CN1292993A - 鱼病多联单克隆抗体治疗制剂 - Google Patents

鱼病多联单克隆抗体治疗制剂 Download PDF

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Abstract

鱼病多联单克隆抗体治疗制剂,涉及生物技术领域。本发明将鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌免疫小鼠,进行细胞融合,再克隆化,制备出特异性很强,且效价较高的单抗,再将以上单抗筛选出对鱼类有较高保护率的抗病菌单抗,按一定比例配制成鱼病多联单抗治疗制剂。该生物制剂对鱼病有良好的预防和治疗作用,同时不会污染环境,也不会通过食物链对人类造成危害。

Description

鱼病多联单克隆抗体治疗制剂
本发明涉及生物技术领域
近年随着我国海水养殖渔业的迅猛发展，鱼病特别是由细菌引起的鱼病越来越严重，每年海水养殖鱼因病而死亡达30～40％，造成了严重的经济损失。对养殖鱼病的防治，国内外迄今还停留在主要采用化学药物及抗生素的初始阶段，化学药物的大量应用会带来不良的作用，一是引起病菌的耐菌性而失效，二是造成对环境的污染；使用抗生素，也会通过食物链对人类造成不良的影响。鱼病单克隆抗体治疗制剂迄今未见报道。
本发明的目的：利用生物技术，生产多种鱼病病菌的单克隆抗体，对鱼病有良好的预防和治疗作用，同时不会污染环境，也不会通过食物链对人类造成危害。
本发明的技术方案：
将鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌菌株(均由青岛海洋大学提供)，进行扩增培养，再将培养后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c小鼠，取免疫后小鼠脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合，将细胞融合的细胞悬液进行培养，用酶联免疫反应法(ELISA法)检测阳性克隆，将确定为阳性的孔以有限稀释法，进行克隆化，再将阳性克隆的杂交瘤细胞株扩增培养，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠制备出腹水型单抗，将以上腹水型单抗以ELISA法进行效价，亚类及交叉试验，挑选效价较高的单克隆抗体，分别和致死量的病菌混合(1∶1～1∶2比例)，然后以腹腔注射感染海鱼，对照组以生理盐水取代单抗，观察单抗对海鱼的免疫保护率，结果显示，抗鳗弧菌单抗中有3株单抗4A6、3B2、4E12，它们对海鱼的保护率分别为80％、60％、50％；抗创伤弧菌单抗中有2株单抗1A1、3E9，它们对海鱼的保护率分别为87％和89％；抗迟缓爱德华菌单抗中有两株单抗3F7和1B4，它们对海鱼的保护率分别为80％和60％。挑选出保护率较高的单抗按一定比例配制成鱼病多联单抗治疗制剂。
本发明的实施例：
(一)材料
1．菌种：鳗弧菌、外伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌的标准菌株由青岛海洋大学生命学院提供。以上菌种用作免疫原产生单克隆抗体。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、拟态弧菌、少女弧菌、麦氏弧菌的标准菌株购自北京生物制品公司。肠毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、志贺氏菌属的福氏志贺氏菌、绝氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、宋氏志贺氏菌，购自中国药品生物制品鉴定所。以上菌种用作单克隆抗体交叉试验。
2．细胞胞：SP2／0小鼠骨髓瘤细胞株，由第四军医大学细胞工程研究中心惠赠。
(二)实验方法
1．免疫原细菌的制备及灭活
鳗弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、迟缓爱德华氏菌以平板划线培养于细菌培养基上，37℃培养箱中过夜，无菌生理盐水洗脱菌苔，3000rpm离心20分钟，弃上清，加入1％的甲醛固定过夜。3000rpm离心20分钟，弃上清，加无菌生理盐水，比浊记数后，4℃冰箱保存，以备用作免疫原菌液。
2．Ba／b／c小鼠的免疫
8周龄的Ba／b／c雌性小鼠10只，将以上灭活的细菌菌液(1×108个／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫，第31天取脾细胞进行细胞融合。
3．细胞融合
(1)免疫脾细胞的制备
①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢铜网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻冲洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀，1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③用不完全培养液将沉淀细胞再离心洗涤一次(重复步骤②)，将细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞记数板记数。
(2)SP2／0骨髓瘤细胞悬液的制备
①将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml离心管内。
②1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③再加入30ml不完全培养液，重复步骤②再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至10ml，混匀，记数。
(3)细胞融合
①分别吸取含1×108个脾细胞和悬液和含2-3×107个骨髓瘤细胞的悬液，加入一支50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。
②1000rpm离心7分钟，弃去上清。
③加50％的融合剂PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
⑥加入20ml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培养。
4．抗体检测--间接ELISA法
(1)用已知抗原灭活菌液包被。
(2)加有克隆长生的孔中的培养上清100μl。
(3)加酶标单抗鼠IgG抗体100μl。
(4)加底物液100μl，室温避光显色10～20分钟。
