线照射期间通过180℃半途旋转夹具以提供均匀的剂量。辐射是单次给予(在第1天5Gy)或通过多次每日给予(在第1-3天2Gy/天)来给予。在辐射最后给予后30分钟，通过口服管饲法给药ZD6474(25mg/kg)或介质(0.1ml/10g体重)，并且此后每天一次再给13天(即总共口服治疗14天)。ZD6474被制备为在1％聚山梨酯80(即聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯在去离子水中的1％(v/v)溶液)中的混悬液。当小鼠肿瘤的相对体积达到治疗起始的四倍(RTV4)时，人工处死小鼠。采用双尾双样本t-检验来评价获得的结果的显著性。
表1-RTV4天数
  辐射治疗     药物治疗(辐射后14天)      RTV4(天数)     SE
  无     ZD6474  介质      8.8     0.7
  5Gy     ZD6474  介质      20.0     1.5
  3×2Gy     ZD6474  介质      23.1     1.3
  无     ZD6474(25mg/kg/天)      12.1     0.4
  5Gy     ZD6474(25mg/kg/天)      25.5     0.5
  3×2Gy     ZD6474(25mg/kg/天)      28.1     0.7
数据用图显示在图1和图2中。
数据表明在各情况下(5Gy或3×2Gy试验)，辐射加上ZD6474的组合都比每一单独疗法提供更好的疗效。
   RTV4比较    P值*
   (5Gy+ZD6474)对(5Gy+介质)    0.006
   (5Gy+ZD6474)对(ZD6474)    P＜0.001
   (3×2Gy+ZD6474)对(3×2Gy+介质)    0.007
   (3×2Gy+ZD6474)对(ZD6474)    P＜0.001
双样本t-检验的P值(假定有不对称的方差)
在上文描述的应用Calu-6异体移植物模型的模拟试验中观察了不同的方案。
将患有Calu-6肿瘤(220-300mm3)小鼠随机分成八组，在试验的持续时间中仅接受ZD6474(每天口服50mg/kg)或介质(在去离子水中的1％的聚山梨酯)。ZD6474或介质也与或不与放射疗法(在治疗的最初3天以24小时间隔3×2Gy)一同给予。对于接受50mg/kgZD6474加辐射疗法的小鼠，检测两种治疗方案：
a)同时组合治疗：在第一次给予辐射2小时之前给予ZD6474；和
b)相继组合治疗：在最后一次给予放射疗法之后30分钟给予ZD6474。
用介质和5×2Gy放射疗法以24小时间隔治疗另一组有Calu-6异体移植物的小鼠。
通过测量肿瘤从它们的治疗前的大小达到四倍体积(RTV4)的时间和计算相对生长延迟(与对照组比较单独治疗组的RTV4值)来评价治疗有效性。
表2-RTV4和肿瘤生长延迟天数
   治疗(每组n＝8)     RTV4(天数±SE)     生长延迟(天数±SE)
   介质     8±0.5     NA
   50mg/kg ZD6474     17±1.0     9±1.1
   3×2Gy+介质     25±1.7     17±1.8
   3×2Gy+50mg/kgZD6474(相继的)     44±0.9     36±1.0
   3×2Gy+50mg/kgZD6474(同时的)     30±1.0     22±1.1
   5×2Gy+介质     46±4.0*     38±4.0
*基于n＝7；一个肿瘤/组在治疗后100天内没有达到RTV4
数据用图显示在图3中。
数据显示50mg/kg剂量的ZD6474与3×2Gy辐射疗法组合得到的生长延迟显著大于单独用单一疗法得到的生长延迟。辐射和50mg/kgZD6474的相继结合疗法抑制的肿瘤生长显著多于相同药剂同时组合(生长延迟分别为36±1.0天和22±1.1天)。
通过用3×2Gy辐射和50mg/kg ZD6474相继组合治疗产生的抗肿瘤效应大于通过单独疗法诱发的生长延迟的总和，并且也比得上单独用5×2Gy辐射治疗。

Claims (5)

1.ZD6474或其可药用盐在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗血管生成的和/或血管渗透性降低效应的药物中的用途。
2.ZD6474或其可药用盐在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗癌效应的药物中的用途。
3.权利要求2的用途，其中所述癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
4.ZD6474或其可药用盐在制备用于正在用电离辐射治疗的温血动物例如人中产生抗肿瘤效应的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述肿瘤是结肠、乳腺、前列腺、肺或皮肤肿瘤。
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