CN1311073C - 抗猪传染性胃肠炎重组n蛋白杂交瘤细胞株 - Google Patents

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本发明提供的是一种抗猪传染性胃肠炎重组N蛋白杂交瘤细胞株。以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备诊断用单克隆抗体。取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，经过3次克隆筛选，最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E10F10D5，其染色体平均计数为87±10对，间接ELISA检测制备的腹水抗体效价达1∶12800。本发明以生物技术手段纯化重组TGEV N蛋白，制备诊断抗原，建立检测抗体的Dot-ELISA检测方法，制备快诊膜，缩短检测时间；建立间接ELISA检测方法，检测TGEV感染和抗体效价测定，为建立标准化诊断试剂盒奠定基础；为建立快速检测病毒抗原的诊断方法奠定物质基础。

Description

抗猪传染性胃肠炎重组N蛋白杂交瘤细胞株
(一)技术领域
本发明涉及的是一种生物材料，具体地说是一种杂交瘤细胞株。
(二)背景技术
用杂交瘤细胞生产单克隆抗体(Monoclonal Antibody，McAb)是近些年来在免疫学和分子生物学领域中显著成就之一，自1975年Khle等报道了淋巴细胞杂交瘤技术以来，其理论和实用研究取得了惊人的进展。McAb纯度高、专一性强、重复性好且能在动物体外或体内产生同质性抗体，较常规的免疫学方法优越，为标准化提供了机会。单克隆抗体以其严格的识别特异性已渗透到TGE研究的许多领域，在TGEV抗原分析、TGEV结构蛋白功能及其作用机理、TGE诊断的研究等方面得到了广泛的应用。
猪群在产仔期间，仔猪TGE发病症状明显，损失也最大，当该病发生于育成猪、育肥猪和成年猪时，由于临床症状轻微，一般只有几天厌食或腹泻，常常得不到确诊，成为潜在传染源，而且目前没有有效而实用的治疗方法。可买到的商品疫苗交叉保护力不高(Bohl E.H.et al，1975；Moxley R A et al，1989；Saif L J et al，1990)。目前，包括我国在内的许多国家均有TGE流行的报道，TGEV给养猪业造成了严重的经济损失。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种以生物技术手段纯化重组TGEV N蛋白，制备的抗猪传染性胃肠炎重组N蛋白杂交瘤细胞株。
本发明的目的是这样实现的：以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备诊断用单克隆抗体；取纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，经过3次克隆筛选，最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E10F10D5，其染色体平均计数为87±10对，间接ELISA检测制备的腹水抗体效价达1∶12800，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C 200502。。
本发明为能更好地对TGE进行疾病监测、及时做出准确诊断，尽可能减少经济损失，以生物技术手段纯化重组TGEV N蛋白，制备诊断抗原，建立检测抗体的Dot-ELISA检测方法，制备快诊膜，缩短检测时间；建立间接ELISA检测方法，检测TGEV感染和抗体效价测定，为建立标准化诊断试剂盒奠定基础；研制诊断抗体，制备抗TGEV N蛋白的杂交瘤细胞系，为建立快速检测病毒抗原的诊断方法奠定物质基础。并从整体上为检测我国是否存在PRCV奠定物质基础。
以全病毒为抗原对杂交瘤细胞(E10F10D5)产生的腹水进行Western-Blot及间接ELISA检测分析，结果均为阳性。证明制备的单克隆抗体可以识别天然TGEV N蛋白上的某一抗原位点。为建立诊断TGEV抗原的检测方法奠定了物质基础。
(四)附图说明
图1是SP/20细胞染色体记数；
图2是E10F10D5细胞染色体记数；
图3、4是杂交瘤细胞上清液与TGEV N蛋白进行的SDS-PAGE、Western-blot的结果；图3中1是纯化的重组N蛋白；2是TGE病毒；3是蛋白质标准分子量；图4中1是纯化的重组N蛋白；2是TGEV病毒。
(五)具体实施方案
下面举例对本发明做更详细的描述：
本发明的猪传染性胃肠炎重组N蛋白是采用这样的方法纯化：
1融合蛋白的大量表达
(1)接种已表达融合蛋白的大肠杆菌DH5α菌株于10ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养过夜；
(2)转接10ml过夜培养物于500ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养至OD590值达0.5左右，取出1ml样品供电泳分析；
(3)加入0.5ml 1mol/L IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于37℃继续培养至OD值达1.0，终止培养，取出1ml样品供电泳分析。
2融合蛋白的纯化
(1)向1.5cm×7.5cm层析柱中加入1mlNi2+-NTA凝胶介质，20ml去离子水洗柱后，再用20ml Buffer A溶液洗柱；