(5)判定结果：在酶联免疫检测仪492nm波长下测定OD值，空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔2．1倍，即为阳性克隆。
5．克隆化--有限稀释法
将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后记数，然后采取有限稀释法进行逐级稀释，加到96孔板进行培养。观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测。将阳性单克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养。
6．杂交瘤细胞的冻存
将成对数生长的杂交瘤细胞收集入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml冻存液混匀，然后加到冻存管，在-70℃代温冰箱过夜后移入液氮罐长期保存。
7．腹水型单克隆抗体制备
将培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清作亚型试验，加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞数为1×106个／ml。每只Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接种杂交瘤细胞后7～14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水，离心，收集上清，分装后-20℃冻存备用。
8．单克隆抗体的鉴定
抗鳗弧菌单抗筛选到8株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株，分别命名为2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。经亚类鉴定其中2H2、3D2、3B2和4E12为IgG3；4E3为IgG2a；3A3、3C4、4A6为IgG1。经效价测定，这些单抗效价为1×10-5～1×10-7。
抗创伤弧菌单抗筛选到12株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，命名为1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。经亚类鉴定，其中2F6为IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1为IgG2a；2G8、3D5、2F1为IgG1。经效价测定，以上单抗的效价为1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌单抗筛选到8株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞中，命名为2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。经亚类鉴定，其中2E3为IgG3，2G2、2D11、3A10为IgG2a；2E4、3B12为IgG2b；2G8、4C7为IgG1。经效价鉴定，以上单抗的效价为1×10-6～1×10-7。
抗迟缓爱德华菌单抗筛选到10株单抗杂交瘤细胞株，分别命名为1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B11、6E1、6E6和6H3。经亚类鉴定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11为IgG1，6E1为IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3为IgG3。经效价测定，以上单抗的效价为1×10-6～1×10-7。
9．对海鱼的免疫保护试验
(1)将菌液(5LD50)与腹水型单克隆抗体1∶1(体积比混合，以0．1ml／条的量腹腔注射牙鲆，每条注射抗体量为100μg／条。对照组为同样的菌液与生理盐水1∶1混合，观察5天内牙鲆的存活率。保护率计算公式：
保护率(％)=(实验组存活率-对照组存活率)／对照组存活率×100％
(2)结果
经单克隆抗体对海鱼病治疗保护试验，从四种病菌的单克隆抗体中，分别筛选到了对海鱼有较好保护率的单抗。
抗鳗弧菌单克隆抗体中筛选到3株单抗4A6、3B2、4E12，它们对海鱼的治疗免疫保护率分为80％、60％、50％。
抗创伤弧菌单克隆抗体中筛选到2株单抗1A1、3E9，它们对海鱼的保护率分别为87％和89％。
抗迟缓爱德华菌单抗中筛选到2株单抗3F7和1B4，它们对海鱼的保护率分别为80％和60％。
抗溶藻弧菌单抗中未筛选到对海鱼有保护作用的单抗，但筛选到一株2D11对乳鼠有很好保护作用，其保护率达90％。
10．制备成品
将抗鳗弧菌单抗中的4A6，抗创伤弧菌单抗中的3E9，抗迟缓爱德华菌单抗中的3F7单抗以1∶1∶5的比例混和，制成鱼病多联单抗治疗制剂。
本发明的优点：
本发明鱼病多联单克隆抗体治疗制剂对海鱼保护率达80％以上，治疗效果好，不会污染环境，对人类不会造成损害，且所制备的含有海鱼病特异性单抗的杂交瘤细胞株可通过生物效应器无限扩增，实现特异性单抗工业化大生产，具有很高的社会与经济效益。

Claims (1)

1．鱼病多联单克隆抗体治疗制剂，其特征是：
将鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌进行扩增培养，再将培养后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c，取免疫后小鼠脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合，将细胞融合的细胞悬液进行培养，用酶联免疫反应法(ELISA法)检测阳性克隆，将确定为阳性的孔以有限稀释法，进行克隆化，再将阳性克隆的杂交瘤细胞株扩增培养，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠制备出腹水型单抗；将以上腹水型单抗以ELISA法进行效价，亚类及交叉试验，挑选效价较高的单克隆抗体；分别和致死量的病菌混合(1∶1～1∶2比例)，然后以腹腔注射感染海鱼，对海鱼进行保护试验，挑选对海鱼有较高保护率的单抗，按一定比例配制成鱼病多联单克隆抗体治疗制剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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