CN1308131A - 一种低密度生物芯片及其制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种低密度生物芯片及其制作方法,用于检测待测样品中的抗原或抗体、药物或受体、互补DNA或RNA的存在与否,主要由载体基片及载体基片上的点样物组成,特点是在点样物上还同时含有标记物,二者密切接触,点样物和标记物是按特定程序打印在载体基片上,具有结构简单、操作方便和灵敏、准确的优点。

Description

一种低密度生物芯片及其制作方法

本发明属于生物医学检验领域，特别是一种低密度生物芯片。本发明还涉及该低密度生物芯片的制作方法。

现有的生物芯片，是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵。是利用生物大分子间具有特异相互识别的能力而将他们有序的排列在固相载体基片(膜、玻璃片、硅片等)上，与检测样品和标记的生物分子同时反应或杂交，经过自动阅读设备可获得大量有用的生物信息。

生物芯片中的DNA芯片，又称基因芯片，是一种高密度的寡聚核苷酸(DNA探针)微阵列。它采用原位组合合成化学和微电子芯片的光刻技术，或者利用其他方法将大量特定序列的DNA片段(探针)有序地固化在玻璃或硅片上，从而构成储存有大量生命信息的DNA芯片。

生物芯片中的肽芯片是将肽或蛋白质固定到特定固相载体基质上，利用肽或蛋白质能特异性与配体分子(如抗原或抗体)结合的原理，与血清或样品液发生特异性反应，然后通过相应的标记分子，用来大规模检测抗原、抗体或蛋白质、多肽片段。

肽芯片又称为蛋白质芯片，其与基因芯片的基本原理相同，结合以免疫标记反应，在一种固相载体基片上，用不同的方法将不同来源的多种蛋白质(抗原或抗体)直接点于其上，使之与载体基片牢固结合，形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。抗原或抗体物质大部分都是蛋白质，抗原抗体的结合又是特异性的，在抗原或抗体上可以加上各种标记以检测相应的抗体或抗原。抗原抗体在蛋白质芯片上与带有特殊标记的蛋白质分子(抗体或抗原)进行特异性免疫反应，两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检，用于检测相应的抗体或抗原。这种技术的特点是微量化、并行化，可广泛应用于抗原抗体及临床疾病的检测等各领域。

利用抗原抗体特异性免疫反应检测的基本原理有以下几种：

1、三明治夹心法：固相载体上结合的抗原或抗体+待检样品中的抗体或抗原+标记抗原或抗体，用于检测待检样品中的抗原或抗体，显色为阳性，无色为阴性。

2、双位点一步法：固相载体上结合的单克隆抗体+待检样品中的抗原+标记的另一种不同抗原决定簇的单克隆抗体，用于检测待检样品中的抗原，显色为阳性，无色为阴性。

3、间接法：固相载体上结合的抗原+待检样品中的抗体+标记抗抗体或二抗抗体，用于检测待检样品中的抗体，显色为阳性，无色为阴性。

4、捕获法：固相载体上结合的抗人IgM抗体+待检样品中的抗体+特异性抗原和针对特异性抗原的标记抗体，用于检测待检样品中的IgM抗体，显色为阳性，无色为阴性。

上述生物芯片如基因芯片多采用原位合成和直接点样的方式制备。原位合成适用于寡核苷酸，直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成有光刻法、喷印法和分子印章法。与原位合成法比较，点样法较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。

原位喷印合成法的原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点寡核苷酸探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。喷印合成法由于不需要与载体表面直接接触，故有很高的效率，但制造工艺还不太成熟。

合成点样法是将合成好的寡核苷酸探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人三维控制打印/喷印针将寡核苷酸探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯片保持一定距离。打印法的优点是寡核苷酸探针密度高，缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，寡核苷酸探针密度低。

共价结合法是将合成好的特定寡核苷酸探针，采用特殊的共价化学技术将寡核苷酸探针结合于微通道内芯片的特定区域。从待测样品中分离DNA或RNA并对其进行荧光标记，然后样品流过芯片，固定的寡核苷酸探针捕获与之相互补的核酸，采用Gene Logic′s信号检测系统分析结果。该流通式芯片用于高通量分析已知基因的变化，其特点在于(1)敏感性高：由于寡核苷酸探针吸咐表面的增大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化；(2)速度快：微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需时间；(3)价格降低：由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸探针吸附于微通道内，使每一种流过式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。