(2)将菌液经10000g/min离心20min，去上清，沉淀的菌体用BufferA溶液10ml进行裂解菌体，溶解沉淀，室温搅拌1h后，4℃继续搅拌过夜；
(3)将溶解物移至30ml离心管中，4℃条件下，以20 000g/min离心40min，取上清留待上柱用；
(4)将上清以0.5ml/min的流速加入到Ni-NTA柱中；收集流出液，进行SDS-PAGE分析；
(5)依次使用20ml Buffer A、20ml Buffer B以0.5ml/min的流速洗涤，并收集流出液，SDS-PAGE分析；
(6)用含有80mmol/L咪唑的Buffer C 10ml进行洗涤，收集洗脱液，在280nm的紫外线波长下，检测蛋白的吸收峰值，保存含有重组蛋白的洗脱液，短期保存的保存温度为4℃，长期保存的保存温度为-20℃。
以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备诊断用单克隆抗体。取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，经过3次克隆筛选，最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E10F10D5，其染色体平均计数为87±10对，间接ELISA检测制备的腹水抗体效价达1∶12800。
3.诊断抗体(McAb)的制备及其免疫活性检测
(1)免疫脾细胞  取8～12周龄BALB/c小鼠3只用纯化的TGEVN蛋白加等量弗氏完全佐剂进行腹腔免疫，首免每只小鼠10ug；20天后加不完全佐剂免疫，剂量同前；15天后腹腔注射抗原，剂量同前；3天后杀鼠取脾细胞。
(2)细胞融合过程  按常规方法融合，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞以8∶1混合，用50％PEG3500作为融合剂，分别接种于96孔培养板中每孔100ul，置于37℃CO2培养箱中培养，第七天换成HT培养液培养。
(3)单抗筛选  建立间接ELISA方法，用方阵滴定法确立最佳抗原包被量。细胞生长杂交瘤培养上清液用间接ELISA方法检测，同时用pPROEXHTb表达载体转化大肠杆菌表达产物做阴性对照。用有限稀释法对杂交瘤细胞进行多次克隆，直至筛选结果100％阳性为止。
(4)McAb免疫扩散试验  以生理盐水配成1％琼脂，打孔封底后，中央孔加纯化N蛋白，周边孔分别加兔抗TGEV阳性血清、兔阴性血清及PBS对照，置湿盒孵育24～48h，观察结果。
(5)杂交瘤细胞的染色体检查  将传代2-3天杂交瘤细胞和SP2/0细胞分别从培养箱中取出，向细胞瓶内加入20/ug/ml秋水仙素0.05ml使其终浓度为0.1ug/ml，继续培养2.5小时，使染色体停止在分裂中期。收集细胞，用10ml 0.075mol/LKCL溶液悬浮均匀，于37水浴低渗处理30min，加入1ml细胞固定液(3份甲醇+1份冰醋酸)欲固定2-3min，1000r/min离心5min，弃上清。细胞用新鲜固定液在室温固定20min，重复固定一次。加入1ml固定液制成悬液，垂滴1-2滴至洁净冷冻的载玻片上，自然干燥。用Giemsa染色液染色10min，蒸馏水冲洗，晾干。在显微镜下观察染色体的形态，各分别记数10个细胞的染色体数目。
(6)腹水的制备  雌性BABL/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡/只，7天后腹腔注射2.5×106个杂交瘤细胞/只，观察小鼠状态，7-11天收集腹水，间接ELISA测其效价，-70℃保存。
(7)单克隆抗体部分特性的鉴定  western-blot检测单克隆抗体，按常规方法。
4、结果
(1)间接ELISA检测方法的建立  经方阵试验测得TGEV重组N蛋白抗原包被浓度为5μg/孔，酶标羊抗鼠IgG的工作浓度为1∶2000，培养上清的作用时间为1h，底物显色时间为20min。
(2)细胞融合及筛选情况  将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫鼠脾细胞融合后，共接种了192孔，8～9d后有84孔有杂交瘤细胞生长，融合率为43.7％。用间接ELISA检测，从中选P/N值最高的杂交瘤细胞进行了3次再克隆，直至阳性率达100％。该细胞命名为E10F10D5。
(3)McAb免疫扩散试验  琼扩试验表明，该株杂交瘤细胞E10F10D5分泌的抗体无免疫沉淀特性。
(4)间接ELISA测腹水效价达64000。
(5)杂交瘤细胞染色体记数
SP2/0染色体平均记数45对，杂交瘤细胞E10F10D5染色体平均记数89对。见图1、2。
(6)单克隆抗体部分特性的鉴定
杂交瘤细胞上清液与TGEV N蛋白进行的Western-blot，结果见图3、4。
本发明申请的杂交瘤细胞株的保藏日期为：2005年3月23日，保藏编号：CCTCC NO：C 200502，分类命名：抗猪传染性胃肠炎病毒核蛋白抗原的单克隆抗体细胞株，保藏单位及地址：中国典型培养物保藏中心；中国.武汉.武汉大学。

Claims (1)

1、一种抗猪传染性胃肠炎重组N蛋白杂交瘤细胞株，其特征是：在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：C 200502的杂交瘤细胞株。
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