上述制备方法工艺复杂，通常需要特殊昂贵设备，不利于常规应用。另外原位合成对基质材料要求条件较高；直接点样时由于采用复杂工艺，常会造成点样液中活性物质如DNA或RNA、抗原或抗体、药物或受体、组织或细胞等发生不可逆的变性或活性的损失，影响了生物芯片的检测灵敏度和特异性，甚至影响了生物芯片的稳定性和保存期。由于制造工艺复杂，相应检测手段要求条件也很高，导致制造和应用成本较高，限制了该高科技技术的广泛推广应用。

本发明的目的在于提供一种同时将点样物及标记物固化在载体基片上的一种低密度生物芯片，灵敏度和准确度高并可稳定存放。

本发明还涉及上述低密度生物芯片的制作方法。

本发明是这样实现的：

一种低密度生物芯片，用于检测待测样品中的抗原或抗体、药物或受体、互补DNA或RNA的存在与否，主要由载体基片及固化在该载体基片上的点样物组成，其特征在于：在载体基片上的点样物上还同时含有标记物，二者密切接触；上述标记物和点样物的形状为点状或线状，点阵个数为10-500/cm2，点阵大小为50-500μm。上述点样物用于捕获待检样品中的待测物；标记物即上述点样物的标记物，用于显示被点样物捕获的待检样品中的待测物。

其制作方法主要是将已合成或纯化好的不同类型的点样物和标记物分别装入喷墨打印机的各自不同的墨盒中，然后利用计算机上已有的字处理程序或其他软件依次将点样物打印于载体基片上的相应位点上，然后用小牛血清封闭载体基片上没结合点样物的活性基团，再利用计算机上已有的字处理程序或其他软件用喷墨打印机依次将标记物打印于相应点样物的位点上。

本发明制作方法的特征是：在载体基片上的同一行或同一列上的标记物和点样物是相同的，可以根据需要进行按列或行随意切割成不同的低密度生物芯片条状物，这些切割好的低密度生物芯片条状物又可以根据实际需要进行随意拼接，据此可以制备成不同用途或多种用途或多种形式的低密度生物芯片装置，以达到微量化、并行化检测多种抗原或抗体及多种疾病的目的。

本发明由于在载体基片上同时含有标记物和点样物，只需一次加入血清或全血样品，标记物和点样物中的抗原或抗体与待检血清或全血中的抗体或抗原发生特异性的免疫反应，然后洗涤掉未发生反应的物质，通过标记物的显色反应观察结果。如果待检血清或全血中有相应的抗体或抗原，就能特异性结合标记物而发生显色反应，结果为阳性；如果待检血清或全血中没有相应的抗体或抗原，就不能特异性结合标记物，标记物被洗涤除去，就不能发生显色反应，结果为阴性。该装置无须再加入液态标记物，操作简便快速，结果准确可靠，易于观察，灵敏度和准确度高，并可稳定存放。其室温稳定性可与金标渗滤法相媲美，适用于以三明治夹心法、双位点一步法、间接法和捕获法为原理的免疫标记法测定抗原或抗体、药物或受体，亦可以进行互补DNA或RNA的检测，具有结构简单、操作方便和灵敏、准确的优点，而且制备工艺简单，成本低廉。

附图为本发明纵向拉长的剖面图。

下面结合附图对本发明作进一步的详细描述。

附图中，1为标记物、2为点样物、3为载体基片。

如附图所示，本发明为一种低密度生物芯片装置，主要由标记物1、点样物2和载体基片3组成，载体基片3为柔性膜状基片，其上同时含有标记物1和点样物2，标记物1和点样物2之间密切接触。点样物2可以是DNA探针、cDNA探针、PNA探针、mRNA、抗原、抗体(包括不同位点的单克隆抗体、抗人IgM捕获抗体、抗人IgG抗体或二抗抗体)、药物受体、多糖凝集素、细胞或组织等多种配体，用于捕获待检样品中的待测物；标记物1即上述配体或受体的标记物，可以是金标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记、电化学发光标记和放射性标记等标记物，用于显示被点样物2捕获的待检样品中的待测物。

上述标记物1和点样物2多是已合成或纯化好的并采用海藻糖进行稳定化处理。其制作方法是：取1-10mg干重的标记物1或点样物2和30-100mg海藻糖加1ml的蒸馏水溶解即为稳定化液，也可以向含有1-10mg/ml标记物1或点样物2的溶液1ml中加入30-100mg的海藻糖，标记物或点样物与海藻糖的重量比为1∶10-30。将上述稳定化处理的标记物1和点样物2分别装入相应的墨盒中备用。

本发明的制作方法主要包括：用含有活性基团的柔性膜状基片作为载体基片3，该柔性膜状基片可以是玻璃纸、纤维膜、塑料膜等无机、有机聚合物薄膜，其特征是：耐水、耐酸碱性好且能够用通用喷墨打印机打印的薄膜。

本发明制作方法的特征是：取已合成或纯化好的并采用海藻糖进行稳定化处理的两种以上点样物2，分别装入各自不同的墨盒中或混合后装入同一个墨盒中，然后取已活化好的并切割成相同规格的柔性膜状载体基片3装入喷墨打印机的纸盒中，再选取一种或两种墨盒装入打印机中，最后再利用计算机上已有的字处理程序或其他软件按照特定的设计执行各张载体基片3的逐行或逐列打印，通过更换墨盒和载体基片3依次将不同的点样物打印于载体基片3上，使点样物2与载体基片3上的活性基团反应以共价结合的方式固定于载体基片3上。载体基片3上点样物2的形状可以是点状、线状或计算机上已有的字处理程序或其他软件中的任意一种字符的形状。载体基片3上点样物2的点阵个数为10-500/cm2，点阵大小为50-500μm。为了达到载体基片3上同时含有标记物1和点样物2的目的，将上述含有不同点样物2的载体基片3放入小牛血清中封闭载体基片3上没结合点样物2的活性基团，然后将已封闭并带有点样物2的载体基片3装入喷墨打印机的纸盒中，再选取一种或两种已装入相应标记物1的墨盒装入打印机中，最后再利用计算机上已有的字处理程序或其他软件按照既定的设计执行各张载体基片3的逐行或逐列打印，通过更换墨盒和基片依次将不同的标记物1打印于载体基片3上相应点样物2的位点上。载体基片3上标记物1的形状与上述点样物2相同，可以是点状、线状或计算机上已有的字处理程序或其他软件中的任意一种字符的形状。载体基片3上标记物1的点阵个数为10-500/cm2，点阵大小为50-500μm。

本发明中的DNA芯片即基因芯片为上述生物芯片的一种特殊形式，其主要区别为：标记物1为待测样品中DNA的标记物，可以是金标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记、电化学发光标记和放射性标记等标记物。喷墨打印待测样品DNA标记物1的过程就是加待测样品的过程，之后待测样品DNA标记物1与载体基片3上点样物2包括DNA探针、cDNA探针、PNA探针和mRNA作用，用于显示被点样物捕获的待检样品中的互补DNA或RNA的存在与否。

本发明中的载体基片，是通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体基片表面键合上各种各样的活性基团，以便与点样物共价结合，形成具有不同生物特异性的亲和型载体基片，用来固定和检测各种不同的活性生物分子，如蛋白质、多肽、酶、核酸、抗原、抗体、药物和受体等。不同的载体基片可以用不同的活化试剂把载体基片表面活化，如表面为羧基的载体基片，用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)把表面变成活泼酯，然后再同点样物中各种不同的生物分子偶联；如此采用类似公知共用的方法，可以分别把含有羟基、氨基、醛基、肼基、巯基等基团的载体基片表面活化成活性基团，然后再与点样物进行不同的键和反应，从而把点样物中的生物活性分子以共价结合的方式固定于载体基片上。

操作时，取1-2ml的待检血清或全血加入加样区中或将本发明侵入待检血清或全血中。本发明由于在载体基片3上同时含有标记物1和点样物2，加入血清或全血样品后，37℃待反应30-60分钟，标记物1和点样物2中的抗原或抗体与待检血清或全血中的抗体或抗原发生特异性的免疫反应，然后取洗涤液洗涤该低密度生物芯片装置，共洗三遍，洗涤掉未发生反应的物质，再随后加入显色剂，待反应，通过标记物2的显色反应观察结果。或用洗涤液洗涤后在扫描仪或其他设备上判读结果，斑点显色为阳性，斑点无色为阴性。如果待检血清或全血中有相应的抗体或抗原，就能特异性结合标记物1而发生显色反应，结果为阳性；如果待检血清或全血中没有相应的抗体或抗原，就不能特异性结合标记物1，标记物1被洗涤除去，就不能发生显色反应，结果为阴性。

本发明中的DNA芯片即基因芯片为上述生物芯片的一种特殊形式，其主要区别为：标记物1为待测样品中DNA的标记物，可以是金标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记、电化学发光标记和放射性标记等标记物。喷墨打印待测样品DNA标记物1的过程就是加待测样品的过程，之后待测样品DNA标记物1与载体基片3上点样物2包括DNA探针、cDNA探针、PNA探针和mRNA作用，用于显示被点样物2捕获的待检样品中的互补DNA标记物1的存在与否。其具体操作是：喷墨打印待测样品DNA标记物1后，37℃待反应30-60分钟，待测样品DNA标记物1与载体基片3上点样物2包括DNA探针、cDNA探针、PNA探针和mRNA作用，然后取洗涤液洗涤该低密度生物芯片装置，共洗三遍，洗涤掉未发生反应的物质，再随后加入显色剂，待反应，通过标记物1的显色反应观察结果。或用洗涤液洗涤后直接在扫描仪或其他设备上判读结果，斑点显色为阳性，斑点无色为阴性。如果待检血清或全血中有互补DNA或RNA的存在，就能特异性结合在载体基片3上而不能被洗涤除去，继而发生显色反应，结果为阳性；如果待检血清或全血中无互补DNA或RNA的存在，就不能特异性结合在载体基片3上而被洗涤除去，就不能发生显色反应，结果为阴性。

Claims (11)

1、一种低密度生物芯片，主要由含有活性基团的载体基片(3)及固化在该载体基片(3)上的点样物(2)组成，其特征在于：在载体基片(3)上的点样物(2)位点上还同时含有标记物(1)，二者密切接触；上述标记物1和点样物(2)的形状为点状或线状，点阵个数为10-500/cm2，点阵大小为50-500μm。

2、根据权利要求1所述的低密度生物芯片，其特征在于：上述标记物(1)和点样物(2)分别为含有海藻糖稳定化的混合物。

3、根据权利要求1或2所述的低密度生物芯片，其特征在于：上述点样物(2)可以为DNA探针、cDNA探针、PNA探针、mRNA、抗原、抗体、药物受体、多糖凝集素、细胞或组织中的任一种或任一组合。

4、根据权利要求1或2所述的低密度生物芯片，其特征在于：上述标记物(1)可以为金标记、酶标记、荧光标记、化学发光标记、电化学发光标记、放射性标记标记物中的任一种或任一组合。

5、根据权利要求3所述的低密度生物芯片，其特征在于：所述的点样物(2)和标记物(1)在载体基片(3)上的点阵呈线形排列，在载体基片(3)上含有多行或多列排列的不同的点样物(2)和标记物(1)线形点阵。

6、根据权利要求4所述的低密度生物芯片，其特征在于：所述的点样物(2)和标记物(1)在载体基片(3)上的点阵呈线形排列，在载体基片(3)上含有多行或多列排列的不同的点样物(2)和标记物(1)线形点阵。

7、根据权利要求6所述的低密度生物芯片，其特征在于：所述的载体基片(3)为柔性膜状基片。

8、根据权利要求7所述的低密度生物芯片，其特征在于：所述的载体基片(3)可以是玻璃纸、纤维膜、塑料膜或无机、有机聚合物薄膜中的任一种。

9、一种制造权利要求1所述的低密度生物芯片的方法，其特征是：将已合成或纯化好的不同类型的点样物(2)和标记物(1)分别装入喷墨打印机的各自不同的墨盒中，然后利用计算机已有的字处理程序或其他软件依次将点样物(2)打印于载体基片(3)上的相应位点上，然后用小牛血清封闭载体基片(3)上没结合点样物(2)的活性基团，再利用计算机已有的字处理程序或其他软件用喷墨打印机依次将标记物(1)打印于相应点样物(2)的位点上。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于上述标记物(1)和点样物(2)的制作步骤为：取固相标记物(1)或点样物(2)，与海藻糖加蒸馏水溶解；也可向含有标记物(1)或点样物(2)的溶液中加入海藻糖。

11、根据权利要求10所述的方法，其特征在于：固相标记物(1)或点样物(2)与海藻糖的重量比为1∶10-30。